膠囊化處理羅倫隱球酵母在清除棒曲霉素中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及膠囊化處理羅倫隱球酵母在清除棒曲霉素中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]棒曲霉素(Patulin)是部分青霉屬和曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物。它對(duì)人及動(dòng)物具有廣泛而強(qiáng)烈的毒性作用。急性毒性表現(xiàn)為抽搐、痙攣、皮下組織水腫、肺腸充血、腸炎、無(wú)尿直至死亡;慢性毒性可導(dǎo)致胃潰瘍，并具有抑制免疫、致畸性以及潛在的致癌性等，還有可能影響男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性條件下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。
[0003]在具有棒曲霉素產(chǎn)生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一種是擴(kuò)展青霉病菌(Penicillium expansum)。這種病原菌是世界范圍內(nèi)引起果實(shí)采后腐爛的最重要的病原菌之一，常見(jiàn)的寄主包括蘋(píng)果、梨、葡萄、櫻桃、桃、草莓等等。它在引起果實(shí)腐爛的同時(shí)，會(huì)向果實(shí)組織中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工產(chǎn)業(yè)中，如果腐爛的果實(shí)混入原材料中，那么生產(chǎn)出的果汁就會(huì)有不同程度的棒曲霉素殘留，給消費(fèi)者(特別是兒童)的身體健康帶來(lái)危害?；诎羟顾貙?duì)人體健康的潛在危害，世界上很多國(guó)家都對(duì)果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量做了規(guī)定，EU、USFDA規(guī)定果汁產(chǎn)品中棒曲霉素的最大限量為50yg/kg，WHO建議人每天棒曲霉素的攝入量不超過(guò)0.4yg/kg體重。
[0004]由于果汁通常為酸性，而棒曲霉素在酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，因此果汁中一旦污染了棒曲霉素后很難自然分解。目前，主要通過(guò)吸附、微波處理等物理手段進(jìn)行去除，但效果不是十分理想，亟需研發(fā)新型的棒曲霉素脫除手段。
[0005]酵母羅倫隱球酵母廣泛分布于植物(例如果實(shí))表面，它作為生防菌對(duì)多種果實(shí)采后病害表現(xiàn)出較好的防治效果。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)羅倫隱球酵母還具有降解棒曲霉素的能力，然而如何應(yīng)用它的這種能力是生產(chǎn)上的一個(gè)難題。如果直接將酵母加入果汁中，雖然能降解果汁中的毒素，但是混入果汁內(nèi)的酵母菌不易去除。因此，需要尋找其他的方法來(lái)利用羅倫隱球酵母的這種能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用羅倫隱球酵母膠粒清除體系中棒曲霉素的方法。
[0007]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0008]I)將羅倫隱球酵母或其懸浮液、褐藻酸鈉水溶液和CaCl2水溶液混合，得到羅倫隱球酵母膠粒；
[0009]2)將所述羅倫隱球酵母膠粒與含有棒曲霉素的體系混勻，反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)清除所述體系中棒曲霉素。
[0010]上述方法中，所述將羅倫隱球酵母懸浮液、褐藻酸鈉水溶液和CaCl2水溶液混合包括如下步驟:將所述羅倫隱球酵母懸浮液與所述褐藻酸鈉水溶液混勻，得到混合液;再將所述混合液逐滴加入所述CaCl2水溶液中混勻，靜置，得到羅倫隱球酵母膠粒；
[0011 ]所述混合液中所述羅倫隱球酵母和所述褐藻酸鈉的配比為2.5 X 18個(gè):lg;
[0012]所述CaCl2水溶液的質(zhì)量體積百分比為2%。
[0013]上述方法中，所述混合液中羅倫隱球酵母的含量為2.5X 18個(gè)/ml;
[0014]所述混合液中褐藻酸鈉的質(zhì)量體積百分比為I%。
[0015]上述方法中，所述褐藻酸鈉的粘度為3500cp。
[0016]上述方法中，所述羅倫隱球酵母懸浮液的懸浮緩沖液為水。
[0017]上述方法中，所述靜置的時(shí)間為1min;
[0018]所述反應(yīng)的時(shí)間為24-72小時(shí)。
[0019]上述方法中，在步驟2)的反應(yīng)后，還包括如下步驟:回收反應(yīng)體系中的所述羅倫隱球酵母膠粒。
[0020]上述方法中，所述含有棒曲霉素的體系為污染棒曲霉素的果汁或含有棒曲霉素的水溶液。
[0021]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種制備羅倫隱球酵母膠粒的方法。
[0022]本發(fā)明提供的方法，包括上述的方法中的步驟I)。
[0023]上述的方法制備的羅倫隱球酵母膠粒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]上述的方法或上述的羅倫隱球酵母膠粒在清除污染棒曲霉素的果汁中棒曲霉素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種用羅倫隱球酵母膠粒清除體系中棒曲霉素的方法，其清除效果顯著高于單獨(dú)的膠粒和單獨(dú)的羅倫隱球酵母，且清除后容易回收膠囊化的羅倫隱球酵母，不會(huì)影響體系;證明了膠囊化的羅倫隱球酵母可以用來(lái)清除體系中的棒曲霉素。這種方法可以用來(lái)清除污染棒曲霉素的果汁，且不影響果汁本身的組分。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為羅倫隱球酵母清除棒曲霉素的結(jié)果圖。
[0027]圖2為棒曲霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]下述實(shí)施例中的酵母菌株:羅倫隱球酵母Cryp to Co c cu s laurentii (Kuffer.)Skinner0
[0031]下述實(shí)施例中培養(yǎng)基如下:
[0032]NYDA固體培養(yǎng)基(g/L):牛肉浸膏(Beef Extract)l，葡糖糖(Glucose) 10，蛋白胨(Pep tone) 5，酵母提取物(Yeast extract) 7,氯化鈉(NaCl) 5，瓊脂粉(Agar) 15。
[0033]NYDB液體培養(yǎng)基(g/L):牛肉浸膏(Beef Extract)l，葡糖糖(Glucose) 10，蛋白胨(Peptone)5，酵母提取物(Yeast extract)7，氯化鈉(NaCl)5。蒸饋水定容到IL后，121°C滅菌20mino
[0034]pH=4雙蒸水:取雙蒸水用乙酸調(diào)至pH=4后過(guò)濾滅菌；
[0035]質(zhì)量體積百分比2%褐藻酸鈉水溶液(W/V):稱(chēng)取2g粘度為3500cp的褐藻酸鈉(Sigma公司生產(chǎn))，加入10ml蒸饋水，121°C滅菌20min;
[0036]質(zhì)量體積百分比2%CaCl2水溶液(W/V):稱(chēng)取2gCaCl2，加入10ml蒸餾水，過(guò)濾滅菌；
[0037]濾膜:又名神奇濾布(Miracloth)，22-25μηι孔徑，MerckMiIIipore公司產(chǎn)品。
[0038]棒曲霉素(？&加1丨11少六1'):取21^棒曲霉素(青島生工公司)溶于41111 PH = 4的雙蒸水中，配成0.5mg/ml的母液，過(guò)濾滅菌后使用。
[0039]實(shí)施例1、膠囊化處理羅倫隱球酵母清除棒曲霉素的方法
[0040]一、膠囊化處理羅倫隱球酵母
[0041]1、酵母細(xì)胞懸液的制備
[0042]取_80°C冰箱中凍存的羅倫隱球酵母Cryptococcus laurentii菌種，在NYDA板上劃線，待長(zhǎng)出菌落后，挑單菌落到NYDB中，28°C，220rpm/min，培養(yǎng)18h。計(jì)數(shù)后以細(xì)胞終濃度為I X 15個(gè)/ml轉(zhuǎn)接到40ml NYDB中，28°(3，220印111/1^11，培養(yǎng)4811，得到酵母細(xì)胞懸液；
[0043]2、膠囊化處理
[0044]取出20ml酵母細(xì)胞懸液，115°C，1min高壓滅菌，使細(xì)胞完全失活為死細(xì)胞懸液，另