的加入與否并不影響發(fā)酵蔬菜中風味物質雙乙酰和 酯的形成。在加相容性溶質的泡菜汁中風味物質雙乙酰和總酯含量反而略高于對照樣。
[0020] 從圖2菌體生長曲線也可看出在加相容性溶質的發(fā)酵泡菜中，菌體密度值不受加 鹽影響，仍能保持很高生長量，而不加相容性溶質的發(fā)酵泡菜菌體生長緩慢且菌體密度不 高，說明發(fā)酵泡菜中由于加入鹽，滲透壓增高使得菌體生長受到了抑制。
[0021] 實施例3: 本實施例提供了一種提高乳桿菌耐鹽能力的方法，該方法所用的耐鹽保護物質為相容 性溶質，可在直投式方酵劑生產過程中的高密度培養(yǎng)中應用，將長雙歧桿菌按4%的量接種 于MRS-WP培養(yǎng)基中。
[0022] MRS-WP液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，胰酶水解酪蛋白（Tryptone) 10g，牛肉膏 l〇g，酵母浸汁5g，檸檬酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，MgS04. 7H20(λ58g，MnS04. 4H20 0. 25g，吐溫80lml，L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 005,無水碳酸鈉0. 002,10%牛乳清（WP)，用蒸 饋水補足至l〇〇〇ml，115°C，15min滅菌。
[0023] 取少量MRS-WP培養(yǎng)基，所用相容性溶質由組氨酸、四氫嘧啶、脯氨酸組成，將組氨 酸、四氫嘧啶、脯氨酸分別溶于37°C的高密度培養(yǎng)基中混均后過0.2μπι濾膜，然后依次加 入到高密度培養(yǎng)基中混均，使組氨酸、四氫嘧啶、脯氨酸在高密度培養(yǎng)基中的濃度分別為 5. 6mmol/L、6. 5mmol/L、7.Ommol/L，在發(fā)酵罐中控制溫度37°C、轉速為llOrpm，用10%的氫 氧化鈉中和恒定發(fā)酵液pH值在5. 6-6. 0,發(fā)酵培養(yǎng)24小時。由圖3可知，發(fā)酵16后活菌數(shù) 可達2. 24X109CFU/mL，而不加相容性溶質的對照樣菌數(shù)為9. 54X108CFU/mL，菌數(shù)較未加 相容性溶質提高了 1.35倍。
[0024] 實施例4 : 本實施例提供了一種提高乳桿菌耐鹽能力的方法，該方法可在直投式方酵劑生產過程 中應用，具體方法如下： 將德式乳桿菌保加利亞亞種接種到由8-12%的脫脂乳粉、4-6%的胰蛋白酶水解乳清 粉、3-6%的番茄汁、3-6%的麥芽糖、1-3%乳糖、0. 5-0. 7%的酵母膏或粉、40-80毫克/公斤 甲酸和余量的水組成的增菌培養(yǎng)基中，混均后，取少量培養(yǎng)基，加入乳桿菌的耐鹽保護性相 容性溶質一一甲硫氨酸、四氫嘧啶、賴氨酸的混合物，將各相容性溶質分別溶于37°C該培養(yǎng) 基中混均后過0. 2Pm濾膜，將全部濾過液加入到增菌培養(yǎng)基中，使甲硫氨酸、四氫嘧啶、賴 氨酸在高密度培養(yǎng)基中的濃度為5. 0mmol/L、7. 2mmol/L、5. 6mmol/L，在發(fā)酵罐中控制溫度 41. 5-43. 5°C、用10%的氫氧化鈉中和恒定發(fā)酵液pH值在5. 6-6. 0,發(fā)酵培養(yǎng)4. 0-4. 7小時； 發(fā)酵液在0-20°C、轉數(shù)為6000-15000轉/分鐘的條件下離心處理，得到離心沉淀物；按離 心沉淀物重量的1-2倍添加凍干保護劑，凍干保護劑由10-20%奶粉、1-3%甘油、1-2%維生 素C、0. 5-1%谷氨酸或甘氨酸、5%蔗糖、1%海藻糖和余量的水組成，凍干保護劑與菌體離心 沉淀物在無菌條件下均勻混合。加入相容性溶質凍干后的菌粉活力要高于未加相容性溶質 的菌體活力，發(fā)酵乳時間明顯縮短，說明相容性溶質不但可以在高密度培養(yǎng)中提高菌密度 還可以增加菌體抗凍干保護性。凍干后干粉活菌數(shù)比沒加相容性溶質的活菌數(shù)提高2. 46 倍。
[0025] 表 3
表3的說明：將生產出的直投發(fā)酵劑以0. 003%。（W/V)的比例接種于滅菌的乳中，42°C發(fā)酵，測定凝乳時間及產酸幾乎終止的時間，由表3可以看到加入相容性溶質生產出的發(fā) 酵劑發(fā)酵乳產酸速度快，產酸終止時間短，說明菌體活力高代謝產酸速度快，再次證明生產 直投式方酵劑，在菌體高密度培養(yǎng)中加入相容性溶質可提高菌體對不良環(huán)境的抗性，增強 菌體活性。
[0026] 實施例5 :加入相容性溶質對細胞膜通透性變化影響 一、采用激光共聚焦顯微圖像法對菌體在不同培養(yǎng)條件下活菌比例的變化進行觀察， 見圖4-6。其中具有較為完整細胞膜的菌體呈現(xiàn)綠色，而菌體細胞膜被破壞的菌體呈現(xiàn)紅 色。通過圖4-6可知，加鹽加相容性溶質組合后菌數(shù)較只加鹽的情況下有顯著增加且活菌 比例更高，與正常MRS培養(yǎng)基下培養(yǎng)的情況相比菌數(shù)相差不顯著且活菌比例差別也不顯 著。說明鹽脅迫下通過添加相容性溶質確實可以緩解鹽脅迫對德式乳桿菌保加利亞亞種生 長的抑制作用，并且提高了鹽脅迫下德式乳桿菌保加利亞亞種菌體的活菌比例。
[0027] 二、采用流式細胞儀對不同培養(yǎng)條件下德式乳桿菌保加利亞亞種菌體細胞膜完整 性的變化趨勢觀察，如圖7所示。由圖7分析可知，加入相容性溶質后Q4區(qū)域的熒光響應 (占總響應量的77. 6%)比只加鹽情況（占總響應量的22. 8%)顯著提高（代0. 05)且與正常培 養(yǎng)條件下（占總響應量的81. 6%)差異不顯著（/?). 05)。與此同時，Q2區(qū)域的熒光響應（占 總響應量的5. 4%)顯著（K0. 05)低于只加鹽情況（占總響應量的16. 3%)且與正常培養(yǎng)條 件下（占總響應量的5. 3%)差異不顯著（/?). 05)。
[0028] 三、對不同培養(yǎng)條件（MRS、MRS加0. 2MNaCl、MRS加0. 2MNaCl和相容性溶質組 合）下德式乳桿菌保加利亞亞種細胞膜流動性的變化如圖8所示。
[0029] 由圖8分析可知，三種不同的培養(yǎng)條件下，加入優(yōu)化后的相容性溶質組合后菌體 細胞膜的偏振度（P值）和細胞膜微粘度（η值）與只加鹽情況相比顯著減小且與正常培養(yǎng) 條件下相比差異不顯著。由于p值和η值越小細胞膜流動性越好，鹽脅迫下乳酸菌的細胞 膜膜蛋白雙分子層流動性降低。加入優(yōu)化后的相容性溶質組合后細胞膜的流動性較只加鹽 情況下有顯著提高且與正常培養(yǎng)條件下細胞膜的流動性差異不顯著。這說明加入優(yōu)化后的 相容性溶質組合后細胞膜流動性恢復到正常水平，菌體細胞膜正常生理功能顯著提升，鹽 脅迫得到顯著緩解。
【主權項】
1. 一種提高乳桿菌耐鹽能力的方法，其特征在于所述方法步驟如下： 一、 將活化好的目的菌株或直投發(fā)酵劑按要求接入到待發(fā)酵物質中，混均； 二、 所用乳桿菌耐鹽保護物質為一類相容性溶質的混合物，將相容性溶質用去離子水 或待發(fā)酵液溶解，所述相容性溶質為四氫嘧啶、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸、組氨酸或脯氨 酸； 三、 將步驟二中的各種相容性溶質進行兩兩互配或多種組合互配，加入到步驟一中的 待發(fā)酵物中，使得各種相容性溶質在最終待發(fā)酵物中的濃度為4. 5-7. 5mmol/L，然后按待發(fā) 酵物發(fā)酵條件進行發(fā)酵； 本發(fā)明中，所述目的菌株為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，例如：保加利亞乳標菌、干酪乳桿 菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等，其中：保加利亞乳桿菌在2%濃度下活菌數(shù)僅為4. 33X106 CFU/mL，而加入抗?jié)B保護性相容性溶質后，活菌數(shù)可達5. 71X108CFU/mL，可顯著增加該菌 的抗鹽性。2. 根據(jù)權利要求1所述的提高乳桿菌耐鹽能力的方法，其特征在于所述目的菌株為乳 桿菌屬或雙歧桿菌屬。3. 根據(jù)權利要求2所述的提高乳桿菌耐鹽能力的方法，其特征在于所述乳桿菌屬為保 加利亞乳標菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌中的一種或幾種。4. 根據(jù)權利要求1所述的提高乳桿菌耐鹽能力的方法，其特征在于所述相容性溶質的 溶解溫度不得超過50°C，然后過0. 2μπι濾膜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高乳桿菌耐鹽能力的方法，其步驟如下：一、將活化好的目的菌株或直投發(fā)酵劑按要求接入到待發(fā)酵物質中，混均；二、所用乳桿菌耐鹽保護物質為一類相容性溶質的混合物，將相容性溶質用去離子水或待發(fā)酵液溶解，所述相容性溶質為四氫嘧啶、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸、組氨酸或脯氨酸；三、將步驟二中的各種相容性溶質進行兩兩互配或多種組合互配，加入到步驟一中的待發(fā)酵物中，使得各種相容性溶質在最終待發(fā)酵物中的濃度為4.5-7.5mmol/L，然后按待發(fā)酵物發(fā)酵條件進行發(fā)酵。加入本發(fā)明確定的相容性溶質混合物及添加量，可使乳酸菌在亞致死濃度下活菌菌數(shù)提高1倍左右。
【IPC分類】A23L19/20
【公開號】CN105361062
【申請?zhí)枴緾N201510852881
【發(fā)明人】韓雪, 張?zhí)m威, 馮鎮(zhèn), 張莉麗, 易華西, 張英春, 杜明, 王學良
【申請人】哈爾濱工業(yè)大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月30日