本發(fā)明涉及一種復(fù)合植物水提物及其在飼料及動(dòng)物保健產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及一種新型含石榴皮復(fù)合植物提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：飼用抗生素曾對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了不可磨滅的貢獻(xiàn)，但其耐藥性和藥物殘留等問題也日益凸顯?？股乇唤煤?，抗生素替代品的研究也就理所當(dāng)然成為養(yǎng)殖業(yè)內(nèi)首要解決的問題。植物提取物因富含蛋白、糖苷和酚酸等多種活性成分，兼具抑菌、抗氧化、抗應(yīng)激、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功能，且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題，成為抗生素替代品的研究熱點(diǎn)。但目前所研究的提取物大多是從單種植物原料中提取，因此往往存在生物活性成分含量較低、功能單一、效果不顯著等問題。而對(duì)于復(fù)合提取物而言，又存在復(fù)方科學(xué)性不強(qiáng)、添加量過高、成本昂貴等缺陷。因此，若能篩選出具有多種功能、且性價(jià)比較高的復(fù)合植物提取物用于替代仔豬飼用抗生素，無疑可解決畜牧養(yǎng)殖業(yè)的一大難題。申請(qǐng)人前期研制的復(fù)方植物提取物在斷奶仔豬上具有較好促生長及替代飼用抗生素效果，但因價(jià)格昂貴、添加量大等問題，限制了它的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種復(fù)合植物水提物，用于替代飼用抗生素，最終實(shí)現(xiàn)“環(huán)保、無毒、安全和綠色”的養(yǎng)殖目標(biāo)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的復(fù)合植物水提物的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)易，成本低。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的復(fù)合植物水提物的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：一種新型含石榴皮復(fù)合植物提取物，該植物水提物按質(zhì)量百分比計(jì)由以下的組分的植物原料提取制得：石榴皮2.94％檸檬38.24％桂枝26.47％青蒿17.54％厚樸14.71%。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：上述的復(fù)合植物水提物的方法，該方法包括以下的步驟：1）將植物原料研磨粉碎、混合，按料水比1：20放入提取設(shè)備槽內(nèi)，升溫至80℃，提取6h后轉(zhuǎn)至濃縮槽內(nèi)，在0.085mpa、60℃條件下濃縮比重至1.25；2）將濃縮產(chǎn)物轉(zhuǎn)至噴霧干燥設(shè)備，在進(jìn)風(fēng)溫度150℃、空氣流量500l/h、進(jìn)料量20％條件下對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥。為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：上述的復(fù)合植物水提物用于制備代替抗生素的動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種動(dòng)物飼料添加劑，動(dòng)物飼料添加劑包所述的復(fù)合植物水提物。本發(fā)明還提供了一種動(dòng)物飼料，動(dòng)物飼料包括權(quán)所述的復(fù)合植物水提物。綜上所述，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：（1）為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的首要目的，首先摸索建立了一套適用于提取植物多種活性成分的簡(jiǎn)易工藝參數(shù)：料水比1：20、80℃提取6h后，在60℃下濃縮提取液比重至1.25，再進(jìn)行噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度150℃、空氣流量500l/h、進(jìn)料量20％)。（2）然后以體外抗炎、抑菌和抗氧化能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步從23種植物原料中篩選出復(fù)合植物提取物的原料組成：石榴皮、厚樸、桂枝、青蒿和檸檬。原來配方原料為：石榴皮、艾葉、南五味子和吳茱萸。（3）進(jìn)一步通過正交組合實(shí)驗(yàn)明確復(fù)合植物提取物的配方（石榴皮1g，桂枝9g，青蒿6g，厚樸5g和檸檬13g）及驗(yàn)證其抑菌功能（mic為125mg/ml）抗炎(ic50為0.434mg/ml)和抗氧化能力(ic50為0.31mg/ml)。原來配方（石榴皮1g，艾葉3g，南五味子9g和吳茱萸9g）及驗(yàn)證其抑菌功能（mic為250mg/ml）和抗氧化能力(ic50為6.46mg/ml)，未檢測(cè)其抗炎活性。（4）分別給小鼠連續(xù)灌胃125、250、500、1000mg/kg·bw-1劑量的復(fù)方提取物21天，小鼠精神狀態(tài)良好，毛色光亮、未見異常死亡現(xiàn)象，經(jīng)綜合分析后，復(fù)合植物提取物的最佳添加量應(yīng)在250mg/kg·bw-1左右。（5）在小鼠飲水中添加0.6mg/ml（相當(dāng)于200mg/kg·bw-1劑量）21天，可使小鼠日增重顯著提高13.3%（p<0.05）。原來配方未做此內(nèi)容研究，僅發(fā)現(xiàn)在每天給小鼠灌胃1000mg/kg·bw-1劑量，連續(xù)灌胃14天，可使小鼠日增重具有提高趨勢(shì)。（6）在小鼠飲水中添加0.6mg/ml（相當(dāng)于200mg/kg·bw-1劑量）21天，小鼠進(jìn)行l(wèi)ps造模處理后，可降低小鼠的腹瀉率，顯著提高小腸的絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度的值（p<0.05）。（7）與原來配方相比，本發(fā)明的復(fù)合植物提取物在小鼠上的用量?jī)H為原來配方的20％，在很大程度上提高了其性價(jià)比，在畜禽養(yǎng)殖中具有較好應(yīng)用前景。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：1、本發(fā)明摸索建立了一套適用于提取植物多種活性成分的簡(jiǎn)易工藝，適用于各中小型企業(yè)加工、生產(chǎn)。2、本發(fā)明中用于組成復(fù)合植物提取物的幾種植物原料均屬低價(jià)或中等價(jià)位、且在國內(nèi)資源豐富、性價(jià)比高。3、與原來配方相比，保留了性價(jià)比較高的石榴皮，極大地降低了復(fù)方的成本并可顯著降低在仔豬上的應(yīng)用劑量。附圖說明圖1為lps注射4小時(shí)后小鼠空腸絨毛的光鏡切片圖。圖1a為正常對(duì)照組（生理鹽水注射4h），圖1b為lps組（lps注射4h）,圖1c為復(fù)合植物提取物組（lps注射4h）。圖2為lps注射24小時(shí)后小鼠空腸絨毛的光鏡切片圖。圖2a為lps組（lps注射24h）,圖2b為復(fù)合植物提取物組（lps注射24h）。具體實(shí)施方式一、植物原料的提取、篩選、復(fù)方活性成分檢測(cè)1、提取包括青蒿、女貞子、檸檬、澤漆、桂枝、石榴皮、檸檬、刺五加、牛膝、絞股藍(lán)、銀杏、秦皮、魚腥草、補(bǔ)骨脂、厚樸、香附子、茵陳蒿、迷迭香、肉桂、白術(shù)、淫羊藿、甘草、竹葉、蚊子草等23種植物原料。2、提取工藝：將植物原料研磨粉碎，按料水比1：20放入提取設(shè)備槽內(nèi)，升溫至80℃，提取6h后轉(zhuǎn)至濃縮槽內(nèi)，在0.085mpa、60℃條件下濃縮比重至1.25。將濃縮產(chǎn)物轉(zhuǎn)至噴霧干燥設(shè)備，在進(jìn)風(fēng)溫度150℃、空氣流量500l/h、進(jìn)料量20％條件下對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥。3、抑菌率測(cè)定：以大腸桿菌c83912為受試菌株，提取物生藥濃度均為0.5g/ml、按體積比1：10加至各培養(yǎng)基、接種菌液為1：1000，在酶標(biāo)板上于37℃、210r/min培養(yǎng)24h，600nm測(cè)od值。抑菌率計(jì)算公式為：表1植物水提物對(duì)大腸桿菌的抑菌率提取物種類桂枝香附子茵陳蒿女貞子淫羊藿肉桂抑菌率+++————+++提取物種類澤漆絞股藍(lán)牛膝厚樸白術(shù)甘草抑菌率———+—++提取物種類銀杏葉秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抑菌率++—+—++++提取物種類青蒿補(bǔ)骨脂檸檬竹葉魚腥草抑菌率+++————注：+++抑菌率>50%，++抑菌率在30%~50%，+抑菌率<30%，—無抑菌效果通過以上研究（表1），篩選出抑菌率較強(qiáng)的植物原料為：石榴皮、桂枝和青蒿。4、抗炎率測(cè)定：紫外分光光度計(jì)測(cè)定23種植物水提物對(duì)脂肪氧化酶（lox）活性的抑制率來表征植物水提物的體外抗炎活性。具體操作如下：（1）試驗(yàn)組：取1μl0.5g/ml的中藥材水提物加入至已含20μl酶液的1.5mleppendorf管中，30℃水浴30min后，加入150μl底物，30℃反應(yīng)3min，加入500μl無水乙醇終止反應(yīng)，然后加入500μl蒸餾水混勻待測(cè)；（2）陽性對(duì)照組：以1μl蒸餾水替代中藥材水提物，其余步驟同（1）；（3）陰性對(duì)照組：取1μl中藥材水提物，以20μl蒸餾水取代酶液，其余步驟同（1）；（4）空白對(duì)照組：以1μl蒸餾水替代中藥材水提物，在加底物之前先加入500μl無水乙醇終止反應(yīng)，其余步驟同（1）。各取200μl待測(cè)液至96孔紫外檢測(cè)板，在酶標(biāo)儀上選取234nm波長檢測(cè)反應(yīng)液的吸光度od值。中藥材水提物的抑制活性以抗炎率表示，公式如下：oda、odb、odc、odd分別表示試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的od值。表2植物水提物對(duì)脂肪氧化酶的抑制活性（抗炎率）提取物種類桂枝香附子茵陳蒿女貞子淫羊藿肉桂抗炎率（％）68.0612.072.0120.072.385.66提取物種類澤漆絞股藍(lán)牛膝厚樸白術(shù)甘草抗炎率（％）89.3432.786.7191.255.881.13提取物種類銀杏葉秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抗炎率（％）23.547.488.9290.8496.0634.29提取物種類青蒿補(bǔ)骨脂檸檬竹葉魚腥草抗炎率（％）——91.47——注：—無抗炎效果通過以上研究（表2），篩選出抗炎能力較強(qiáng)的植物原料為：石榴皮、檸檬和厚樸5、抗氧化能力測(cè)定：檢測(cè)提取物生藥濃度分別為100、50、25、12.5和6.25mg/ml時(shí)，采用酶標(biāo)板（100μl/孔）在體積比為1：1、37℃、30min條件下對(duì)dpph（0.5mg/ml）的清除率，516nm測(cè)od值，按公式：計(jì)算自由基清除率并利用curveexpert擬合回歸方程換算半自由基清除率（ic50）。表3植物水提物對(duì)dpph自由基的清除ic50值（抗氧化ic50）提取物種類桂枝香附子茵陳蒿女貞子淫羊藿肉桂抗氧化ic50，mg/ml10.4136.081.042.555.341.5提取物種類澤漆絞股藍(lán)牛膝厚樸白術(shù)甘草抗氧化ic50，mg/ml13.081.1199.271.5410.9178.45提取物種類銀杏葉秦皮蚊子草迷迭香石榴皮刺五加抗氧化ic50，mg/ml2.870.718.520.310.0850.62提取物種類青蒿補(bǔ)骨脂檸檬竹葉魚腥草抗氧化ic50，mg/ml2.71149.1720.5625.345.19通過以上研究（表3），篩選出抗氧化能力較強(qiáng)的植物原料為：石榴皮5、正交組合試驗(yàn)：采用l16(54)試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表4），分別制備含檸檬、厚樸、青蒿、桂枝和石榴皮不同比例的16種復(fù)合植物提取物并檢測(cè)其體外抑菌率和抗氧化能力。表4五種植物原料的的正交組合設(shè)計(jì)表格表5正交設(shè)計(jì)的各組合植物水提物的體外抑菌率、抗炎率和抗氧化ic50值組合抑菌率（%）抗炎率（%）抗氧化ic50（mg/ml）134.5386.930.82233.7378.530.823-4.9969.550.67436.5375.030.41526.9557.120.29631.7473.070.27717.7679.870.48838.5294.310.69959.0872.210.721079.4491.812.0111-1.2091.670.331279.6492.810.261360.5073.510.291428.5479.710.251581.0493.471.091671.06103.910.72根據(jù)正交設(shè)計(jì)和各組合的抑菌、抗炎和抗氧化結(jié)果（表5），采用spps方差分析方法明確抑菌效果的影響因素依次為：厚樸>石榴皮>桂枝>青蒿>檸檬，體外抑菌效果最佳且兼具抑菌和抗氧化功能的組合水平為：石榴皮為1，桂枝為4，青蒿為2，厚樸為4，檸檬為4，各水平相對(duì)應(yīng)的原料質(zhì)量分別為1g，9g，6g，5g和13g，該復(fù)方標(biāo)記為抑菌復(fù)方。采用spps方差分析方法明確抗氧化效果的影響因素依次為：石榴皮>桂枝>厚樸>檸檬>青蒿，體外抗氧化效果最佳且兼具抑菌和抗炎功能的組合水平為：石榴皮為4，桂枝為1，青蒿為1，厚樸為2，檸檬為4，各水平相對(duì)應(yīng)的原料質(zhì)量分別為7g，1g，4g，3g和13g，該復(fù)方標(biāo)記為抗氧化復(fù)方。6.復(fù)合植物提取物的制備、抑菌、抗炎和抗氧化活性測(cè)定配方：石榴皮2.94％檸檬38.24％桂枝26.47％青蒿17.54％厚樸14.71%。制備方法包括以下的步驟：1）將植物原料研磨粉碎，按料水比1：20放入提取設(shè)備槽內(nèi)，升溫至80℃，提取6h后轉(zhuǎn)至濃縮槽內(nèi)，在0.085mpa、60℃條件下濃縮比重至1.25；2）將濃縮產(chǎn)物轉(zhuǎn)至噴霧干燥設(shè)備，在進(jìn)風(fēng)溫度150℃、空氣流量500l/h、進(jìn)料量20％條件下對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥。（1）抗炎ic50值的檢測(cè)：將水提物等比稀釋，測(cè)定每個(gè)濃度梯度的抗炎率，方法同上。再根據(jù)抗炎率和水提物濃度，利用curveexpert軟件擬合回歸方程，計(jì)算抗炎率為50%時(shí)水提物濃度，即抗炎ic50。（2）抑菌mic值的檢測(cè)：采用常量肉湯稀釋法。將復(fù)方水提物濃縮至生藥濃度1g/ml，用mh液體培養(yǎng)基以1:1000比例稀釋0.5麥?zhǔn)辖臃N菌液。取滅菌試管加入1ml無菌肉湯培養(yǎng)基，倍比稀釋至各試管中的水提物濃度分別為500、250、125、62.5和31.25mg/ml；并同時(shí)制備陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。將所有試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察細(xì)菌生長情況，最低濃度的無菌試管即為該水提物的最小抑菌濃度（mic）。（3）抗氧化ic50值的檢測(cè)：方法同上。表6抑菌復(fù)方和抗氧化復(fù)方的抑菌mic、抗炎ic50及抗氧化ic50結(jié)果由表6可見，抑菌組方的抑菌mic值為125mg/ml，抗炎ic50值為0.434，抗氧化ic50值為0.31。7.不同劑量的復(fù)合植物提取物在小鼠上的應(yīng)用效果選取54只balb/c雌性小鼠，按體重隨機(jī)分為3個(gè)處理：對(duì)照組（灌胃生理鹽水），抑菌復(fù)方組和抗氧化復(fù)方組，兩個(gè)復(fù)方均設(shè)125、250、500、1000mg/kg·bw-14個(gè)水平（灌胃相應(yīng)水提液），每個(gè)水平6只小鼠，試驗(yàn)期21天。整個(gè)飼養(yǎng)試驗(yàn)期間，所有實(shí)驗(yàn)小鼠精神狀態(tài)良好，毛色光亮、未見異常死亡現(xiàn)象；由表7－12可見，2個(gè)復(fù)方高劑量添加會(huì)對(duì)小鼠日增重和部分臟器指數(shù)造成顯著降低（p<0.05），特別是抗氧化復(fù)方小鼠的部分臟器指數(shù)即使在250mg/kg·bw-1劑量時(shí)仍與對(duì)照組差異顯著（p<0.05）。因此僅對(duì)抑菌組方進(jìn)行了小鼠上的促生長效果研究，且從生長性能來看，添加劑量應(yīng)為250mg/kg·bw-1左右。表7不同處理組小鼠的日增重及采食量注：同行肩標(biāo)字母不同者表示與對(duì)照組相比有顯著性差異p<0.05，下表同表8不同處理組小鼠的臟器指數(shù)——肝臟表9不同處理組小鼠的臟器指數(shù)——腎臟表10不同處理組小鼠的臟器指數(shù)——胸腺表11不同處理組小鼠的臟器指數(shù)——脾臟表12不同處理組小鼠的臟器指數(shù)——心臟8.抑菌復(fù)方對(duì)小鼠促生長效果的研究選取60只15g左右的balb/c雌性小鼠，分為2組：對(duì)照組（正常飲水），抑菌復(fù)方組（飲水中添0.6mg/ml，相當(dāng)于250mg/kg·bw-1劑量），每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期21天。試驗(yàn)結(jié)果表明（見表13）：與對(duì)照組相比，抑菌復(fù)方可使小鼠日增重顯著提高13.3%（p<0.05）。表13抑菌復(fù)方對(duì)小鼠生長性能的影響對(duì)照抑菌復(fù)方組日采食量g3.11±0.093.25±0.09日增重g0.15±0.01a0.17±0.01b料重比21.21±1.6319.71±0.859.抑菌復(fù)方對(duì)小鼠腸道健康的保護(hù)作用選取45只balb/c雌性小鼠，分為3個(gè)處理：對(duì)照組（正常飲水）、lps組（正常飲水）、lps＋復(fù)方組（飲水中添加0.6mg/ml抑菌復(fù)方，相當(dāng)于250mg/kg·bw-1劑量）），飼養(yǎng)試驗(yàn)至第21天，對(duì)照組注射生理鹽水，其他2組注射lps，分別于lps注射后4h（每組8只）和24h（每組7只）屠宰、取樣。由表14-16和圖1-2所示，lps注射后4h試驗(yàn)結(jié)果表明：lps組小鼠全部出現(xiàn)腹瀉，腹瀉率為100％；與對(duì)照組相比，空腸隱窩深度cd顯著升高（p<0.05），vh/cd顯著降低（p<0.05）；與lps組相比，lps＋抑菌復(fù)方組小鼠腹瀉率為75％，vh/cd均顯著升高（p<0.05）。lps注射后24h試驗(yàn)結(jié)果表明，lps組小鼠腹瀉率降至71.43％，lps＋抑菌復(fù)方組小鼠腹瀉率降至57.14％，與lps組相比，lps＋抑菌復(fù)方組空腸vh和vh/cd均顯著升高（p<0.05）。表14lps注射后4h和24h不同處理組小鼠腹瀉情況表15lps注射4h后不同處理組小鼠空腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度的值對(duì)照組lps組lps+抑菌復(fù)方組絨毛高度（vh）474.23±41.25431.55±42.14463.65±37.02隱窩深度（cd）155.90±21.92a225.54±27.05b200.94±10.27b絨毛高度/隱窩深度（vh/cd）3.23±0.28c1.95±0.11a2.37±0.14b表16lps注射24h后不同處理組小鼠空腸絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度lps組lps+抑菌復(fù)方組絨毛高度（vh）331.00±60.26a447.31±79.84b隱窩深度（cd）168.15±15.74a185.58±21.00a絨毛高度/隱窩深度（vh/cd）2.01±0.34a2.46±0.28b當(dāng)前第1頁12