本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮及其制法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤(tumor)是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物(neogrowth)，因?yàn)檫@種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物(neoplasm)。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞是單克隆性的，即一個(gè)腫瘤中的所有瘤細(xì)胞均是一個(gè)突變的細(xì)胞的后代。腫瘤的肉眼觀形態(tài)肉眼觀腫瘤的形態(tài)多種多樣，并可在一定程度上反映腫瘤的良惡性。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。良性腫瘤細(xì)胞的異型性不明顯，一般與其來源組織相似。惡性腫瘤常具有明顯的異型性?，F(xiàn)有技術(shù)中腫瘤的治療尚無確切的手段和藥物，且不良反應(yīng)大。腫瘤病人的生存期短，生活質(zhì)量低，因病導(dǎo)致家庭負(fù)擔(dān)加重。因此，臨床上迫切需要一種具有抑制腫瘤的藥物，效果確切，不良反應(yīng)小，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：提供具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮，解決現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤的治療尚無確切的手段和藥物，且不良反應(yīng)大的問題。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供毛葉山桐子葉黃酮的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明所述的具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮，由毛葉山桐子葉經(jīng)堿性稀乙醇提取后，經(jīng)大孔吸附樹脂兩次吸附分離而得。本發(fā)明所述的具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法，具體包括以下步驟：步驟1：提?。喝∶~山桐子葉，加入堿性稀乙醇加熱提取，過濾，濾液濃縮；步驟2：一次吸附分離：將所述濾液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、5-15％乙醇水溶液、25-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集80-95％乙醇洗脫液；步驟3：將所述80-95％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；步驟4：二次吸附分離：將所述濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、30-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集80-95％乙醇洗脫液；步驟5：將步驟4所得的80-95％乙醇洗脫液濃縮后，低溫干燥，即得。進(jìn)一步地，所述步驟1中，取毛葉山桐子葉，加入所述毛葉山桐子葉3-6倍質(zhì)量的堿性稀乙醇50-70℃加熱提取1-5次，過濾，濾液濃縮。進(jìn)一步地，所述堿性稀乙醇為ph值8-14的15-50％乙醇水溶液。進(jìn)一步地，所述步驟2中的大孔吸附樹脂的型號(hào)為d-101，其用量按每克毛葉山桐子葉計(jì)為0.2-0.6g；所述步驟4中的大孔吸附樹脂的型號(hào)為d-101，其用量按每克毛葉山桐子葉計(jì)為0.05-0.1g。進(jìn)一步地，所述步驟2中依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的4-8倍，收集90％乙醇洗脫液。進(jìn)一步地，所述步驟4中依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱的柱體積的4-8倍，收集80％乙醇洗脫液。進(jìn)一步地，所述步驟5中的低溫干燥為冷凍干燥。本發(fā)明所述的毛葉山桐子葉黃酮在制備具有抑制腫瘤作用的食品、保健食品和藥品中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明首次從毛葉山桐子葉中分離出具有抑制腫瘤作用的黃酮成分，且制備方法簡單，操作簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，所用試劑對(duì)環(huán)境友好。本發(fā)明以毛葉山桐子葉為原料，價(jià)廉易得。采用堿性稀乙醇提取后，再經(jīng)大孔吸附樹脂兩次吸附分離，得到純度大于90％的黃酮，且收率高。動(dòng)物試驗(yàn)表明，本發(fā)明抑制腫瘤作用確切，不良反應(yīng)小。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實(shí)施例。具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮，由毛葉山桐子葉經(jīng)堿性稀乙醇提取后，經(jīng)大孔吸附樹脂兩次吸附分離而得。具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法，具體包括以下步驟：步驟1：提?。喝∶~山桐子葉，加入堿性稀乙醇加熱提取，過濾，濾液濃縮；步驟2：一次吸附分離：將濾液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、5-15％乙醇水溶液、25-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集80-95％乙醇洗脫液；步驟3：將80-95％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液；步驟4：二次吸附分離：將濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉剑^濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、30-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集80-95％乙醇洗脫液；步驟5：將步驟4所得的80-95％乙醇洗脫液濃縮后，低溫干燥，即得。步驟1中，取毛葉山桐子葉，加入毛葉山桐子葉3-6倍質(zhì)量的堿性稀乙醇50-70℃加熱提取1-5次，過濾，濾液濃縮；堿性稀乙醇為ph值8-14的15-50％乙醇水溶液。步驟2中的大孔吸附樹脂的型號(hào)為d-101，其用量按每克毛葉山桐子葉計(jì)為0.2-0.6g；步驟4中的大孔吸附樹脂的型號(hào)為d-101，其用量按每克毛葉山桐子葉計(jì)為0.05-0.1g。步驟2中依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的4-8倍，收集90％乙醇洗脫液。步驟4中依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱的柱體積的4-8倍，收集80％乙醇洗脫液。步驟5中的低溫干燥為冷凍干燥。毛葉山桐子葉黃酮在制備具有抑制腫瘤作用的食品、保健食品和藥品中的用途。實(shí)施例1具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法，具體包括以下步驟：步驟1：提?。喝∶~山桐子葉1000g，加入毛葉山桐子葉3000mlph值8的堿性稀乙醇70℃加熱提取5次，過濾，濾液濃縮至200ml。步驟2：一次吸附分離：將濾液加入d-101大孔吸附樹脂200g，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的4倍，收集90％乙醇洗脫液。步驟3：將90％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液。步驟4：二次吸附分離：將濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱的柱體積的6倍，收集80％乙醇洗脫液。步驟5：將步驟4所得的80％乙醇洗脫液濃縮后，冷凍干燥，即得。本實(shí)施例所得毛葉山桐子葉黃酮245mg，純度為92.8％。實(shí)施例2具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法，具體包括以下步驟：步驟1：提取：取毛葉山桐子葉1000g，加入毛葉山桐子葉6000mlph值14的堿性稀乙醇50℃加熱提取1次，過濾，濾液濃縮至200ml。步驟2：一次吸附分離：將濾液加入d-101大孔吸附樹脂600g，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、5％乙醇水溶液、25％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的8倍，收集80％乙醇洗脫液。步驟3：將90％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液。步驟4：二次吸附分離：將濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱的柱體積的4倍，收集95％乙醇洗脫液。步驟5：將步驟4所得的95％乙醇洗脫液濃縮后，冷凍干燥，即得。本實(shí)施例所得毛葉山桐子葉黃酮252mg，純度為91.2％。實(shí)施例3具有抗腫瘤作用的毛葉山桐子葉黃酮的制備方法，具體包括以下步驟：步驟1：提取：取毛葉山桐子葉1000g，加入毛葉山桐子葉5000mlph值10的堿性稀乙醇60℃加熱提取3次，過濾，濾液濃縮至200ml。步驟2：一次吸附分離：將濾液加入d-101大孔吸附樹脂500g，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、15％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱柱體積的6倍，收集95％乙醇洗脫液。步驟3：將90％乙醇洗脫液濃縮，得濃縮洗脫液。步驟4：二次吸附分離：將濃縮洗脫液加入大孔吸附樹脂，室溫?cái)嚢栉?，過濾，取吸附后的大孔吸附樹脂裝柱，依次用水、50％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫液的用量均為其洗脫的大孔吸附樹脂柱的柱體積的8倍，收集85％乙醇洗脫液。步驟5：將步驟4所得的85％乙醇洗脫液濃縮后，冷凍干燥，即得。本實(shí)施例所得毛葉山桐子葉黃酮265mg，純度為93.7％。實(shí)施例4毛葉山桐子葉黃酮的抗腫瘤作用。受試樣品：取實(shí)施例1所得毛葉山桐子葉黃酮作為樣品。對(duì)照樣品：阿霉素。劑量選擇與受試物給予方式：根據(jù)該樣品的人體推薦用量，人口服推薦劑量為每人(成人)每日3次，每次90mg，成人體重按60kg計(jì)算，折合劑量為1.5mg/kgbw，設(shè)3.75g/kgbw(低劑量組)、7.5mg/kgbw(中劑量組)、15mg/kgbw(高劑量組)(分別相當(dāng)于人體推薦用量的2.5、5、10倍)劑量的試驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)一個(gè)模型組對(duì)照組和一個(gè)空白對(duì)照組。動(dòng)物：spf級(jí)bablc小鼠，雌性，體重18.0-20.0g。方法：將處于對(duì)數(shù)生長期的emt-6細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化脫壁后，終止消化，加入rpmi-1640培養(yǎng)液，制成懸液，將懸液接種至小鼠左前肢腋窩皮下0.2ml/只，待腫瘤長到1cm3時(shí)剝離，剪碎，按比例加入生理鹽水(1g:3ml)，再在玻璃勻漿器內(nèi)研磨，經(jīng)80-100目篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。將制備好的細(xì)胞懸液按0.2ml/只接種于50只bablc小鼠左前腋窩下。小鼠隨機(jī)分組，每組10只。試驗(yàn)藥物分高、中、低組，對(duì)照藥物組，空白模型組。于接種后的第二天開始給藥，連續(xù)給藥1周，于接種后第6天開始測(cè)量腫瘤體積，待模型組平均瘤重大于1.0g(瘤體積約為0.5cm3)時(shí)停止試驗(yàn)，處死小鼠并稱重，剝?nèi)∧[瘤，計(jì)算抑瘤率。對(duì)emt-6乳腺癌小鼠移植瘤體積的影響表組別6d7d8d9d10d樣品低劑量0.027±0.0160.076±0.048**0.194±0.035**0.405±0.033**0.441±0.042**樣品中劑量0.033±0.0210.081±0.014**0.249±0.025**0.418±0.031**0.462±0.035**樣品高劑量0.029±0.0390.088±0.051**0.201±0.019**0.336±0.045**0.451±0.039**模型對(duì)照組0.054±0.1010.176±0.1090.399±0.1020.642±0.0720.785±0.031陽性對(duì)照組0.013±0.032**0.029±0.047**0.124±0.065**0.256±0.078**0.417±0.078**注：**與模型組比較，p＜0.01。由上表可知，本發(fā)明具有抗腫瘤作用。將飼喂本發(fā)明的小鼠解剖后，發(fā)現(xiàn)其臟器正常，且在飼喂期間無異常。本發(fā)明不良反應(yīng)小。上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式之一，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計(jì)思想和精神上作出的毫無實(shí)質(zhì)意義的改動(dòng)或潤色，其所解決的技術(shù)問題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12