本發(fā)明涉及一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中的主要天然菌群，長(zhǎng)久以來的研究證明，雙歧桿菌對(duì)人體的生理作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過許多菌種。發(fā)酵乳桿菌是乳酸桿菌之一，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分布廣泛且是生物體內(nèi)正常菌群。其菌落表面光滑，不透明且形態(tài)多呈圓頂狀。植物乳桿菌作為乳桿菌科中的乳酸菌屬的一種，廣泛存在于傳統(tǒng)的發(fā)酵制品中，如酸菜、泡菜、熏制紅腸及發(fā)酵奶中。其菌落形態(tài)多為圓形，表面光滑，外觀呈白色或淺黃色。對(duì)生物體有多種益生作用，目前在發(fā)酵食品領(lǐng)域，工業(yè)乳酸生產(chǎn)以及保健品領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。有研究表明，植物乳桿菌有抑制腸道內(nèi)致病菌生長(zhǎng)的作用，從而維持腸道菌群平衡，維持機(jī)體健康。但這些益生菌易受胃液、腸液、膽汁的破壞，使活菌數(shù)降低，影響保健效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決益生菌易受胃液、腸液、膽汁的破壞，使活菌數(shù)降低，影響保健效果的問題，提供了一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、將活化的植物乳桿菌接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃下富集培養(yǎng)48h，得到植物乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的發(fā)酵乳桿菌接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的短雙歧桿菌接種到mrs+l-半胱氨酸鹽酸鹽的液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)48h，得到短雙歧桿菌培養(yǎng)液；將得到的三種菌種培養(yǎng)液分別離心、去上清，得到短雙歧桿菌的菌體沉淀、發(fā)酵乳桿菌的菌體沉淀和植物乳桿菌的菌體沉淀；

二、將短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌的菌體沉淀等質(zhì)量混合，然后用無菌生理鹽水定容至5ml，得到復(fù)合濃縮菌液；

三、將果膠溶液等體積加入到復(fù)合濃縮菌液中，并在漩渦振蕩器上振蕩至混合均勻，得到混合液；用注射器吸取混合液，通過針頭將混合液滴入濃度為100-500mmol/l的無菌cacl2溶液中，得到濕的微粒子；

四、將濕的微粒子置于4℃冰箱靜止固化0.5-4h，然后過濾，再用無菌水沖洗膠囊表面，得到?jīng)_洗后的微粒子；

五、將沖洗后的微粒子與凍干保護(hù)劑按照質(zhì)量體積比為(1-5)g:(1-8)ml的比例混合均勻，然后放入-20℃的冰箱預(yù)凍2h，再用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，制得短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用果膠包裹益生菌使心材免受貯藏環(huán)境及胃液、腸液和膽汁破壞，使微粒子中包埋的活菌經(jīng)過胃腸道時(shí)得到保護(hù)，從而可以順利到達(dá)腸道，尤其是結(jié)腸。將益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的貯藏穩(wěn)定性，還可為厭氧菌株阻隔外界的高氧環(huán)境；并且以低甲氧基果膠作為微粒子壁材，對(duì)三菌復(fù)合混菌都有很好的包埋效果，微粒子的包埋率達(dá)99％以上。本發(fā)明所得三菌復(fù)合微粒子貯藏一段時(shí)間以后，其中的活菌數(shù)要明顯的高于裸菌菌粉對(duì)照，可見益生菌微粒子可以顯著地提高產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，且三菌復(fù)合微粒子相對(duì)單一菌株微粒子減重效果更加顯著。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中濕微粒子的圖片；

圖2為實(shí)施例1中冷凍干燥后微粒子的圖片；

圖3為實(shí)施例1中短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子貯藏穩(wěn)定性圖；其中x為-20℃、y為4℃、z為室溫；

圖4為實(shí)施例1中裸菌貯藏穩(wěn)定性圖；其中x為-20℃、y為4℃、z為室溫；

圖5為實(shí)施例1血清中甘油三脂(tg)的含量測(cè)定圖；

圖6為實(shí)施例1血清中總膽固醇(tc)的含量測(cè)定圖；

圖7為實(shí)施例1血清中高密度脂蛋白(hdl)的含量測(cè)定圖；

圖8為實(shí)施例1小鼠肝臟的he染色圖；其中a為空白組、b為高脂對(duì)照組、c為高脂陽(yáng)性對(duì)照組、d為短雙歧桿菌微粒子組、e為兩菌復(fù)合微粒子組、f為三菌復(fù)合微粒子組；

圖9為實(shí)施例1小鼠小腸的he染色圖；其中a為空白組、b為高脂對(duì)照組、c為高脂陽(yáng)性對(duì)照組、d為短雙歧桿菌微粒子組、e為兩菌復(fù)合微粒子組、f為三菌復(fù)合微粒子組；

圖10為實(shí)施例1小鼠脂肪的he染色圖；其中a為空白組、b為高脂對(duì)照組、c為高脂陽(yáng)性對(duì)照組、d為短雙歧桿菌微粒子組、e為兩菌復(fù)合微粒子組、f為三菌復(fù)合微粒子組。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、將活化的植物乳桿菌接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃下富集培養(yǎng)48h，得到植物乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的發(fā)酵乳桿菌接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的短雙歧桿菌接種到mrs+l-半胱氨酸鹽酸鹽的液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)48h，得到短雙歧桿菌培養(yǎng)液；將得到的三種菌種培養(yǎng)液分別離心、去上清，得到短雙歧桿菌的菌體沉淀、發(fā)酵乳桿菌的菌體沉淀和植物乳桿菌的菌體沉淀；

二、將短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌的菌體沉淀等質(zhì)量混合，然后用無菌生理鹽水定容至5ml，得到復(fù)合濃縮菌液；

三、將果膠溶液等體積加入到復(fù)合濃縮菌液中，并在漩渦振蕩器上振蕩至混合均勻，得到混合液；用注射器吸取混合液，通過針頭將混合液滴入濃度為100-500mmol/l的無菌cacl2溶液中，得到濕的微粒子；

四、將濕的微粒子置于4℃冰箱靜止固化0.5-4h，然后過濾，再用無菌水沖洗膠囊表面，得到?jīng)_洗后的微粒子；

五、將沖洗后的微粒子與凍干保護(hù)劑按照質(zhì)量體積比為(1-5)g:(1-8)ml的比例混合均勻，然后放入-20℃的冰箱預(yù)凍2h，再用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，制得短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子。

本實(shí)施方式步驟一中活化的植物乳桿菌、活化的發(fā)酵乳桿菌和活化的短雙歧桿菌的接種量均為8％。

本實(shí)施方式中的短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)菌種編號(hào)：cicc6182，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentumsubsp.bulgarics)菌種編號(hào)：cgmcc1.1880，和植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)：菌種編號(hào)：as1.557，均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

本實(shí)施方式中mrs液體培養(yǎng)基的配方為：2.0g磷酸氫二鉀，2.0g檸檬酸三胺，5.0g無水乙酸鈉，0.25g硫酸錳，0.58g硫酸鎂，20.0g葡萄糖，10.0g蛋白胨，10.0g牛肉膏，5.0g酵母浸膏，0.5gl-半胱氨酸鹽酸鹽，1.0ml吐溫80，ph調(diào)至6.8，加1l蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌20min。mrs+l-半胱氨酸鹽酸鹽的液體培養(yǎng)基配方為：mrs液體培養(yǎng)基+5mg/mll-半胱氨酸鹽酸鹽.

本實(shí)施方式選用的針頭型號(hào)、混合液滴入無菌cacl2溶液中滴加的高度以及漩渦振蕩器旋轉(zhuǎn)速度決定微粒子的大小。本實(shí)施方式制備的濕微粒子外觀顏色呈白色，凍干后的微粒子呈淡黃色，形狀一致，直徑為0.5-3mm左右，多呈球形，濕微粒子圓潤(rùn)飽滿表面光滑，流動(dòng)性良好，凍干后微粒子之間不存在粘連成塊現(xiàn)象。

本實(shí)施方式的有益效果：本實(shí)施方式利用果膠包裹益生菌使心材免受貯藏環(huán)境及胃液、腸液和膽汁破壞，使微粒子中包埋的活菌經(jīng)過胃腸道時(shí)得到保護(hù)，從而可以順利到達(dá)腸道，尤其是結(jié)腸。將益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的貯藏穩(wěn)定性，還可為厭氧菌株阻隔外界的高氧環(huán)境；并且以低甲氧基果膠作為微粒子壁材，對(duì)三菌復(fù)合混菌都有很好的包埋效果，微粒子的包埋率達(dá)99％以上。本實(shí)施方式所得三菌復(fù)合微粒子貯藏一段時(shí)間以后，其中的活菌數(shù)要明顯的高于裸菌菌粉對(duì)照，可見益生菌微粒子可以顯著地提高產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，且三菌復(fù)合微粒子相對(duì)單一菌株微粒子減重效果更加顯著。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一中活化的短雙歧桿菌的活化方法為：a、取0.5ml已滅菌的tpy液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，得到菌體懸浮液；b、將菌體懸浮液移植于tpy斜面培養(yǎng)基上，在37℃下厭氧培養(yǎng)48h；c、挑選菌落在tpy固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃下厭氧培養(yǎng)48h；重復(fù)步驟c操作三次，短雙歧桿菌即可充分活化。其它與具體實(shí)施方式一相同。

本實(shí)施方式中tpy液體培養(yǎng)基配方為：10.0g酪蛋白胨，5.0g大豆蛋白胨，2.5g酵母粉，5.0g葡萄糖，2.0g磷酸氫二鉀，0.5g氯化鎂，0.15g氯化鈣，0.25g硫酸鋅，0.1g氯化鐵，0.5gl-半胱氨酸鹽酸鹽，1.0ml吐溫80，ph調(diào)至6.5，加1l蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

tpy固體培養(yǎng)基配方為：tpy液體培養(yǎng)基+20g/l瓊脂。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二之一不同的是：步驟一中活化的發(fā)酵乳桿菌的活化方法為：a、利用接菌環(huán)挑取菌種接種到mrs斜面培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)12h；b、挑取菌落接種于mrs固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)12h，重復(fù)步驟b操作三次，發(fā)酵乳桿菌即可充分活化。其它與具體實(shí)施方式一或二之一相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟一中活化的植物乳桿菌的活化方法為：a、利用接菌環(huán)挑取菌種接種到mrs斜面培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h；b、挑取菌落接種于mrs固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h，重復(fù)步驟b操作三次，植物乳桿菌即可充分活化。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

本實(shí)施方式中mrs固體培養(yǎng)基的配方為：在上述mrs液體培養(yǎng)基中加入20g/l瓊脂得到mrs固體培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟三所述的果膠溶液的質(zhì)量濃度為1-5g/ml。其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三所述的漩渦振蕩器的轉(zhuǎn)速為100-500r/min。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是：步驟三所述的注射器為1、2.5、5或10ml的注射器。其它與具體實(shí)施方式一至六之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟三所述的將混合液滴入無菌cacl2溶液中滴加的高度為距無菌cacl2溶液液面5～10cm。其它與具體實(shí)施方式一至七之一相同。

具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至八之一不同的是：所述的三菌復(fù)合微粒子的直徑為0.2-3mm。其它與具體實(shí)施方式一至八之一相同。

具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的應(yīng)用是指可作為降脂產(chǎn)品進(jìn)行應(yīng)用。

實(shí)施例1、本實(shí)施例一種短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子的制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、短雙歧桿菌的活化：a、取0.5ml已滅菌的tpy液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀態(tài)。b、吸取全部菌體懸浮液，移植于tpy斜面培養(yǎng)基上，在37℃下厭氧培養(yǎng)48h。c、挑選長(zhǎng)勢(shì)好的菌落在tpy固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃下厭氧培養(yǎng)48h。步驟c重復(fù)三次，短雙歧桿菌即可充分活化；發(fā)酵乳桿菌的活化：a、利用接菌環(huán)挑取實(shí)驗(yàn)室保藏菌種微量，接種到mrs斜面培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)12h。b、挑取長(zhǎng)勢(shì)好的菌落于mrs固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)12h。步驟b重復(fù)三次，發(fā)酵乳桿菌即可充分活化；植物乳桿菌活化過程為：a、利用接菌環(huán)挑取菌種接種到mrs斜面培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h；b、挑取菌落接種于mrs固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h，重復(fù)步驟b操作三次，植物乳桿菌即可充分活化。

二、將活化的植物乳桿菌按8％的接種量接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃下富集培養(yǎng)48h，得到植物乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的發(fā)酵乳桿菌按8％的接種量接種到mrs液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)液；將活化的短雙歧桿菌按8％的接種量接種到mrs+l-半胱氨酸鹽酸鹽的液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件37℃下富集培養(yǎng)48h，得到短雙歧桿菌培養(yǎng)液；將得到的三種菌種培養(yǎng)液分別離心、去上清，得到短雙歧桿菌的菌體沉淀、發(fā)酵乳桿菌的菌體沉淀和植物乳桿菌的菌體沉淀；

三、將短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌的菌體沉淀等質(zhì)量混合，然后用無菌生理鹽水定容至5ml，得到復(fù)合濃縮菌液；

四、將果膠溶液等體積加入到復(fù)合濃縮菌液中，并在漩渦振蕩器上振蕩至混合均勻，得到混合液；用注射器吸取混合液，通過針頭將混合液滴入濃度為100-500mmol/l的無菌cacl2溶液中，得到濕的微粒子；

五、將濕的微粒子置于4℃冰箱靜止固化0.5-4h，然后用紗布過濾，再用無菌水沖洗膠囊表面，得到?jīng)_洗后的微粒子；

六、將沖洗后的微粒子與凍干保護(hù)劑按照質(zhì)量體積比為(1-5)g:(1-8)l的比例混合均勻，然后放入-20℃的冰箱預(yù)凍2h，再用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，制得短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子。

收集步驟四的濾液及沖洗液混合液，進(jìn)行包埋率的測(cè)試，經(jīng)測(cè)試微粒子的包埋率達(dá)99％以上。

對(duì)本實(shí)施例獲得的短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子進(jìn)行體外模擬人體胃腸道試驗(yàn)，具體操作為：

(1)模擬胃液釋放

對(duì)照組：分別取1ml短雙歧桿菌菌液或三菌混合菌液加入到30ml的模擬胃液中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩2h后，吸取100ul混合液，梯度稀釋后選取適當(dāng)濃度涂板計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)組：分別取0.1g短雙歧桿菌微粒子或三菌復(fù)合微粒子加入到30ml的模擬胃液中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩2h后，500r/min離心5min，收集上清，選取適當(dāng)稀釋度涂板計(jì)數(shù)。

(2)模擬膽汁液釋放

對(duì)照組：將上述胃液處理2h后的短雙歧桿菌菌液或三菌混合菌液在4000r/min下離心15min，收集沉淀菌體。然后取30ml的模擬膽汁加入收集菌體中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩20min后，吸取100ul混合液，選取適當(dāng)稀釋度涂板計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)組：取30ml模擬膽汁加入經(jīng)上述胃液處理2h后的短雙歧桿菌微粒子或三菌復(fù)合微粒子中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩20min后，500r/min離心5min，收集上清，選取適當(dāng)稀釋度涂板計(jì)數(shù)。

(3)模擬腸液釋放

對(duì)照組：將上述膽汁處理20min后的短雙歧桿菌菌液或三菌混合菌液4000r/min離心15min，收集沉淀菌體。然后取30ml的模擬小腸溶液加入該沉淀菌體中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩2h后，吸取100ul混合液，選取適當(dāng)稀釋度涂板計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)組：取30ml模擬小腸溶液加入經(jīng)上述膽汁處理20min后的短雙歧桿菌微粒子或三菌復(fù)合微粒子中，在37℃條件下于搖床中180r/min振蕩2h后，500r/min離心5min，收集上清，選取適當(dāng)稀釋度涂板計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果如表1所示：經(jīng)過模擬胃液、膽汁、腸液處理后，短雙歧桿菌裸菌和短雙歧桿菌微粒子的菌體數(shù)量分別下降了4.82,1.76lgcfu/g；三菌復(fù)合裸菌和三菌復(fù)合微粒子的菌體數(shù)量分別下降了4.82,1.74lgcfu/g。試驗(yàn)結(jié)果說明，低甲氧基果膠作為壁材對(duì)微粒子內(nèi)的短雙歧桿菌等益生菌具有良好的保護(hù)效果。

表1模擬胃腸道釋放試驗(yàn)結(jié)果(lgcfu/g)

對(duì)本實(shí)施例獲得的短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，具體操作為：將制備好的短雙歧桿菌微粒子和三菌復(fù)合微粒子，分別取適量進(jìn)行分裝，將分裝好的兩種微粒子分別置于-20℃、4℃、室溫條件下保存。在試驗(yàn)的0、7、14、21...84天時(shí)，分別取置于不同溫度條件下的兩種樣品各0.1g加入30mlph8.0的edta溶液中，在37℃條件下于搖床中180rpm/min振蕩2h后，取適當(dāng)稀釋度涂平板計(jì)數(shù)微粒子中的活菌數(shù)。凍干后的裸菌作為對(duì)照，處理?xiàng)l件與微粒子相同。試驗(yàn)周期結(jié)束后，以橫坐標(biāo)為天數(shù)、縱坐標(biāo)為活菌數(shù)的對(duì)數(shù)作圖，觀察菌數(shù)的變化趨勢(shì)(見圖3和圖4)，由圖3和圖4可知，在-20℃下保藏84d后，短雙歧桿菌微粒子、三菌復(fù)合微粒子中的活菌數(shù)分別下降了0.94，0.74lgcfu/g，短雙歧桿菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌數(shù)分別下降1.46，1.35lgcfu/g；在4℃下保藏84d后，短雙歧桿菌微粒子、三菌復(fù)合微粒子中的活菌數(shù)分別下降了1.42，1.46lgcfu/g，短雙歧桿菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌數(shù)分別下降2.10，2.29lgcfu/g；在室溫下保藏84d后，短雙歧桿菌微粒子、三菌復(fù)合微粒子中的活菌數(shù)分別下降了3.29，3.33lgcfu/g，短雙歧桿菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌數(shù)分別下降4.11，4.02lgcfu/g。由此可見，在相同的貯存條件下，微粒子中的活菌數(shù)顯著地高于裸菌菌粉的活菌數(shù)量。

對(duì)本實(shí)施例獲得的短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌三菌復(fù)合微粒子進(jìn)行功能性驗(yàn)證：

將試驗(yàn)小鼠置于動(dòng)物飼養(yǎng)室，首先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間12h光照，12h黑暗，自由飲食飲水，將48只小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，然后連續(xù)喂養(yǎng)普通飼料或高脂飼料4周來建立小鼠肥胖模型，建模成功后第五周開始按照以下方案進(jìn)行分組：

a：空白組(喂以普通飼料)

b：高脂對(duì)照組(喂以高脂飼料)

c：高脂陽(yáng)性對(duì)照組(喂以高脂飼料加奧利司他)

d：短雙歧桿菌微粒子組(喂以高脂飼料加短雙歧桿菌微粒子)

e：兩菌復(fù)合微粒子組(喂以高脂飼料加植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌復(fù)合微粒子)

f：三菌復(fù)合微粒子組(喂以高脂飼料加三菌復(fù)合微粒子)

各組每只小鼠飼喂劑量為10⁸cfu/d。

高脂陽(yáng)性對(duì)照組奧利司他喂藥量的計(jì)算公式為：dm＝dh/hw*k*mw

dm、dh分別代表小鼠每天的給藥量、人每天的給藥量；mw代表小鼠的體重，hw代表人的體重，人的體重一般取70kg，小鼠給藥時(shí)的體重取40g；k代表人與小鼠的換算系數(shù)為9。以每只小鼠的給藥容量0.8ml計(jì)算得到奧利司他的藥物濃度應(yīng)為1.5mg/ml。

1、進(jìn)行血脂測(cè)定試，小鼠禁食12小時(shí)，自由飲水，采用摘眼球取血法，用不含熱原和內(nèi)毒素的1.5ml離心管收集血液，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離，將上層血清吸取放入微離心管中，做好標(biāo)記置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍后按照試劑盒使用說明書操作檢測(cè)樣品。血清中甘油三脂(tg)、總膽固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl)的含量測(cè)定(見圖5、6和7)。如圖5、圖6和7所示，高脂對(duì)照組小鼠血清含量極顯著的高于飼喂普通飼料的空白組。高脂飲食組中，短雙歧桿菌微粒子組tg含量?jī)H略低于高脂對(duì)照組，而陽(yáng)性對(duì)照組(奧利司他)和兩菌、三菌復(fù)合微粒子組的tg含量要顯著的低于高脂對(duì)照組。其中兩菌、三菌復(fù)合微粒子組血清tg含量又低于陽(yáng)性對(duì)照組(奧利司他)，說明益生菌微粒子對(duì)高脂飲食肥胖小鼠發(fā)揮了降脂的效果，且復(fù)合益生菌效果要優(yōu)于單菌。

2、將小鼠糞便基因組dna的提取，取出預(yù)先保存在-20℃冰箱的糞便樣品，按照糞便基因組dna提取試劑盒操作，并對(duì)各組小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，應(yīng)用pca分析即主成分分析，主成分1(pc1：12.48％)和主成分2(7.77％)代表原有數(shù)據(jù)的20.25％的信息。6組共47只小鼠腸道菌群組成情況被pc1和pc2分在了4個(gè)不同的區(qū)域，空白組(a)被pc1與其他各組顯著分開，短雙歧桿菌微粒子組(d)、兩菌復(fù)合微粒子組(e)、三菌復(fù)合微粒子組(f)中的絕大多數(shù)被pc2與其他各組分開，由此推斷，主成分1為小鼠是否因?yàn)轱曃沽烁咧暳隙l(fā)了肥胖，主成分2為飼喂的微粒子種類(短雙歧桿菌單菌微粒子；植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌兩菌微粒子；短雙歧桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌三菌微粒子)?？梢苑治龅贸觯瞻捉M(a)的腸道菌群組成相比于高脂對(duì)照組(b)、高脂陽(yáng)性對(duì)照組(c)、短雙歧桿菌微粒子組(d)、兩菌復(fù)合微粒子組(e)、三菌復(fù)合微粒子組(f)整體上存在著顯著的差異，而其他五組的小鼠腸道菌群之間差異相對(duì)較小，但這五組之間也存在著明顯的差異分化趨勢(shì)。由以上結(jié)果可知，高脂飼料的喂養(yǎng)使得小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了明顯的變化，微粒子及奧利司他的干預(yù)也使得肥胖模型小鼠的腸道菌群出現(xiàn)不同程度的變化，所有小鼠糞便樣品中共有469個(gè)otu，各組樣品特有的otu為8～16個(gè)；高脂飲食使得小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門與擬桿菌門的比例升高，微膠囊的干預(yù)提高了乳桿菌屬和雙歧桿菌的相對(duì)豐度，在高脂陽(yáng)性對(duì)照組腸道內(nèi)腸桿菌豐度為其它各組的5～21倍，而微膠囊組腸桿菌和變形細(xì)菌的豐度則維持在正常水平。

3、對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行he染色，見圖8，放大倍數(shù)為100×?？瞻捉M如8(a)所示；高脂對(duì)照組如圖8(b)所示；高脂陽(yáng)性對(duì)照組如8(c)所示；短雙歧桿菌微粒子組如圖8(d)所示；兩菌復(fù)合微粒子組如8(e)所示；三菌復(fù)合微粒子組如圖8(f)所示。he染色結(jié)果清楚的表明，高脂肪飲食引起了肝臟脂肪球狀結(jié)構(gòu)變性和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而4周的益生菌微粒子介入顯著的改善了這些異常，其中三菌復(fù)合微粒子組效果優(yōu)于其它組。

4、對(duì)小鼠小腸進(jìn)行he染色，見圖9，空白組：如圖9(a)所示，取材時(shí)外力引起的絨毛排列紊亂，但小腸組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯病變；高脂對(duì)照組：如圖9(b)所示，絨毛粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的空泡，部分腸粘膜有崩解現(xiàn)象；高脂陽(yáng)性對(duì)照組：腸腔內(nèi)腸黏膜有大量崩解，黏膜固有層內(nèi)有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；高脂對(duì)照組：如圖9(c)所示，短雙歧桿菌微粒子組：如圖9(d)所示，兩菌復(fù)合微粒子組：如圖9(e)所示，三菌復(fù)合微粒子組：如圖9(f)所示，均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

5、對(duì)小鼠脂肪進(jìn)行he染色，見圖10，he染色結(jié)果清楚的表明，高脂肪飲食引起了肝臟脂肪球狀結(jié)構(gòu)變性和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而4周的益生菌微粒子介入顯著的改善了這些異常，其中三菌復(fù)合微粒子組效果優(yōu)于其它組。

由本實(shí)施例可知利用果膠包裹益生菌使心材免受貯藏環(huán)境及胃液、腸液和膽汁破壞，使微粒子中包埋的活菌經(jīng)過胃腸道時(shí)得到保護(hù)，從而可以順利到達(dá)腸道，尤其是結(jié)腸。將益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的貯藏穩(wěn)定性，還可為厭氧菌株阻隔外界的高氧環(huán)境；并且以低甲氧基果膠作為微粒子壁材，對(duì)三菌復(fù)合混菌都有很好的包埋效果，微粒子的包埋率達(dá)99％以上。本實(shí)施例所得三菌復(fù)合微粒子貯藏一段時(shí)間以后，其中的活菌數(shù)要明顯的高于裸菌菌粉對(duì)照，可見益生菌微粒子可以顯著地提高產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，且三菌復(fù)合微粒子相對(duì)單一菌株微粒子減重效果更加顯著。