一種新型開菲爾發(fā)酵劑的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種開菲爾發(fā)酵劑的制備方法，屬于乳制品加工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 開菲爾是一種含有少量酒精的發(fā)酵酸乳，開菲爾不同于其他傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，它是 由開菲爾粒發(fā)酵制成的。開菲爾粒是幾種菌的集合體，它賦予了開菲爾特殊的風(fēng)味?，F(xiàn)代開 菲爾粒的生產(chǎn)是基于牛奶中連續(xù)培養(yǎng)，從而增加開菲爾粒體積，但是運(yùn)種方法生長緩慢，而 且只能在原粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行，運(yùn)嚴(yán)重制約了開菲爾的工業(yè)化生產(chǎn)。直投式發(fā)酵劑的使用有 效地解決了菌種來源困難的難題，但是直投式發(fā)酵劑價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本太大，不適合中小 型企業(yè)的生產(chǎn)要求。因此，一種穩(wěn)定的能夠連續(xù)使用的發(fā)酵劑是開菲爾大規(guī)模生產(chǎn)所必需 的。而將開菲爾粒中菌種進(jìn)行微囊化，然后將微囊化發(fā)酵劑裝入特定的生物反應(yīng)器可進(jìn)行 連續(xù)接種，從而實(shí)現(xiàn)開菲爾的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0003] 傳統(tǒng)的微膠囊制法是將海藻酸鋼與菌體的混合液滴入到氯化巧溶液中制成實(shí)屯、 微球，但運(yùn)種微膠囊菌體分布不均勻，傳質(zhì)性差，易被巧樣酸和憐酸等對化有馨合作用的 物質(zhì)溶解。而液忍膠囊的制作方法正好相反，將氯化巧和菌體的混合液滴入到海藻酸鋼溶 液中，形成一層半透膜將菌體細(xì)胞環(huán)繞在液態(tài)環(huán)境中生長，并且在微囊的表面形成一層殼 聚糖膜。運(yùn)種方法不僅具有海藻酸巧包埋的優(yōu)點(diǎn)，而且具有更好地傳質(zhì)性能，為菌體細(xì)胞提 供良好的生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)菌體的高濃縮生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于研制一種能夠連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)開菲爾乳品的新型發(fā)酵劑。采用液 忍包埋和復(fù)配菌種的方式來模擬開菲爾粒的結(jié)構(gòu)，微囊化發(fā)酵劑不僅可W大量制備而且還 可W循環(huán)使用，解決了開菲爾粒來源困難、發(fā)酵不穩(wěn)定W及傳統(tǒng)純培養(yǎng)發(fā)酵劑發(fā)酵效果差 等阻礙其工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)的問題。
[000引本發(fā)明中無特殊標(biāo)注的百分比均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
[0006] 本發(fā)明提供的新型開菲爾發(fā)酵劑，其原料包括： 審恪微囊的原料：1〇8~l〇Wcfu/血的菌液； 混合溶液(其中含有質(zhì)量濃度為0.2~0.6%黃原膠與質(zhì)量濃度為3~7%氯化巧)和質(zhì)量濃 度為0.4~0.8%的海藻酸鋼溶液用于制備微囊，體積比為1: ^3; 質(zhì)量濃度為0. ^0.4%的殼聚糖溶液用于固化微囊，微囊與殼聚糖溶液體積比為1:2~5。
[0007] 利用對數(shù)后期的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌分別制成的微囊按質(zhì)量混合比例為：（2~ 6):(7 ~14):(^4)。
[0008] 本發(fā)明所使用的所用的菌種均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、，保存編號分別 為馬克思克魯維酵母CICC1953;開菲爾乳桿菌CICC20260;腸膜明串珠菌CICC23516;己氏醋 桿菌羅旺亞種CICC7011。運(yùn)樣的進(jìn)而克服了現(xiàn)有技術(shù)中直接將開菲爾粒作為發(fā)酵劑時(shí)，其 含有大量的雜菌，影響風(fēng)味及發(fā)酵不穩(wěn)定等缺陷。
[0009] 本發(fā)明新型的開菲爾發(fā)酵劑中包含酵母菌、乳酸菌和醋酸菌。其中酵母菌是 Kluyveromyces marxianus，乳酉畫菌是Lactobaci 1 lus kef iri 和Leuconostoc mesenteroides，醋酸菌是醋酸菌Acetobacter lovaniensis。
[0010] 本發(fā)明所使用的酵母菌，利用PDA培養(yǎng)基（馬鈴馨200g/L，葡萄糖20.0g/L，水 lOOOmL，121°C滅菌20min)，30°C，120;r/min進(jìn)行擴(kuò)增，通過測定菌液的0D值來確定酵母菌的 生長曲線，取對數(shù)期的菌液，4°C，800化/min離屯、15min，收集菌體備用。
[00川本發(fā)明所使用的乳酸菌，利用MRS培養(yǎng)基（蛋白腺10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，巧樣酸二錠2 g/L，憐酸氨二鐘2 g/L，乙酸鋼5 g/L，硫酸儘0.05 g/L，屯水硫酸儀0.58 g/L，葡萄糖20 g/L，加水至 1000mL，pH6.0-6.5，121°C滅菌20min)，35°C，120r/min進(jìn)行擴(kuò) 增，通過測定菌液的OD值來確定醋酸菌的生長曲線，取對數(shù)期的菌液，4°C，80(K)r/min離屯、 15min，收集菌體備用。
[0012] 本發(fā)明所使用的醋酸菌，利用LB培養(yǎng)基（氯化鋼10 g/L，蛋白腺10 g/L，酵母粉5 g/L，加蒸饋水至lOOOmL，121°C滅菌20min)，30°C，120;r/min進(jìn)行擴(kuò)增，通過測定菌液的0D值 來確定醋酸菌的生長曲線，取對數(shù)期的菌液，4°C，80(K)r/min離屯、15min，收集菌體備用。
[0013] 本發(fā)明將從開菲爾粒中分離得到的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌，分別制成108~ l〇iDc化/mL的菌液，然后取ImL菌液與19mL的黃原膠和氯化巧溶液混合均勻，利用注射裝置 將混合菌液勻速滴入到海藻酸鋼溶液中，形成液忍微膠囊。過濾并用無菌水沖洗表面的海 藻酸鋼，然后放入3~7%的氯化巧溶液中固化處理20~50min，濾出沖洗，放入到0. ^0.4%的殼 聚糖溶液中處理20~50min，濾出沖洗備用。
[0014] 本發(fā)明的新型開菲爾發(fā)酵劑是按照質(zhì)量比酵母菌微膠囊:乳酸菌微膠囊:醋酸菌 微膠囊=(2~6): (7~14):(1~4)。它是通過統(tǒng)計(jì)同一稀釋度下分離培養(yǎng)基上各菌種菌落數(shù)量， 從而按比例來確定新型發(fā)酵劑中各個(gè)菌種的配比。
[0015] 本發(fā)明提供新型開菲爾發(fā)酵劑的制備方法，與傳統(tǒng)固定化發(fā)酵劑和純培養(yǎng)發(fā)酵劑 相比，它有利于微囊內(nèi)外物質(zhì)交換，為菌體細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了菌體的高濃縮 增長，而且它可W循環(huán)使用。利用該新型開菲爾發(fā)酵劑，按5%的比例接種到滅菌乳中，20~40 °C，100~150r/min，發(fā)酵24~4化生產(chǎn)開菲爾，與傳統(tǒng)開菲爾相比，揮發(fā)性物質(zhì)和氨基酸組成 基本相同。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明新型開菲爾發(fā)酵劑發(fā)酵開菲爾揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖。圖中，橫 坐標(biāo)表示總離子流時(shí)間，縱坐標(biāo)表示總離子流豐度。
[0017] 圖2是傳統(tǒng)開菲爾揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖。橫坐標(biāo)表示總離子流時(shí)間，縱坐標(biāo) 表示總離子流豐度。
[0018] 表1是新型開菲爾發(fā)酵劑發(fā)酵開菲爾、傳統(tǒng)開菲爾和純牛奶中氨基酸組成和含量 對比表。
[0019]
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的技術(shù)方案和目的更加清楚明白，結(jié)合W下實(shí)施例對該發(fā)明進(jìn)一步 的說明。該實(shí)施例可w使本領(lǐng)域的研究人員更好的理解本發(fā)明并予w實(shí)施，但所舉實(shí)施例 不作為對本發(fā)明的限制。
[0021 ]實(shí)施例1: 馬克思克魯維酵母化luyveromyces marxianus):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、，保藏 編號為CICC1953; 開菲爾乳桿菌化actobacillus kefiri):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保藏編號為 CICC20260； 腸膜明串珠菌化euconostoc mesenteroides):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保藏編 號為 CICC23516; 己氏醋桿菌羅旺亞種(Acetobacter lovaniensis):中國工業(yè)微生物菌種保藏中屯、保 藏編號為CICC7011。
[0022] 具體操作過程如下： 1、菌種比例的選擇 取ImL開菲爾發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，然后分別吸取20化L的稀釋液涂布到MRS固體培養(yǎng) 基(乳酸菌選擇培養(yǎng)基），PDA固體培養(yǎng)基(酵母菌選擇培養(yǎng)基），Elliker固體培養(yǎng)基(醋酸菌 選擇培養(yǎng)基:膜腺20g/L，酵母粉5 g/L，明膠2.5 g/L，葡萄糖5 g/L，乳糖5 g/L，薦糖5 g/L， 氯化鋼4旨/1，乙酸鋼5旨/1，抗壞血酸0.5旨/1，加蒸饋水至10001^，抑6.8，瓊脂15-20邑/ L)上，其中PDA和Elliker培養(yǎng)基放入30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，MRS培養(yǎng)基放在37°C的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，直到菌落長出。通過菌落形態(tài)觀察，優(yōu)勢菌有1株酵母菌，2株乳酸菌和1株醋酸菌。統(tǒng) 計(jì)各菌株的數(shù)量，來確定各菌株在發(fā)酵劑中所占的比重。
[0023] 2、菌種的比例的確定 通過對開菲爾優(yōu)勢菌的鑒定和菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，確定優(yōu)勢菌的種屬和相互之間的比 例。確定酵母菌、乳酸菌和酵母菌的比例為2:7:1，其中兩種乳酸菌的比例是1:1。
[0024] 3、菌株的擴(kuò)增培養(yǎng) 在超凈工作臺上，將購得的馬克思克魯維酵母CICC1953、開菲爾乳桿菌CICC20260和 腸膜明串珠菌CICC23516、己氏醋桿菌羅旺亞種CICC7011各挑取2環(huán)分別接種到PDA液體培 養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基和Elliker液體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其中酵母菌和醋酸菌30°C， 12化/min條件下培養(yǎng)，乳酸菌37°C，120r/min條件下培養(yǎng)。通過測定發(fā)酵液的0D值確定菌株 的生長階段。各取lOOmL對數(shù)期的菌液備用。
[00巧]4、菌液的預(yù)處理 各取50mL對數(shù)期的菌液，8000g，4°C離屯、15min，去除上清液，用滅菌水清洗菌體Ξ次。 然后將收集到的菌體分別進(jìn)行稀釋，制成l〇8c化/mL的菌液，保存到4°C的冰箱中備用。
[0026] 5、液忍微膠囊的制備 取ImL菌液與19mL含有3%的氯化巧和0.2%黃原膠的混合溶液混合，制成20mL菌懸液，然 后在不斷攬拌的情況下，W5滴