一種抑制李斯特菌的涂層、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品安全領(lǐng)域，具體設(shè)及一種抑制李斯特菌的涂層、其制備方法及應(yīng) 用。 技術(shù)背景
[0002] 單核細胞增生李斯特菌（單增李斯特菌）的危害由來已久，且該菌在環(huán)境中無處 不在。1983年，在美國馬薩諸塞州爆發(fā)了一起由污染李斯特菌的己氏殺菌全脂牛奶和含 2%脂肪的牛奶造成的至少14人死亡的案例。1985年，在美國加利福尼亞州再次爆發(fā)了由 單增李斯特菌污染的墨西哥類型軟芝±造成的人感染李斯特菌病的病例。該次爆發(fā)中有超 過100例的確診病例，并造成了至少40人死亡。美國食品和藥品管理局于1986年進行的一 項調(diào)查顯示，全美357家乳品加工廠中，有2. 5%的工廠在其產(chǎn)品中含有李斯特菌。Lwasor 等人在1989年從全蛋液中分離出了單增李斯特菌，隨后對肉、蔬菜等的檢測中都發(fā)現(xiàn)了單 增李斯特菌的存在。近年來還出現(xiàn)了由污染的豆芽、卷屯、菜和香瓜導(dǎo)致的李斯特菌病爆發(fā) 病例。李斯特菌是一種革蘭氏陽性桿菌，可W在4°C至45°C生長，單獨的制冷措施不足W防 止其在食品中的繁殖，Doyle等人于1987的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌能在己氏殺菌條件下 存活，所W其在原料和食品加工工程中不可避免的存在，因此二次殺菌處理十分必要。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，牛奶等食物儲存過程中需要添加化學成分的抑菌、殺菌劑，由于化學 成分抑菌、殺菌劑大多數(shù)采用化學方法合成，存在較多安全隱患，不符合消費者對于安全、 健康和天然的要求。
[0004] 耐久腸球菌NJ株產(chǎn)生的細菌素對李斯特菌屬（尤其是單增李斯特菌）、耐久腸球 菌、糞腸球菌和尿腸球菌都能抑制，對植物乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、唾液鏈球菌嗜 熱亞種和大腸桿菌等菌株無抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制李斯特菌的涂層，能高效抑制李斯特菌的生長，應(yīng) 用食品保鮮時可有效避免現(xiàn)階段使用的廣譜殺菌細菌素對食品中其他有益菌的抑制，無毒 副作用，可W用于玻璃、塑料、陶瓷和鐵制品上。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供所述涂層的制備方法，該方法安全、簡單、成本低，適合 在食品工業(yè)廣泛的推廣。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供所述涂層在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明目的是通過W下方案來實現(xiàn)的：
[0009] 一種抑制李斯特菌的涂層，含有95-105質(zhì)量份聚乳酸，20-65質(zhì)量份可抑制李斯 特菌的細菌素；所述細菌素來源于耐久腸球菌巧nterococcus化rans)NJ株。
[0010] 在本發(fā)明中，所述可抑制李斯特菌的細菌素效價為7*105-9*105AU/g。
[0011] 在本發(fā)明中，所述涂層的厚度為0.1-0. 3毫米。
[0012] 在本發(fā)明中，所述可抑制李斯特菌的細菌素采用如下方法制備：發(fā)酵培養(yǎng)耐久腸 球菌巧nterococcus化rans)NJ株，取發(fā)酵液，離屯、分離上清液和菌體沉淀；將所述上清液 采用大孔吸附樹脂分離，收集含有所述細菌素的洗脫液A;采用異丙醇水溶液洗涂菌體沉 淀表面的細菌素，得到洗脫液B;合并洗脫液A和B，用截留分子量為1000-3000化的透析袋 分離，取截留液，即得所述可抑制李斯特菌的細菌素。
[0013] 本發(fā)明還提供一種制備所述抑制李斯特菌涂層的方法，包括如下步驟：將聚乳酸 和可抑制李斯特菌的細菌素加入溶劑中，攬拌至聚乳酸溶解、所述細菌素均勻分散于溶劑 中，得到涂層溶液；將所述涂層溶液倒入容器內(nèi)或者涂覆于物體表面，除去溶劑、干燥。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述溶劑為二氯甲燒。
[0015] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，每15ml溶劑內(nèi)加入的聚乳酸為0. 5-1. 5邑。
[0016] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述干燥的溫度為25-90°C，干燥時間為2-20小時。
[0017] 在本發(fā)明中，所述容器或物體的材料為塑料、陶瓷、金屬或玻璃。
[0018] 本發(fā)明還提供所述抑制李斯特菌涂層在食品安全方面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明抑制李斯特菌的涂層，能高效抑制李斯特菌的生長，應(yīng)用食品保鮮儲存領(lǐng) 域時可有效避免現(xiàn)階段使用的廣譜殺菌細菌素對食品中其他有益菌的抑制，無毒副作用， 可W用于玻璃、塑料、陶瓷和鐵制品上，成本低廉。本發(fā)明所述涂層的制備方法，安全、簡單、 成本低，適合在食品工業(yè)廣泛的推廣。
【附圖說明】：
[0020] 圖1顯示了涂層前后玻璃瓶的變化。從左往右分別為無涂層玻璃瓶（沒有涂覆任 何物質(zhì)）、對照涂層玻璃瓶、含有細菌素NJ的涂層玻璃瓶（該玻璃瓶內(nèi)壁涂覆了含有細菌素 NJ的涂層）。
[0021] 圖2顯示了 4°C條件下培養(yǎng)不同時間后，各玻璃瓶內(nèi)牛奶樣品中單增李斯特菌 ScottA的菌落數(shù)，其中"無"表示玻璃瓶中無涂層，PLA表示對照涂層玻璃瓶，NJ表示內(nèi)壁 涂覆了含有細菌素NJ的涂層的玻璃瓶，且NJ前方數(shù)字表示涂層中細菌素NJ的含量。
[0022] 圖3顯示了 25°C條件下培養(yǎng)不同時間后，各玻璃瓶內(nèi)牛奶樣品中單增李斯特菌 ScottA的菌落數(shù)，其中"無"表示玻璃瓶中無涂層，"PLA"表示對照涂層玻璃瓶，"NJ"表示 內(nèi)壁涂覆了含有細菌素NJ的涂層的玻璃瓶，且NJ前方數(shù)字表示涂層中細菌素NJ的含量。
[0023] 圖4顯示了牛奶在玻璃瓶內(nèi)、4°C條件下保存42天后狀態(tài)，其中圖A中玻璃瓶的涂 層內(nèi)含有250mg細菌素NJ，圖B中玻璃瓶的涂層內(nèi)含有500mg細菌素NJ。
[0024] 圖5是涂層中細菌素NJ和乳酸鏈球菌細菌素Nisin加入量對抑制單增李斯特菌 ScottA的生長情況的比較。其中"無"表示玻璃瓶中無涂層，"PLA"表示對照涂層玻璃瓶， "NJ"表示內(nèi)壁涂覆了含有細菌素NJ的涂層的玻璃瓶，"NISN"表示內(nèi)壁涂覆了含有乳酸鏈 球菌細菌素Nisin的涂層的玻璃瓶，NJ或NISN前方數(shù)字表示涂層中細菌素的含量。
[00巧]圖6是鐵質(zhì)容器涂層前后對比，其中（A)是無涂層，度）是有涂層。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1細菌素NJ的制備 W27] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方：膜蛋白腺（0X0ID) 30g/L，酵母粉（0X0ID)lOg/L，牛肉膏 (0X0ID)lOg/l，憐酸氨二鐘5g/l，乳糖5g/l，使用憐酸調(diào)節(jié)pH值6. 5,溶劑為水。
[0028] 將保存在-70 °C的耐久腸球菌巧nterococcusdurans)NJ株（公開于 化201310265229. 3號發(fā)明專利中）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下過夜培養(yǎng)用W 活化NJ株。然后再W1% (v/v)的接種量將活化的NJ株菌液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在隔水 式恒溫培養(yǎng)箱中37Γ、厭氧條件下靜置培養(yǎng)1她。
[0029] 耐久腸球菌NJ株所產(chǎn)細菌素命名為細菌素NJ。細菌素NJ的純化過程如下：收 集培養(yǎng)1化后的耐久腸球菌NJ株發(fā)酵液，4°C、12000r/min離屯、20min，分離上清液和菌體 沉淀，其中上清液作為細菌素NJ粗提液。將大孔樹脂狂AD-16樹脂）進行預(yù)處理：采用抑 2.0、濃度為70% (v/v)的異丙醇水溶液漂洗，然后采用超純水平衡。細菌素NJ粗提液采 用預(yù)處理后的大孔樹脂吸附，pH2.0、濃度為70% (v/v)的異丙醇水溶液洗脫，收集洗脫液 A。另外，用抑2.0、濃度為70% (v/v)的異丙醇水溶液重新懸浮菌體沉淀，洗涂粘附在腸 球菌上的細菌素，4°C、12000r/min離屯、20min取上清液，作為洗脫液B。合并洗脫液A、B， 在75°C恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25mU采用截留分子量為1000化的透析袋透析過夜，取截留液再次 75°C恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25mU冷凍干燥后得到細菌素NJ凍干粉。
[0030] 細菌素NJ的成本計算過程如下：1L培養(yǎng)基經(jīng)過W上制備方法可W得到細菌素凍 干粉5g，成本為454. 11元，具體分析如表一。因此，細菌素NJ的成本為90.8元/克。 陽03U 表一：細菌素NJ的成本
[0032]
[0033] 細菌素NJ效價的測定W單核細胞增生李斯特菌作為指示菌，具體方法如下：將 Ig/mL細菌素溶液進行2倍倍比稀釋（在EP管中加入100μL的超純水，然后取100μL腸 球菌素加入超純水中，混勻后逐級向下稀釋）。取稀釋好的細菌素溶液5μ以滴加到接種有 0.5% (v/v)新鮮的單核細胞增生李斯特菌的ΒΗΙ固體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公 司）上，通過瓊脂擴散法檢測該梯度細菌素稀釋液的抑菌效果。細菌素的效價用下式計算：
[0034] X= 2"X(1000/A)
[0035] 式中：η-細菌素對單核細胞增生李斯特菌有抑菌效果的最大稀釋次數(shù);A-滴加的 細菌素溶液的體積（μ?;X-細菌素的效價（AU/mL或者AU/g)。
[0036] 經(jīng)過檢測，本實施例中制備的細菌素NJ的效價為819200AU/g。
[0037] 實施例2在玻璃瓶內(nèi)壁涂覆抑制李斯特菌的涂層 陽03引 1.制備涂層的溶劑選擇
[0039] 為了選擇安全、高效的溶劑，考察大量溶劑對聚乳酸（PLA)的溶解性能，其中部分 溶劑的溶解性能列于表二。PLA，購自化化reworks化C，型號為4060D，比重1. 24,溶體密度 在230°C時為1. 08,玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為55-60°C，相對粘度為3. 4。 柳4〇] 表二：PLA的溶解情況（室溫）
[0041 ]
[0042] 從表二可W看出，PLA在二氯甲燒和氯仿中有較好的溶解性，室溫條件即可溶解， 在丙酬中溶解性相對略差，由于氯仿的毒性較大，故本實驗選取二氯甲燒作為溶劑。 陽0創(chuàng) 2.在玻璃瓶內(nèi)壁涂覆含有細菌素NJ的涂層 W44] 準確稱取一克PLA和80mg細菌素NJ。將PLA