一種紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特指利用紅曲霉采用液體發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化苦蕎麥中 活性成分黃酮，同時(shí)降解苦蕎麥中淀粉等糖類物質(zhì)，經(jīng)過種子擴(kuò)大培養(yǎng)和固體發(fā)酵生產(chǎn)含 有黃酮、洛伐他汀和紅曲色素的功能性食品。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高以及人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，尤其是高 脂膳食攝入的增多，高血壓、高血脂和高血糖等"三高"疾病的發(fā)病率逐年上升。"三高"疾 病已成為影響國民身體健康的頭號大敵，每年因"三高"疾病死亡的人數(shù)居各種疾病死亡人 數(shù)的首位?？刂坪皖A(yù)防"三高"，西藥雖然效果較好，但因副作用大、價(jià)格相對較高，并非每 個(gè)病人都能接受，因此幵發(fā)療效更好、副作用更小的藥品及保健食品有著良好的發(fā)展前景。
[0003] 紅曲霉已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用于釀酒、釀醋、食品著色和作為中藥使用。紅曲霉在我國 已使用千余年。紅曲應(yīng)用廣泛，最先被用于釀造黃酒。關(guān)于紅曲的藥用價(jià)值，明代李時(shí)珍 在《本草綱目》中記述："紅曲氣溫味甘，無毒。主消食、活血、健脾、燥胃，治赤白痢，下 水谷。"《本草經(jīng)解要卷四》記述："紅曲以白飯蒸署成紅色，與營血有同氣相求之理；能 升血而健脾，脾健，則為胃行其律液而胃燥矣。治赤白痢者，以有活血消食之功也；下水 谷者，氣溫達(dá)肝味甘益脾之力也……'?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明紅曲具有降血脂、降血壓、保護(hù) 肝臟、抗腫瘤和促進(jìn)骨骼再生等功效。
[0004] 苦蕎麥又稱韃靼蕎麥，為寥科雙子葉植物苦蕎麥的種子，因具有降糖降脂、下氣消 積的作用而被譽(yù)為"凈腸草"?？嗍w麥不僅含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪以 及多種維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，而且富含蘆丁、槲皮素等黃酮類活性成分，具有很 高的營養(yǎng)與保健價(jià)值?？嗍w麥有悠久的入藥歷史?！洱R民要術(shù)》："頭風(fēng)畏冷者，以面湯和粉 為餅，更令罨出汗，雖數(shù)十年亦愈"。《圖經(jīng)本草》："實(shí)腸胃，益氣力"?！侗静菥V目》："降氣寬 腸磨積滯，消熱腫風(fēng)痛。除白濁血滯，脾積泄瀉"。并記載苦蕎麥味苦，性平、寒，有益氣力、 續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸，健胃的作用?！吨参锩麑?shí)圖考》:"性能消積，俗呼凈腸草"?！度珖?中草藥匯編》："理氣止痛，健脾利濕"。苦蕎麥還是當(dāng)今世界上集營養(yǎng)、保健、醫(yī)療于一體的 天然保健食品之一，被稱為"食藥兩用"的糧食珍品，含有多種營養(yǎng)成分和對人體有益的化 學(xué)成分，具有降血糖、降血脂、降血壓以及抗氧化、抗衰老、改善血管微循環(huán)等多種功效。目 前除了苦蕎麥種子供食用外，其芽也作為一種營養(yǎng)豐富的菜肴走上餐桌。以苦蕎麥為關(guān)鍵 詞，可以檢索到相關(guān)專利共85條，其中專利"一種苦蕎麥紅曲的制作方法及其應(yīng)用"（專利 號為：201110340441)只是介紹了利用苦蕎麥作為主要原料生產(chǎn)紅曲，而是否能合成紅曲的 特有成分洛伐他汀和紅曲色素，以及其合成的量沒有界定，苦蕎麥中黃酮是否存在，以及存 在多少也沒有做出描述，更沒有對產(chǎn)品進(jìn)行生理功能的研究；專利"一種利用苦蕎麥生產(chǎn)降 血糖降血脂產(chǎn)品的方法"（專利號為：201410010328)介紹了利用酶法轉(zhuǎn)化苦蕎麥原料，進(jìn) 一步通過有機(jī)溶媒提取生產(chǎn)降血糖降血脂食品，該工藝只是提取了苦蕎麥的成分，而沒有 涉及深層次的生物轉(zhuǎn)化。專利"苦蕎麥紅曲發(fā)酵茶的制作方法"(專利號為：201010130837) 保護(hù)了利用紅曲采用盒式固體發(fā)酵苦蕎麥生產(chǎn)發(fā)酵茶的技術(shù)，該技術(shù)只是根據(jù)紅曲和苦蕎 麥含有黃酮、洛伐他汀和紅曲色素，推測該飲品含有這些成分，而沒有對這些成分進(jìn)行測定 分析，更沒有進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得到的飲品是否真的具有降低血糖和血脂功效。其他專 利均與苦蕎麥加工方面以及活性成分提取相關(guān)，而與本專利內(nèi)容無關(guān)。以紅曲和苦蕎為關(guān) 鍵詞查閱相關(guān)文獻(xiàn)共6篇，其中一篇涉及提取，一篇"苦蕎紅曲紅曲酒的抗氧化活性"與本 專利不相關(guān)，碩士學(xué)位論文"紅曲霉蕎麥的固態(tài)發(fā)酵及其產(chǎn)物分析"報(bào)道了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的紅 曲霉固態(tài)發(fā)酵苦蕎生產(chǎn)洛伐他汀，以及檢測了桔霉素和黃酮。該論文的研究只是在實(shí)驗(yàn)室 規(guī)模，產(chǎn)物和功效與本專利保護(hù)內(nèi)容不重疊；碩士學(xué)位論文"紅曲霉蕎麥的固態(tài)發(fā)酵及其產(chǎn) 物降血脂作用的研究"同樣在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究了紅曲發(fā)酵蕎麥生產(chǎn)洛伐他汀，并利用動物 實(shí)驗(yàn)評價(jià)了其降血脂功能，它與本專利的內(nèi)容差異在于產(chǎn)品中只有洛伐他汀，而沒有考察 其他成分，忽視了紅曲的整體功效，同時(shí)更沒有涉及其降血糖功效；另外兩篇論文與紅曲酒 的釀造以及蕎麥紅曲對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠血脂水平的影響，均與本專利保護(hù)內(nèi)容無關(guān)。
[0005] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，摸索出一種以苦蕎麥為主要原料，通過紅曲霉菌體液 態(tài)搖瓶培養(yǎng)、液體種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥的發(fā)酵液。該 方法不同于過去的方法之處在于：①目的不同，以前申請的專利主要是獲得紅曲，而不是以 生產(chǎn)活性成分功能性食品為目的，本發(fā)明是以生產(chǎn)含有黃酮、洛伐他汀和紅曲色素的功能 性食品為目的；②以前的專利只是根據(jù)產(chǎn)品含有洛伐他汀、黃酮和紅曲色素，推測其具有生 物學(xué)功能，本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品經(jīng)過嚴(yán)格的動物實(shí)驗(yàn)和含量分析，確證了使用本發(fā)明技術(shù)生 產(chǎn)的功能性食品；③以前的專利公開的規(guī)模都是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，其工藝技術(shù)能否用于工業(yè)化 還不能確定，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究和反復(fù)工業(yè)化生產(chǎn)試驗(yàn)，摸索出工業(yè)化規(guī)模固態(tài)發(fā)酵 生產(chǎn)紅曲苦蕎麥功能性食品技術(shù)。因而無論從產(chǎn)品的生產(chǎn)目的、功能和工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，本 發(fā)明都有別于以往的專利和文章報(bào)道的內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供的一種液體深層發(fā)酵與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合，以紅曲霉為菌種，苦蕎麥為 主要原料，生產(chǎn)具有降血糖、降血脂功能的保健食品為目的，紅曲苦蕎麥功能性發(fā)酵液生產(chǎn) 技術(shù)以及該發(fā)酵液的應(yīng)用技術(shù)。
[0007] 紅曲苦蕎麥功能性食品，該發(fā)酵液外觀為粉紅色至紫紅色，具有特有的發(fā)酵香味， 含有黃酮20-100mg/L，洛伐他汀5-50mg/L，紅曲色素4-60mg/L;該發(fā)酵液具有顯著的降低 血糖和血脂功效，用于生產(chǎn)治療或輔助治療糖尿病和高血脂癥的功能性食品或藥品。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供了紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液的制備方法，按照下述步驟進(jìn) 行： a.試管擴(kuò)大培養(yǎng)：將紅曲霉菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，制得紅曲霉 試管斜面孢子；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將紅曲霉試管斜面孢子接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖 瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，制得液體搖瓶菌種；c. 一級種子罐種子培養(yǎng)：將液體搖瓶菌種接種到種子 罐培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，制成一級種子罐菌種；d.液體發(fā)酵培養(yǎng)：將一級種子罐菌種接種到發(fā) 酵罐培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥的發(fā)酵液。
[0009] 進(jìn)一步的改進(jìn)，所述的紅曲轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液的制備方法包括如下步驟： a.試管擴(kuò)大培養(yǎng)：將紅曲霉菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，在溫度20-45Γ下培 養(yǎng)3-10d后，進(jìn)行1-10°C保藏，制得紅曲霉試管斜面孢子；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基來源(諸葛 健、王正祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:367頁);b.液體搖瓶培養(yǎng)：將一環(huán)紅曲霉試管 斜面孢子接種于裝有20-150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉(zhuǎn)速為50-200 轉(zhuǎn)/分，溫度20-43°C的條件下，搖床培養(yǎng)18-86h，制成液體搖瓶菌種；每1L液體搖瓶培養(yǎng) 基所含有的各成分的重量為：麩皮5-20g，葡萄糖5-20g，蛋白胨l-5g，酵母浸膏2-8g，硫酸 鎂0. 01-0. 2g，磷酸氫二鉀0. 01-0. 2g;c. -級種子罐種子培養(yǎng)：按接種量為1%-20% (液 體搖瓶菌種與種子罐培養(yǎng)基的體積比）將液體搖瓶菌種接種于種子罐培養(yǎng)基中，在溫度為 20-43°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50-160轉(zhuǎn)/分，通氣量為0. 2-1. 8:1 (每分鐘通入氣體的體積與種 子罐培養(yǎng)基體積比）的條件下，培養(yǎng)18-50h，制成一級種子罐菌種；每1L種子罐培養(yǎng)基所 含有的各成分的重量為：麩皮5-20g，葡萄糖5-20g，蛋白胨l-5g，酵母浸膏2-8g，硫酸鎂 0. 01-0. 2g，磷酸氫二鉀0. 01-0. 2g;d.紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液：按接種量為1-20% (-級 種子罐菌種液體體積與液體發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比）將種子罐菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。在 溫度為20-43°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50-160轉(zhuǎn)/分，通氣量為0. 2-1. 8:1 (每分鐘通入氣體的體積 與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比）的條件下，培養(yǎng)54-150h，得到紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液；每1L發(fā) 酵基培養(yǎng)基所含有的各成分的重量為：苦蕎麥10_40g，蛋白胨5-20g，葡萄糖4-30g，酵母浸 膏2-10g，硫酸鎂0· 01-0. 2g，磷酸氫二鉀0· 01-0. 2g，玉米蛋白0·l-5g; e.紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液可以直接生產(chǎn)具有輔助降低血糖調(diào)節(jié)血脂的片劑、膠囊、 飲料、黃酒、酸奶、醋。
[0010] 本發(fā)明所紅使用的紅曲霉為紅曲霉屬中的紅色紅曲菌（Monascusruber)、 紫色紅曲菌（Monascuspurpureu)、叢毛紅曲菌（Monascuspilosus)、紅曲紅曲菌 (Monascusanka)的任意一種，所使用的苦蕎麥為栽培使用。
[0011] 本發(fā)明所提供的液體搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過100_130°C滅菌30-120min。
[0012] 進(jìn)一步的改進(jìn)，所述的紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液制備方法包括如下步驟： a.試管擴(kuò)大培養(yǎng)：將紅曲霉菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，在溫度20-45Γ下培 養(yǎng)3-10d后，進(jìn)行1-KTC保藏，制得紅曲霉試管斜面孢子；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將一環(huán)紅曲霉 試管斜面孢子接種于裝有20-150mL液體搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在溫度20-43°C，在 攪拌轉(zhuǎn)速為50-200轉(zhuǎn)/分的條件下，搖床培養(yǎng)18-86h，制得液體搖瓶菌種；c. 一級種子罐 種子培養(yǎng)：按接種量為1%_20%(液體搖瓶菌種與種子罐培養(yǎng)基的體積比)將液體搖瓶菌種接 種于種子罐培養(yǎng)基中，在溫度為20-43°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50-160轉(zhuǎn)/分，通氣量為0. 2-1. 8:1 (每分鐘通入氣體的體積與種子罐培養(yǎng)基體積比）的條件下，培養(yǎng)18-50h，制得一級種子罐 菌種；d.紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥液體發(fā)酵培養(yǎng)：按接種量為1-20%(-級種子罐菌種液體體積與 發(fā)酵培養(yǎng)基的重量比)將種子罐菌種接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。在溫度為20-43Γ，攪拌轉(zhuǎn)速 為50-160轉(zhuǎn)/分，通氣量為0. 2-1. 8:1 (每分鐘通入氣體的體積與發(fā)酵罐培養(yǎng)基的體積比） 的條件下，培養(yǎng)54-150h，得到紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液； e.紅曲霉苦蕎麥功能性食品；紅曲霉轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液可以直接生產(chǎn)具有輔助降低 血糖調(diào)節(jié)血脂的片劑、膠囊、飲料、黃酒、酸奶、醋。
[0013] 通過以上方法獲得的紅曲轉(zhuǎn)化苦蕎麥發(fā)酵液外觀為粉紅色至紫紅色，具有特有的 發(fā)酵香味，含有黃酮20-100mg/L，洛伐他汀5-50mg/L，紅曲色素4-60mg/L;該發(fā)酵液具有顯 著的降低血糖和血脂功效，用于生產(chǎn)治療或輔助治療糖尿病和高血脂癥的功能性食品或藥 品。
[0014] 進(jìn)一步的改進(jìn)，所述一級種子罐菌種經(jīng)二級種子罐種子培養(yǎng)后，再進(jìn)行固體發(fā)酵 培養(yǎng)，所述二級種子罐種子培養(yǎng)工藝為：按接種量為1-20%將一級種子罐菌種接種于種子 罐培養(yǎng)基中，在溫度為20-43°C，攪