一種磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸化是將磷酸基團(tuán)加在中間代謝產(chǎn)物上或蛋白質(zhì)上的過程，其機(jī)理是無機(jī)磷酸 與蛋白質(zhì)上特定的氧原子或氮原子形成-C-O-Pi或-C-N-Pi醋化反應(yīng)，從而引進(jìn)磷酸根基 團(tuán)，提高蛋白分子之間的靜電斥力，增加蛋白的電負(fù)性，使之更易分散，進(jìn)而改善蛋白的乳 化性。而且磷原子是生物膜的重要組成成分，是所有生物體不可缺少的元素之一，從毒理學(xué) 的角度看，磷酸根離子為所有生物代謝所必需，但其必須從膳食中獲得，所以蛋白質(zhì)的磷酸 化改性是一種實(shí)用、有效的方法。
[0003] 卵白蛋白是雞蛋清中的主要蛋白，其含量約占蛋清蛋白質(zhì)的54%~63%。蛋清是一種 優(yōu)質(zhì)蛋白，含有8種人體必需氨基酸，還含有部分人體必需的微量元素，其蛋白質(zhì)含量高達(dá) 90%，水溶性好，易被人體吸收利用；另外，卵白蛋白能快速提供能量，促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育 和新陳代謝，加速傷口愈合和血紅蛋白合成。卵白蛋白為磷酸糖蛋白，是具有高度二級結(jié)構(gòu) 的球型結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量為43. OkDa，等電點(diǎn)為4. 5, 50%以上為疏水氨基酸殘基，含3. 5% 糖基及埋藏于疏水中心內(nèi)部的1個(gè)二硫鍵、4個(gè)自由巰基，天然卵白蛋白的巰基雖然包裹在 分子內(nèi)，但在蛋白質(zhì)因變性而展開的過程中發(fā)揮很大作用，熱處理下蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性以及蛋白質(zhì)聚集體的形成都與巰基有關(guān)，且卵白蛋白相對有序度較高，結(jié)構(gòu)較為致密， 自然卵白蛋白在儲運(yùn)過程中會(huì)轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定性的S-卵白蛋白構(gòu)型。正是由于卵白蛋白的 結(jié)構(gòu)獨(dú)特性決定其在分子改性以改善其功能特性時(shí)，呈現(xiàn)出與其他常用食品蛋白不同的機(jī) 理與條件。隨著蛋品深加工、綜合利用的研宄深入，雞蛋生物活性成分的多級聯(lián)產(chǎn)提純技術(shù) 日趨發(fā)展與完善，卵白蛋白作為雞蛋清中含量最大的蛋白組分，是各種方法提純其它功能 活性成分時(shí)必須首先分離的對象。
[0004] 蛋白質(zhì)分子與多相體系中的脂肪、水等分子間相互作用形成乳化性，其被作為衡 量蛋白質(zhì)促進(jìn)油-水型乳狀液形成能力的指標(biāo)，受疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)及氨基酸種類、數(shù)量 的影響。由于卵白蛋白具有良好的起泡性、膠凝性、乳化性、持水性等特性，是食品加工中的 重要原輔料。但其欠理想的乳化性限制其在乳化體系中的應(yīng)用。因此，加深對卵白蛋白的 研宄，采用生物、物理或化學(xué)方法對卵白蛋白進(jìn)行改性能夠改善并提高卵白蛋白的乳化性， 進(jìn)一步擴(kuò)大其在食品中的應(yīng)用，對促進(jìn)其高效綜合利用具有重要意義。目前，卵白蛋白改 性的方法主要有物理、化學(xué)及酶法，即可通過改變卵白蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)的分子大 小、疏水基團(tuán)的數(shù)量以及表面靜電荷數(shù)等手段提高卵白蛋白的乳化性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，其可顯著提 高所得卵白蛋白的乳化性，有利于促進(jìn)卵白蛋白在乳化體系中的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種磷酸化改性提高卵白蛋白乳化性的方法，是將卵白蛋白加水配成質(zhì)量濃度為5. 0% 的蛋白溶液，然后在蛋白溶液中加入卵白蛋白質(zhì)量3. 0%的三聚磷酸鈉，并調(diào)pH值為7. 6，再 將混合液置于39°C的水浴鍋中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為153min，反應(yīng)結(jié)束后收集上清 液，經(jīng)冷凍干燥得改性后的卵白蛋白。
[0007] 所述卵白蛋白來源于雞蛋清，其具體提取方法為：選擇無污染、無裂縫的新鮮雞 蛋，將蛋白與蛋黃分離后，將蛋白與去離子水按質(zhì)量比為1:1混合進(jìn)行稀釋，在25°C下磁 力攪拌lOmin，用紗布過濾，然后邊磁力攪拌邊緩慢加入混合液質(zhì)量15%的PEG8000 ;攪拌 1-2h后將混合液在5000r/min的條件下離心20min，取上清液；邊磁力攪拌邊用lmol/L HCl 調(diào)pH值至4.5,靜置30min后產(chǎn)生沉淀，收集沉淀即為卵白蛋白純品，冷凍干燥后冷藏備用。
[0008] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:采用本發(fā)明方法對卵白蛋白進(jìn)行改性，其乳化活性可達(dá) 0. 513,與未改性的卵白蛋白相比，其乳化性有顯著提高，且其處理方法簡單，有利于促進(jìn)卵 白蛋白在乳化體系中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0009] 圖1為不同反應(yīng)溫度對卵白蛋白乳化性的影響。
[0010] 圖2為不同反應(yīng)時(shí)間對卵白蛋白乳化性的影響。
[0011] 圖3為不同STP用量對卵白蛋白乳化性的影響。
[0012] 圖4為不同pH值對卵白蛋白乳化性的影響。
[0013] 圖5為反應(yīng)溫度與pH值對卵白蛋白乳化活性影響的響應(yīng)面圖（a)和等高線分析 圖（b)〇
[0014] 圖6為pH值與反應(yīng)時(shí)間對卵白蛋白乳化活性影響的響應(yīng)面圖（a)和等高線分析 圖（b)〇
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0016] 1儀器和試劑 1. 1實(shí)驗(yàn)儀器 722型可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)科學(xué)儀器有限公司）；FJ200-SH數(shù)顯高速分 散均質(zhì)器(上海標(biāo)本模型廠）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 (常州振華儀器有限公司）；FD5-2. 5真空冷凍干燥器（SM，U. S. A)，F(xiàn)A2004電子天平(上海 舜宇恒平科學(xué)科學(xué)儀器有限公司）;HH-S2恒溫水浴鍋(金壇市成輝儀器廠）;PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室 pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；25mm透析袋（BIOSHARP，U. S. A)等。
[0017] 1.2材料與試劑 鮮雞蛋(湘西吉首陽光超市購置）；金龍魚食用調(diào)和油(廣東省深圳市）；三聚磷酸鈉， 十二烷基磺酸鈉，PEG8000, NaOH，濃鹽酸均為國產(chǎn)分析純試劑。
[0018] 2實(shí)驗(yàn)方法 2. 1卵白蛋白的提取 所用卵白蛋白的提取方法為：選擇無污染、無裂縫的新鮮雞蛋，將蛋白與蛋黃分離后， 將蛋白與去離子水按質(zhì)量比為1:1混合進(jìn)行稀釋，在25°C下磁力攪拌lOmin，用紗布過濾， 然后邊磁力攪拌邊緩慢加入混合液質(zhì)量15%的PEG8000 ;攪拌1-2h后將混合液在5000r/ min的條件下離心20min，取上清液；邊磁力攪拌邊用lmol/L HCl調(diào)pH值至4. 5,靜置30min 后產(chǎn)生沉淀，收集沉淀即為卵白蛋白純品，冷凍干燥后冷藏備用。
[0019] 2. 2磷酸化改性工藝 將所得卵白蛋白加去離子水配成質(zhì)量濃度為5. 0%的蛋白溶液，然后加入三聚磷酸鈉， 調(diào)PH值后置于水浴鍋中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集上清液，冷凍干燥后備用。
[0020] 2. 3卵白蛋白乳化性測定 將經(jīng)不同條件磷酸化處理后的卵白蛋白，分別溶解于pH值為7. 4、0. lmol/L的磷酸緩 沖液中，配制成0. 5mg/L的蛋白溶液樣品。然后于IOmL調(diào)和油中分別加入20mL樣品，室溫 下以10000r/min均質(zhì)lmin，然后立即從底部吸取100 μ L均質(zhì)后的乳化液，加入5mL質(zhì)量分 數(shù)為0. 1%的SDS，充分混勻后，以等量0. 1%的SDS溶液作空白，在500nm處測其吸光度A1, 即為乳化活性Ea;靜置IOmin后，再次測定吸光度A 2，計(jì)算得乳化穩(wěn)定性Es。乳化穩(wěn)定性的 計(jì)算方法為！Es=A1 X V (A1-A2)，其中，t為靜置時(shí)間。
[0021] 2. 4單因素試驗(yàn) 2. 4. 1不同反應(yīng)溫度對卵白蛋白乳化性的影響 將蛋白溶液的pH值調(diào)至8. 0, STP添加量為卵白蛋白的5. 0%，分別將反應(yīng)溫度設(shè)為15、 20、25、30、35、40、45°〇，反應(yīng)18011^11，測定反應(yīng)后各蛋白樣品的乳化性。
[0022] 2. 4. 2不同反應(yīng)時(shí)間對卵白蛋白乳化性的影響 將蛋白溶液的pH值調(diào)至8. 0, STP添加量為卵白蛋白的5. 0%，在35°C下分別將反應(yīng)時(shí) 間設(shè)為30min、60min、120min、180min、240min、300min，測定反應(yīng)后各蛋白樣品的乳化性。
[0023] 2. 4. 3不同S