本發(fā)明涉及化學(xué)化工領(lǐng)域，且特別涉及一種竹葉黃酮的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

竹葉黃酮(bambooleavesflavonids)是從竹葉中提取出來的具有生理活性的生物黃酮。竹葉黃酮是竹葉中主要活性成分之一，在竹葉中的含量占1-2％，主要以葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等黃酮碳苷為主，同時，還含有木犀草素、芹菜素等黃酮苷元。與氧苷黃酮相比，竹葉黃酮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解、食用安全性強。

黃酮具有清除氧自由基、抑菌殺菌、消炎、消腫、降血脂等功能，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。竹葉黃酮的提取方法多樣，溶劑提取法、超聲提取法、超臨界提取法等。這些方法獲得的很好的產(chǎn)品，但是成本都較高，使得竹葉黃酮的應(yīng)用受到價格限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種竹葉黃酮的制備方法，此制備方法操作簡單，易于實現(xiàn)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述竹葉黃酮的制備方法制備而得的竹葉黃酮的應(yīng)用，即將竹葉黃酮作為抗氧化劑應(yīng)用于食品加工中，可降低食品的加工成本。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明提出一種竹葉黃酮的制備方法，其包括以下步驟：

將經(jīng)蒸汽沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合酶解，得酶解液。過濾酶解液，收集濾液。以醇-水溶液為洗脫劑，于大孔吸附樹脂層析柱中等度洗脫濾液，收集洗脫液，得竹葉黃酮。

等度洗脫包括第一次洗脫，第一次洗脫是以醇體積濃度為20-30％的醇-水溶液洗脫濾液。

復(fù)合酶溶液含有重量比為0.05-0.4：0.05-1：0.01-0.05的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

本發(fā)明還提出了一種竹葉黃酮的應(yīng)用，即將由上述的竹葉黃酮的制備方法制備而得的竹葉黃酮作為抗氧化劑應(yīng)用于食品加工中。

本發(fā)明實施例的竹葉黃酮的制備方法和應(yīng)用的有益效果是：

蒸汽沖蒸可在滅活竹葉中所含的生物酶的同時，盡可能的保留竹葉原料中的黃酮活性成分。其次，蒸汽沖蒸還能將竹葉中的細(xì)菌滅活。再次，蒸汽沖蒸還能對竹葉起到殺青作用，以利于除去竹葉中的葉綠素。酶解可溶解竹葉中的纖維素、果膠和木聚糖。過濾可除去酶解液中的纖維素、果膠和木聚糖，避免上述物質(zhì)影響黃酮成份的提取，降低提取難度和成本。選擇醇體積濃度為20-30％的醇-水溶液進(jìn)行等度洗脫，可使黃酮的洗脫效果最佳，洗脫出的黃酮量最大，且雜質(zhì)含量最少。

因此，本發(fā)明實施例的竹葉黃酮的制備方法操作簡單，易于實現(xiàn)，且竹葉黃酮的得率及純度均較高。將其作為抗氧化劑應(yīng)用于食品加工中，可降低食品的加工成本。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的竹葉黃酮的制備方法和應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

本實施例中例如可以選擇毛竹、淡水竹等品種的竹葉為原料，較佳地，上述竹葉例如采自新鮮竹葉。以新鮮竹葉為原料，一方面可避免黃酮成分流失，另一方面還便于原料的加工，降低原料的加工成本。

對上述原料進(jìn)行蒸汽沖蒸。蒸汽沖蒸例如可以用壓強為0.2-0.6mpa的蒸汽對竹葉原料沖蒸20-40min。因新鮮竹葉中含有多種生物活性酶，生物活性酶可改變竹葉中竹葉黃酮的含量和比例，故通過蒸汽沖蒸，可在滅活生物酶的同時，盡可能的保留竹葉原料中的黃酮活性成分。其次，蒸汽沖蒸還能將竹葉中的細(xì)菌滅活。再次，蒸汽沖蒸還能對竹葉起到殺青作用，以利于除去竹葉中的葉綠素。

將經(jīng)蒸汽沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合酶解，得到酶解液。作為可選地，竹葉與復(fù)合酶溶液可按1g：1ml的比例混合，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.1-0.5％。復(fù)合酶例如可以含有重量比為0.05-0.4：0.05-0.1：0.01-0.05的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。纖維素酶主要用于酶解竹葉原料中的纖維素，果膠酶主要用于酶解竹葉原料中的果膠酶，木聚糖酶主要用于酶解竹葉原料中的木聚糖。按上述比例將三種酶混合，可對竹葉原料中的纖維素、果膠和木聚糖同時起到充分酶解的作用。

具體地，酶解例如可在40-60℃的條件下進(jìn)行5-15h。優(yōu)選地，酶解溫度可以為45-55℃，此酶解溫度可使纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶對竹葉原料的酶解效果較為均衡，達(dá)到最佳狀態(tài)。酶解過程中還可對酶解物進(jìn)行攪拌，以提高酶解程度。

過濾上述酶解液，得到濾液。作為可選地，本實施例中的過濾可包括第一次過濾，第一次過濾是用堿性溶液以10-15ml/min的速度滲濾酶解液2-3h，得到第一濾液。其中，堿性溶液例如可以為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉和氫氧化鈣。優(yōu)選為氫氧化鈣，該物質(zhì)不僅具有較強的堿性作用，而且可較其它堿性物質(zhì)對酶解液起到更優(yōu)的除雜效果。經(jīng)第一次過濾的滲濾作用，酶解液中的纖維素、果膠、木聚糖類以及其它雜質(zhì)即可得以除去。

進(jìn)一步地，因滲濾后的第一濾液中所含有的黃酮成分在堿性物質(zhì)的作用下，環(huán)狀結(jié)構(gòu)變成了開環(huán)狀態(tài)，不利于后續(xù)的柱層析操作。故，本實施例中的過濾還包括第二次過濾，第二次過濾是用酸性溶液調(diào)節(jié)第一濾液至ph為6-8，然后除去固體。其中，酸性溶液例如可以為鹽酸和硫酸等。為了節(jié)約柱層析洗脫劑的用量以及縮短柱層析的時間，本實施例中還將濾液進(jìn)行濃縮至其比重為1.05-1.1。

然后，以醇-水溶劑為洗脫劑，于大孔吸附樹脂層析柱中等度洗脫上述濾液，收集洗脫液，得到竹葉黃酮。其中，洗脫劑優(yōu)選為乙醇-水溶劑，以便于將獲得的竹葉黃酮用于食品加工中。

在洗脫前，將濾液濃縮物進(jìn)行上柱于大孔吸附樹脂層析柱中，上柱速度例如可控制在1-5l/min范圍內(nèi)，以使濾液濃縮物上柱均勻。上柱完后，可先用去離子水進(jìn)行預(yù)洗脫，將大孔吸附樹脂層析柱中的雜質(zhì)除去。

然后，進(jìn)行等度洗脫。作為可選地，本實施例中的等度洗脫例如可以包括第一次洗脫。第一次洗脫是以醇體積濃度為20-30％的醇-水溶液洗脫。洗脫過程中，可將第一次洗脫的洗脫速度控制在1.5-3.5l/min，第一次洗脫的洗脫體積控制在450-650l。較優(yōu)地，以500l的醇體積濃度為25％的乙醇-水溶液，以1.5l/min的速度進(jìn)行洗脫，該洗脫條件下的乙醇-水溶液對黃酮成分的洗脫效果最佳。

由于第一次洗脫雖能洗脫出原料中大部分的黃酮活性成分，但還殘留部分不能洗脫出的黃酮活性成分。故本實施例還可包括第二次洗脫，第二次洗脫是以醇體積濃度為60-75％的醇-水溶液洗脫第一次洗脫后大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分。洗脫過程中，可將第二次洗脫的洗脫速度控制在2-3l/min，第二次洗脫的洗脫體積控制在300-500l。較優(yōu)地，以400l的醇體積濃度為67.5％的乙醇-水溶液，以2.5l/min的速度進(jìn)行洗脫，該洗脫條件下的乙醇-水溶液對剩余黃酮活性成分的洗脫效果最佳，從而將大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分含量降到最低。

因制備而得竹葉黃酮具有較強的抗氧化能力，故可將竹葉黃酮作為抗氧化劑用于制備抗氧化劑或直接用于食品加工中。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例1

選擇200kg新鮮毛竹竹葉為原料，以0.2mpa的蒸汽對該原料沖蒸40min。然后以1g：1ml將沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合，并于40℃的條件下酶解15h，得到酶解液。其中，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.1％，該復(fù)合酶含有重量比為0.05：0.05：0.01的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

用氫氧化鈉以10ml/min的速度滲濾酶解液3h，得到第一濾液。然后再用甲醇體積濃度為20％的甲醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為1.5l/min、洗脫體積為450l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一濾液進(jìn)行等度洗脫，收集洗脫液，得到竹葉黃酮。

實施例2

選擇200kg新鮮淡水竹竹葉為原料，以0.6mpa的蒸汽對該原料沖蒸20min。然后以1g：1ml將沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合，并于60℃的條件下酶解5h，得到酶解液。其中，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.5％，該復(fù)合酶含有重量比為0.4：0.1：0.05的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

用氫氧化鉀以15ml/min的速度滲濾酶解液2h，得到第一濾液。然后用鹽酸調(diào)節(jié)第一濾液至ph為6，然后除去固體，將除去固體后的濾液進(jìn)行濃縮至濾液比重為1.05，得到濾液濃縮物。

將上述濾液濃縮物以1l/min的上柱速度上柱于大孔吸附樹脂層析柱中，然后用去離子水進(jìn)行預(yù)洗脫，將大孔吸附樹脂層析柱中的雜質(zhì)除去。然后再用乙醇體積濃度為30％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為3.5l/min、洗脫體積為650l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一濾液進(jìn)行第一次洗脫，收集第一次洗脫后的洗脫液作為第一洗脫液。

然后，用乙醇體積濃度為60％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為2l/min、洗脫體積為300l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一次洗脫后大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分進(jìn)行第二次洗脫，收集第二次洗脫后的洗脫液作為第二洗脫液。

上述第一洗脫液和第二洗脫液中均含有竹葉黃酮，共同最為最終的竹葉黃酮。

實施例3

選擇200kg新鮮毛竹竹葉為原料，以0.4mpa的蒸汽對該原料沖蒸30min。然后以1g：1ml將沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合，并于50℃的條件下酶解10h，得到酶解液。其中，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.3％，該復(fù)合酶含有重量比為0.225：0.075：0.03的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

用碳酸氫鈉以12.5ml/min的速度滲濾酶解液2.5h，得到第一濾液。然后用硫酸調(diào)節(jié)第一濾液至ph為8，然后除去固體，將除去固體后的濾液進(jìn)行濃縮至濾液比重為1.1，得到濾液濃縮物。

將上述濾液濃縮物以5l/min的上柱速度上柱于大孔吸附樹脂層析柱中，然后用去離子水進(jìn)行預(yù)洗脫，將大孔吸附樹脂層析柱中的雜質(zhì)除去。然后再用乙醇體積濃度為25％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為2.5l/min、洗脫體積為550l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一濾液進(jìn)行第一次洗脫，收集第一次洗脫后的洗脫液作為第一洗脫液。

然后，用乙醇體積濃度為75％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為3l/min、洗脫體積為500l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一次洗脫后大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分進(jìn)行第二次洗脫，收集第二次洗脫后的洗脫液作為第二洗脫液。

上述第一洗脫液和第二洗脫液中均含有竹葉黃酮，共同最為最終的竹葉黃酮。

實施例4

選擇200kg新鮮淡水竹竹葉為原料，以0.3mpa的蒸汽對該原料沖蒸35min。然后以1g：1ml將沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合，并于45℃的條件下酶解7.5h，得到酶解液。其中，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.2％，該復(fù)合酶含有重量比為0.1：0.065：0.02的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

用氫氧化鈣以11.5ml/min的速度滲濾酶解液2.3h，得到第一濾液。然后用鹽酸調(diào)節(jié)第一濾液至ph為7，然后除去固體，將除去固體后的濾液進(jìn)行濃縮至濾液比重為1.075，得到濾液濃縮物。

將上述濾液濃縮物以3l/min的上柱速度上柱于大孔吸附樹脂層析柱中，然后用去離子水進(jìn)行預(yù)洗脫，將大孔吸附樹脂層析柱中的雜質(zhì)除去。然后再用乙醇體積濃度為22.5％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為2l/min、洗脫體積為500l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一濾液進(jìn)行第一次洗脫，收集第一次洗脫后的洗脫液作為第一洗脫液。

然后，用乙醇體積濃度為67.5％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為2.5l/min、洗脫體積為400l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一次洗脫后大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分進(jìn)行第二次洗脫，收集第二次洗脫后的洗脫液作為第二洗脫液。

上述第一洗脫液和第二洗脫液中均含有竹葉黃酮，共同最為最終的竹葉黃酮。

實施例5

選擇200kg新鮮淡水竹和毛竹竹葉共同作為原料，以0.5mpa的蒸汽對該原料沖蒸25min。然后以1g：1ml將沖蒸后的竹葉與復(fù)合酶溶液混合，并于55℃的條件下酶解12.5h，得到酶解液。其中，復(fù)合酶溶液中的復(fù)合酶的質(zhì)量濃度為0.4％，該復(fù)合酶含有重量比為0.3：0.085：0.04的纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶。

用氫氧化鈣以14.5ml/min的速度滲濾酶解液2.8h，得到第一濾液。然后用鹽酸調(diào)節(jié)第一濾液至ph為6.5，然后除去固體，將除去固體后的濾液進(jìn)行濃縮至濾液比重為1.55，得到濾液濃縮物。

將上述濾液濃縮物以3l/min的上柱速度上柱于大孔吸附樹脂層析柱中，然后用去離子水進(jìn)行預(yù)洗脫，將大孔吸附樹脂層析柱中的雜質(zhì)除去。然后再用乙醇體積濃度為25％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為1.5l/min、洗脫體積為500l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一濾液進(jìn)行第一次洗脫，收集第一次洗脫后的洗脫液作為第一洗脫液。

然后，用乙醇體積濃度為67.5％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，以洗脫速度為2.5l/min、洗脫體積為400l的洗脫條件，于大孔吸附樹脂層析柱中對第一次洗脫后大孔吸附樹脂層析柱中剩余的黃酮活性成分進(jìn)行第二次洗脫，收集第二次洗脫后的洗脫液作為第二洗脫液。

上述第一洗脫液和第二洗脫液中均含有竹葉黃酮，共同最為最終的竹葉黃酮。

試驗例1

重復(fù)上述實施例1-5，得到足夠多的竹葉黃酮。分別測定實施例1-5中洗脫出的竹葉黃酮中所含的總黃酮的重量和得率(以洗脫液中竹葉黃酮占洗脫液的重量百分?jǐn)?shù)計)，并計算最終竹葉黃酮的得率(以所有洗脫液中竹葉黃酮的總量占竹葉原料中總黃酮重量的百分?jǐn)?shù)計)，其結(jié)果如表1所示。

表1竹葉黃酮含量及得率

由表1可以看出，經(jīng)本實施例中的竹葉黃酮的制備方法所制備出的黃酮含量較高，且較以相同原料通過溶劑提取法、超聲提取法和超臨界提取法所得到的黃酮含量(0.5-0.8％)要高，說明本實施例中的竹葉黃酮的制備方法有效可行。此外，經(jīng)試驗對比，本實施例1-5所得到的竹葉黃酮中黃酮的純度較通過溶劑提取法、超聲提取法和超臨界提取法所得到的要高8.3-11.4％，成本低17-21％。

進(jìn)一步地，通過對實施例1-5所得的竹葉黃酮進(jìn)行羥基自由基清除率試驗，得到以下結(jié)論：竹葉黃酮的濃度在0.4-0.8ug/ul范圍內(nèi)時，其對羥基自由基清除率可到50％-89％。因此說明本發(fā)明實施例制備出的竹葉黃酮具有較強的自由基清除效果，也即具有較強的抗氧化性。

故，可將上述所得的竹葉黃酮作為抗氧化劑用于食品加工或其它含有抗氧化劑的產(chǎn)品中。

綜上所述，本發(fā)明實施例的竹葉黃酮的制備方法操作簡單，易于實現(xiàn)，且竹葉黃酮的得率及純度均較高。將其作為抗氧化劑應(yīng)用于食品加工中，可降低食品的加工成本。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。