本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及漢遜德巴利酵母在發(fā)酵改善黑茶制品風(fēng)味中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、茯磚茶是一種中國傳統(tǒng)黑茶，其特點(diǎn)是滋味醇厚，具有獨(dú)特的“菌花香”風(fēng)味，并具有多種保健功效，包括調(diào)節(jié)腸道微生物、抗高脂血癥、抗氧化和降血糖等作用。茯磚茶的生產(chǎn)工藝主要包括堆制、蒸制、壓制、微生物發(fā)酵和干燥。茯磚茶的特殊香味和保健功效得益于生產(chǎn)過程中的微生物發(fā)酵階段。微生物分泌多種胞外酶，催化許多復(fù)雜的生化反應(yīng)，極大地促進(jìn)了黑茶獨(dú)特風(fēng)味和品質(zhì)的形成。

2、近年來，人們對茯磚茶生產(chǎn)過程中的微生物組成進(jìn)行了大量研究，探討它們與茯磚茶特殊香氣形成的關(guān)系。茯磚茶中的關(guān)鍵氣味化合物主要包括芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、α-紫羅蘭酮、苯乙酮、β-紫羅蘭酮和α-松油醇，它們共同構(gòu)成了茯磚茶獨(dú)特的“菌花香”。近年來，已有一些工作闡明了微生物發(fā)酵對茯磚茶形成特征香氣的影響。據(jù)報(bào)道，漢遜德巴利酵母是茯磚茶后發(fā)酵階段的優(yōu)勢微生物，也是茯磚茶形成特征香氣的核心功能微生物。在整個茯磚茶制造過程中，化學(xué)成分的變化與漢遜德巴利酵母的存在之間存在密切聯(lián)系。因此，漢遜德巴利酵母對形成茯磚茶的獨(dú)特風(fēng)味至關(guān)重要。

3、漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)是許多發(fā)酵食品(如香腸、奶酪和葡萄酒)中的一種重要微生物，屬于“一般認(rèn)為安全”的微生物類別。固態(tài)發(fā)酵(ssf)是一種經(jīng)濟(jì)高效的生物技術(shù)方法，具有操作簡單、生產(chǎn)成本低、發(fā)酵代謝產(chǎn)物得率高、對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，目前已在諸多研究領(lǐng)域如前體化合物的生物轉(zhuǎn)化改構(gòu)、有機(jī)化合物的生物轉(zhuǎn)化與合成、藥用成分篩選、新藥開發(fā)以及藥物代謝研究等中得到廣泛應(yīng)用。微生物固態(tài)發(fā)酵黑茶的過程中會產(chǎn)生豐富的酶系(α-淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等)，降解茶葉中的大分子物質(zhì)，提高生物活性成分利用率，同時賦予茶品獨(dú)特的色、香、味品質(zhì)。

4、cn113355249a公開了一種漢遜德巴利酵母菌株及其應(yīng)用，發(fā)酵顯著提升了煙葉品質(zhì)；cn116064253a公開了一種漢遜德巴利酵母cmrc?5y及其在發(fā)酵腌臘肉制品中的應(yīng)用，沒有公開將漢遜德巴利酵母用于黑茶加工中的應(yīng)用；cn104560747a公開漢遜德巴利酵母菌及其發(fā)酵液、混合發(fā)酵液和在二次發(fā)酵蔬菜中的應(yīng)用，公開使用含有漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08的發(fā)酵液用于蔬菜發(fā)酵，縮短生產(chǎn)周期，提高經(jīng)濟(jì)效益。雖然目前對于黑茶的研究與開發(fā)已經(jīng)較多，但大都停留在傳統(tǒng)的黑茶制品開發(fā)與研究，缺乏創(chuàng)新性的、精細(xì)加工的黑茶產(chǎn)品的開發(fā)與利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一株茶源漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08及其在固態(tài)發(fā)酵黑茶中的應(yīng)用。將從傳統(tǒng)茯磚茶中分離篩選出來的優(yōu)勢菌株漢遜德巴利酵母菌應(yīng)用到黑茶中，提高黑茶風(fēng)味化合物的種類和含量，提升黑茶的風(fēng)味。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

3、首先，本發(fā)明提供一種漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08，該菌株是從傳統(tǒng)茯磚茶中分離獲得的，適用于作為發(fā)酵黑茶的發(fā)酵劑。分類命名為漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08，其保藏編號為cgmcc?no.5770，于2012年02月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，經(jīng)檢測，存活，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

4、本發(fā)明還提供一種含有漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08的發(fā)酵劑。

5、同時，本發(fā)明提供一種所述的漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08發(fā)酵劑的制備方法，該方法包括以下步驟：

6、(1)將所述漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08在無菌的條件下接入ypd液體培養(yǎng)基(2％葡萄糖、2％胰蛋白胨、1％酵母膏)中進(jìn)行傳代；

7、(2)將活化后的菌株在無菌條件下轉(zhuǎn)接至ypd培養(yǎng)基，在28℃、120rpm的條件下培養(yǎng)48h，待培養(yǎng)基中長出大量酵母菌體；

8、(3)在無菌的條件下，用接種環(huán)鉤取1～2環(huán)菌體接種于ypd液體培養(yǎng)基，在相同溫度下再次繁殖。隨后，將酵母菌體洗滌兩次后收集，然后在無菌水中重懸，以獲得漢遜德巴利酵母發(fā)酵劑。

9、同時，本發(fā)明還提供一種漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08固態(tài)發(fā)酵黑茶的制備方法，該方法包括以下步驟：

10、(1)將稱量好的黑毛茶裝按比例稱至加有超純水的錐形瓶中，分裝；

11、(2)分裝好后將樣品進(jìn)行高溫高壓滅菌；

12、(3)待溫度降至室溫后(25℃)，將漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08發(fā)酵劑接種于黑毛茶基質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵；

13、(4)將發(fā)酵后得到的成品真空冷凍干燥，然后裝入無菌聚乙烯袋中。

14、在制備方法中，優(yōu)選地，步驟(1)中，所述黑毛茶選用的是一級黑毛茶，所述黑毛茶質(zhì)量和水體積單位分別是g和ml，黑毛茶和水的質(zhì)量體積比為1:5。

15、在制備方法中，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述高溫高壓滅菌的具體條件為：121℃下滅菌20min。

16、在制備方法中，優(yōu)選地，步驟(3)中，所述漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)w08以106～107個/ml的細(xì)胞計(jì)數(shù)被接種，所述發(fā)酵的具體條件為28℃下發(fā)酵22天。

17、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，黑茶經(jīng)漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08固態(tài)發(fā)酵后，揮發(fā)性化合物的含量顯著提高。通過基于頂空氣相色譜-離子遷移譜(hs-gc-ims)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gc-ms)的分析表明，使用漢遜德巴利酵母固態(tài)發(fā)酵顯著降低了具有青氣的揮發(fā)物的含量，而具有花香和薄荷香的揮發(fā)性有機(jī)化合物的濃度顯著增加，如苯乙醇、水楊酸甲酯、β-大馬烯酮、芳樟醇、芳樟醇氧化物i和芳樟醇氧化物ii。因此，漢遜德巴利酵母的代謝有助于固態(tài)發(fā)酵期間黑茶風(fēng)味特性的改善。

18、除對黑茶揮發(fā)性成分的變化外，我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)該法制備的發(fā)酵黑茶中，α-淀粉酶、多酚氧化酶、單寧酶、過氧化物酶和纖維素酶的活性都呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵10天時酶活性最高。發(fā)酵過程中酵母產(chǎn)生了大量的胞外酶，參與脂肪酸、氨基酸、黃酮類化合物和其他芳香前體的分解、糖基化、氧化和甲基化反應(yīng)，催化形成了一些特殊揮發(fā)物的生物合成。如漢遜德巴利酵母分泌的纖維素酶可將黑茶中的粗纖維降解為可溶性糖，從而對黑茶的甜味有一定改善作用。多酚氧化酶可降解茶多酚形成茶黃素和茶紅素，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為茶褐素，賦予茶湯獨(dú)特的紅褐色并降低茶湯的苦澀味。水楊酸甲酯可以由β-葡萄糖苷酶水解生成，而芳樟醇及其氧化物的生成也與微生物酶密切相關(guān)。綜上，漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08對黑茶中獨(dú)特芳香化合物的形成和調(diào)節(jié)做出了重要貢獻(xiàn)。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

20、(1)本發(fā)明菌株來源于傳統(tǒng)茯磚茶，具有天然綠色的特點(diǎn)，更容易獲得現(xiàn)代消費(fèi)者的認(rèn)可。此外，固態(tài)發(fā)酵工藝條件易于控制，操作簡單，制備過程節(jié)能環(huán)保、無廢水廢氣廢料產(chǎn)生，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

21、(2)本發(fā)明制備的發(fā)酵黑茶能使黑茶的整體風(fēng)味轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓ㄏ恪⒐愕莫?dú)特香氣。經(jīng)漢遜德巴利酵母(debaryomyces?hansenii)w08代謝轉(zhuǎn)化后，能顯著改善黑茶的風(fēng)味特征，賦予黑茶獨(dú)特的色、香、味外。

22、(3)將本發(fā)明提供的菌株運(yùn)用于黑茶等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，對于降低生產(chǎn)成本、提高發(fā)酵黑茶制品的質(zhì)量和品質(zhì)具有深遠(yuǎn)的意義。