一種烏鱧的抗病免疫增強劑環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，是一種烏鱧的抗病免疫增強劑及其綜合飼養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏鱧（Oa/Maargys)隸屬鱸形目，鱧科，鱧屬。因烏鱧是適合東北特有的氣候和 水域特點且抗逆性強的品種，又因其營養(yǎng)價值高、味道鮮美，有各種吃法，是很受國內(nèi)外市 場歡迎的品種。近年來，已對烏鱧進行馴化及人工繁育的突破，配合飼料的營養(yǎng)組成已有系 統(tǒng)研究。但在高密度集約化養(yǎng)殖中，面臨各種環(huán)境脅迫，進入高密度養(yǎng)殖水體中的消毒劑和 藥物能夠影響胃腸道微生物菌群的完整性，降低生產(chǎn)性能，抑制免疫反應(yīng)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制 疾病的最有效的方法之一就是通過免疫增強劑的預(yù)防管理增強魚的防御機制。從這方面 看，許多中草藥和其他天然免疫增強劑被篩選出并被認為是水產(chǎn)疾病管理中較有效的替代 方法，并且許多具有抗菌性能的天然免疫增強劑的應(yīng)用已經(jīng)被提出。通過微生態(tài)制劑處理 漁用飼料，可以改善飼料的品質(zhì)，提高飼料的營養(yǎng)價值和飼料轉(zhuǎn)化效率，提高水產(chǎn)動物的免 疫力，促進動物生長。近來許多研究表明利用細菌細胞基質(zhì)產(chǎn)品控制魚類疾病是由于它們 那獨一無二產(chǎn)生新奇的代謝物的能力。所以，根據(jù)科研和實踐的經(jīng)驗總結(jié)和梳理，海洋細菌 代謝產(chǎn)物環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）可作為烏體的一種有前景的抗病 免疫增強劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一是提供一種烏鱧抗病免疫增強劑環(huán)_ (苯丙氨酸-絲氨酸）。
[0004] 環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）作為烏鱧飼料添加劑的應(yīng)用。
[0005] 所述的烏鱧飼料添加劑為提高烏鱧抗病能力及促生長添加劑。
[0006] 一種烏鱧的配合飼料，按質(zhì)量份： 進口魚粉15. 2~16. 0、國產(chǎn)魚粉15. 3~19. 0、環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）0. 5~2. 0、維 生素預(yù)混料1. 〇、蠶蛹3. 5~4. 5、血球蛋白粉2. 40~3. 2、礦物質(zhì)預(yù)混料2. 0、豆柏16. 0~ 19. 00、花生柏7. 0~10. 0、面粉25. 40~31. 00、魚油2. 12~2. 6、玉米5. 5~6. 5、棉柏 5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨魚粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。
[0007] 優(yōu)選：進口魚粉15. 23~15. 6、國產(chǎn)魚粉15. 38~15. 84、環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨 酸）0. 5~2. 0、維生素預(yù)混料1. 0、蠶蛹3. 5~4. 4、血球蛋白粉2. 45~3. 2、礦物質(zhì)預(yù)混 料2. 0、豆柏16. 5~18. 75、花生柏7. 0~8. 84、面粉25. 42~30. 2、魚油2. 2~2. 5、玉米 5. 5~6. 5、棉柏5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨魚粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。
[0008] 優(yōu)選：進口魚粉15. 6、國產(chǎn)魚粉15. 84、環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）0? 5、蠶蛹3. 5、 豆柏16. 5、血球蛋白粉2. 45、花生柏7. 0、面粉30. 2、維生素預(yù)混料1. 0、魚油2. 2、玉米5. 5、 礦物質(zhì)預(yù)混料2. 0、棉柏5. 6、菜柏5. 3、墨魚粉2. 3 ; 優(yōu)選：進口魚粉15. 36、國產(chǎn)魚粉15. 38、環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）1.0、蠶蛹4. 25、棉 柏6.8、血球蛋白粉2. 56、菜柏5. 2、豆柏18. 75、墨魚粉2. 5、花生柏8.84、面粉26. 2、維生素 預(yù)混料I.O、魚油2. 5、礦物質(zhì)預(yù)混料2.O、玉米6. 3 ; 優(yōu)選：進口魚粉15.23、國產(chǎn)魚粉15. 6、棉柏7.5、環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）2.0、菜柏 6. 3、蠶蛹4. 4、墨魚粉2. 4、血球蛋白粉3. 2、豆柏18. 62、維生素預(yù)混料1. 0、花生柏9. 68、面 粉25. 42、魚油2. 4、玉米6. 5、礦物質(zhì)預(yù)混料2. 0 ; 所述的維生素預(yù)混料： 鹽酸硫胺素，15mg;核黃素，20g;葉酸，I. 5g;鹽酸啦咳醇，4g;尼克酸，80g;泛酸I丐， 28g;肌醇，40g;生物素，0.6g;VitB3,30mg;VitB9,3.0mg;VitB12,0.01g;VitA，6000IU; VitD3,0.005g;VitC，200mg;VitD，2000IU;VitE，50mg;VitK，5.0mg，載體為脫脂米糠。
[0009] 所述的礦物質(zhì)預(yù)混料： 磷酸二氫鈉，450g;氯化鉀，129g;七水硫酸鎂，102g;五水硫酸銅，0. 6g;檸檬酸鐵 150mg;七水硫酸鋅，80mg;-水硫酸錳，3. 25g;六水三氯化鋁，0. 15g;碘化鉀，0. 23g;亞硒 酸鈉，〇?Olg;七水硫酸鈷〇? 〇30g。
[0010] 一種烏鱧綜合飼養(yǎng)的方法如下： 1、 每10畝塘放養(yǎng)體長10-15cm左右的烏鱧魚種50000尾、搭配養(yǎng)殖的魚類有：鰱（30g /尾）2000尾，鳙（20g/尾）800尾，鯉（40g/尾）800尾，鯽（30g/尾）800尾，細鱗斜 頌鲴（20g/尾）500尾； 2、 先將鰱魚、鳙魚放養(yǎng)魚池中，適應(yīng)3d，每畝施用光合細菌200g調(diào)水2d后放養(yǎng)鯉、鯽和 細鱗斜頌鲴； 3、 烏鱧魚苗饑餓2d，投喂上述一種烏鱧配合飼料馴食，待3~5d完全攝食后，再與鰱、 鳙、鯉、鯽和細鱗斜頌鲴混養(yǎng)； 4、 每天投喂上述一種烏鱧配合飼料，三個月后捕撈。
[0011] 本發(fā)明為烏鱧的一種免疫增強劑環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸），添加海洋細菌 /wh辦代謝物可抵抗常見的淡水細菌性魚病的發(fā)生，與鰱、鳙、鯉、鯽和細鱗 斜頌鲴共同飼養(yǎng)，可充分利用水體的餌料資源和水體空間，綜合飼養(yǎng)經(jīng)濟效益更高，適合東 北地區(qū)應(yīng)用，商品魚肉質(zhì)好、口味極佳。
[0012] 具體優(yōu)點如下： 1、配方科學(xué)、營養(yǎng)均衡，搭配各種蛋白飼料，使得氨基酸互補，飼料和魚體必需氨基酸 平衡關(guān)聯(lián)程度最佳，確保飼料系數(shù)低，使得魚體生長快。
[0013] 2、飼料中含有海洋細菌代謝產(chǎn)物環(huán)_(苯丙氨酸-絲氨酸） 可作為免疫增強劑對烏鱧IL-IP基因表達、體液反應(yīng)和抗病力等都有正面影響，可有效地 增強烏鱧的抗防病能力，提高養(yǎng)殖的成活率。
[0014] 3、精選的蠶蛹、血球蛋白粉、花生柏和墨魚粉的劑量和搭配比例使得飼料具有特 有的顏色和氣味，可使烏鱧迅速轉(zhuǎn)食和攝食，提高飼料的利用率。
[0015] 4、不同食性、不同水層的魚類進行搭配養(yǎng)殖，充分利用水體和空間，達到生態(tài)健康 養(yǎng)殖。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）的提取 (1)發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物提?。?海洋細菌/wtit/a活化2~3天后，從平板上挑取適量單菌落接種到含有IOmLMB液體培養(yǎng)基的試管中，30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)1.5天。然后將菌液以5%(V/ V)的接種量接種到裝有100mL培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)1.5天。將菌 液以5%(V/V)的接種量接種至1000mL培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)5 天。擴大培養(yǎng)后的細菌發(fā)酵液用等體積的含有5%丙酮的乙酸乙酯進行萃取，菌液與提取液 以一定比例混合，每瓶菌液萃取三次（第一次按菌液與混合液1 :1的比例萃取，第二次按 菌液與混合液2 :1的比例，第三次按菌液與混合液4 :1的比例）。收集上層有機相，然后將 萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上水浴溫度37°C，真空度82mbar條件下蒸餾濃縮，濃縮到一定體積 后轉(zhuǎn)移到小體積的梨形旋蒸瓶中，再次進行濃縮，移入已稱重的小離心管，氮吹儀吹干后稱 重，記錄質(zhì)量后4°C避光保存，備用。共得到粗提物約6.2g。
[0017] (2)薄層層析： 取GF254薄層層析硅膠板置于IKTC恒溫鼓風(fēng)干燥箱中活化Ih，待降至常溫后開始進 行點樣。先用鉛筆在層析上距末端Icm處輕輕畫一橫線，然后用毛細管吸取樣液在橫線上 輕輕點樣，點的直徑在2 _以內(nèi)。將點了樣的薄層板放入已預(yù)飽和展開劑的層析缸中，密 封展開缸頂?shù)纳w。由于毛細管作用，展開溶劑在薄層板上緩慢前進，前進至距離頂端Icm 處時，取出薄層板，樣品組分因移動速度不同而彼此分離。展開后的薄層板經(jīng)過干燥后，用 紫外光燈暗室中照射（A為254nm和365nm)觀察檢出斑點情況。展開分離后，化合物在 薄層板上的位置用比移值（Rf?值）表示?；衔锇唿c中心至原點的距離與溶劑前沿至原點 的距離的比值就是該化合物的Rf值。本實驗通過試驗不同的二氯甲烷+甲醇體系，選取比 值Rf介于〇. 2到0. 4之間的溶劑比例：二氯甲烷：甲醇的洗脫體系比例分別為70 :1、30 :1、 8 :1、2 :1、丙酮、甲醇。
[0018] (3)分離： 取粗提物6. 2g經(jīng)200-300目減壓桂膠柱層析，以70 :1、30 :1、8 :1、2 :1、丙酮、甲醇七個 極性系統(tǒng)快速洗脫，共得七個組分：Fr.a、Fr.b、Fr.c、Fr.d、Fr.e、Fr.f、Fr.g、Fr.h。Fr.b 部分經(jīng)ODS減壓柱色譜，流動相為甲醇：水比例依次為20: 80、40: 60、60: 40、80: 20、95: 5、甲醇，得到 6 個組分：Fr.b-l、Fr.b-2、F;r.b-3、F;r.b-4、F;r.b-5、F;r.b-6。
[0019] 其中Fr.b-1又經(jīng)ODS加壓柱色譜，以甲醇：水比例為12:88~100梯度洗脫，最 后用HPLC(RP-18)分離與純化，得到化合物環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）（13mg)、環(huán)-(丙 氨酸-色氨酸）（12mg)、環(huán)-(羥脯氨酸-苯丙氨酸）10mg、環(huán)-(酪氨酸-纈氨酸）（6 mg)、環(huán)_(酪氨酸-丙氨酸）（2mg)、環(huán)-(酪氨酸-甘氨酸）（5. 5mg)和環(huán)-(酪氨酸-色 氨酸）（11.6mg)，收集環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）。
[0020] 環(huán)-(苯丙氨酸-絲氨酸）化學(xué)結(jié)構(gòu)為：
白色無定型粉末；FABMS(positivemode)m/z235. 4 [M+H] + ; [a]25D-66. 7°(c0? 09， EtOHk1HNMR(500MHz，DMS0-d6) 5 8.03 (1H，s，NH)，7.91 (1H，s，NH)，7.28 (2H，t，J=7.5Hz，H-3'，5'），7.17 (2H，d，J=7.5Hz，H-2'，6'），7.22 (lH，t，J=7.5Hz，H-4'），4.04 (1H，m，H-3)，3. 65 (1H，m，H-6)，3. 28，2. 83(2H，m，CH2OH)，3. 08，2. 98 (2H，m，H-7); 13CNMR(125MHz，APT，DMSO)S167. 65 (s，C-2)，56. 61 (d，C-3)，166. 87 (s，C-5)，58. 26 (d，C-6)，41.03 (，tC-7)，137.76 (s，C-l，），131.10 (d，C-2'，6'），129.26 (d，C-3'， 5'），127. 65 (d，C-4'），64. 25 (t，CH2OH)。
[0021] 實施例2材料和方法 健康的烏鱧，80g左右，運到實驗室后隨機分布在200L流水式水槽內(nèi)。正式試驗前馴 化14d以適應(yīng)實驗室的條件(溶解氧5. 50 ± 0. 68mg/L;pH7. 2 ± 0. 5;亞硝酸鹽：0.022 ± 0.01mg/L;氨氮 0.14 ± 0.05mg/L;23 ± 2°C)，試