力下，處理5min，在真空度lOMPa，溫度-20°C下，冷凍干燥24h至粉末狀，得超高壓米渣蛋白 粉，干燥后產(chǎn)品水分含量為5% ; (4) 酶解：將步驟（3)所得超高壓米渣蛋白粉配制成3wt%的水溶液，加入4000U中性蛋 白酶/g超高壓米渣蛋白粉，在pH值為7,溫度40°C下，酶解2h，75°C滅酶8min，4000r/min 離心10min，收集上清液； (5) 真空濃縮：將步驟（4)所得上清液在真空度0. 08MPa，溫度45°C下，進(jìn)行真空濃縮， 至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50wt%的濃縮液； (6) 冷凍干燥：將步驟（5)所得濃縮液在真空度lOMPa，溫度-30°C下，冷凍干燥24h至 粉末狀，即得高抗氧化活性肽，干燥后產(chǎn)品水分含量為5%。
[0026] 所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等雜質(zhì)。
[0027] 實(shí)施例3 (1) 米渣預(yù)處理：將500g米渣磨碎，過(guò)100目篩，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：將步驟（1)所得米渣粉與5L水混合，用1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)混合液pH值至13,在溫度50°C，轉(zhuǎn)速900r/min下，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)5h，然后5000r/min 離心20min，收集上清液，用1.0 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至5. 8,靜置沉淀3h， 5000r/min離心20min，棄去上清液，采用去離子水洗滌沉淀至中性，沉淀即為米渣蛋白； (3) 超高壓處理：將步驟（2)所得米渣蛋白用雙層聚氯乙烯袋包裝，密封，在500MPa壓 力下，處理15min，在真空度30MPa，溫度-40°C下，冷凍干燥48h至粉末狀，得超高壓米渣蛋 白粉，干燥后產(chǎn)品水分含量為10% ; (4) 酶解：將步驟（3)所得超高壓米渣蛋白粉配制成5wt%的水溶液，加入8000U中性蛋 白酶/g超高壓米渣蛋白粉，在pH值為7,溫度50°C下，酶解3h，95°C滅酶15min，6000r/min 離心20min，收集上清液； (5) 真空濃縮：將步驟（4)所得上清液在真空度0. lOMPa，溫度50°C下，進(jìn)行真空濃縮， 至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70wt%的濃縮液； (6) 冷凍干燥：將步驟（5)所得濃縮液在真空度30MPa，溫度-40°C下，冷凍干燥48h至 粉末狀，即得高抗氧化活性肽，干燥后產(chǎn)品水分含量為10%。
[0028] 所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等雜質(zhì)。
[0029] 對(duì)比例1 本對(duì)比例技術(shù)方案同實(shí)施例1，其區(qū)別僅在于，將步驟（3)替換為：將步驟（2)所得米 渣蛋白在超聲波清洗機(jī)中，以超聲頻率20kHz進(jìn)行超聲處理30min，在真空度20MPa，溫 度-30°C下，冷凍干燥36h至粉末狀，得超聲米渣蛋白粉，干燥后產(chǎn)品水分含量為8% ;步驟 (4)中酶解的對(duì)象為超聲米渣蛋白粉。
[0030] 對(duì)比例2 本對(duì)比例技術(shù)方案同實(shí)施例1，其區(qū)別僅在于，去掉步驟（3)，直接將步驟（2)所得米渣 蛋白進(jìn)行酶解。
[0031] 將實(shí)施例1~3和對(duì)比例1、2所得高抗氧化活性肽進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法如下： 高抗氧化活性肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法： (1) DPPH自由基清除能力測(cè)定： 將干燥的高抗氧化活性肽分別溶解在4mL蒸餾水中，制得濃度為I mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液；在4mL蒸餾水和上述各濃度高抗氧化活性肽溶 液樣品中分別添加 ImL濃度40 μ mol/L的DPPH自由基的乙醇溶液，25°C下靜置30min，于 517nm處分別測(cè)定吸收值A(chǔ)空自和，DPPH自由基清除能力的計(jì)算公式為：DPPH自由基清 除能力（％)=( I-A樣品/A空白）X 100,檢測(cè)結(jié)果如表1所示： 表1不同濃度的實(shí)施例1~3和對(duì)比例1、2高抗氧化活性肽產(chǎn)品對(duì)DPPH自由基的清 除率
(2) ABTS自由基清除能力測(cè)定： 將干燥的高抗氧化活性肽分別溶解在4mL蒸餾水中，制得濃度為I mg/mL、2 mg/ mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液，將ABTS反應(yīng)液用PBS緩沖液稀釋，使其 在734nm處的吸光值為0. 700，制成ABTS測(cè)定液，取4mLABTS測(cè)定液，加入40 μ L樣品， 在734nm處多次測(cè)其吸光值，取平均值A(chǔ)，ABTS清除率的計(jì)算公式為：ABTS清除率（％)= (1-A/0. 700) X 100,檢測(cè)結(jié)果如表2所示： 表2不同濃度的實(shí)施例1~3和對(duì)比例1、2高抗氧化活性肽產(chǎn)品對(duì)ABTS自由基的清 除率
(3)輕自由基的清除能力測(cè)定： 將干燥的高抗氧化活性肽分別溶解在4mL蒸餾水中，制得濃度為I mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液；通過(guò)Fenton反應(yīng)測(cè)高抗氧化活性肽清除· OH 的能力：取ImL濃度5mmol/L的鄰二氮菲乙醇溶液于試管中依次加入2mL pH7.40的 0. 2mol/L磷酸緩沖溶液和ImL高抗氧化活性肽溶液充分混勻后，加入ImL 5mmol/L硫 酸亞鐵溶液，混勻后加入ImL雙氧水，于37°C水浴60min后，在波長(zhǎng)536nm處測(cè)其吸光 度（A s)。未損傷管以ImL蒸餾水代替損傷管中ImL 0. 1%的雙氧水，樣品管以ImL樣 品溶液代替損傷管中的I mL樣品溶劑，其他同損傷管，測(cè)得未損傷管的吸光度（Aife)及樣 品管的吸光度（A樣），·0 H清除率的計(jì)算公式為：·0 H清除率（％)= (A樣-A損）/ (A未-A s) X 100,檢測(cè)結(jié)果如表3所示： 表3不同濃度的實(shí)施例1~3和對(duì)比例1、2高抗氧化活性肽產(chǎn)品對(duì)羥基自由基的清除 率
對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基或羥基自由基的清除率越高，表明抗氧化能力越強(qiáng)，說(shuō)明 原料處理方式對(duì)米渣蛋白結(jié)構(gòu)的破環(huán)更強(qiáng)，才導(dǎo)致在酶解時(shí)釋放出更多的小肽分子，而小 肽分子恰好是自由基清除的有效作用成分。由于超聲波的空化作用，使得蛋白質(zhì)內(nèi)部活性 部位暴露出來(lái)，有利于底物更好地與酶結(jié)合，但超聲功率過(guò)大時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞程度 加大，且超聲對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂缺乏選擇性，有可能造成米渣蛋白中具有抑制抗氧化 活性的多肽片段被斷開(kāi)，從而影響酶解液的抗氧化活性。由表1~3可知，米渣蛋白用超 聲處理后的酶解液抗氧化活性優(yōu)于常規(guī)酶解；而超高壓對(duì)食品中生物大分子的作用主要是 由于壓力所產(chǎn)生的體積變化，與物質(zhì)組分在結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生差異而導(dǎo)致在超高壓下壓縮變形不 同，當(dāng)這一變形足夠大時(shí)，可能會(huì)影響物質(zhì)分子間結(jié)合形式，導(dǎo)致鍵的破壞和重組，從而使 食品中的生物大分子功能特性發(fā)生變化，許多經(jīng)高靜壓變性的蛋白質(zhì)在壓力撤消后，分子 構(gòu)象會(huì)有所改變，并隨之帶來(lái)功能特性的改善，由表1~3可知，超高壓所得的米渣蛋白酶 解液的抗氧化活性遠(yuǎn)大于超聲處理。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：包括以下 步驟： (1) 米渣預(yù)處理：將米渣磨碎，過(guò)60~100目篩，得米渣粉； (2) 提取米渣蛋白：將步驟（1)所得米渣粉與水以質(zhì)量比1:6~10混合，調(diào)節(jié)混合液 pH值至11~13,恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)3~5h，然后離心，收集上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值至5. 0~ 5. 8,靜置沉淀，離心，棄去上清液，采用去離子水洗滌沉淀至中性，沉淀即為米渣蛋白； (3) 超高壓處理：將步驟（2)所得米渣蛋白在300~500MPa壓力下，處理5~15min， 冷凍干燥，得超高壓米渣蛋白粉； (4) 酶解：將步驟（3)所得超高壓米渣蛋白粉配制成3~5wt%的水溶液，加入4000~ 8000U中性蛋白酶/g超高壓米渣蛋白粉，酶解2~3h，滅酶，離心收集上清液； (5) 真空濃縮：將步驟（4)所得上清液真空濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~70wt%的濃 縮液； (6) 冷凍干燥：將步驟（5)所得濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得高抗氧化活性肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方法，其特征 在于：步驟（2)中，所述攪拌反應(yīng)的溫度為30~50°C，攪拌反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為500~900r/min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方法，其 特征在于：步驟（2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為3000~5000r/min，離心的時(shí)間為10~20min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（2)中，所述靜置沉淀的時(shí)間為1~3h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（4)中，所述中性蛋白酶的酶活為40000~60000U/g。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（4)中，所述酶解的pH值為7,溫度為40~50°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（4)中，所述滅酶的溫度為75~95°C，時(shí)間為8~15min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（4)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為4000~6000r/min，離心的時(shí)間為10~ 20min〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方 法，其特征在于：步驟（5)中，所述真空濃縮的真空度為0. 08~0. lOMPa，溫度為45~50°C。10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9之一所述利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性 肽的方法，其特征在于：步驟（3)、（6)中，所述冷凍干燥是指在真空度10~30MPa，溫 度-20~-40 °C下，冷凍干燥24~48h至水分含量為5~10%。
【專利摘要】一種利用超高壓處理米渣蛋白制備高抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟：（1）米渣預(yù)處理得米渣粉；（2）提取米渣蛋白：將米渣粉與水混合，調(diào)節(jié)pH值至11～13，攪拌反應(yīng)，離心收集上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值至5.0～5.8，沉淀，離心，洗滌，得米渣蛋白；（3）超高壓處理：將米渣蛋白在超高壓下處理，冷凍干燥，得超高壓米渣蛋白粉；（4）酶解：將超高壓米渣蛋白粉配制成水溶液，酶解，滅酶，離心，收集上清液；（5）將上清液真空濃縮至濃縮液；（6）冷凍干燥，得高抗氧化活性肽。本發(fā)明方法所得產(chǎn)品具有較高抗氧化活性，與未經(jīng)超高壓處理所得產(chǎn)品相比，對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基的清除率均大大提高。
【IPC分類】A23J3/34
【公開(kāi)號(hào)】CN105010720
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510440288
【發(fā)明人】楊濤, 趙貴川, 李艷, 黃慧芬
【申請(qǐng)人】中南林業(yè)科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月24日