本發(fā)明涉及功能性食品及化妝品原料制備，更具體地，涉及一種具有抗衰老作用的水翁花提取物的制備方法及其應用。

背景技術：

1、皮膚老化受到內部因素和外部因素影響。彈性蛋白在皮膚結構中于皮膚的真皮層中，由許多稱為彈性蛋白原的單體組成，這些單體通過交聯(lián)形成一個復雜的網絡結構。這種交聯(lián)結構使得彈性蛋白具有高度的彈性，能夠承受多次的形變而不易斷裂，從而使皮膚富有彈性和緊致。雖然含量只有總皮膚蛋白的2-4％，但其對皮膚結構的維持至關重要，彈性蛋白的合成減少和彈性纖維破碎化會導致皮膚老化。彈性蛋白酶是一種廣泛存在于機體中酶，能降解彈性蛋白。正常條件下，機體存在著彈性蛋白酶天然抑制劑，防止彈性蛋白被降解。但在機體衰老、長期紫外線輻射等病理情況下，彈性蛋白酶抑制劑濃度下降，或彈性蛋白酶活性升高，彈性蛋白與彈性蛋白酶之間的動態(tài)平衡被破壞，彈性蛋白被降解。皮膚組織失去結構支撐喪失彈性，致使皮膚松弛、衰老。

2、此外，自由基是皮膚衰老的重要原因，它們不僅會損傷端粒、而且也會破壞皮膚中的膠原蛋白和彈性纖維，導致皮膚松弛、皺紋增多等問題。因此，具有抗氧化清除自由基和抑制彈性蛋白酶活性物質的挖掘是制備抗皮膚衰老活性成分的關鍵。

3、水翁花，學名：cleistocalyx?operculatus，是桃金娘科的常綠喬木。原產于亞洲熱帶地區(qū)，我國南方各省均有栽培或野生。它不僅具有較高觀賞價值而且還具有一定的藥用價值，據《嶺南采藥錄》記載：“入藥用，以舊為佳。其花，味苦，性寒，清熱，解毒，消食滯?！绷硗猓袒ㄟ€具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，可以用于外傷的處理和皮膚的護理。

4、目前針對水翁花在抗衰老領域的應用研究，主要存在以下幾個不足點：

5、1、成分復雜，使用多種不同的活性物質，不僅增加了成本，而且生產時需要精確控制各成分的比例和配比，制備要求高，操作復雜。

6、2、多種成分的混合；單一、天然成分更受消費者親睞。

7、3、多種成分協(xié)同作用，使得評估每種成分的具體貢獻變得復雜。在臨床試驗和效果評估時，難以確定每種成分對最終抗衰老效果的具體貢獻。

8、因此，本領域迫切需要開發(fā)一種具有抗衰老作用的水翁花提取物的制備方法及其應用。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明的目的是一種具有抗衰老作用的水翁花提取物的制備方法及其應用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種具有抗衰老作用的水翁花提取物的制備方法，包括將干燥、粉碎、過篩后的水翁花，在20-90℃溫度下，用水或有機溶劑以一定固液比進行提取，從而提取出所述具有抗衰老作用的水翁花提取物。

3、在另一優(yōu)選例中，所述水翁花包括水翁花花蕾。

4、在另一優(yōu)選例中，所述干燥是采用25-90℃溫度干燥。

5、在另一優(yōu)選例中，所述過篩是采用50-100目進行過篩；較佳地，60-100目；更佳地，采用80目進行過篩。

6、在另一優(yōu)選例中，所述溫度為25-90℃，優(yōu)選為30℃。

7、在另一優(yōu)選例中，所述有機溶劑選自下組中一種或多種組合：

8、甲醇、乙醇、丙二醇、丙酮、或乙酸乙酯。

9、在另一優(yōu)選例中，所述有機溶劑的濃度為50％-90％，較佳地為65％-80％。

10、在另一優(yōu)選例中，所述固液比為1:20(g:ml)-1:50(g:ml)，較佳地為1:30(g:ml)-1:40(g:ml)，更佳地為1:35(g:ml)。

11、在另一優(yōu)選例中，所述提取的方式采用選自下組方式進行提?。撼曒o助提取、閃式提取、、或其組合。

12、在另一優(yōu)選例中，所述超聲輔助提取采用的超聲頻率為35khz，超聲溫度為25℃，超聲時間為40min。

13、在另一優(yōu)選例中，所述閃式提取是采用閃式提取器在5000rpm條件下，提取70s。

14、在另一優(yōu)選例中，所述加熱回流提取是采用加熱回流提取器在65℃條件下進行提取，提取時間為150min。

15、在另一優(yōu)選例中，所述提取的時間包括2-200min，較佳地為4-150min，更佳地為40min。

16、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在所述提取后，進行過濾或離心，提取上清液，所述上清液經濃縮、干燥后得到所述具有抗衰老作用的水翁花提取物。

17、在另一優(yōu)選例中，所述離心的轉數(shù)為1000rpm，離心時間為10min。

18、在另一優(yōu)選例中，所述提取的工藝參數(shù)選自下組中的任意一種或多種組合：

19、(1)80目過篩，有機溶劑為80％乙醇，固液比為1:30(g:ml)，超聲輔助提取，提取溫度為25℃，提取時間為40min；

20、(2)100目過篩，有機溶劑為65％乙醇，固液比為1:35(g:ml)，采用閃式提取器進行閃式提取，提取溫度為30℃，提取時間為4min；

21、(3)60目過篩，有機溶劑為80％甲醇，固液比為1:40(g:ml)，采用加熱回流提取，提取溫度為90℃，提取時間為150min。

22、在本發(fā)明的第二方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的方法制備得到的水翁花提取物。

23、在另一優(yōu)選例中，所述水翁花提取物以干物質計，其體外抗氧化活性試驗中的dpph自由基清除率≥50％且提取物濃度≤1mg/ml；和/或,

24、所述水翁花提取物以干物質計，其彈性蛋白酶抑制試驗中的抑制率≥50％且提取物濃度≤5mg/ml。

25、在另一優(yōu)選例中，所述水翁花提取物的生物活性評價方法包括：體外抗氧化試驗和/或體外彈性蛋白酶抑制試驗的方法。

26、在另一優(yōu)選例中，所述體外抗氧化試驗的dpph自由基清除率的測定方法如下：

27、將水翁花提取物稀釋成不同濃度梯度的樣液；準確稱取dpph粉末溶于無水乙醇中，超聲15min配置成濃度為0.2mm的dpph溶液；取0.5ml樣液和1.5ml?dpph溶液于試管為as，作為樣品管；吸取0.5ml蒸餾水和1.5ml?dpph溶液于試管為ab，作為空白管；吸取0.5ml樣液和1.5ml無水乙醇于試管為aj，作為對照管；每個樣品中三支試管同時配置并震蕩均勻，在37℃下避光、靜置30min；做三個平行，使用酶標儀于517nm處測定吸光度；dpph自由基清除率公式如下：

28、dpph自由基清除率(％)＝[1-(as–aj/ab)]×100

29、其中，ab為空白組吸光度，as為樣品組吸光度,aj為對照組吸光度。ic50為dpph自由基清除率達到50％時樣品的濃度，以維生素c為陽性對照。

30、在另一優(yōu)選例中，所述的體外彈性蛋白酶抑制為將上述提取物稀釋成不同濃度梯度并與tris-hcl緩沖液混合，加入彈性蛋白酶溶液，隨后加入aaapan(n-琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺(n-succinyl-ala?ala-ala-p-nitroanilide))，在25℃下孵育15min后測定吸光度；以egcg為陽性對照。

31、在另一優(yōu)選例中，所用的試劑濃度分別為：tris-hcl緩沖液(50mmol/l,ph8.0)；彈性蛋白酶溶液(60mu/ml)；aaapan(1mmol/l)。

32、在另一優(yōu)選例中，所述水翁花提取物的彈性蛋白酶體外抑制活性的測定方法為：

33、將不同濃度的樣品(30μl)與85μl的tris-hcl緩沖液(50mmol/l,ph8.0)混合，然后加入25μl彈性蛋白酶溶液(60mu/ml)，在25℃下孵育15min。隨后加入aaapan(25μl，1m?mol/l)，15min后在410nm處測定吸光度。以egcg為陽性對照。彈性蛋白酶抑制活性的計算公式為：

34、抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)×100

35、其中a為反應體系中不含樣品的反應溶液的吸光度；b為反應體系中不含樣品和酶的反應溶液的吸光度；c為反應體系中含有樣品和酶的反應溶液的吸光度；d為反應體系中不含酶的反應溶液的吸光度。

36、在本發(fā)明的第三方面，提供了如本發(fā)明第二方面所述的水翁花提取物的用途，所述水翁花提取物用于選自下組中一種或多種組合：

37、(1)用于制備具有抗氧化和/或抗皮膚衰老的產品；

38、(2)用于制備具有彈性蛋白酶抑制功能的產品。

39、在另一優(yōu)選例中，所述產品選自下組：

40、功能性食品、保健品、化妝品、或其組合。

41、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種化妝品，所述化妝品含有如本發(fā)明第二方面所述的水翁花提取物。

42、在另一優(yōu)選例中，所述化妝品還含有化妝品上可接受的輔料。

43、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種食品或保健品，所述食品或保健品含有如本發(fā)明第二方面所述的水翁花提取物。

44、應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

45、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下技術效果：

46、(1)本發(fā)明所述的提取方法制備所得的具有抗衰老作用的水翁花提取物，原料為單一植物來源。

47、(2)本發(fā)明所述的提取方法簡單、便捷、成本低廉。

48、(3)本發(fā)明所述的提取方法制備所得的具有抗衰老作用的水翁花提取物，抗衰老機制主要基于抗氧化和彈性蛋白酶抑制，在清除皮膚中的自由基，減緩皮膚老化過程的同時能有效抑制彈性蛋白酶的活性，從而使皮膚維持彈性保持緊致。

49、(4)本發(fā)明制備方法簡便，易于操作，效果顯著，將其作為活性成分在制備抗氧化以及抗皮膚衰老功能的食品或化妝品中具有廣闊市場和應用價值。