冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及營養(yǎng)素，尤其是涉及冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素的制備方法，所述 冬麥包括冬小麥、冬燕麥、冬裸麥等。
【背景技術(shù)】
[0002] 春化處理，是植物（胚）感受大自然溫度濕度的一種機(jī)能，許多冬性植物接受春化 處理后，不僅提高了對胚乳的營養(yǎng)利用率、發(fā)芽率、種子活性、種子產(chǎn)量、抗病蟲害能力，而 且縮短了苗穗期，限制了主莖的頂端生長優(yōu)勢，促進(jìn)分蘗能力，促進(jìn)營養(yǎng)生長向生殖生長的 轉(zhuǎn)化；同時(shí)，提高了抵抗自然不利條件的能力，例如抗旱、抗寒、抗?jié)?、抗高溫等。此外，春?處理過的種子，可以把春花效果轉(zhuǎn)移至沒有春花處理的種子里，讓沒有嚴(yán)格春花處理的種 子得到春花的效果。
[0003] 中國專利CN1383745公開一種酪蛋白及其復(fù)合營養(yǎng)素，該營養(yǎng)素由酪蛋白、酪蛋 白復(fù)合多肽、低聚糖、磷脂、微量元素、維生素和可食用的載體和/或賦形劑制成；該發(fā)明以 酪蛋白為基質(zhì)在其中添加具有多種生物活性的多肽，使該發(fā)明具有延緩衰老、調(diào)理腸道、 抗誘變、可全面促進(jìn)營養(yǎng)素吸收。
[0004] 中國專利CN102524514A公開一種從脫脂小麥胚芽粉中提取活性多肽的方法及應(yīng) 用，該方法通過復(fù)合蛋白酶對脫脂小麥胚芽粉進(jìn)行水解，得粗制多肽液，然后進(jìn)行脫色， 濾紙過濾，微濾膜過濾，納濾膜過濾，得多肽濃縮液，再通過大孔樹脂柱處理得產(chǎn)品。
[0005] 中國專利CN102150910A公開一種小麥胚芽飲料，主要由小麥胚芽蛋白酶解制備 的小分子肽、維生素E和二十八烷醇組成。制備方法：1)將小麥胚芽蛋白提純，并經(jīng)二級酶 解制成小分子肽溶液；2)采用超臨界C02萃取和分子蒸餾技術(shù)，從小麥胚芽中萃取和制備 維生素E;3)采用超臨界C02萃取和多重結(jié)晶技術(shù)，從小麥胚芽中萃取和制備二十八烷醇； 4)加入吐溫80,將維生素E和二十八烷醇制備成乳劑；將小麥胚芽的主要營養(yǎng)成分維生素 E、二十八烷醇、小麥胚芽蛋白分離提純，通過酶解技術(shù)制備小分子肽，將維生素E、二十八 烷醇制成乳劑，按一定比例將三種營養(yǎng)成分重新組合，配以輔料，制備出具有抗疲勞、抗 氧化、抗高血壓等功能的小麥胚芽飲料。
[0006] 中國專利CN101513218公開一種從小麥胚芽中提取抗氧化活性小肽營養(yǎng)粉的方 法，其步驟為：小麥胚芽粉碎后經(jīng)萃取將其中的非蛋白除去，然后加入蛋白酶和肽酶后得 到小肽營養(yǎng)液，最后濃縮、干燥得到小肽營養(yǎng)粉。
[0007] 中國專利CN102168124A公開一種復(fù)合酶結(jié)合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方 法。該方法以脫脂小麥胚芽為原料，首先對其進(jìn)行脫糖，脫糖后離心分離；得到的固形物 用復(fù)合酶對其進(jìn)行水解，然后調(diào)節(jié)溶液的PH8~9進(jìn)行堿提，堿提后進(jìn)行離心分離；離心 分離后上清液通過膜進(jìn)行分離，通過最小分子量膜的液體再進(jìn)行透析脫鹽；各級分離物采 用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素的制備方法，所述冬麥 包括冬小麥、冬燕麥、冬裸麥等。
[0009] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0010] 1)將冬麥浸潤；
[0011] 2)將浸潤后的冬麥進(jìn)行低溫處理；
[0012] 3)將低溫處理后的冬麥破碎得細(xì)胞漿液，再用EDTA和蛋白酶K處理后保存；
[0013] 4)將EDTA和蛋白酶K處理后的細(xì)胞漿液以胚芽自己的細(xì)胞DNA/RNA為擴(kuò)增的模 板，增加DNA/RNA循環(huán)擴(kuò)增的營養(yǎng)元素，設(shè)置細(xì)胞漿液在模擬的溫控環(huán)境下培養(yǎng)，35個(gè)循 環(huán)，每個(gè)循環(huán)溫度與時(shí)間設(shè)置如下：
[0014] 70°C60s；
[0015] 40°C60s；
[0016] 60°C180s；
[0017] 在溫度預(yù)先設(shè)置好的恒溫加熱器中完成，加熱器放置在旋轉(zhuǎn)式搖床上，得母液；
[0018] 5)將步驟4)達(dá)到預(yù)期擴(kuò)增時(shí)間后的母液超聲波處理，離心，收集上清液，分離純 化處理，低溫（4~18°C)真空濃縮，噴霧干燥后，即得冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素，呈黃 色粉狀，有青麥苗與發(fā)酵特殊氣味與滋味。
[0019] 在步驟1)中，所述浸潤可采用無菌開水浸泡24h。
[0020] 在步驟2)中，所述低溫處理可分兩階段進(jìn)行，第一階段的溫度為0~:TC，第一階 段的處理時(shí)間為10~30h，優(yōu)選24h，第二階段的溫度為7~9°C，第二階段的處理時(shí)間為 10~30h，優(yōu)選24h，低溫處理可循環(huán)4~6,最好5次。
[0021] 在步驟3)中，所述破碎可采用勻漿機(jī)破碎，勻漿機(jī)的膠體磨細(xì)度1~7ym，1. 1KW; 經(jīng)破碎后的細(xì)胞漿液保持原細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
[0022] 所述EDTA的摩爾濃度可為0. 005~0.Olmol/L;所述蛋白酶K的質(zhì)量濃度可為 50yg/ml，蛋白酶K可用 50mMTris-HCL, 10mMCaCL2pH7. 5 緩沖液配制；
[0023] 所述處理的溫度可為55~65°C，處理的時(shí)間可為5~48h，所述處理的溫度優(yōu)選 58°C，處理的時(shí)間優(yōu)選36h;所述處理是將蛋白酶K與細(xì)胞漿液共同孵育，充分保護(hù)并暴露 胚芽內(nèi)的發(fā)芽早期DNA/RNA，蛋白酶K已經(jīng)把細(xì)胞內(nèi)的DNA/RNA酶滅活；
[0024] 所述保存的溫度可為4~8°C;該細(xì)胞勻漿包含目標(biāo)活性物的DNA/RNA(編碼降糖 肽，谷光甘肽，丙氨酰-谷氨酰胺二肽，甘氨酰-谷氨酰胺二肽及其它容易消化的小分子肽） 及其中所含的所有發(fā)芽時(shí)期胚芽內(nèi)活性酶與調(diào)節(jié)因子。
[0025] 在步驟4)中，所述DNA/RNA循環(huán)擴(kuò)增的營養(yǎng)元素可采用外源鎂、dNTP和TaqDNA 聚合酶，所述外源鎂可采用Mg++，4. 5~5. 5mM，摩爾用量為200ymol/L;dNTP采用1M Tris-HCl緩沖液，pH7. 0~7. 5,摩爾用量為200ymol/L;TaqDNA聚合酶的用量為2. 5萬 單位/10L;所述旋轉(zhuǎn)式搖床的轉(zhuǎn)速可為60~100r/min。
[0026] 在步驟5)中，所述超聲波處理的超聲波功率可為450W，超聲波處理的時(shí)間可為 12~15min;所述分離可在4~8°C離心機(jī)8000r/m速度離心10~15min;所得冬麥種子胚 芽活性多肽營養(yǎng)素可進(jìn)行總蛋白質(zhì)濃度、多肽分子量分布等參數(shù)測定；當(dāng)所得母液不用于 鑒別多肽分子量與氨基酸組成分析時(shí)，不再分離純化處理。
[0027] 所述冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素包括：
[0028] 分子量蘭130,占25%;
[0029]分子量 131 ~500,占 49%;
[0030] 分子量 501 ~1000,占 17%
[0031] 分子量 1001 ~2000,占 6% ;
[0032]分子量 2001 ~5000,占 2%;
[0033] 分子量蘭5001D，蘭1% ;
[0034] 其中有：
[0035] 由5~9個(gè)氨基酸組成的極容易消化吸收小麥胚芽活性肽：相對分子量500~ lOOODa，富含谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺片段；
[0036] 由2~4個(gè)氨基酸組成的低聚肽，相對分子量131~500之間，包括具有抗氧化 (消除自由基）特色谷胱甘肽（GSH);具有降血壓作用的VAL-ALA-TYR(纈氨酰-丙氨酰-酪 氨酰胺）；以及單獨(dú)存在的游離甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺。
[0037] 本發(fā)明所制得的冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素，具有不使用化學(xué)溶劑、沒有化學(xué) 改性、沒有破壞原有成分與結(jié)構(gòu)、沒有任何添加劑（包括輔助溶劑、保鮮、防腐、抗凝、防潮、 風(fēng)味劑）等優(yōu)點(diǎn)。
[0038] 本發(fā)明所制得的冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素，是生物活性多肽物質(zhì)，是冬性種 子（包括冬小麥/燕麥/裸麥）胚芽內(nèi)預(yù)先存在的活性物質(zhì)，與細(xì)胞外RNA編碼蛋白質(zhì)同 源，具有感應(yīng)自然變化、啟動(dòng)RNA翻譯成蛋白質(zhì)、利用胚乳營養(yǎng)（淀粉），抗氧化，信號(hào)源（激 素）等作用。
[0039] 本發(fā)明所制得的冬麥種子胚芽活性多肽營養(yǎng)素可作為食品營養(yǎng)素，具有抗氧化、 改善胰島素抵抗、降低異常高血糖等作用；保存了種子發(fā)芽期所有生物活性物質(zhì)，包括維生 素，酶，多肽等。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例包括以下步驟：
[0042] 1)將公斤級冬麥浸潤；所述浸潤可采用燒開無菌水浸泡即浸潤24h。
[0043] 2)將浸潤后的冬麥進(jìn)行低溫處理，所述低溫處理分兩階段進(jìn)行，第一階段的溫度 為0~3°C，第一階段的處理時(shí)間為10~30h，優(yōu)選24h，第二階段的溫度為7~9°C，第二 階段的處理時(shí)間為10~30h，優(yōu)選24h，低溫處理可循環(huán)4~6,最好5次；
[0044] 3)將低溫處理后的冬麥用勻漿機(jī)（膠體磨，細(xì)度1~7ym，1. 1KW)破碎，保持原細(xì) 胞結(jié)構(gòu)，EDTA(0. 005~0.Olmol/L)和蛋白酶K處理該細(xì)胞漿液，（蛋白酶K的濃度50yg/ ml，用50mMTris-HCL，10mMCaCL2pH7. 5緩沖液配制），蛋白酶K與胚芽細(xì)胞漿液共同孵育在 溫度55~65°C，（最理想溫度58°C);孵育時(shí)間5~48h，最佳孵育時(shí)間36h;充分保護(hù)并 暴露胚芽內(nèi)的發(fā)芽早期DNA/RNA。蛋白酶K已經(jīng)把細(xì)胞內(nèi)的DNA/RNA酶滅活。
[0045] 在4~8°C保存以上勻漿，該細(xì)胞勻漿包含目標(biāo)活性物的DNA/RNA(編碼降糖肽，谷 光甘肽，丙氨酰-谷氨酰胺二肽，甘氨酰-谷氨酰胺二肽及其它容易消化的小分子肽）及其 中所含的所有發(fā)芽時(shí)期胚芽內(nèi)活性酶與調(diào)節(jié)因子。
[0046]4)母液細(xì)胞勻漿原位擴(kuò)增（類似PCR擴(kuò)增）：模仿離體臨床PCR，給母液胚芽細(xì)胞 漿液系統(tǒng)提供DNA/RNA循環(huán)擴(kuò)增的營養(yǎng)元素及條件，以胚芽自己的細(xì)胞DNA/RNA為擴(kuò)增的 模板，增加外源鎂（Mg++4. 5 ~5. 5mM, 200ymol/L)、dNTP(200ymol/L，用 1MTris-HCl緩 沖液調(diào)節(jié)pH7. 0~7. 5)和TaqDNA聚合酶（2. 5萬單位/10L)，設(shè)置細(xì)胞漿液在模擬的溫控 環(huán)境下培養(yǎng)，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)溫度與時(shí)間設(shè)置：
[0047] 70°C60s；