91] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[009引 （e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，12rc滅菌15min，W 1L計(jì)，由W 下量的組分組成：
[0093] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二轅 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鋪 5.0g; 憐酸氨二鐘 2.0g; 硫酸鑲 〇.58g; 硫酸猛 025g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0094] pH 6.2 ?6.4
[0095] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[009引 訊所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，12rc滅菌15min，W 1L計(jì)，由W 下量的組分組成：
[0097] 蛋白腺 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧樣酸氨二較 2.0g; 葡萄糖 20.0呂； 乙酸錯(cuò) 5.0g; 憐酸氨二鄉(xiāng) 2.0g; 硫酸僕 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4 倒試管斜面
[009引該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0099] (g)所述的魏豆乳發(fā)酵培養(yǎng)基W 1L計(jì)，由W下量的組分組成：
[0100] 謊糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 打泮汁 lOOmL； 魏豆汁 余量。
[OW] 化）魏豆汁的制備包括；1000mL水中加20g魏豆，浸泡7小時(shí)，95C碼磨成漿汁，得 到魏豆汁。
[0102] 本發(fā)明實(shí)施例中，納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽抱桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙 橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽抱桿菌10263 來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院 6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei 化irota)來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu) 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0103] 實(shí)施例1
[0104] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的魏 豆乳，包括W下步驟：
[0105] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-208的選育
[0106] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-208,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽抱 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長(zhǎng)胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0107] 突變庫(kù)高通量篩選；①制備2個(gè)豆芽汁魏豆汁固體培養(yǎng)基平板（魏豆汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅Γ鶕?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-208,保藏于豆芽汁魏豆汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[010引 似甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0109] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Siirota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[0110] LcS-Met-篩選；①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至 另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Mef，保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0111] (3) BN-NKPQQ-RWX-208 的活化培養(yǎng)
[0112] 將保存于豆芽汁魏豆汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-208取一環(huán)，接種 至豆芽汁魏豆汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109c化/mL左右。 [011引 （4) LcS-Met-的活化培養(yǎng)
[0114] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS-Mef取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到109c化/mL左右。
[01巧](5)富含NK和PQQ的魏豆乳的發(fā)酵制備
[0116] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-208與LcS-Met-混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (1 X 108CFM/mL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液W 1 %接種量接種魏豆乳發(fā)酵培養(yǎng)基，42C六 層紗布封口培養(yǎng)2化，得到富含NK和PQQ的魏豆乳。魏豆乳發(fā)酵培養(yǎng)基中所含豆芽汁、酪 氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-208合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽汁有利于納 豆芽抱桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)膚鍵連接環(huán)化而成。 發(fā)酵結(jié)束后，魏豆乳中NK活力1012U/mL，PQQ含量75ng/mL。所獲得的魏豆乳富含納豆激 酶和化咯唾晰釀，具有魏豆乳固有的滋味及發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0117] 實(shí)施例2
[0118] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽抱桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的魏 豆乳，包括W下步驟：
[0119] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-208的選育
[0120] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽抱桿菌BN-NKPQQ-RWX-208,具體方法為；首先構(gòu)建納豆芽抱桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基脈誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合（促融劑為聚己二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 抱桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長(zhǎng)胚盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。
[0121] 突變庫(kù)高通量篩選；①制備2個(gè)豆芽汁魏豆汁固體培養(yǎng)基平板（魏豆汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽抱桿菌10261和納豆芽抱桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大??；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑥平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽抱桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 抱桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-208,保藏于豆芽汁魏豆汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0122] (2)甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met-)的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0123] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)進(jìn)行亞硝基脈誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-Met-)。
[0124] LcS-Mef篩選；①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei化irota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素 膜影印至另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的