一種促進河蝦生長的生物制劑及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促進河蝦生長的生物制劑及其應(yīng)用方法，屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肌抑素(Myostatin，MSTN),屬于轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming GrowthFactor-β, TGF-β )家族的新成員，主要表達于骨骼肌，抑制骨骼肌的生長，是骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)控因子。哺乳動物肌抑素基因突變及功能喪失均會導(dǎo)致骨骼肌的劇增，形成一種“雙肌”現(xiàn)象。肌抑素N端前體肽是肌抑素C端活性肽的抑制劑，可通過結(jié)合并抑制肌抑素與其受體的結(jié)合，阻斷肌抑素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制其生物活性。肌抑素前體肽作為肌抑素的抑制劑，研究表明過表達肌抑素前體肽或?qū)⒓∫炙厍绑w肽注入小鼠均可以有效促進肌肉生長，表現(xiàn)出骨骼肌的“雙肌”現(xiàn)象。在斑馬魚胚胎發(fā)育中過表達肌抑素前體肽，骨骼肌肌纖維數(shù)量顯著增加，胚胎體型大、生長加快。因此，選擇一種合適的表達載體表達肌抑素前體肽，通過飼料添加促進動物肌肉生長從而提高養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)性能，在農(nóng)業(yè)畜禽生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有巨大的應(yīng)用前景。
[0003]河蝦是我國最主要的淡水養(yǎng)殖蝦類，近幾年全國河蝦養(yǎng)殖面積已達400萬畝，年產(chǎn)量約20萬噸，年產(chǎn)值近100億元，河蝦養(yǎng)殖已成為農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑之一。但在河蝦養(yǎng)殖中普遍存在生長緩慢、個體小型化等現(xiàn)象，導(dǎo)致河蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量低，市場價格居高不下。目前，主要通過河蝦人工育苗、種質(zhì)資源保護和改良途徑，培育出經(jīng)濟性狀好，抗逆性強的良種，通過河蝦人工配合飼料的開發(fā)研制提高養(yǎng)殖河蝦的規(guī)格和效益。
[0004]基于此，做出本申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有河蝦養(yǎng)殖過程中所存在的生長緩慢、產(chǎn)量低等缺陷，本發(fā)明首先提供一種效果穩(wěn)定、可快速促進河蝦生長的生物制劑。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種促進河蝦生長的生物制劑，由如下重量含量的各組分構(gòu)成:1-10%表達河蝦肌抑素前體肽的重組枯草芽孢桿菌、5-50%殼聚糖和余量的玉米淀粉載體；所述的重組枯草芽孢桿菌采用如下方式獲得:在河蝦MSTN基因編碼序列(GENBANK N0.KF530847)前體肽基因的5 ‘端和3’端插入BamH I和Hind III酶切位點，其引物序列如下:
MSTN-F (BamHl):
5 ^ ——GATCCACGCAGAAAAGCCACGGGAAAA——3，
MSTN -R (Hind3):
5 ^-----AAGCTTCCCTCGGCGACTTTCTTCCGT——3 ’
再通過PCR擴增反應(yīng)，酶切獲得基因片段，構(gòu)建其重組表達質(zhì)粒，該重組表達質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，誘導(dǎo)表達并培養(yǎng)后，篩選出表達量最高誘導(dǎo)菌株，將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，收集后作為種子菌，該種子菌接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵后的菌液經(jīng)冷凍干燥后即可。
[0007]進一步的，作為優(yōu)選:
所述的重組枯草芽孢桿菌的菌含量為19個/克。
[0008]所述的誘導(dǎo)表達培養(yǎng)是指在28-30°C，180-200 rpm培養(yǎng)2_8h。
[0009]所述的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜是指添加氨芐青霉素50 Pg/ml、卡那霉素5 μg/ml、紅霉素5μg/ml、林可霉素5μg/ml。于30-37°C培養(yǎng)過夜，至細胞密度為18 cfu/mlο
[0010]所述的種子菌接種量為1-5%。
[0011]所述的載體為玉米淀粉，其目數(shù)為80-200目。
[0012]同時，本發(fā)明還提供了一種上述促進河蝦生長的生物制劑的應(yīng)用方法，將該生物制劑按蝦餌料總重的0.5-1%。加入河蝦餌料中，生物制劑與河蝦餌料一次混合混勻后，均勻噴灑5-10%。魚油或花生油包被，二次均勻混合后即可喂食河蝦。
[0013]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)系統(tǒng)已有多年歷史，60%以上的商品酶制劑通過枯草芽孢桿菌表達生產(chǎn)。近年來，枯草菌逐漸用于藥用蛋白、抗原蛋白的生產(chǎn):其高分泌能力，使得重組表達的目標蛋白不需要經(jīng)過下游的純化和分離；枯草菌本身為益生菌，技術(shù)相對成熟且安全性高；由于芽孢的理化特性，口服制劑能夠耐受胃腸道環(huán)境。本申請中，以河蝦MSTN前體肽基因作為基礎(chǔ)，向其結(jié)構(gòu)中插入BamH I和Hind III酶切位點，并對其進行擴增、表達和培養(yǎng)，從而形成可以表達河蝦肌抑素前體肽的重組枯草芽孢桿菌，再將該重組枯草芽孢桿菌與殼聚糖、載體進行混合形成生物制劑，該生物制劑混入常規(guī)飼料中，進而通過飼料添加途徑達到促進動物生長。
[0014]本專利基于肌抑素前體肽抑制肌抑素生物活性的特點，采用枯草芽孢桿菌表達河蝦肌抑素前體肽，作為飼料添加劑將肌抑素前體肽應(yīng)用于河蝦養(yǎng)殖，是一種快速有效促進河蝦生長的途徑。根據(jù)河蝦MSTN基因編碼序列(GENBANK N0.KF530847)前體肽基因設(shè)計引物，分別在5‘端和3’端插入BamH I和Hind III酶切位點，通過PCR擴增反應(yīng)得到MSTN前體肽基因，將目的基因插入PMD19-T克隆質(zhì)粒，用2種限制性核酸內(nèi)切酶Hind III和BamH I進行酶切，獲得951bp目的基因的片段，構(gòu)建其重組表達質(zhì)粒PET28A-P-MSTN，重組表達質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，進行IPTG誘導(dǎo)表達，在28-30°C，180-200 rpm培養(yǎng)2-8h0篩選出表達量最高誘導(dǎo)菌株。將分泌表達菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，添加氨芐青霉素50 Pg/ml、卡那霉素5 Kg/ml、紅霉素5 μ g/ml、林可霉素5 μ g/ml。于30-37°C培養(yǎng)過夜，至細胞密度為10s cfu/ml，收集后作為種子菌。將種子菌以2.0%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，于37°C、發(fā)酵培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵后的菌液經(jīng)冷凍干燥后即為MSTN前體肽工程菌粉。殼聚糖和玉米淀粉均能通過市購的方式獲得；其中殼聚糖可選用飼料級殼聚糖，玉米淀粉能過80-200目篩。將前體肽工程菌粉按不同比例和市售殼聚糖、玉米淀粉攪拌混合，即制備成促河蝦生長的口服生物制劑。
[0015]本發(fā)明的口服生物制劑具有以下優(yōu)點:
I)使用方便，可作為飼料添加劑在河蝦飼料中使用，本申請所制備的生物制劑以重組枯草芽孢桿菌、殼聚糖和載體為基本原料，形成可表達河蝦肌抑素前體肽的獨立生物制劑，因此，可直接將其按比例與河蝦飼料混合、拌食。
[0016]2)安全性好、無副作用。本申請的三種主要原料中，重組枯草芽孢桿菌以河蝦MSTN前體肽基因為處理對象，對其進行酶切、PCR表達、培養(yǎng)等處理，在處理過程中不引入任何有毒副作用的物質(zhì)，因此安全性較好，不會對河蝦造成毒害副作用。
[0017]3)促生長效果好，顯著提高河蝦生長速度。本申請所合成的生物試劑中，生物制劑由1~10%表達河蝦肌抑素前體肽的重組枯草芽孢桿菌、5~50%殼聚糖和作為載體的玉米淀粉構(gòu)成，其中表達河蝦肌抑素前體肽的重組枯草芽孢桿菌的菌含量為19個/克，可充分有效促進肌肉生長，骨骼肌肌纖維數(shù)量顯著增加，河蝦體型大、生長加快。4)生產(chǎn)工藝簡單