本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種香水蓮花提取物及其組合物在預(yù)防肥胖方面的用途，其預(yù)防肥胖的機理為抑制胰脂肪酶活性、改善腸道菌群。
背景技術(shù)：
：作為一種公共衛(wèi)生問題，肥胖的發(fā)病率隨著人們生活水平與生活方式的改變在全球呈不斷上升趨勢，它已成為危害全人類的慢性非傳染性疾病(non-communicablediseases，ncd)。從營養(yǎng)學(xué)角度看，肥胖是機體營養(yǎng)過剩的表現(xiàn)；從醫(yī)學(xué)角度看，肥胖是脂肪細胞脂肪含量過多或過大的表現(xiàn)。中國把身體指數(shù)(bodymassindex，bmi)超過28的人群定義為肥胖患者，而世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization，who)把bmi超過30的人群定義為肥胖患者。2014年，全球中共有13％的成年人(18周歲以上)患有肥胖癥，而中國從2010年到2014年，成年人的平均肥胖率從5.4％上升到7.3％。who已經(jīng)將它定義為二十一世紀的流行病，并極力倡導(dǎo)人們采取各種方式控制它的進一步發(fā)展。肥胖不僅影響體型與美觀，且與糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、阻塞性睡眠呼吸暫停和骨關(guān)節(jié)炎等疾病息息相關(guān)。它由多種復(fù)雜因素混合導(dǎo)致，包括遺傳、行為、社會、環(huán)境等，但根本原因是能量攝入與消耗的不平衡。2015年，美國內(nèi)分泌學(xué)會發(fā)布了首部《肥胖藥物治療指南》，其中指出，截止2015年fda共批準六種用于治療肥胖的藥物，包括奧利司他、非處方型奧利司他、氯卡色林、芬特明/托吡酯、環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮/安非他酮和利拉魯肽。這些減肥藥主要包括兩大類：1)作用于中樞的減肥藥，用于抑制食欲、增加飽腹感，如氯卡色林；2)作用于外周的減肥藥，用于抑制脂肪代謝相關(guān)酶活性，如奧利司他。胰脂肪酶(pancreaticlipase，ec3.1.1.3)在人體中由pnlip基因編碼，是一種由胰腺分泌，負責(zé)水解50％～70％膳食脂肪的關(guān)鍵生物酶，它能催化甘油三酯分解生成游離脂肪酸、甘油、單酯和二酯，游離脂肪酸經(jīng)小腸上皮細胞吸收，重新合成甘油三酯并運輸?shù)礁髌鞴僦羞M行積累。當胰脂肪酶的代謝失去平衡后，便會產(chǎn)生肥胖及相關(guān)的代謝疾病，因此可以通過調(diào)節(jié)胰脂肪酶的活性來控制膳食脂肪在人體消化道中的分解與吸收，從而起到減肥降脂的作用。奧利司他作為胰脂肪酶抑制劑，是通過抑制胰脂肪酶活性起到減肥作用，是目前市場上美國fda批準使用的唯一一種不是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的減肥藥。然而，奧利司他的一系列胃腸道副作用也逐漸被揭露，包括胃腸排氣增多、脂肪瀉、失禁以及肝臟損傷。因此，天然胰脂肪酶抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用日益成為健康產(chǎn)業(yè)關(guān)注的熱點。腸道不僅是人體重要的消化吸收場所，同時它也是人體最大的免疫器官，為數(shù)以兆計的腸道微生物提供良好的棲息場所。1958年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎獲得者joshualederberg將人體比作“超級生物體”，即人體是由真核細胞和與它們共生的微生物共同組成。研究表明，人體腸道微生物的數(shù)量可以達到1014，是人體細胞數(shù)量的10倍；重量高達2.1kg，接近人體肝臟的重量；包含的編碼基因可以達到330萬個，是人體基因組所含基因數(shù)的150倍。人體腸道微生物大致可分為六大類：厚壁菌門(firmicutes)、擬桿菌門(bacteroidetes)、變形菌門(proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)、疣微菌門(verrucomicrobia)和梭桿菌門(fusobacteria)，其中厚壁菌門與擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門。近十幾年，隨著高通量測序技術(shù)與宏基因組學(xué)的快速發(fā)展，腸道菌群與肥胖的關(guān)系在學(xué)術(shù)界引起了研究狂潮。發(fā)表于《nature》上的一篇文章曾對12名肥胖患者進行膳食限制治療，分別給予碳水化合物限制性飲食與脂肪限制性飲食。在這一年的膳食限制治療中，肥胖患者的體重有不同程度的降低，肥胖癥狀均得到緩解。此外，研究者們對肥胖患者的糞便進行了微生物基因組分析，結(jié)果表明，無論采取何種膳食限制治療手段，患者腸道內(nèi)的擬桿菌門微生物數(shù)量上升、厚壁菌門微生物數(shù)量下降。此后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物可以通過影響腸道微生物的豐度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)起到減肥降脂的作用，包括靈芝多糖、藤茶提取物、藍莓花青素、石榴皮多酚等，其作用機理是增加腸道有益菌的數(shù)量(如乳酸桿菌、雙歧桿菌、akk.菌)，減少腸道有害菌的數(shù)量(如脫硫弧菌)，保護腸道屏障等。香水蓮花(nymphaeahybrid)是睡蓮科(nymphaeaceae)睡蓮屬(nymphaea)熱帶大型睡蓮，2003年，在《中國花舟園藝》雜志中第一次報道問世。從1970年開始，臺灣園林部門在引進美國香蓮的基礎(chǔ)上經(jīng)過多年選育，現(xiàn)己培育金、黃、紅、紫、藍、赤、綠等深淺不同的9種花色品種，故亦稱之為“九品香蓮”。香水蓮花具有較好的耐寒性能，在適宜的溫度下可全年不間斷地開花，花朵碩大、色彩鮮艷、香氣宜人，它集當今全球各種珍貴荷花與蓮花的優(yōu)點于一身，具有觀賞、醫(yī)療、餐飲、美容等作用。新鮮的香水蓮花經(jīng)去除腐爛花、清水沖洗、干燥、冷卻等工藝流程可制作出香水蓮花茶，該茶是天然綠色食品，經(jīng)熱水沖泡后既擁有了茶的清新爽口，又保留了花的馥郁芳香。金敬紅等對香水蓮花安全性進行了測定，小鼠急性經(jīng)口毒性試驗與大鼠長期毒性試驗，發(fā)現(xiàn)實驗老鼠活動、生長、攝食均正常，各類指標測定值均在正常范圍內(nèi)，各類器官病理組織學(xué)檢查均未顯示有異常。香水蓮花是一種無毒無害的天然食用花卉，在食品、保健食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用空間。香水蓮花富含總酚、黃酮、鞣質(zhì)、花色苷、生物堿等次生代謝產(chǎn)物。沈建福等研究表明，香水蓮花醇提物可以清除dpph、·過氧化氫及羥自由基，證實了其具有抗氧化能力，且其抗氧化能力與其總酚含量呈正相關(guān)性，相關(guān)性指數(shù)均大于0.9。車璐等發(fā)現(xiàn)香水蓮花醇提取物對前列腺增生具有良好的改善作用，其作用表現(xiàn)為大鼠前列腺的5α-還原酶與前列腺酸性磷酸酶活性顯著降低(p<0.05)，同時血清丙二醛含量顯著減低(p<0.05)，大鼠血清內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增加(p<0.05)。孫玉潔采用小鼠b16黑素瘤細胞模型發(fā)現(xiàn)60％乙醇提取物能有效抑制黑素瘤細胞增殖，減少黑素合成，在100μg/ml濃度下，細胞增殖率分別下降到84.44±1.77％、48.24±3.14％，相對黑素含量減少了30.31％和33.02％，且能有效抑制細胞內(nèi)酪氨酸酶活性，表明60％醇提物具有較好的美白作用。此外孫玉潔采用體外保濕實驗與人體實驗，均表明香水蓮花的水提物以及子房提取物具有較好的保濕作用。而有關(guān)香水蓮花提取物抑制胰脂肪酶、預(yù)防肥胖、改善腸道菌群功效的研究卻無人報道。荷葉提取物富含荷葉生物堿、荷葉黃酮等次生代謝產(chǎn)物，具有利尿通便、通腸毒、降脂清暑解熱等生物學(xué)功效。綠茶提取物富含茶多酚、咖啡堿等次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤、殺菌解毒、提高機體免疫力等生物學(xué)功效。決明子提取物富含大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、決明素、鈍葉決明素等次生代謝產(chǎn)物，具有清熱明目、潤腸通便等生物學(xué)功效。葡萄籽提取物富含原花青素，具有抗氧化、降低血管粥樣硬化、預(yù)防癌癥、消炎等生物學(xué)功效。荷葉提取物、綠茶提取物、決明子提取物、葡萄籽提取物在健康食品的開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種香水蓮花提取物及其組合物的用途，用于制備具有預(yù)防肥胖的食品、保健食品及藥品。本發(fā)明制備的香水蓮花及其組合物是通過抑制胰脂肪酶活性，增加腸道微生物豐度、多樣性以及改善腸道菌群結(jié)構(gòu)起到預(yù)防肥胖的作用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種香水蓮花提取物及其組合物的用途：用于制備抑制胰脂肪酶活性、改善腸道菌群的食品、保健食品、藥品。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的改進：用于制備預(yù)防肥胖或減肥降脂的食品、保健食品、藥品。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的進一步改進：所述預(yù)防肥胖或減肥降脂包括抑制胰脂肪酶活性、改善體重、調(diào)節(jié)血脂以及改善腸道菌群。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的進一步改進：改善腸道菌群包括增加腸道微生物豐度、多樣性、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的進一步改進：香水蓮花提取物組合物由香水蓮花提取物以及荷葉提取物、綠茶提取物、決明子提取物、葡萄籽提取物中的至少一種組合而成，香水蓮花提取物在組合物中的重量含量為≥20％。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的進一步改進：香水蓮花提取物、香水蓮花提取物組合物由20～100％香水蓮花提取物、0～50％荷葉提取物、0～50％綠茶提取物、0～50％決明子提取物、0～50％葡萄籽提取物組成。作為本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物的用途的進一步改進：香水蓮花提取物組合物由香水蓮花提取物30％、荷葉提取物25％、綠茶提取物15％、決明子提取物15％、葡萄籽提取物15％組成。上述％為質(zhì)量％。本發(fā)明提供的一種預(yù)防肥胖及改善腸道菌群的物質(zhì)或組合，可以是香水蓮花提取物或香水蓮花提取物與荷葉提取物、綠茶提取物、決明子提取物、葡萄籽提取物等其中的一種或幾種科學(xué)配比。本發(fā)明中，可以直接使用香水蓮花提取物及其組合物，也可以將該提取物或組合物與其他藥學(xué)上可接受的輔料混合制成各種劑型。在本發(fā)明中：香水蓮花提取物可按照專利《香水蓮花或香水蓮花制品的用途》(專利號：201310059820.3)進行制備；其余成分均能通過市購的方式獲得，荷葉提取物的荷葉堿含量為2％～4％，綠茶提取物的茶多酚含量為95％～98％，決明子提取物的總蒽醌含量為1％～5％，葡萄籽提取物的原花青素含量為95％～98％。本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢：香水蓮花提取物是一種植物來源、安全有效的天然產(chǎn)物，其富含多酚、黃酮、鞣質(zhì)、花色苷、生物堿等次生代謝產(chǎn)物。香水蓮花提取物單獨使用或與其他天然產(chǎn)物復(fù)配，能有效抑制胰脂肪酶的活性、控制高脂動物體重、降低血脂、改善肝臟氧化應(yīng)激、緩解脂肪組織慢性炎癥及改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。本發(fā)明對香水蓮花提取物及其組合物在制胰脂肪酶、預(yù)防肥胖及改善腸道菌群方面的作用進行了系統(tǒng)的研究，表明其具有抑制胰脂肪酶活性、預(yù)防肥胖、改善肝臟氧化應(yīng)激、緩解脂肪組織慢性炎癥的作用，且能改善高脂膳食動物(例如小鼠)腸道微生物的豐度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)。綜上所述，可將該香水蓮花提取物單獨或者復(fù)配制備成保健食品或者藥品，用于預(yù)防肥胖及改善腸道菌群，在保健食品或藥品領(lǐng)域具有廣泛的前景。由于香水蓮花提取物的成本較高，本發(fā)明將香水蓮花提取物與其他提取物復(fù)配是為了在降低成本的前提下，仍然保留香水蓮花提取物的功效，并且能使其效果更加顯著。研究表明，預(yù)防肥胖的機理有很多，比如抑制胰脂肪酶活性、抑制脂肪合成酶的活性、抑制食欲、改善腸道菌群等等。胰脂肪酶抑制劑可以預(yù)防肥胖，但具有預(yù)防肥胖的物質(zhì)不一定能抑制胰脂肪酶活性。本發(fā)明中香水蓮花提取物及其組合物能抑制胰脂肪酶的活性，可以減少膳食脂肪的吸收量，增加膳食脂肪的排出量(通過糞便排出)，因而必然可以起到預(yù)防肥胖的作用。在腸道中，優(yōu)勢菌門為厚壁菌門與擬桿菌門，這兩種菌門在腸道微生物中所占的比值與肥胖一定的關(guān)系。研究表明，厚壁菌門所占比例越大，擬桿菌門所占比例越小，機體體重越大。此外，一些腸道重要的微生物也與肥胖相關(guān)，比如akk.(akkermansiamuciniphila)與脫硫弧菌(desulfovibrio)。研究表明，將akk.菌移植到肥胖小鼠的腸道內(nèi)，小鼠的肥胖癥狀得到改善。脫硫弧菌是革蘭氏陰性菌，它能分泌內(nèi)毒素，使機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致機體非正常肥胖。在本發(fā)明中，香水蓮花提取物及其組合物能減少厚壁菌門微生物的數(shù)量，增加擬桿菌門微生物的數(shù)量，減少有益菌akk.菌的數(shù)量，增加有害菌脫硫弧菌的數(shù)量，引起起到預(yù)防肥胖的作用。降血脂是指減少機體血液中甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白的含量，增加高密度脂蛋白的含量；胰脂肪酶抑制劑，通過抑制生物體內(nèi)胰脂肪酶的活性，減少機體對飲食中油脂的分解和吸收，達到預(yù)防肥胖的作用。一般而言，具有抗氧化作用的天然產(chǎn)物在動物實驗中均具有降血脂的作用，但不一定有抑制胰脂肪酶活性。胰脂肪酶抑制劑在動物試驗中，可以下調(diào)體重，通常同時具有降血脂的作用。本發(fā)明中，香水蓮花提取物及其組合物能通過抑制胰脂肪酶的活性，減少膳食脂肪被機體吸收，因此同時可以起到降低血脂含量，減少機體體重的作用。本發(fā)明在研究過程中將荷葉提取物、綠茶提取物、決明子提取物、葡萄籽提取物與香水蓮花提取物配伍，獲得性價比較高的具有抑制胰脂肪酶、預(yù)防肥胖、改善腸道菌群功效的組合物。本發(fā)明的香水蓮花提取物及其組合物用熱水沖泡食用，或添加至其他食物中食用，或灌至空膠囊中食用，每日食用量0.5～2.5g。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1為pcr擴增結(jié)果鑒定膠圖；m、1、2、3、4、5、ck分別為腸道微生物dna的泳道代號。其中m為pcrmarker的泳道代號，1-5分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、實驗組1、實驗組2小鼠腸道微生物dna的泳道代號，ck為空白對照組的泳道代號。圖2為香水蓮花提取物及其組合物對高脂膳食小鼠體重的影響對比圖；**代表p<0.01，***代表p<0.001。圖3為香水蓮花提取物及其組合物對高脂膳食小鼠腸道微生物的影響圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。香水蓮花提取物可按照專利《香水蓮花或香水蓮花制品的用途》(專利號：201310059820.3)進行制備；即，具體如下，香蓮提取物的制備方法為以下任意一種：a、以香水蓮花的鮮花為原料，將香水蓮花的鮮花粉碎，加入提取劑回流或超聲提取0.5～3h，減壓抽濾，得到香蓮提取物溶液；料液比為：2～10ml的提取劑/g的香水蓮花的鮮花；b、以香水蓮花的干花為原料，將香水蓮花的干花粉碎，加入提取劑回流提取0.5～3h，減壓抽濾，得到香蓮提取物溶液；料液比為：10～30ml的提取劑/g的香水蓮花的干花；所述提取劑為水、乙醇水溶液或乙醇。下述％均為重量％，實施例中所述香水蓮花提取物總酚含量為32.0％、總黃酮含量為11.5％，荷葉提取物荷葉堿含量2.0％，綠茶提取物茶多酚含量為98.0％，決明子提取物總蒽醌含量為2.0％，葡萄籽提取物原花青素含量為95.0％。實施例1本發(fā)明中單獨使用香水蓮花提取物，具有抑制胰脂肪酶活性、預(yù)防肥胖及改善腸道菌群功效。實施例2本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物65％、綠茶提取物35％。實施例3本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物65％、荷葉提取物35％。實施例4本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物50％、荷葉提取物25％、葡萄籽提取物25％。實施例5本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物50％、決明子提取物15％、葡萄籽提取物35％。實施例6本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物50％、綠茶提取物35％、荷葉提取物15％。實施例7本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性及預(yù)防肥胖功效的組合物配方為：香水蓮花提取物35％、荷葉提取物25％、綠茶提取物25％、葡萄籽提取物15％。實施例8本發(fā)明中具有抑制胰脂肪酶活性、預(yù)防肥胖及改善腸道菌群功效的組合物配方為：香水蓮花提取物30％、荷葉提取物25％、綠茶提取物15％、決明子提取物15％、葡萄籽提取物15％。對本發(fā)明所得的香水蓮花提取物及其組合物進行了如下的檢測實驗：實驗1、香水蓮花提取物對胰脂肪酶活性的抑制作用1.1實驗方法配制濃度為1μmol/ml、2μmol/ml、3μmol/ml、4μmol/ml、5μmol/ml的油酸/苯溶液，分別取4ml于錐形瓶中，加1ml5％醋酸銅溶液(用吡啶調(diào)節(jié)至ph＝6.1)，磁力攪拌3分鐘后，離心取上層有機相在710nm下測定吸光度，得脂肪酸吸光度工作曲線y＝0.142x+0.022(r2＝0.999；式中x為油酸濃度，μmol/ml；y為吸光值)。取3ml50mmol/l磷酸鹽緩沖液(ph按需配置)和1ml橄欖油于25ml錐形瓶中，預(yù)熱5分鐘。然后向錐形瓶中加入0.1ml0.20mg/ml胰脂肪酶酶溶液分別與0.5ml濃度為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的香水蓮花提取物，37℃下水浴震蕩10min，立即加8ml苯，繼續(xù)震蕩2分鐘，終止反應(yīng)。將溶液轉(zhuǎn)移至離心試管中，在4000r/min下離心10分鐘，取上層有機相4ml于錐形瓶中，之后重復(fù)上述方法測定有機相在710nm波長下的吸光度。胰脂肪酶的活性以反應(yīng)液每分鐘每毫升體積釋放的油酸分子數(shù)(μmol)來表達。香水蓮花提取物對胰脂肪酶活性的抑制率按照以下公式進行計算抑制率/％＝(u1-u2)/u1×100式中u1、u2分別代表在不添加香水蓮花提取物與添加香水蓮花提取物情況下胰脂肪酶的活性。1.2胰脂肪酶抑制劑胰脂肪酶活性抑制的結(jié)果按照1.1方法測定實施例1～8中不同濃度香水蓮花提取物、含香水蓮花提取物組合物及奧利司他對胰脂肪酶的抑制作用，測定結(jié)果用半抑制濃度(ic50)表示(表1)。當ic50越低，則該抑制劑對胰脂肪酶的抑制作用越強；反之，則越弱。表1、香水蓮花提取物、含香水蓮花提取物組合物及奧利司他對胰脂肪酶活性的半抑制濃度(ic50)抑制劑ic50(mg/ml)實施例14.02±0.36實施例24.26±0.24實施例34.67±0.41實施例45.03±0.35實施例55.32±0.39實施例64.14±0.31實施例74.18±0.29實施例83.81±0.31奧利司他0.21±0.08結(jié)果顯示：實施例1～8中的香水蓮花提取物及其組合物對胰脂肪酶有較強的抑制作用，其中實施例1、實施例8作用效果較為突出。實驗2、香水蓮花提取物及其組合物對小鼠高脂膳食誘導(dǎo)肥胖的預(yù)防作用2.1實驗方法2.1.1動物分組飼養(yǎng)50只鼠齡為8-9周的c57bl/6雄性小鼠在溫度為22±2℃，濕度為30-70％的動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為5組，每組10只，其中正常對照組小鼠喂養(yǎng)10kcal％低脂飼料，其余4組小鼠(模型對照組、陽性對照組、實施組1、實驗組2)喂養(yǎng)60kcal％高脂飼料。在飼養(yǎng)同時，各組小鼠均采用灌胃方式給予樣品，灌胃樣品由0.5％羧甲基纖維素鈉溶液配置而成，具體飼養(yǎng)與灌胃情況見表2。飼養(yǎng)期間每周稱一次體重，實驗結(jié)束前48小時取新鮮糞便，冷凍保存。8周后各組小鼠禁食12h，稱重，摘眼球采血，隨即頸椎脫臼處死，取腎周及睪丸周圍脂肪、肝臟、脾臟、胰腺，稱重記錄并冷凍。表2、小鼠預(yù)防肥胖模型的試驗分組注：lfd為10kcal％低脂飼料；hfd為60kcal％高脂飼料。2.1.2指標測定2.1.2.1血清、糞便中脂類含量的測定血清中脂類含量的測定：小鼠血液3000r/min離心15分鐘，分離血清，按照試劑盒方法測定tg、tc含量。糞便中脂類含量的測定：用氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)充分萃取小鼠糞便中的脂類后，5000r/min離心15分鐘，取澄清液，離心濃縮儀蒸發(fā)有機試劑，用4倍糞便重量的異丙醇復(fù)溶后，按照試劑盒方法測定甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)含量。2.1.2.2胰腺中胰脂肪酶活性的測定將胰腺剪碎，加入4倍重量預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.01mol/l，ph為7.4)，高速勻漿1min，3000r/min離心20min，取上清液，按照試劑盒方法測定胰脂肪酶的活性。2.1.2.3肝臟中抗氧化水平的測定將肝臟剪碎，加入4倍重量預(yù)冷的生理鹽水，高速勻漿1min，3000r/min離心20min，取上清液，按照試劑盒方法測定谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、蛋白質(zhì)含量。2.1.2.4脂肪組織中炎癥因子的測定將附睪脂肪組織剪碎，加入4倍重量預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.01mol/l，ph為7.4)，高速勻漿1min，5000r/min離心10min，取上清液，按照試劑盒方法測定腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白細胞介素-6(il-6)、單核細胞趨化因子-1(mcp-1)含量。2.2實驗結(jié)果2.2.1香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠體重、臟器、攝食的影響研究表明，高脂膳食會引起機體體重的增加、器官脂肪的積累、攝食量的減少。香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠體重、臟器、攝食量的影響見圖2和表3(圖2為8周飼養(yǎng)過程中小鼠體重的變化)。在未灌胃之前，各組小鼠的體重?zé)o差異，8周后，模型對照組顯著高于正常對照組(p<0.05)，說明造模成功。陽性對照組、實驗組1、實驗組2的小鼠體重顯著低于模型對照組(p<0.05)，表明香水蓮花提取物及其組合物能有效地控制小鼠的體重，但控制的效果略低于陽性對照組。同時香水蓮花提取物及其組合物能顯著降低小鼠附睪周圍脂肪、腎周圍脂肪、肝臟的重量(p<0.05)。此外，與正常對照組相比，高脂飼料會影響小鼠的攝食量(p<0.05)，但其每日能量攝入量卻沒有顯著差異。表3、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠體重、攝食、臟器的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。2.2.2香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠血清、糞便脂類含量的影響在體內(nèi)，攝入的脂類一部分被腸道消化吸收，還有一部分則隨著消化道排除體外，而肥胖會導(dǎo)致血脂水平的升高。香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠血清、糞便脂類含量的影響見表4、表5。實驗結(jié)果表明，香水蓮花提取物及其組合物均能顯著地降低小鼠血清中tg、tc含量(p<0.05)。此外，香水蓮花提取物及其組合物可降低ldl-c含量、提高hdl-c含量，但作用效果不顯著。在糞便中，實驗組1(香水蓮花提取物)、實驗組2(含香水蓮花提取物的組合物)小鼠糞便脂類含量、tg含量均顯著高于模型對照組(p<0.05)，但與陽性對照(奧利司他)組存在顯著差異(p<0.05)，而實驗組1、實驗組2及陽性對照組均不會改變糞便tc的含量。表4、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠血清中脂類含量的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。表5、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠糞便中脂類含量的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。2.2.3香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠胰脂肪酶活性的影響胰脂肪酶由胰腺分泌，它是一種影響膳食脂肪消化吸收的關(guān)鍵酶，其中在膳食脂肪中50～70％的甘油三酯都由它負責(zé)水解。香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠胰脂肪酶活性的影響見表6。與正常對照組比較，高脂膳食組(模型對照組、陽性對照組、實驗組1、實驗組2)小鼠胰腺中胰脂肪酶活性(p<0.01)極顯著增強。而陽性對照組、實驗組1、實驗組2較模型對照組可極顯著降低小鼠胰脂肪酶活性，下降程度分別為41.00％，27.82％、29.70％(p<0.01)。表6、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠胰脂肪酶相對活性的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在極顯著差異(p<0.01)。2.2.4香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠肝臟抗氧化水平的影響在正常情況下，人體的抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，各種疾病都會引起機體的氧化水平與抗氧化水平之間的失衡。前人研究表明，肥胖會導(dǎo)致抗氧化水平的降低。香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠肝臟抗氧化水平的影響見表7。模型對照組小鼠肝臟gsh-px活性、sod活性均顯著低于正常對照組(p<0.05)，mda含量顯著高于正常對照組(p<0.05)。而相比于模型對照組小鼠，香水蓮花提取物及其組合物均能顯著增強高脂膳食小鼠肝臟sod活性(p<0.05)，顯著降低肝臟mda含量(p<0.05)，提高肝臟抗氧化能力。然而奧利司他、香水蓮花提取物及其組合物對小鼠肝臟gsh-px活性有增強趨勢，但均無顯著效果。表7、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠肝臟抗氧化水平的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。2.2.5香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠脂肪組織慢性炎癥的影響脂肪組織是一個能分泌眾多脂肪細胞因子的內(nèi)分泌器官，因此研究脂肪組織中慢性炎癥因子的分泌水平能在一定程度上反映出機體慢性炎癥的程度。同時，脂肪組織的慢性炎癥是聯(lián)系肥胖與其他疾病(如二型糖尿病、動脈粥樣硬化、脂肪肝等)的關(guān)鍵因素。肥胖能提高脂肪組織促炎癥因子的分泌水平，如tnf-α、il-6、mcp-1，而這些促炎癥因子能導(dǎo)致器官非正常的脂肪積累，如肝臟、骨骼肌、胰腺等，最終影響這些器官的正常運作。脂肪組織是一個能分泌眾多脂肪細胞因子的內(nèi)分泌器官，因此研究脂肪組織中慢性炎癥因子的分泌水平能在一定程度上反映出機體慢性炎癥的程度。香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠脂肪組織慢性炎癥水平的影響見表8。由表可知，高脂膳食會導(dǎo)致小鼠脂肪組織炎癥因子tnf-α、il-6、mcp-1含量的顯著增加(p<0.01)，而相比于模型對照組，奧利司他、香水蓮花提取物及其組合物均能極顯著地降低上述炎癥因子水平(p<0.01)。實驗條件下香水蓮花提取物及其組合物的作用與奧利司他的作用效果相當。表8、香水蓮花提取物及其組合物對實驗小鼠脂肪組織炎癥水平的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在極顯著差異(p<0.01)。實驗3、香水蓮花提取物對高脂膳食小鼠腸道菌群的影響3.1實驗方法3.3.1實驗動物腸道內(nèi)容物取樣按照2.1.1方法飼養(yǎng)實驗小鼠，在第8周將其頸椎脫臼處死，每組隨機取5只，開腹取結(jié)腸內(nèi)容物混合于保存管中，于-80℃冰箱中冷凍保存。3.3.2illuminape250測序illuminape250測序的實驗流程為基因組dna提取、設(shè)計并合成引物接頭、pcr擴增、pcr產(chǎn)物定量和均一化、illuminape250文庫制備、illuminape250高通量測序。3.3.2.1腸道微生物dna提取取混合均勻的糞便，使用糞便dna提取試劑盒，按照說明書方法進行糞便dna提取。dna提取步驟為細胞壁與細胞膜的裂解、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除、dna的沉淀與純化。3.3.2.2引物設(shè)計與pcr擴增引物設(shè)計如表9所示。表9、pcr擴增引物的設(shè)計pcr采用transstartfastpfudnapolymerase，20μl反應(yīng)體系：5×fastpfubuffer4μl，2.5mmdntps2μl，forwardprimer(5μm)0.8μl，reverseprimer(5μm)0.8μl，fastpfupolymerase0.4μl，templatedna10ng，添加ddh2o至20μl。pcr反應(yīng)參數(shù)如下：a.1×(5minutesat95℃)；b.27×(30secondsat95℃，30secondsat55℃，45secondsat72℃)；c.10minutesat72℃，10℃untilhaltedbyuser。全部樣本按照以上實驗條件進行，每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的pcr產(chǎn)物混合后用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用axyprepdna凝膠回收試劑盒切膠回收pcr產(chǎn)物，tris-hcl洗脫，2％瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將pcr產(chǎn)物用quantifluortm-st藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。3.3.2.3illuminape250文庫構(gòu)建illuminape250文庫構(gòu)建的步驟包括1)連接“y”字形接頭；2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3)利用pcr擴增進行文庫模板的富集；4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈dna片段。3.3.2.4illuminape250測序illuminape250測序的步驟包括(1)dna片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；(2)另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋(bridge)”；(3)pcr擴增，產(chǎn)生dna簇；(4)dna擴增子線性化成為單鏈；(5)加入改造過的dna聚合酶和帶有4種熒光標記的dntp，每次循環(huán)只合成一個堿基；(6)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；(7)將“熒光基團”和“終止基團”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；(8)統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板dna片段的序列。3.2實驗結(jié)果3.2.1pcr擴增結(jié)果小鼠腸道微生物dna的pcr擴增結(jié)果鑒定圖見圖1，結(jié)果表明pcr產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可進行后續(xù)實驗。3.2.2香水蓮花提取物及其組合物對腸道微生物多樣性的影響樣本多樣性分析(alpha-diversity)可以反映腸道微生物的豐度與多樣性。其中otu(operationaltaxonomicunits，操作分類單位)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)中，人們根據(jù)某一個分類水平設(shè)置的標志，在本實驗中把有效序列相似性在97％以上的歸為1個otu；chao與ace是反映腸道微生物豐度的指數(shù)，chao值與ace值越大，說明腸道微生物豐度越高；shannon(香農(nóng)指數(shù))與simpson(辛普森指數(shù))是反映腸道微生物多樣性的指數(shù)，shannon數(shù)值越大，說明腸道微生物多樣性越高，而simpson數(shù)值越大，說明腸道微生物多樣性越低；coverage(測序覆蓋度)則是反映測序深度的指數(shù)，其數(shù)值越大，說明越能反映腸道微生物的真實情況。高脂膳食小鼠在食用香水蓮花提取物及其組合物后腸道微生物豐度與多樣性的變化情況見表10。在本次實驗中，各組coverage值均大于0.99，表示本次實驗?zāi)芊从承∈竽c道微生物的真實情況。由ace值與chao值可知，高脂膳食會導(dǎo)致小鼠腸道微生物豐度降低，而香水蓮花提取物及其組合物均使高脂膳食小鼠腸道微生物豐度升高。由shannon值與simpson值可知，高脂膳食會導(dǎo)致小鼠腸道微生物多樣性減少，而香水蓮花提取物及其組合物均使高脂膳食小鼠腸道微生物多樣性增加。此外，orlistat雖能使高脂膳食小鼠體重下降，卻嚴重導(dǎo)致高脂膳食小鼠腸道微生物豐度與多樣性的降低。表10、腸道微生物多樣性指數(shù)3.2.3香水蓮花提取物及其組合物對腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的影響厚壁菌門(firmicutes)與擬桿菌門(bacteroidetes)的比值(f/b值)與肥胖有著密切的關(guān)系，f/b值與個體體重呈正相關(guān)。腸道內(nèi)各菌門在腸道微生物中所占比例以及厚壁菌門與擬桿菌門比值(f/b值)的變化情況見表11、圖3。從菌群結(jié)構(gòu)中可知，每組小鼠腸道內(nèi)包含的主要腸道微生物菌門均為厚壁菌門(firmicutes)、擬桿菌門(bacteroidetes)、變形菌門(proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)、脫鐵桿菌門(deferribacteres)和疣微菌門(verrucomicrobia)，其中優(yōu)勢菌群均為firmicutes與bacteroidetes，這與前人報道一致。然而五組小鼠腸道微生物菌群在門分類水平上的比例分布有較大的差異。相比于正常對照組，高脂膳食能使f/b值增加6倍。而相對模型性對照組，香水蓮花提取物及其組合物能減小f/b值。因此，推測香水蓮花提取物及其組合物能通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)來起到減肥降脂作用。此外，西藥奧利司他嚴重擾亂了小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，它導(dǎo)致陽性對照組小鼠腸道內(nèi)放線菌門微生物數(shù)量猛增，其比例高達11.00％(正常對照組為2.75％)；變形菌門微生物數(shù)量提高，可達到4.49％(正常對照組為0.54％)。前人研究表明克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等腸道疾病患者微生物多樣性降低，放線菌門與變形菌門微生物增多。雖然在抑制胰脂肪酶活性與控制體重方面，奧利司他的作用效果強于香水蓮花提取物及其組合物，但是奧利司他卻嚴重降低機體腸道菌群的豐度、多樣性以及紊亂腸道菌群結(jié)構(gòu)，進而使機體產(chǎn)生胃腸道疾病。因此香水蓮花提取物及其組合物的安全性遠高于西藥奧利司他。表11、香水蓮花提取物及其組合物對腸道微生物菌群分布(門分類水平)的影響天然產(chǎn)物能通過改變腸道微生物的菌群構(gòu)成(包括腸道有益菌與腸道有害菌)對健康產(chǎn)生積極作用。香水蓮花提取物及其組合物對幾種常見腸道有益菌及有害菌的影響見表12，其中乳酸桿菌(lactobacillus)、雙歧桿菌(bifidobacterium)、akk.(akkermansiamuciniphila)是腸道益生菌，脫硫弧菌(desulfovibrio)是腸道有害菌。乳酸桿菌(lactobacillus)是腸道益生菌，因能發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸得名，它能通過釋放抗菌物質(zhì)(乳酸、過氧化氫、細菌素)，競爭黏附位點、競爭營養(yǎng)物質(zhì)，誘導(dǎo)黏液素分泌、保護上皮細胞，調(diào)控腸道免疫功能來改善宿主健康。雙歧桿菌(bifidobacterium)是人體腸道內(nèi)重要的益生菌，它不產(chǎn)生內(nèi)毒素、治病物質(zhì)以及有害氣體，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低膽固醇、抗腫瘤、延遲集體衰老等作用。akkermansiamuciniphila是腸道益生菌，它寄居在宿主腸道粘液層并能降解黏蛋白。前人研究發(fā)現(xiàn)該菌能使肥胖小鼠在不改變膳食的前提下，改善小鼠代謝紊亂狀況，包括減少脂肪量，代謝內(nèi)毒素及改善脂肪組織炎癥與胰島素抵抗等。脫硫弧菌(desulfovibrio)是腸道有害菌，它能在宿主體內(nèi)代謝硫酸鹽產(chǎn)生硫化氫，過量的硫化氫會使腸上皮粘膜受到損害，且它能產(chǎn)生內(nèi)毒素造成機體炎癥反應(yīng)，而機體炎癥與肥胖有極大的相關(guān)性。相對于正常對照組，高脂膳食導(dǎo)致小鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量減少，akk.菌無法檢出，脫硫弧菌數(shù)量增多。而相對于模型對照組，香水蓮花提取物及其組合物能提高高脂膳食小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌、akk.菌數(shù)量，減少脫硫弧菌數(shù)量，但對雙歧桿菌數(shù)量作用不大。表12、香水蓮花提取物及其組合物對幾種常見腸道有益菌及有害菌的影響結(jié)論：香水蓮花提取物及其組合物具有抑制胰脂肪酶、預(yù)防肥胖、改善肝臟氧化應(yīng)激、緩解脂肪組織慢性炎癥的作用，且能改善高脂膳食小鼠腸道微生物的豐度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)，而此處香水蓮花提取物抑制胰脂肪酶活性功效、改善腸道菌群功效與它的預(yù)防肥胖功效有一定的關(guān)系。實驗4、將如下表13所述配方的組合物設(shè)置成相應(yīng)的實驗組，按照上述實驗2、實驗3所述方法進行實驗。表13、香水蓮花提取物組合物配方主要實驗性能數(shù)據(jù)如表14、表15、表16所顯示。結(jié)果表明，香水蓮花組合物a、b、c、d均能表現(xiàn)出控制體重增長、抑制胰腺中胰脂肪酶活性、改善腸道菌群的功效，但作用效果不如實施例8的配方(香水蓮花提取物30％、荷葉提取物25％、綠茶提取物15％、決明子提取物15％、葡萄籽提取物15％)。表14、香水蓮花提取物組合物對實驗小鼠體重的影響指標abcd初體重(g)21.65±0.63a21.24±0.46a22.01±0.44a21.73±0.64a終體重(g)40.68±1.49b37.82±1.68a38.71±1.03ab37.91±1.72a注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。表15、香水蓮花提取物組合物對實驗小鼠胰脂肪酶相對活性的影響注：結(jié)果表示為平均值±標準差，n＝10；同一行兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(p<0.05)。表16、香水蓮花提取物組合物對腸道微生物菌群f/b的影響指標abcdf/b1.230.860.890.75最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是發(fā)明的保護范圍。<110>浙江蕓麒龍祥生物技術(shù)有限公司<120>香水蓮花提取物及其組合物在預(yù)防肥胖、改善腸道菌群方面的用途<160>1<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物515f<400>1gtgccagcmgccgcgg16當前第1頁12