一種花生納米肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體的，設及一種花生納米膚的制備方法。
【背景技術】
[0002] 花生蛋白為制備具有優(yōu)良生理活性短膚的重要蛋白源，一些花生蛋白酶解產物、 =膚、四膚和六膚等陸續(xù)被發(fā)現具有較好的ACE抑制活性，但ACE抑制單體膚因為需要經過 高成本、低得率的酶解、純化工藝，因此實際應用有限。提高酶解效率、充分挖掘花生蛋白中 蘊藏的大量高生理活性短膚，同時適當降低生產成本，提高混合型花生短膚在功能食品中 的應用，成為花生短膚的重要發(fā)展方向，而對花生蛋白進行物理改性就是一個具有實際應 用價值的有效方案。
[0003] 動態(tài)高壓微射流(DHPM)技術是一種新興的物理處理手段，其工作原理是通過高速 碰撞、高頻振蕩、瞬時壓降、強烈剪切等作用實現對物料的改性，能夠實現對物料的改性或 者改變大分子的結構。高壓微射流處理目前已經成為提高蛋白質功能性質的一種有效方 法，但采用高壓微射流改性蛋白質W有利于短膚制備的研究尚未見報道。
[0004] 因此有必要開發(fā)利用高壓微射流方法對蛋白質進物理行改性的技術，從而為制備 具有高生物活性的短膚產品提供新的有效的方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種采用高壓微射流處理提高酶解效率制備高ACE抑制活 性花生納米膚的方法。
[0006] 為達到W上目的，本發(fā)明提供了一種花生納米膚的制備方法，該方法包括W下步 驟：
[0007] 步驟一:將花生蛋白制備成花生分離蛋白；
[000引步驟二:將花生分離蛋白配制成質量體積比濃度為4-6%的花生分離蛋白水溶液， 采用高壓微射流在100-135M化壓力下循環(huán)處理2-4次后干燥，得到物理改性的花生分離蛋 白；
[0009] 步驟將所述物理改性的花生分離蛋白配制成質量體積比濃度為8-10%的水溶 液，加入中性蛋白酶，酶解反應80-11 Omin;得到中間酶解液(即第一次酶解液）；
[0010] 步驟四：在中間酶解液中加入復合蛋白酶，酶解反應80-1 IOmin，得到最終酶解產 物；
[0011] 步驟五:對所得酶解產物進行滅酶處理，離屯、取上清液，取分子量小于化D的濾過 液，干燥后獲得納米膚。所述納米膚為高ACE抑制活性納米膚。
[0012] 圖1為本發(fā)明所述高壓微射流處理提高酶解效率制備高ACE抑制活性花生納米膚 的方法示意圖。
[0013] 優(yōu)選的，所述花生分離蛋白由如下的堿溶酸沉方法制備而成:將花生蛋白粉與去 離子水混合，制備質量體積比濃度為9-11%的花生蛋白溶液，調節(jié)抑值至7.8-8.2,攬拌溶 解110-130min; 3800-4200巧m離屯、14-16min;取上清液，調節(jié)抑值至4.4-4.6，靜置沉淀50-70min; 3800-4200巧m離屯、14-16min;取沉淀，加水溶解，調節(jié)抑值至6.8-7.2，攬拌溶解100-140min;噴霧干燥，得花生分離蛋白。
[0014]優(yōu)選的，在步驟一中，所述花生分離蛋白中蛋白含量大于85%。
[001引其中，可W利用NaOH和肥1進行抑值調節(jié)。
[0016] 其中，步驟二中，通過高壓微射流處理對花生分離蛋白進行物理改性，通過高壓微 射流的高速碰撞、高頻振蕩、瞬時壓降、強烈剪切等作用實現對物料的改性，使蛋白質結構 解聚，W暴露更多的酶切位點，增進酶的作用效率。
[0017] 優(yōu)選的，在步驟二中；高壓微射流的壓力為110-125MPa，循環(huán)次數為3次。
[0018] 優(yōu)選的，所述花生分離蛋白水溶液的質量體積比濃度為4-6%。
[0019] 優(yōu)選的，在步驟一中，所述花生分離蛋白中蛋白含量大于85%。
[0020] 優(yōu)選的，在步驟S中，中性蛋白酶的添加量為3800-4500U/g底物，酶解時間為90-1 lOmin、酶解溫度為42-48°C。特別優(yōu)選的，中性蛋白酶的添加量為3900-4000U/g底物，酶解 時間為95-105min、酶解溫度為45°C。
[0021] 優(yōu)選的，在步驟=中，先將物理改性的花生分離蛋白的水溶液在75-85°C水浴中震 蕩保溫8-12min后再利用中性蛋白酶進行酶解。
[0022] 優(yōu)選的，復合蛋白酶的添加量為300-450U/g底物;酶解時間為90-1 lOmin、酶解溫 度為42-48°C。特別優(yōu)選的，復合蛋白酶的添加量為350-380U/g底物；酶解時間為95-105min、酶解溫度為45°C。
[0023] 可選的，在步驟五中將所述酶解產物在85-95°C下水浴8-12min滅酶。
[0024] 步驟五中離屯、的目的是為了除去部分未酶解的雜質;超濾采用化D的超濾膜進行， 濾液即為高活性的納米膚，運主要是根據前期大量的結果發(fā)現，小于IKD的膚具有更好的 ACE抑制活性。經測定，小于化D的膚粒徑低于lOOnm，因此所獲得膚就是納米膚。
[0025] 本發(fā)明還提供了利用上述方法制備的花生納米膚。
[0026] 本發(fā)明還提供了所述的花生納米膚在制備用于抑制ACE活性的制劑中的應用。所 述制劑為降壓食品或藥品。
[0027] 有益效果：
[0028] 1.本發(fā)明所述的花生納米膚的制備方法，采用優(yōu)化的料液濃度、高壓微射流壓力 和循環(huán)次數，實現了花生蛋白結構的最大程度展開，為后續(xù)酶解創(chuàng)造了最佳的作用環(huán)境；
[0029] 2.本發(fā)明所述的花生納米膚的制備方法，有效降低了酶解成本，提高了酶解效率； 對比同類底物，采用相同種類的酶，中性蛋白酶用量降低了 25%，酶解時間降低了 17%;復 合蛋白酶用量則相差不大，酶解時間降低了 17% ;
[0030] 3.本發(fā)明所述的高壓微射流處理提高酶解效率，制備花生納米膚的方法，所獲得 的酶解產物短膚得率達到88.26%，所獲得的分子量小于1000化的短膚含量占98.15%，均 高于原料未采用高壓微射流處理的同等酶解工藝;未經超濾的短膚的ACE抑制活性，其IC50 值為0.55mg/mL，高于未采用高壓微射流處理同等酶解工藝的對照；而經超濾處理后，其 IC50值為0.192mg/mL，粒徑為14.4nm，具有高ACE抑制活性。
【附圖說明】
[0031] 圖I為本發(fā)明所述高壓微射流處理提高酶解效率制備高ACE抑制活性花生納米膚 的方法示意圖。
[0032] 圖2為本發(fā)明中所得的高壓微射流不同壓力處理花生分離蛋白及對照微觀結構。
[0033] 圖3為本發(fā)明中所得的高壓微射流不同壓力處理及對照酶解產物ACE抑制活性 IC50值變化。
[0034] 圖4為本發(fā)明中所得的高壓微射流不同壓力處理及對照中性蛋白酶酶解不同底物 濃度、酶解時間和酶用量對短膚得率的影響。
[0035] 圖5為本發(fā)明中所得的高壓微射流不同壓力處理及對照復合蛋白酶酶解不同酶解 時間和酶用量對短膚得率的影響。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0037] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0038] 下述實施例中采用的高壓微射流處理為通過微射流高壓均質機進行，設備為美國 B邸international公司生產;所采用的中性蛋白酶、復合蛋白酶均為北京索萊寶科技有限 公司生產;粒徑分析采用的儀器為英國馬爾文儀器有限公司生產的Zeta電位分析儀;透射 電鏡為日本日立公司生產的H-7500透射電子顯微鏡;高效液相色譜采用美國Waters公司的 Waters 1525高效液相色譜系統；
[0039] 下述實施例中通過透射電鏡法進行微觀結構的觀察：
[0040] 用去離子水將固體樣品配制成濃度為lmg/mL(w/v)的溶液，取一滴溶液加到覆有 聚乙締醇縮甲醒脂膜的銅網上，銅網水平放置2~3min使分子聚集體沉積到網面上，用濾紙 吸去表面多余溶液，之后滴加2 %的醋酸雙氧釉溶液負染2min，將銅網在濾紙上放置3min使 充分染色并吸去多余的染液，干燥后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。
[0041 ]花生短膚分子量分布的測定:高效液相色譜法
[0042] 分別精確稱取固體樣品2. Omg，加入去離子水1 OmL配制成0.2mg/mL濃度的短膚溶 液，采用高效液相色譜對短膚的分子量分布進行測定，條件為：色譜柱： TSKge 12000SWXL300mm X 7.8mm;流動相：乙臘:水:S氣乙酸=45:55:0.1，流速:0.5mL/min， 溫度:30°C;檢測波長:220nm。
[0043] ACE抑制活性的測定:高效液相色譜法
[0044]分別精確稱取花生短膚，加入去離子水分別配制成2mg/mL、lmg/mL、0.5mg/mL、 0.2mg/mL、0.05mg/mL濃度的短膚溶液，采用高效液相色譜對短膚的ACE抑制活性進行測定， 條件為：色譜柱Sunf ire TM-C18(250 X 4.6mm)，流動相：乙臘：水:S氣乙酸=50:50:0.05， 流速:0.4mL/min，溫度:30°C;檢測波長:228nm。測定結果采用化igin 8.0軟件計算IC50值。
[0045] 短膚得率的測定:采用=氯乙酸可溶性氮法。
[0046] 精密稱取Ig左右中間酶解產物樣品入小燒杯，加入IOml 10%S氯乙酸，電磁攬 拌，溶解，定容至50ml容量瓶中，靜止沉降30分鐘后，420化pm離屯、30分鐘，取上清液5ml采用 福林酪法測定含氮量;同法測定中間酶解產物