本發(fā)明涉及一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑及其制備方法和用途，特別涉及一種提高動(dòng)物免疫力、增強(qiáng)抗病力、提高采食量和飼料轉(zhuǎn)化率起到治療及預(yù)防動(dòng)物腸道疾病、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡和抗應(yīng)激能力的生物發(fā)酵飼料添加劑。本發(fā)明屬于生物發(fā)酵飼料添加劑研究技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物發(fā)酵飼料作為一種新型飼料，在21世紀(jì)的作用已越來越引起飼料行業(yè)的高度重視，因此，生物飼料無論在理論研究還是實(shí)踐應(yīng)用上都有很大的發(fā)展前景。
生物飼料符合人類對保健食品的需求，21世紀(jì)人類的保健食品將是安全、無污染、無殘留、豐富多樣并具備低脂肪、低蛋白質(zhì)、低熱量、多纖維和有預(yù)防疾病的成分等優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)物性食品的安全，首先是飼料的安全，因此，飼料本身的安全是生產(chǎn)肉食品的基礎(chǔ)。生物飼料由于其自身的安全性，使人類食品的安全得到了保證。
生物技術(shù)的高速發(fā)展促進(jìn)了生物飼料的發(fā)展，近二十年來，生物技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，對微生物的分離、純化、誘導(dǎo)技術(shù)越來越完善，具有安全性的已知微生物種類越來越多，用于飼料的效果越來越好，保證了生物飼料品種系列化。
生產(chǎn)生物飼料可以提高飼料企業(yè)的競爭力，但這需要高科技技術(shù)的及時(shí)應(yīng)用，同時(shí)也是今后飼料企業(yè)爭奪市場的主要手段之一。生物飼料能有效地提高畜禽對飼料原料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與利用，不但擴(kuò)大了飼料原料應(yīng)用的范圍，緩解了飼料原料緊張的問題，而且更有助于降低飼料成本，增強(qiáng)飼料企業(yè)的競爭力。21世紀(jì)的飼料將是一個(gè)嚴(yán)格要求產(chǎn)品質(zhì)量，并且具有成本低、利潤高，強(qiáng)調(diào)安全、清潔和環(huán)保意識的飼料。生物飼料由于其本身的特性，將在降低營養(yǎng)物質(zhì)的排泄量、提高其消化利用效率、節(jié)約財(cái)力與人力方面起到重要作用。
飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后能產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸和芳香酸，具有特殊的芳香味和良好的適口性，可明顯刺激畜禽的食欲，增加采食量。多種有益菌在胃腸道內(nèi)抑制有害菌的生長和繁殖，對頑固性腹瀉有特殊功效，且不含任何抗生素，無毒、副作用。膽固醇含量低，是保健型畜產(chǎn)品，符合人類對衛(wèi)生、健康、生態(tài)、環(huán)保的要求。有益菌可降低禽舍內(nèi)氨氣、硫化氫、臭氣的濃度，減少呼吸道疾病，達(dá)到凈化禽舍環(huán)境的目的，并刺激動(dòng)物的免疫功能，增強(qiáng)動(dòng)物對多種疫病的抵抗力，明顯降低發(fā)病率和死亡率。
生物飼料是以微生物、復(fù)合酶做為生物飼料發(fā)酵劑，將飼料原料轉(zhuǎn)化為微生物菌體蛋白、生物活性小肽類氨基酸、微生物活性益生菌、復(fù)合酶制劑為一體的生物發(fā)酵飼料。所謂生物飼料即微生物飼料，是在微生態(tài)理論指導(dǎo)下采用已知有益的微生物與飼料混合經(jīng)發(fā)酵、干燥等特殊工藝制成的含活性益生菌的安全、無污染、無殘留的優(yōu)質(zhì)飼料。生物飼料是經(jīng)過某些特殊的微生物發(fā)酵過的飼料，而這些微生物能夠產(chǎn)生消化酶、有機(jī)酸、抑菌素、b族維生素、氨基酸等物質(zhì)，通過對飼料的發(fā)酵，也就能產(chǎn)生有益物質(zhì)，相當(dāng)于消化器官的延長和消化時(shí)間的增加，飼料被動(dòng)物攝入后，各種營養(yǎng)成分不可能完全被動(dòng)物吸收利用，沒有被動(dòng)物吸收的成分將隨糞便排出。動(dòng)物對各成分的利用率越高，則排泄物中的含量就越低，對環(huán)境的污染就越少。
因此，為了保護(hù)環(huán)境，營養(yǎng)學(xué)家在設(shè)計(jì)配方時(shí)，不是簡單地進(jìn)行一些動(dòng)物營養(yǎng)平衡的設(shè)計(jì)，而是在配方設(shè)計(jì)中還要考慮以下幾方面內(nèi)容：①控制臭味的環(huán)境污染；②改善和控制氮(n)的環(huán)境污染；③改善和控制磷(p)的環(huán)境污染；④改善和提高飼料消化率，減少養(yǎng)分損失；⑤改善飼料衛(wèi)生，發(fā)展生物飼料符合環(huán)境保護(hù)的需要，眾所周知生物飼料可提供人類食品的安全保證。
生物飼料在歐盟等許多國家已被廣泛使用，生物飼料也在中國悄然興起，我國的生物飼料產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，產(chǎn)量迅速增加，極大地豐富了飼料的市場供給，但是，我國生物飼料產(chǎn)業(yè)還存在著規(guī)模效益低、技術(shù)水平與管理水平較低、生產(chǎn)成本及勞動(dòng)生產(chǎn)率方面無競爭優(yōu)勢、市場競爭能力弱、生物飼料產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)與布局不合理以及生物飼料安全性等問題。
國內(nèi)固體生物飼料的應(yīng)用現(xiàn)狀；(1)全價(jià)生物飼料：就是將全營養(yǎng)的無藥配合飼料加入微生物菌劑、水和增菌劑混合后在適當(dāng)?shù)臏囟认陆?jīng)厭氧或需氧發(fā)酵而成的飼料。從本質(zhì)上講，是將有益活菌制劑與全價(jià)配合飼料按一定的比例混和發(fā)酵而生產(chǎn)的新型高效飼料。關(guān)于富酶綠色生物飼料的研究表明，可以運(yùn)用現(xiàn)代生物工程、代謝控制發(fā)酵技術(shù)、動(dòng)物營養(yǎng)平衡理論等一系列高技術(shù)手段生產(chǎn)出富含消化酶、乳酸菌素和生物活性多肽的綠色生物飼料，該類飼料不僅能全面滿足動(dòng)物的營養(yǎng)需要，還能增加多種消化酶、有機(jī)酸、功能微生物和多肽、氨基酸的含量，具有明顯的促生長、防治疾病等多種生物學(xué)效應(yīng)，可以減少抗生素、酶制劑、促生長保健劑的添加量.對腸道疾病有預(yù)防和治療作用，并能節(jié)約生產(chǎn)成本。目前國內(nèi)做固體發(fā)酵全價(jià)飼料的沒有幾家，生產(chǎn)量也很少。(2)非全價(jià)生物飼料：生物濃縮料：就是將不用藥物的濃縮飼料與微生物和水等輔料配合發(fā)酵而成的改性飼料。利用發(fā)酵劑及配套技術(shù)生產(chǎn)的生物飼料可明顯促進(jìn)動(dòng)物生長、特別能促進(jìn)微循環(huán)和后臀部發(fā)育，提高抗病力，在替代抗生素，等方面具有獨(dú)特的功效。
國內(nèi)發(fā)酵飼料存在的問題；(1)發(fā)酵設(shè)備落后、專業(yè)人員缺乏；由于大多數(shù)發(fā)酵飼料廠，對微生物和發(fā)酵工藝了解甚少，在某種意義上說生產(chǎn)發(fā)酵飼料的條件都不規(guī)范，多數(shù)生產(chǎn)廠家的發(fā)酵設(shè)備和專業(yè)人員都非常有限，一些基礎(chǔ)條件就顯得特別差。根本不符合衛(wèi)生要求，更為嚴(yán)重的是他們中根本沒有專業(yè)人員進(jìn)行顯微檢驗(yàn)，就這樣一批復(fù)一批地生產(chǎn)，從而使產(chǎn)品安全性存在隱患。(2)管理、衛(wèi)生條件差；凡從事微生物發(fā)酵工作的人都知道“消毒、滅菌”工作是發(fā)酵成敗的關(guān)建環(huán)節(jié)之一。然而，許多發(fā)酵飼料廠在管理上制度不健全，物流混亂，員工衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生都存在嚴(yán)重問題。(3)危險(xiǎn)的原料發(fā)酵；許多發(fā)酵飼料廠家認(rèn)為一般霉變的原料，只要是發(fā)酵了就能脫毒、就能提高飼料利用率和改善飼料適口性，就此說明對“發(fā)酵”的基礎(chǔ)知識了解太少。發(fā)酵原則上只能用于新鮮、無霉變的原料。事實(shí)上作為發(fā)酵飼料所用植物蛋白原料不進(jìn)行污染檢測是嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素。眾所周知危害嚴(yán)重的病原菌，很容易在自然環(huán)境存活和增殖。它們可以在飼料原料、飼料中存活很長的時(shí)間。飼料原料極易被沙門氏菌污染。因此，良好的貯存和飼料原料檢測和選擇是非常重要的。(4)菌種失活問題；由于各種微生物菌種組合、篩選、培育方向和方法的不同，生產(chǎn)水平、針對使用動(dòng)物種類以及發(fā)酵加工、儲(chǔ)存條件等因素差異，微生物發(fā)酵豆粕生產(chǎn)和應(yīng)用效果差異較大，質(zhì)量難以保證。部分發(fā)酵豆粕中的有益菌在培養(yǎng)、干燥、分裝、保存、加工等生產(chǎn)過程中死亡，降低了微生物的活性，致使產(chǎn)品達(dá)不到預(yù)期功效。由于發(fā)酵豆粕暫無國家標(biāo)準(zhǔn)，各企業(yè)根據(jù)市場需求來制定標(biāo)準(zhǔn)，使得市場上發(fā)酵豆粕產(chǎn)品魚目混雜，有些甚至是假冒的微生物發(fā)酵產(chǎn)品。(5)菌種來源復(fù)雜；由于這些飼料廠對發(fā)酵認(rèn)識能力差，不愿花錢到正規(guī)單位購買菌種和生產(chǎn)技術(shù)，也不請專業(yè)人員進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)，菌種安全性得不到保證。根本沒有做過動(dòng)物的急性、亞急性毒性實(shí)驗(yàn)、致畸致殘等試驗(yàn)，沒有產(chǎn)品目的功效驗(yàn)證，益生菌含量及配比的不科學(xué)性導(dǎo)致產(chǎn)品的功效不穩(wěn)定，由于動(dòng)物腸道環(huán)境的復(fù)雜性，微生物飼料中所含的有益菌數(shù)必須要達(dá)到一定數(shù)量和配比才能保證其存活和發(fā)揮作用。多數(shù)廠家對微生態(tài)發(fā)酵的認(rèn)識不夠而致使菌種使用不當(dāng)，生產(chǎn)出的產(chǎn)品質(zhì)量得不到穩(wěn)定保證。(6)大劑量使用促生長劑；一些飼料廠由于發(fā)酵技術(shù)綜合水平較差，發(fā)酵產(chǎn)品雜菌較多，因而將此發(fā)酵飼料用于仔豬濃縮飼料時(shí)，腹瀉率較高，于是便在仔豬濃縮飼料中加大了桿菌肽、鋅、抗生素等的用量。(7)亂用標(biāo)簽誤導(dǎo)用戶；一些飼料廠在包裝袋上大肆宣楊“生物飼料”、“每克含活菌數(shù)多少億個(gè)”等等，借助《動(dòng)物微生態(tài)學(xué)》的理論，宣傳其功效。
生物飼料與普通飼料有這本質(zhì)區(qū)別：①由有益生微生物產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，可以幫助動(dòng)物消化吸收，顯著提高飼料的利用率。②適口性好，經(jīng)發(fā)酵后飼料有一種特別的芳香味，這是由微生物產(chǎn)生的多種不飽和脂肪酸或芳香酸，可明顯剌激豬等動(dòng)物的食欲。③多種有益菌在胃腸道中抑制有害菌的繁殖和生長，防止拉稀和腹瀉。④不用添加任何抗生素，無任何藥物殘留，可用于生產(chǎn)綠色畜禽產(chǎn)品。⑤用生物飼料飼養(yǎng)的動(dòng)物畜產(chǎn)品(肉、蛋、奶)，味道鮮美，膽固酵含量低，是保健型畜產(chǎn)品。⑥使用生物飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，可使畜禽圈舍的氨氣(nh3)、硫化氫(h2s)及糞臭素的含量明顯降低，起到凈化畜舍環(huán)境的目的。⑦生物飼料可以刺激動(dòng)物的免疫功能，增強(qiáng)動(dòng)物對多種疫病的抗病力，大幅度降低發(fā)病率和死淘率。
總之，固體發(fā)酵的生物飼料，包括全價(jià)生物飼料、生物濃縮料、雜粕混合發(fā)酵形成的新蛋白源、正在中國興起，各有特色與國外不同的是，國內(nèi)普遍使用微生物發(fā)酵劑，而國外則普通采用飼料中天然存在的乳酸菌類；另外，國外采用液體發(fā)酵飼料.而國內(nèi)采用固體發(fā)酵飼料。從未來的發(fā)展來看，生物飼料可能會(huì)成為市場的主流。
綜上所述，生物飼料或發(fā)酵飼料是一種新型飼料，可改善飼料的消化特性，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，尤其在提高動(dòng)物采食量和日增重，預(yù)防動(dòng)物腹瀉方面效果明顯，相信隨著發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)的不斷完善，必然會(huì)被生產(chǎn)者普遍接受和廣泛使用，有利于進(jìn)一步提高畜牧生產(chǎn)水平，推動(dòng)綠色食品生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展和增強(qiáng)我國畜禽產(chǎn)品的國際市場競爭能力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑及其制備方法和用途。本發(fā)明所述的生物發(fā)酵飼料添加劑是由輔料(豆粕、小麥、玉米)、發(fā)酵益生菌、酶制劑以及和鹽溶液培養(yǎng)基所組成。該產(chǎn)品可直接應(yīng)用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖場，具有提高動(dòng)物免疫力、增強(qiáng)抗病力、提高采食量和飼料轉(zhuǎn)化率、治療及預(yù)防動(dòng)物腸道疾病、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡和抗應(yīng)激能力的作用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
本發(fā)明的一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑，其包括以下組分：
(1)輔料：
所述的輔料由豆粕、小麥以及玉米組成，其中豆粕、小麥以及玉米的重量比為4-8:0.5-2:1-5，所述輔料粉碎后過60-100目篩；
(2)發(fā)酵益生菌
所述的發(fā)酵益生素由乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按照重量比為80-120:1-10:1-5組成，其中：
所述的乳酸菌菌粉是由雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌以及干酪乳桿菌的液體發(fā)酵液經(jīng)低溫冷凍干燥后獲得；
所述的芽孢桿菌菌粉是由一種或兩種以上的枯草芽孢桿菌以及一種或兩種以上的地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵液經(jīng)低溫冷凍干燥后獲得；
所述的酵母菌菌粉是由熱帶假絲酵母以及釀酒酵母的液體發(fā)酵液經(jīng)低溫冷凍干燥后獲得；
(3)酶制劑
所述的酶制劑中包括中性蛋白酶、酸性蛋白酶以及淀粉酶，其中中性蛋白酶：酸性蛋白酶：淀粉酶的重量比＝1：1-3：1；
(4)鹽溶液培養(yǎng)基
所述的鹽溶液培養(yǎng)基是將0.1-1.0％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.1-0.5％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.001-0.1％(v/v)的tween80溶液，0.01-1.0％(w/w)的k2hpo4溶液，0.1-0.5％(w/w)的mgso4·7h2o溶液以及0.001-0.01％(w/w)的mnso4·h2o溶液按照等體積混合得到；
其中，發(fā)酵益生菌、酶制劑以及鹽溶液培養(yǎng)基的重量比為5-15：1-3：0.5-2；
其中，發(fā)酵益生菌、酶制劑以及鹽溶液培養(yǎng)基的混合物與輔料的重量比為1:8-10。
在本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中，優(yōu)選的，豆粕、小麥以及玉米的重量比為6:1:3。
在本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中，優(yōu)選的，所述的發(fā)酵益生素由乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按照重量比為100:5:2組成。
在本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中，優(yōu)選的，所述的鹽溶液培養(yǎng)基是將0.5％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.2％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.01％(v/v)的tween80溶液，0.1％(w/w)的k2hpo4溶液，0.2％(w/w)的mgso4·7h2o溶液以及0.005％(w/w)的mnso4·h2o溶液按照等體積混合后得到。
在本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中，優(yōu)選的，所述的雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌以及干酪乳桿菌的保藏編號分別cicc21717、cicc6090、cicc6073、cicc20271以及cicc23486；所述的枯草芽孢桿菌選自具有以下保藏編號的枯草芽孢桿菌中的一種或兩種以上：cicc10453、cicc10071以及cicc21095；所述的地衣芽孢桿菌選自具有以下保藏編號的地衣芽孢桿菌中的一種或兩種以上：cicc20684、cicc21737、cicc21738；所述的熱帶假絲酵母以及釀酒酵母的保藏編號分別為cicc32831以及cicc1832；以上菌種購自均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection,cicc)。
在本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中，優(yōu)選的，發(fā)酵益生菌、酶制劑以及鹽溶液培養(yǎng)基的重量比為10：1.5：1；發(fā)酵益生菌、酶制劑以及鹽溶液培養(yǎng)基的混合物與輔料的重量比為1:9。
在本發(fā)明所述的所述的生物發(fā)酵飼料添加劑中，雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌以及干酪乳桿菌的總菌數(shù)≧109cfu/g，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。酵母菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。
進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑的方法，包括以下步驟：
(1)輔料制備：將豆粕、小麥、玉米按照重量比為4-8:0.5-2:1-5，優(yōu)選按照6:1:3的比例混合后粉碎，過60-100目篩，通過滾筒干燥機(jī)高溫干燥后備用；
(2)乳酸菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
培養(yǎng)基制備：雙歧桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖8.0g，吐溫801.0g，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，znso4·7h2o0.25g，mgso4·7h2o0.1g，瓊脂15.0g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，雙歧桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂；
乳酸桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，tween801.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.05g，caco320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph6.8，121℃20分鐘高壓滅菌，乳酸菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
增菌培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80500ml，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌；
乳酸菌菌粉制備:將雙歧桿菌cicc21717、嗜酸乳桿菌cicc6090、植物乳桿菌cicc6073、德氏乳桿菌cicc20271以及干酪乳桿菌cicc23486在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基以及乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及干酪乳桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8小時(shí)后將所有菌種等體積混合后按照接種量為1:10體積比接種于液體發(fā)酵罐內(nèi)的增菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫冷凍干燥獲得乳酸菌菌粉；
(3)芽孢桿菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
芽孢桿菌培養(yǎng)基制備:蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph7.0，121℃20分鐘高壓滅菌，芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂；
芽孢桿菌菌粉制備：將枯草芽孢桿菌cicc10453、枯草芽孢桿菌cicc10071、枯草芽孢桿菌cicc21095、地衣芽孢桿菌cicc20684、地衣芽孢桿菌cicc21737、地衣芽孢桿菌cicc21738在芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌分別等體積混合，再將枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌按照體積比1:2混合，然后按照接種量為1:10的體積比接種于液體發(fā)酵罐內(nèi)的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫冷凍干燥獲得芽孢桿菌菌粉；
(4)酵母菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
酵母菌培養(yǎng)基制備：酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，酵母菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂；
酵母菌菌粉制備：將熱帶假絲酵母cicc32831、釀酒酵母cicc1832在酵母菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于酵母菌液體培養(yǎng)基中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將熱帶假絲酵母與釀酒酵母菌等體積混合后，按照接種量為1:10的體積比接種于液體發(fā)酵罐內(nèi)的酵母菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫冷凍干燥獲得酵母菌菌粉；
(5)發(fā)酵益生菌的制備：將上述步驟(2)、(3)、(4)得到的乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按照80-120:1-10:1-5，優(yōu)選按照100:5:2的重量比例混合，得到發(fā)酵益生菌；
(6)酶制劑的制備：將中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶按照中性蛋白酶：酸性蛋白酶：淀粉酶＝1：1-3：1的重量比例混合，優(yōu)選按照1：2：1的重量比例混合；
(7)鹽溶液培養(yǎng)基的制備：
將0.1-1.0％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.1-0.5％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.001-0.1％(v/v)的tween80溶液，0.01-1.0％(w/w)的k2hpo4溶液，0.1-0.5％(w/w)的mgso4·7h2o溶液以及0.001-0.01％(w/w)的mnso4·h2o溶液按照等體積混合得到；優(yōu)選的，所述的鹽溶液培養(yǎng)基是將0.5％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.2％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.01％(v/v)的tween80溶液，0.1％(w/w)的k2hpo4溶液，0.2％(w/w)的mgso4·7h2o溶液，0.005％(w/w)的mnso4·h2o溶液按照等體積混合得到；
(8)將步驟(5)得到的發(fā)酵益生菌、步驟(6)得到的酶制劑以及步驟(7)得到的鹽溶液培養(yǎng)基按照重量比為5-15：1-3：0.5-2混合，優(yōu)選按照重量比為10：1.5：1混合；
(9)將步驟(8)得到的混合物與步驟(1)得到的輔料按照重量比1:8-10，優(yōu)選按照1:9混合，即為直投式生物發(fā)酵飼料添加劑。
在本發(fā)明所述的制備方法中，優(yōu)選的，所述的低溫冷凍干燥所使用的凍干保護(hù)劑為含有18％(w/w)脫脂奶粉以及0.5％(w/w/)乳糖的0.5％(v/v)甘油溶液。
更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑在制備飼料添加劑中的用途。
其中，優(yōu)選的，在使用時(shí)向本發(fā)明所述的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑中加入其重量8-10倍重量的35-36℃溫水，攪拌均勻，在25-37℃發(fā)酵12至18小時(shí)即可，優(yōu)選的，還包括向所述的溫水中添加1％(w/w)的葡萄糖。
相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)操作簡便，應(yīng)用范圍廣，本發(fā)明的生物發(fā)酵飼料添加劑在制備和應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，其特點(diǎn)養(yǎng)殖場即時(shí)發(fā)酵，發(fā)酵后不通過任何加工直接應(yīng)用，保證了發(fā)酵后產(chǎn)生的所有生物活性物質(zhì)(免疫因子，有機(jī)酸、抑菌物質(zhì)、促生長物質(zhì)、消化酶類、生物活性小肽和游離氨基酸以及多種益生活菌)不受任何破壞，大幅度提高了產(chǎn)品的功效，降低養(yǎng)殖成本。
(2)本發(fā)明的生物飼料添加劑功效在于：提高免疫力；刺激機(jī)體產(chǎn)生干擾素、促進(jìn)細(xì)胞分裂、產(chǎn)生抗體；增強(qiáng)機(jī)體特異性與非特異性免疫反應(yīng)，中和內(nèi)毒素從而增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，提高對病毒的抵抗力。增強(qiáng)抗病力；對致病菌如痢疾桿菌、葡萄球菌等有拮抗作用；抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌，防治腹瀉、下痢、腸炎、便秘和其他由于腸道功能紊亂而引起的多種疾病，降低發(fā)病與死亡率。
(3)提高采食量和飼料轉(zhuǎn)化率：本發(fā)明的生物飼料添加劑可促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、顯著提高腸道酶活，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，提高飼料利用率。益生菌所產(chǎn)生的有機(jī)酸使鈣、磷處于易吸收的離子狀態(tài)，利于骨骼發(fā)育，促進(jìn)機(jī)體生長，減少動(dòng)物因消化不良而出現(xiàn)“飼料便”的現(xiàn)象，降低由于免疫接種、更換飼料等所引起的應(yīng)激反應(yīng)。
(4)降氨除臭：益生菌可有效抑制大腸桿菌等臭氣產(chǎn)生菌的繁殖從而明顯降低雞舍內(nèi)氨氣、硫化氫等臭氣濃度，減少呼吸道疾病的發(fā)生及改善養(yǎng)殖環(huán)境，提升養(yǎng)殖福利。
(5)菌株組合篩選的正對性；我們用于生產(chǎn)菌株的分離、篩選、純化及誘導(dǎo)技術(shù)完善，并且菌株均來源于國家工業(yè)菌種保藏中心，具有高度安全性，用于飼料發(fā)酵的效果穩(wěn)定高效,保證了生物飼料品種系列化。
(6)功效穩(wěn)定：工藝操作方法規(guī)范，我們采用了從菌種的選擇和生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)代時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，保證了生物發(fā)酵飼料添加劑的功效穩(wěn)定，
(7)安全性：生物飼料添加劑所用原料及包裝均經(jīng)過微生物指標(biāo)檢測，避免雜菌污染使生物飼料添加劑發(fā)酵效果安全穩(wěn)定。
(8)降低養(yǎng)殖成本：工廠生產(chǎn)的生物發(fā)酵飼料，烘干料生物性能降低增加養(yǎng)殖成本負(fù)擔(dān)，生物發(fā)酵濕料雖然生物效果較好，但不便于儲(chǔ)存，并且易于污染雜菌，我們發(fā)明的直投式生物發(fā)酵飼料添加劑解決了上述弊端，大幅度減低了養(yǎng)殖成本，對綠色養(yǎng)殖起到了積極的推動(dòng)作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
菌株及其來源：
雙歧桿菌(cicc21717)、嗜酸乳桿菌(cicc6090)、植物乳桿菌(cicc6073)、德氏乳桿菌(cicc20271)以及干酪乳桿菌(cicc23486)、枯草芽孢桿菌(cicc10453)、枯草芽孢桿菌(cicc10071)、枯草芽孢桿菌(cicc21095)、地衣芽孢桿菌(cicc20684)、地衣芽孢桿菌(cicc21737)、地衣芽孢桿菌(cicc21738)、熱帶假絲酵母(cicc32831)、釀酒酵母(cicc1832)均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
實(shí)施例1一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑的制備
1、輔料制備：市購豆粕、小麥、玉米按飼料標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測合格后按重量比為6:1:3的比例混合后粉碎，過80目篩，通過滾筒干燥機(jī)高溫(120～150℃)干燥后備用。
2、乳酸菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)培養(yǎng)基制備：雙歧桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖8.0g，吐溫801.0g，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，znso4·7h2o0.25g，mgso4·7h2o0.1g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，雙歧桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
乳酸桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，tween801.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.05g，caco320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph6.8，121℃20分鐘高壓滅菌，乳酸菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
增菌培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80500ml，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌。
(2)乳酸菌菌粉制備：將雙歧桿菌(cicc21717)、嗜酸乳桿菌(cicc6090)、植物乳桿菌(cicc6073)、德氏乳桿菌(cicc20271)以及干酪乳桿菌(cicc23486)在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基以及乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及干酪乳桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基400ml)中，37℃培養(yǎng)8小時(shí)后將所有菌種等體積混合接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基40升增菌培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得乳酸菌菌粉。
3、芽孢桿菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)芽孢桿菌培養(yǎng)基制備：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph7.0，121℃20分鐘高壓滅菌，芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)芽孢桿菌菌粉制備：將枯草芽孢桿菌(cicc10453)、枯草芽孢桿菌(cicc10071)、枯草芽孢桿菌(cicc21095)、地衣芽孢桿菌(cicc20684)、地衣芽孢桿菌(cicc21737)、地衣芽孢桿菌(cicc21738)在芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌分別等體積混合，再將枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌按比例1:2混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升芽孢液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得芽孢桿菌菌粉。
4、酵母菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)酵母菌培養(yǎng)基制備：酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸餾水1.0l，ph6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，酵母菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)酵母菌菌粉制備：將熱帶假絲酵母(cicc32831)、釀酒酵母(cicc1832)在酵母菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于酵母菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將所有菌種按熱帶假絲酵母與釀酒酵母菌等體積混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升酵母菌液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得酵母菌菌粉。
5、發(fā)酵益生菌制備：將上述步驟2、3、4得到的乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按100:5:2的重量比例混合即為發(fā)酵益生菌。
6、酶制劑：中性蛋白酶(5萬單位/g)、酸性蛋白酶(5萬單位/g)、淀粉酶(10萬單位/g)均為購買，按中性蛋白酶：酸性蛋白酶：淀粉酶＝1：2：1的重量比例混合。
7、鹽溶液培養(yǎng)基：將0.5％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.2％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.01％(v/v)的tween80溶液，0.1％(w/w)的k2hpo4溶液，0.2％(w/w)的mgso4·7h2o溶液，0.005％(w/w)的mnso4·h2o溶液等體積混合。
8、將步驟5得到的發(fā)酵益生菌、步驟6得到的酶制劑以及步驟7得到的鹽溶液培養(yǎng)基按照重量比為10：1.5：1混合。
9、將步驟8得到的混合物與步驟1得到的輔料按照重量比9:1混合，即為直投式生物發(fā)酵飼料添加劑，按照每袋2kg分裝。
上述步驟中冷凍干燥所使用的凍干保護(hù)劑為含有18％(w/w)脫脂奶粉、0.5％(w/w/)乳糖的0.5％(v/v)甘油溶液。
制備得到的生物發(fā)酵飼料添加劑中動(dòng)物雙歧桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌總菌數(shù)≧109cfu/g?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。酵母菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。
使用時(shí)在生物發(fā)酵飼料添加劑中加入35-36℃溫水?dāng)嚢杈鶆?每袋2kg加水20kg)，25-37℃發(fā)酵12至18小時(shí)即可使用。
實(shí)施例2一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑的制備
1、輔料制備：市購豆粕、小麥、玉米按飼料標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測合格后按重量比為8:2:3的比例混合后粉碎，過100目篩，通過滾筒干燥機(jī)高溫(120～150℃)干燥后備用。
2、乳酸菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)培養(yǎng)基制備：雙歧桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖8.0g，吐溫801.0g，k2hpo4，瓊脂15.0g，2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，znso4·7h2o0.25g，mgso4·7h2o0.1g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，雙歧桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
乳酸桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，tween801.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.05g，caco320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph6.8，121℃20分鐘高壓滅菌，乳酸菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
增菌培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80500ml，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌。
(2)乳酸菌菌粉制備：將雙歧桿菌(cicc21717)、嗜酸乳桿菌(cicc6090)、植物乳桿菌(cicc6073)、德氏乳桿菌(cicc20271)以及干酪乳桿菌(cicc23486)在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基以及乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及干酪乳桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基400ml)中，37℃培養(yǎng)8小時(shí)后將所有菌種等體積混合接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基40升增菌培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得乳酸菌菌粉。
3、芽孢桿菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)芽孢桿菌培養(yǎng)基制備：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph7.0，121℃20分鐘高壓滅菌，芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)芽孢桿菌菌粉制備：將枯草芽孢桿菌(cicc10453)、枯草芽孢桿菌(cicc10071)、枯草芽孢桿菌(cicc21095)、地衣芽孢桿菌(cicc20684)、地衣芽孢桿菌(cicc21737)、地衣芽孢桿菌(cicc21738)在芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌分別等體積混合，再將枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌按比例1:2混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升芽孢液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得芽孢桿菌菌粉。
4、酵母菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)酵母菌培養(yǎng)基制備：酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸餾水1.0l，ph6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，酵母菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)酵母菌菌粉制備：將熱帶假絲酵母(cicc32831)、釀酒酵母(cicc1832)在酵母菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于酵母菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將熱帶假絲酵母與釀酒酵母菌按等體積混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升酵母菌液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得酵母菌菌粉。
5、發(fā)酵益生菌制備：將上述步驟2、3、4得到的乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按100:3:5的重量比例混合即為發(fā)酵益生菌。
6、酶制劑：中性蛋白酶(5萬單位/g)、酸性蛋白酶(5萬單位/g)、淀粉酶(10萬單位/g)均為購買，按中性蛋白酶：酸性蛋白酶：淀粉酶＝1：1：1的重量比例混合。
7、鹽溶液培養(yǎng)基：將0.7％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.5％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.05％(v/v)的tween80溶液，0.05％(w/w)的k2hpo4溶液，0.1％(w/w)的mgso4·7h2o溶液，0.01％(w/w)的mnso4·h2o溶液等體積混合。
8、將步驟5得到的發(fā)酵益生菌、步驟6得到的酶制劑以及步驟7得到的鹽溶液培養(yǎng)基按照重量比為8：2：1混合。
9、將步驟8得到的混合物與步驟1得到的輔料按照重量比10:1混合，即為直投式生物發(fā)酵飼料添加劑，按照每袋2kg分裝。
上述步驟中冷凍干燥所使用的凍干保護(hù)劑為含有18％(w/w)脫脂奶粉、0.5％(w/w/)乳糖的0.5％(v/v)甘油溶液。
制備得到的生物發(fā)酵飼料添加劑中動(dòng)物雙歧桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌總菌數(shù)≧109cfu/g?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。酵母菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。
使用時(shí)在生物發(fā)酵飼料添加劑中加入35-36℃溫水?dāng)嚢杈鶆?每袋2kg加水20kg)，25-37℃發(fā)酵12至18小時(shí)即可使用。
實(shí)施例3一種直投式生物發(fā)酵飼料添加劑的制備
1、輔料制備：市購豆粕、小麥、玉米按飼料標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測合格后按重量比為5:1:5的比例混合后粉碎，過80目篩，通過滾筒干燥機(jī)高溫(120～150℃)干燥后備用。
2、乳酸菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)培養(yǎng)基制備：雙歧桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖8.0g，吐溫801.0g，k2hpo4，瓊脂15.0g，2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，znso4·7h2o0.25g，mgso4·7h2o0.1g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，雙歧桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
乳酸桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，tween801.0g，k2hpo42.0g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.05g，caco320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph6.8，121℃20分鐘高壓滅菌，乳酸菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
增菌培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80500ml，k2hpo42.0g，乙酸鈉5.0g，蒸餾水定容至1l，ph6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌。
(2)乳酸菌菌粉制備：將雙歧桿菌(cicc21717)、嗜酸乳桿菌(cicc6090)、植物乳桿菌(cicc6073)、德氏乳桿菌(cicc20271)以及干酪乳桿菌(cicc23486)在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基以及乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及干酪乳桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基400ml)中，37℃培養(yǎng)8小時(shí)后將所有菌種等體積混合接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基40升增菌培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得乳酸菌菌粉。
3、芽孢桿菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)芽孢桿菌培養(yǎng)基制備：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0l，ph7.0，121℃20分鐘高壓滅菌，芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)芽孢桿菌菌粉制備：將枯草芽孢桿菌(cicc10453)、枯草芽孢桿菌(cicc10071)、枯草芽孢桿菌(cicc21095)、地衣芽孢桿菌(cicc20684)、地衣芽孢桿菌(cicc21737)、地衣芽孢桿菌(cicc21738)在芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌分別等體積混合，再將枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌按比例1:2混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升芽孢液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得芽孢桿菌菌粉。
4、酵母菌培養(yǎng)基及菌粉制備：
(1)酵母菌培養(yǎng)基制備：酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸餾水1.0l，ph6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，酵母菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
(2)酵母菌菌粉制備：將熱帶假絲酵母(cicc32831)、釀酒酵母(cicc1832)在酵母菌固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后分別接種于酵母菌液體培養(yǎng)基(每個(gè)菌種培養(yǎng)基200ml)中，37℃搖床210rpm培養(yǎng)8小時(shí)后將熱帶假絲酵母與釀酒酵母菌按等體積混合后接種于50升液體發(fā)酵罐內(nèi)(內(nèi)裝培養(yǎng)基30升酵母菌液體培養(yǎng)基，接菌量為體積比1:10)，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，無菌離心，低溫(-50℃)冷凍干燥獲得酵母菌菌粉。
5、發(fā)酵益生菌制備：將上述步驟2、3、4得到的乳酸菌菌粉、芽孢桿菌菌粉以及酵母菌菌粉按100:3:5的重量比例混合即為發(fā)酵益生菌。
6、酶制劑：中性蛋白酶(5萬單位/g)、酸性蛋白酶(5萬單位/g)、淀粉酶(10萬單位/g)均為購買，按中性蛋白酶：酸性蛋白酶：淀粉酶＝1：3：1的重量比例混合。
7、鹽溶液培養(yǎng)基：將0.5％(w/w)的乙酸鈉溶液，0.1％(w/w)的檸檬酸二銨溶液，0.15％(v/v)的tween80溶液，0.15％(w/w)的k2hpo4溶液，0.5％(w/w)的mgso4·7h2o溶液，0.005％(w/w)的mnso4·h2o溶液等體積混合。
8、將步驟5得到的發(fā)酵益生菌、步驟6得到的酶制劑以及步驟7得到的鹽溶液培養(yǎng)基按照重量比為5：2：1混合。
9、將步驟8得到的混合物與步驟1得到的輔料按照重量比8:1混合，即為直投式生物發(fā)酵飼料添加劑，按照每袋2kg分裝。
上述步驟中冷凍干燥所使用的凍干保護(hù)劑為含有18％(w/w)脫脂奶粉、0.5％(w/w/)乳糖的0.5％(v/v)甘油溶液。
制備得到的生物發(fā)酵飼料添加劑中動(dòng)物雙歧桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌總菌數(shù)≧109cfu/g。枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。酵母菌的總菌數(shù)≧2×106cfu/g。
使用時(shí)在生物發(fā)酵飼料添加劑中加入35-36℃溫水?dāng)嚢杈鶆?每袋2kg加水20kg)，25-37℃發(fā)酵12至18小時(shí)即可使用。
實(shí)施例4飼喂本發(fā)明的生物發(fā)酵飼料添加劑對懷孕母豬效果評價(jià)
實(shí)驗(yàn)材料：取直投式生物發(fā)酵飼料添加劑1袋(每袋2kg，實(shí)施例1制備)，加36℃溫水20升(含葡萄糖1％(w/w))，37℃保溫箱12小時(shí)即可使用。
飼喂方法：對懷孕母豬預(yù)產(chǎn)期前30天開始每天飼喂發(fā)酵飼料添加劑100ml，然后通過仔豬生長情況來反應(yīng)添加劑的效果(表1)。
表1懷孕母豬每天飼喂本發(fā)明的生物發(fā)酵飼料添加劑對仔豬生長的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：懷孕母豬每天飼喂本發(fā)明的生物發(fā)酵飼料添加劑100ml可以提高平均產(chǎn)子數(shù)11.7％，平均初生重提高12.86％，仔豬哺乳期平均日增重提高14.01％，平均斷奶重提高12.99％，仔豬腹瀉率下降72.54％，仔豬哺乳期死亡率下降78％。
結(jié)論：從表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，懷孕母豬每天飼喂本發(fā)酵飼料添加劑可以顯著提高母豬產(chǎn)子數(shù)、仔豬初生重、日增重及斷奶重，顯著降低仔豬腹瀉率與死亡率。
實(shí)施例5飼喂本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑對保育豬效果評價(jià)
實(shí)驗(yàn)材料：取直投式生物發(fā)酵飼料添加劑1袋(每袋2kg，實(shí)施例1制備)，加36℃溫水20升(含葡萄糖1％(w/w))放入37℃保溫箱12小時(shí)即可使用。
試驗(yàn)方法：選擇同一批斷奶的仔豬，隨機(jī)分成三組，即添加劑組、發(fā)酵豆粕組和對照組，各自將弱病豬挑出。對照組日糧成分為：60％玉米粉，濃縮料40％(總氮大于33％)，實(shí)驗(yàn)組是在對照組飼料中添加5％(w/w)的本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑，發(fā)酵豆粕組是在對照組飼料中用發(fā)酵豆粕替換飼料中的5％(w/w)的豆粕，每日的6點(diǎn)、10點(diǎn)、14點(diǎn)、17點(diǎn)，四個(gè)時(shí)間不定量加料，保證自由采食卻不浪費(fèi)，每天清理糞便，記錄相應(yīng)的采食量、糞便情況(對照組常規(guī)使用藥物：康泰欣、氟苯尼考粉、強(qiáng)穩(wěn)西、生長素等做預(yù)防，試驗(yàn)組不用藥物)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(每天飼喂本發(fā)酵飼料添加劑對保育豬生長性能的影響)見表2。
表2每天飼喂本發(fā)酵飼料添加劑對保育豬生長性能的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：保育豬每天飼喂含有5％本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑的日糧，平均保育豬日增重實(shí)驗(yàn)組比對照組提高5.23％，比發(fā)酵豆粕組提高4.29％，料肉比實(shí)驗(yàn)組比對照組降低6.98％，比發(fā)酵豆粕組提高5.26％，腹瀉率實(shí)驗(yàn)組比對照組下降72.10％，比發(fā)酵豆粕組下降64.71％，三組平均采食量差異不明顯。
結(jié)論：從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，保育豬每天飼喂本發(fā)酵飼料添加劑可以顯著提高日增重、減低料肉比及腹瀉率。
實(shí)施例6飼喂本生物發(fā)酵飼料添加劑對肉雞生長效果評價(jià)
實(shí)驗(yàn)材料：取直投式生物發(fā)酵飼料添加劑1袋(每袋2kg，實(shí)施例1制備)，加36℃溫水20升(含葡萄糖1％(w/w))放入37℃保溫箱12小時(shí)即可使用。
試驗(yàn)方法：選擇同一批選擇20000只肉雞隨機(jī)分成2組，即實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組飼喂常規(guī)日糧，實(shí)驗(yàn)組是在對照組日糧的基礎(chǔ)上中添加5％(w/w)的本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑，飼喂30天，觀察雞生長情況。結(jié)果如下表3所示。
表3飼喂本生物發(fā)酵飼料添加劑對肉雞生長性能的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肉雞每天飼喂添加5％(w/w)的本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑的日糧，平均每只總重量比對照組提高2.89％，料肉比實(shí)驗(yàn)組比對照組降低4.43％，腹瀉率實(shí)驗(yàn)組比對照組下降69.64％，死亡率實(shí)驗(yàn)組比對照組降低44.51％。
結(jié)論：從表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，肉雞每天飼喂添加5％(w/w)的本發(fā)明生物發(fā)酵飼料添加劑的日糧可以顯著提增重、減低料肉比、腹瀉率及死亡率。
綜上所述，本發(fā)明的生物發(fā)酵飼料添加劑特點(diǎn)是涉及一種提高動(dòng)物免疫力、增強(qiáng)抗病力、改善飼料轉(zhuǎn)化率起到治療及預(yù)防動(dòng)物腸道疾病、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡和抗應(yīng)激能力的生物發(fā)酵飼料添加劑。本發(fā)明通過對生產(chǎn)菌株進(jìn)行組合篩選、完善純化技術(shù)及對生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)代時(shí)嚴(yán)格質(zhì)控，解決了生物發(fā)酵的不穩(wěn)定性問題?，F(xiàn)場發(fā)酵直接應(yīng)用保證了發(fā)酵后產(chǎn)生的所有生物活性物質(zhì)不受任何破壞，同時(shí)也避免了運(yùn)輸、儲(chǔ)存雜菌污染等問題，提高了產(chǎn)品的功效和安全性，大幅度降低了養(yǎng)殖成本，對綠色養(yǎng)殖起到了積極的推動(dòng)作用。