本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯(lián)的糖接枝蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

糖接枝蛋白是基于maillard反應(yīng)機理的一種綠色高效的蛋白改性方法，該方法不需外加化學(xué)試劑，僅加熱即可自發(fā)形成糖-蛋白復(fù)合物，安全性高、快速、穩(wěn)定，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。蛋白質(zhì)多肽鏈中糖鏈的引入，使蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，如溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、起泡性、凝膠性等得到顯著改善，甚至增加某些蛋白質(zhì)的抗氧化性、抑菌性和降低免疫原性，可作為天然防腐劑。糖接枝蛋白為具有球狀形貌的兩親性接枝共聚物，較強兩親性使其能夠在水中自組裝為膠束，該膠束可包埋β-胡蘿卜素、姜黃素、布洛芬等疏水性物質(zhì)，且負載效率高，可作為靶向藥物載體或營養(yǎng)遞送載體，或作為天然表面活性劑應(yīng)用于乳液體系。糖接枝蛋白技術(shù)為研究和開發(fā)新型食品添加劑提供了一條新的途徑，目前該研究在國內(nèi)外食品功能性添加劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域有良好的發(fā)展前景。

cn105669825a公開了“一種基于可溶性大豆多糖的糖基化及其制備方法”。將蛋白和大豆多糖分別溶解混合后凍干為粉末，在溫度為60℃、濕度為79％的干燥器中反應(yīng)7-14天，將反應(yīng)物復(fù)溶離心后取上清干燥得到糖基化蛋白。此法反應(yīng)時間很長，所得物質(zhì)褐變程度大、副產(chǎn)物多，不能完全保證得到maillard反應(yīng)初期產(chǎn)物；反應(yīng)條件要求濕度為79％、需凍干兩次等條件苛刻，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)難以實現(xiàn)，因此限制了此方法的實際應(yīng)用。

cn101429226a公開了“一種蛋白質(zhì)-多糖接枝耦聯(lián)技術(shù)改善大米蛋白功能性質(zhì)的方法”。將大米蛋白在ph為12條件下溶解后與糖基混合，在ph為11、90℃條件下反應(yīng)20min，將混合液冷凍干燥得到產(chǎn)物。此法條件為高溫強堿，條件極端，所得產(chǎn)品副產(chǎn)物多，褐變程度大，不能完全保證得到maillard反應(yīng)初期產(chǎn)物；工業(yè)化生產(chǎn)中污水處理成本高，因此限制了此方法的實際應(yīng)用。

葡聚糖(dextran)是由蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌發(fā)酵后形成的高分子葡聚糖聚合物，具有綠色、安全的特點。其分子主鏈由α(1→6)糖苷鍵連接的葡萄糖單位聚合而成，形成簡單的直鏈結(jié)構(gòu)，其中每個葡聚糖分子都含一個還原末端，可發(fā)生接枝耦聯(lián)反應(yīng)。作為中性多糖的葡聚糖具有優(yōu)良的水溶性、穩(wěn)定性，具有在體內(nèi)不被胃液消化而可被腸道內(nèi)葡聚糖酶降解的特點，是一種潛在的優(yōu)良人體結(jié)腸靶向藥物載體。其也具有良好的生理功能：清除游離自由基、抗輻射、溶解膽固醇、預(yù)防高脂血癥及調(diào)整體內(nèi)消化道的微生態(tài)，促進有益菌增值等。葡聚糖是一種良好的蛋白質(zhì)糖基化修飾反應(yīng)物，能夠明顯改善蛋白的各種功能特性，是具有特殊功能性質(zhì)的蛋白配料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種反應(yīng)時間短，接枝度高，安全、穩(wěn)定，可有效降低產(chǎn)品褐變度的一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯(lián)的糖接枝蛋白的制備方法，可用于蛋白改性或?qū)δ苄誀I養(yǎng)因子/藥物進行包埋，用于營養(yǎng)/藥物遞送體系。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種基于葡聚糖與大豆蛋白耦聯(lián)的糖接枝蛋白的制備方法，其具體步驟如下：

(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制

將葡聚糖和大豆蛋白按照質(zhì)量比1∶1～1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml～21.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述混合液調(diào)節(jié)ph至6.8～7.2，勻速攪拌1～2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；

(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液低溫溫浴

將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調(diào)節(jié)溫度為50～60℃，溫浴50～60min；

(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續(xù)接枝反應(yīng)

將經(jīng)恒溫水浴搖床預(yù)反應(yīng)的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度為80～85℃，反應(yīng)時間為10～15min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續(xù)溫浴，溫度為50～60℃，時間30～40min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環(huán)反應(yīng)，經(jīng)過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應(yīng)1次，共計反應(yīng)6～8次后結(jié)束，然后將反應(yīng)物冰浴3～5min；

(4)接枝物的提取與提純

將(3)制備的反應(yīng)產(chǎn)物調(diào)節(jié)ph值至4.0～5.0，在0～4℃下以8000～10000g離心力離心15～20min；取上清液后進行超濾離心，轉(zhuǎn)速為2000～2500rpm，時間為10～15min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

進一步的，步驟(1)所述葡聚糖的分子量為40～50kda。

進一步的，步驟(1)所述大豆蛋白的蛋白純度≥95％。

進一步的，步驟(1)和步驟(4)調(diào)ph值采用濃度為0.1mol/l的hcl溶液或濃度為0.1mol/l的naoh溶液。

進一步的，步驟(1)勻速攪拌時，攪拌速度為100～150r/min，低速攪拌能夠使多糖和蛋白分子進行重排而不發(fā)生變性，未反應(yīng)分子間能夠更充分地相互結(jié)合參與下一步反應(yīng)。

進一步的，步驟(2)和步驟(3)的恒溫水浴搖床的轉(zhuǎn)速為100～150r/min，搖床轉(zhuǎn)動攪拌能夠降低蛋白的變性熱聚集效應(yīng)，使蛋白重新分散增大接枝度。

進一步的，步驟(1)所述混合液調(diào)節(jié)ph至7，以提高產(chǎn)品溶解性。

進一步的，所述溶液均是用滅菌雙蒸水配制。

本發(fā)明的有益效果：

(1)選擇將混合溶液放入溫度為50～60℃的恒溫水浴搖床中初步溫浴，其中7s形式的球蛋白開始變性溫度在60～70℃，β-伴大豆球蛋白在60～75℃開始變性，因此在低于其變性范圍進行溫浴既提高溫度，又使蛋白在未變性范圍慢慢溫浴以備進一步反應(yīng)。采用分級連續(xù)反應(yīng)的方式使大豆蛋白與多糖進行反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高，短時間內(nèi)即可得到高接枝度產(chǎn)物；接枝物為美拉德反應(yīng)初級產(chǎn)物，安全穩(wěn)定，沒有褐變。

(2)葡聚糖具有良好的溶解分散穩(wěn)定性，使產(chǎn)物具有很好的溶解性，有效提高蛋白在等電點的溶解能力，同時得到功能性優(yōu)越的糖基化蛋白，有效提高蛋白的溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性、起泡性等各種性能。所得糖接枝蛋白為兩親性接枝共聚物，可以用于蛋白改性或?qū)δ苄誀I養(yǎng)因子/藥物進行包埋，用于營養(yǎng)/藥物遞送體系，具有良好的市場前景。

具體實施方式

實施例1

(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制

將0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，用0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌1h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為40kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；

(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預(yù)反應(yīng)

將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調(diào)節(jié)溫度為50℃、轉(zhuǎn)速為100r/min，溫浴50min；

(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續(xù)接枝反應(yīng)

將經(jīng)恒溫水浴搖床預(yù)反應(yīng)的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度為80℃，反應(yīng)時間為15min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續(xù)溫浴，溫度為50℃、轉(zhuǎn)速為100r/min，時間30min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環(huán)反應(yīng)，經(jīng)過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應(yīng)1次，共計反應(yīng)8次后結(jié)束，然后將反應(yīng)物冰浴5min。

(4)接枝物的提取與提純

將(2)制備的反應(yīng)產(chǎn)物所述混合液以0.1mhcl調(diào)節(jié)使ph值為4.0，在4℃下以8000g離心力離心15min；取上清液后進行超濾離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間為10min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

實施例2

(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制

將葡聚糖和大豆蛋白按照質(zhì)量比1.25∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質(zhì)量體積比為17.5mg/ml，所述大豆蛋白與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以125r/min勻速攪拌1.5h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為50kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；

(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預(yù)反應(yīng)

將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調(diào)節(jié)溫度為55℃、轉(zhuǎn)速為125r/min，溫浴55min；

(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續(xù)接枝反應(yīng)

將經(jīng)恒溫水浴搖床預(yù)反應(yīng)的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度為83℃，反應(yīng)時間為13min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續(xù)溫浴，溫度為55℃、轉(zhuǎn)速為125r/min，時間35min；再次于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度83℃，反應(yīng)時間為13min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環(huán)反應(yīng)，經(jīng)過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應(yīng)1次，共計反應(yīng)7次后結(jié)束，然后將反應(yīng)物冰浴5min。

(4)接枝物的提取與提純

將(2)制備的反應(yīng)產(chǎn)物所述混合液以0.1mhcl調(diào)節(jié)使ph值為4.5，在4℃下以9000g離心力離心18min；取上清液后進行超濾離心，轉(zhuǎn)速為2300rpm，時間為13min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

實施例3

(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制

將葡聚糖和大豆蛋白按照質(zhì)量比1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質(zhì)量體積比為21.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以150r/min勻速攪拌2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量為50kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；

(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液預(yù)反應(yīng)

將步驟(1)制備的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴，調(diào)節(jié)溫度為50℃、轉(zhuǎn)速為150r/min，溫浴60min；

(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步連續(xù)接枝反應(yīng)

將經(jīng)恒溫水浴搖床預(yù)反應(yīng)的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度為85℃，反應(yīng)時間為10min；然后置于恒溫水浴搖床中繼續(xù)溫浴，溫度為50℃、轉(zhuǎn)速為150r/min，時間40min；再次于恒溫水浴鍋中進行接枝反應(yīng)，溫度85℃，反應(yīng)時間為10min；將葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床交替循環(huán)反應(yīng)，經(jīng)過恒溫水浴鍋和恒溫水浴搖床處理一次計反應(yīng)1次，共計反應(yīng)6次后結(jié)束，然后將反應(yīng)物冰浴3min。

(4)接枝物的提取與提純

將(2)制備的反應(yīng)產(chǎn)物所述混合液以0.1mhcl調(diào)節(jié)使ph值為5.0，在4℃下以10000g離心力離心20min；取上清液后進行超濾離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間為15min；取上清液凍干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

對比例1

將0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，葡聚糖的分子量為40kda，大豆蛋白的蛋白純度為95％；以0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌1h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為80℃，反應(yīng)時間為380min進行接枝反應(yīng)，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

對比例2

將葡聚糖和大豆蛋白按照質(zhì)量比1.3∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質(zhì)量體積比為17.5mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以125r/min勻速攪拌1.5h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為83℃，反應(yīng)時間為365min進行接枝反應(yīng)，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

對比例3

將葡聚糖和大豆蛋白按照質(zhì)量比1∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述大豆蛋白與水的質(zhì)量體積比為14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh調(diào)節(jié)使ph為7.0，用磁力攪拌器以100r/min勻速攪拌2h；將混合液置于恒溫水浴鍋中以溫度為85℃，反應(yīng)時間為320min進行接枝反應(yīng)，然后放入冰浴中冷卻5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。

表1接枝度與褐變指數(shù)

由表1可看出目標(biāo)產(chǎn)物的接枝度與褐變程度與對照相比，接枝度顯著高，褐變程度顯著低。

分別采用實施例1～實施例3的方法制備葡聚糖-大豆蛋白接枝物，只改變步驟(1)混合液的ph值，其它內(nèi)容不變，測試最終產(chǎn)物的溶解度，結(jié)果如表1所示。

表2產(chǎn)物溶解度(％)隨ph的變化

由表2可知，目標(biāo)產(chǎn)物的溶解度與對照相比，目標(biāo)產(chǎn)物的溶解度受等電點的影響顯著減小，在ph＝7處有很好的溶解性。

表3乳化活性與乳化穩(wěn)定性

由表3可得到，目標(biāo)接枝物乳化活性和乳化穩(wěn)定性較強。

表4熱穩(wěn)定性

由表4可得到，目標(biāo)接枝物的熱穩(wěn)定性很好。

表5起泡能力與泡沫穩(wěn)定性

由表5可得到目標(biāo)接枝物的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性很好。

以上僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。