煙草細胞提取液的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種工程細胞的培養(yǎng)和提取方法，具體地指一種煙草細胞提取液的制 備方法。
【背景技術】
[0002] 植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術，又稱離體培養(yǎng)，是根據植物細胞具有全能性 的理論，利用植物體離體的器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）、組織（如形成層、表皮、皮 層、髓部細胞、胚乳等）或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質體，在無菌和適 宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整 的植株的學科。植物組織培養(yǎng)具有培養(yǎng)條件可以人為控制，生長周期短，繁殖率高，而且管 理方便，利于工廠化生產和自動化控制的特點。其優(yōu)勢也非常明顯，如下所示：
[0003] 1)占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制；
[0004] 2)可短時間大量繁殖，用于拯救瀕危植物；
[0005] 3)可誘導之分化成需要的器官，如根和芽；
[0006] 4)解決有些植物產種子少或無的難題；
[0007] 5)不存在變異，可保持原母本的一切遺傳特征；
[0008] 6)投資少，經濟效益高；
[0009] 7)繁殖方式多，試用品種多。
[0010] 煙用香精香料是卷煙產品的靈魂。全世界的煙草行業(yè)都高度重視煙用香精香料的 開發(fā)和應用，而且把能生產高品質香精香料的技術當作自己的秘密武器，以謀求在激烈的 市場競爭中占據有利的地位。香精香料在卷煙中可以起到掩蓋缺點、改善煙草香氣和吃味、 改進煙草的物理性能、賦予卷煙獨特的口味和風格的作用，并且可以實現產品品質差異化， 穩(wěn)定卷煙抽吸品質，對于卷煙的風格和品質形成有重要影響。同時天然香精香料以其源自 天然，各有效成分比例協(xié)調，綠色、環(huán)保、降害作用明顯的特點，在中式卷煙核心技術的形成 中，其作用將會越來越重要，尤其是在改善卷煙嗅香與吸味，構筑卷煙獨特的口味和風格方 面，作用更加明顯。而在眾多的天然香精香料品種中，煙草提取物具有其它品種提取物不可 比擬的優(yōu)勢。首先，煙草提取物來自于煙葉，其成分種類和煙葉基本一致；其次，提取物不會 對煙支帶來不良氣味；第三，提取后的煙草余料還可以用于煙草薄片的生產，達到循環(huán)利用 的目的。
[0011]目前的煙草提取物主要是從煙葉中提取，該方法具有一定的缺陷和不足：
[0012] 1)煙葉植株的生長過程中易收到溫度、雨水、光照、蟲害、人員素質等因素的影 響；
[0013] 2)需要犧牲大量的耕地面積，同時煙葉施肥還容易造成土壤板結，引起土地養(yǎng)分 嚴重失調；
[0014] 3)由于原料來源的不穩(wěn)定性，導致提取物品質波動；
[0015] 4)由于煙葉資源的有限性，導致煙葉原料需求無法得到滿足。

【發(fā)明內容】

[0016] 本發(fā)明的目的是針對現有技術的不足，提供一種煙草細胞提取物的制備方法。該 方法利用植物細胞培養(yǎng)技術，通過大規(guī)模培養(yǎng)高產煙草工程細胞，獲得大量的煙草細胞，并 對培養(yǎng)的細胞進行提取分離，最終得到高質量的煙草提取物。本方法具有不占用有效煙葉 資源、可控性強、加工周期短、投入低、無污染的特點。通過本方法制備得到的煙草細胞提取 物有效成分含量高，能賦予卷煙甜香和清香香韻，柔和細膩煙氣，提高煙氣濃度，增加香氣 量，增加甜感，降低刺激。
[0017] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的一種煙草細胞提取物的制備方法，包括以下 步驟：
[0018] 1)愈傷組織的獲得
[0019] 選取常規(guī)烤煙品種的裸種，用體積分數為75%的酒精沖洗2~3次，再用質量分數 為0. 1 %的!^(：12溶液處理3~lOmin，無菌水沖洗3~5次，然后將滅菌后的種子播撒在不 含蔗糖和激素的滅菌后的MS固體培養(yǎng)基上，在25± 1°C光照條件下培養(yǎng)3~5周后，選取下 胚軸、莖尖等作為外植體，剪碎移入MS誘導固體培養(yǎng)基中，在25±1°C光照條件下培養(yǎng)2~ 6周，即得到愈傷組織；
[0020] 2)細胞的制備
[0021] 將步驟1)得到愈傷組織連續(xù)培養(yǎng)2~4代，在無菌條件下，挑取細胞形態(tài)好的細 胞團塊繼續(xù)接種培養(yǎng)，經挑選的細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)1~2代挑選一次，直到所獲得的細胞團為 疏松顆粒狀為止，然后將顆粒狀的細胞團置于MS液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，過濾篩選得到 單個細胞或者含有2~5個細胞的小細胞團；
[0022] 3)原生質體的制備和細胞克隆的獲得
[0023] 按原生質體制備的常規(guī)方法將步驟2)得到單個細胞或者含有2~5個細胞的小 細胞團分解過篩制備得到原生質體細胞，再將原生質體細胞孵育后分離培養(yǎng)，選取細胞壁 恢復快、細胞分裂生長正常、迅速的單細胞后代作為備選細胞克隆，經2~20次傳代篩選后 獲得所需細胞克??；
[0024] 4)克隆細胞的收集
[0025] 挑選步驟3)的細胞克隆，培養(yǎng)10~25天后置于干凈的紗布上，用蒸餾水沖洗， 去除多余的瓊脂后，置于40~60°C的干燥培養(yǎng)箱中，處理12~36h后，得到細胞粉末；
[0026] 5)煙草細胞提取物的制備
[0027] a、稱取步驟4)得到細胞粉末，加入10~30倍重量的體積分數為50~95%乙醇 溶液回流提取1~3h，重復2~3次，收集提取液過濾減壓濃縮至1. 18~I. 22g/cm3;得到 初級煙草細胞提取液；
[0028] b、向初級煙草細胞提取液中加入其重量10~40%的丙二醇，攪拌均勻，然后進行 分子蒸餾分離，得到分子蒸餾輕組分即為煙草細胞提取物。
[0029] 進一步地，所述步驟1)中，MS誘導培養(yǎng)基中含有質量分數為0.05~0.3%的萘乙 酸（NAA)、質量分數為0.05~0.25%的2,4_二氯苯氧乙酸（2, 4-D)、質量分數為0.01~ 0. 5%的6-芐基嘌呤（6-BA)和質量分數為0. 1~1. 0%的蔗糖。
[0030] 再進一步地，所述步驟5)的第b小步中，分子蒸餾分離的工藝參數為：真空度 彡1.0 tor，刮板轉速至50~400r/min，蒸餾溫度35~60°C，冷凝溫度-15~(TC，蒸餾速 度 0· 2 ~1.0 Kg/h。
[0031] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點是：不占用有效煙葉資源、可控性強、加工周期短、投入低、無污染 等，制備的煙草細胞提取物有效成分含量高，能賦予卷煙甜香和清香香韻，柔和細膩煙氣， 提高煙氣濃度，增加香氣量，增加甜感，降低刺激。
【附圖說明】
[0033] 圖1為獲得的愈傷組織；
[0034] 圖2為大量培養(yǎng)的煙草工程細胞株；
[0035] 圖3是煙草細胞烘干前后照片對比；
[0036] 圖4是煙草細胞提取物主要致香成分總離子流圖；
【具體實施方式】
[0037] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內容，但 本發(fā)明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0038] 實施例1
[0039] 煙草細胞提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0040] 1)愈傷組織的獲得
[0041] 選取常規(guī)烤煙品種的裸種，用體積分數為75%的酒精沖洗2次，再用質量分數為 0. 1 %的取(：12溶液處理6min，無菌水沖洗5次，然后將滅菌后的種子播撒在不含蔗糖和激 素的滅菌后的MS固體培養(yǎng)基上，在25±1°C光照條件下培養(yǎng)3周后，選取下胚軸、莖尖等作 為外植體，剪碎移入MS誘導固體培養(yǎng)基中，在25 ± I °C光照條件下培養(yǎng)4周，即得到愈傷組 織；所述MS誘導培養(yǎng)基中含有質量分數為0.05%的萘乙酸（NAA)、質量分數為0. 15%的2， 4_二氯苯氧乙酸（2, 4-D)、質量分數為0. 01~0. 5%的6-芐基嘌呤（6-BA)和質量分數為 0. 1~1. 0%的鹿糖。
[0042] 2)細胞的制備
[0043] 將步驟1)得到愈傷組織連續(xù)培養(yǎng)3代，在無菌條件下，挑取細胞形態(tài)好的細胞團 塊繼續(xù)接種培養(yǎng)，經挑選的細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)1代（2-4周）挑選一次，直到所獲得的細胞團 為疏松顆粒狀為止，然后將顆粒狀的細胞團置于MS液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，過濾篩選得 到單個細胞或者含有2~5個細胞的小細胞團；
[0044] 3)原生質體的制備和細胞克隆的獲得
[0045] 按原生質體制備的常規(guī)方法將步驟2)得到單個細胞或者含有2~5個細胞的小 細胞團分解過篩制備得到原生質體細胞，再將原生質體細胞孵育后分離培養(yǎng)，選取細胞壁 恢復快、細胞分裂生長正常、迅速的單細胞后代作為備選細胞克隆，經5次傳代篩選后獲得 所需細胞克隆；
[0046] 4)克隆細胞的收集
[0047] 挑選步驟3)的細胞克隆，培養(yǎng)10天后置于干凈的紗布上，用蒸餾水沖洗，去除多 余的瓊脂后，置于50°C的干燥培養(yǎng)箱中，處理18h后，得到細胞粉末；
[0048] 5)煙草細胞提取物的制備
[0049] a、稱取步驟4)得到細胞粉末，加入15倍重量的體積分數為70%乙醇溶液回流提 取2h，重復2次，收集提取液過濾減壓濃縮至I. 20g/cm3;得到初級煙草細胞提取液；
[0050] b、向初級煙草細胞提取液中加入其重量20%的丙二醇，攪拌均勻，然后進行分子 蒸餾分離，分子蒸餾分離的工藝參數為：真空度為〇. 40tor，刮板轉速至80r/min，蒸餾溫度 35°C，冷凝溫度-10°C，蒸餾速度0. 20Kg/h ;得到分子蒸餾輕組分即為煙草細胞提取物1。
[0051] 實施例2
[0052] 煙草細胞提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0053] 1)愈傷組織的獲得
[0054] 選取常規(guī)烤煙品種的裸種，用體積分數為75%的酒精沖洗2次，再用質量分數為 0. 1 %的取(：12溶液處理lOmin，無菌水沖洗5次，然后將滅菌后的種子播撒在不含蔗糖和激 素的滅菌后的MS固體培養(yǎng)基上，在25±1°C光照條件下培養(yǎng)3周后，選取下胚軸、莖尖等作 為外植體，剪碎移入MS誘導固體培養(yǎng)基中，在25±1°C光照條件下培養(yǎng)6周，即得到愈傷組 織；其中，MS誘導培養(yǎng)基中含有質量分數為0. 05 %的萘乙酸、質量分數為0. 15 %的2，4-二 氯苯氧乙酸、質量分數為0.0 l~0. 5%的6-芐基嘌呤和質量分數為0. 1~