本發(fā)明涉及用于靶向的醫(yī)學(xué)成像和/或治療的預(yù)靶向方法(pretargetingmethod)，其中使用彼此顯示出生物正交(bio-orthogonal)反應(yīng)性的非生物(abiotic)反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。本發(fā)明還涉及含有至少一種預(yù)靶向探針(pre-targetingprobe)和至少一種效應(yīng)物探針(effectorprobe)的預(yù)靶向試劑盒(kit)，其中所述預(yù)靶向探針包含初級(jí)靶向部分(primarytargetingmoiety)和第一生物正交反應(yīng)性基團(tuán)，和其中所述效應(yīng)物探針包含效應(yīng)物部分，例如標(biāo)記物或藥學(xué)活性化合物，和第二生物正交反應(yīng)性基團(tuán)。本發(fā)明還涉及在上述方法和試劑盒中使用的預(yù)靶向試劑。本發(fā)明特別地涉及核成像和放射療法。

背景技術(shù)：
在醫(yī)學(xué)診斷和治療的許多領(lǐng)域中，希望選擇性地將試劑，例如治療劑(藥物)或診斷(例如成像)劑遞送到受試者(subject)例如病人體內(nèi)的特定位點(diǎn)或有限區(qū)域。器官或組織的活性靶向通過所希望的活性部分(例如對(duì)比增強(qiáng)劑或細(xì)胞毒素化合物)對(duì)靶向結(jié)構(gòu)的直接或間接結(jié)合實(shí)現(xiàn)，其與細(xì)胞表面結(jié)合或促進(jìn)在感興趣的靶位點(diǎn)處或附近的細(xì)胞攝取。用于靶向此類試劑的靶向部分典型地是對(duì)細(xì)胞表面靶(例如膜受體)、結(jié)構(gòu)蛋白(例如淀粉樣斑)或細(xì)胞內(nèi)靶(例如RNA、DNA、酶、細(xì)胞信號(hào)通路)具有親和性的結(jié)構(gòu)。這些部分可以是抗體(片段)、蛋白質(zhì)、適體(aptamers)、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、擬肽(peptoids)和已知在特定疾病或障礙處積累的有機(jī)藥物化合物。作為選擇，對(duì)比/治療劑可以靶向代謝途徑，其在疾病(例如感染或癌癥)期間表達(dá)升高，例如DNA、蛋白質(zhì)和膜合成和碳水化合物攝取。在患病組織中，上述標(biāo)志物可以將患病細(xì)胞從健康組織區(qū)分并提供早期檢測(cè)、特異性診斷和(靶向的)治療的獨(dú)特可能性。通常對(duì)于成功的分子成像/治療劑和特別對(duì)于核成像/治療劑一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是它們呈現(xiàn)高靶攝取，同時(shí)顯示出從非靶組織和從血液的快速清除(通過腎臟和/或肝膽體系)。但是，這經(jīng)常存在問題：例如，人中的成像研究已經(jīng)顯示，在腫瘤位置處經(jīng)放射標(biāo)記的抗體在24小時(shí)內(nèi)可達(dá)到最大濃度，但需要另外幾天在循環(huán)中的所述經(jīng)標(biāo)記的抗體的濃度才下降到低至足以發(fā)生成功成像的水平。在靶組織中的緩慢或不充分積累以及從非靶區(qū)域緩慢清除所帶來的這些問題(特別是對(duì)于核成像和治療)已經(jīng)導(dǎo)致預(yù)靶向方法的應(yīng)用。預(yù)靶向是指在靶向方法中的步驟，其中向初級(jí)靶(例如細(xì)胞表面)提供有預(yù)靶向探針。后者包括次級(jí)靶，其最后將通過裝備有次級(jí)靶向部分的進(jìn)一步的探針(所述效應(yīng)物探針)進(jìn)行靶向。這樣，在預(yù)靶向中，將預(yù)靶向探針結(jié)合到初級(jí)靶。所述預(yù)靶向探針還攜帶次級(jí)靶，其促進(jìn)對(duì)診斷(成像)和/或治療劑，所述效應(yīng)物探針的特異性結(jié)合。在形成所述預(yù)靶向探針的結(jié)構(gòu)已經(jīng)定位在靶位點(diǎn)處之后(花費(fèi)時(shí)間例如24小時(shí))，如果自然清除不充分，則可以使用清除劑從血液除去過量的部分。在第二培育步驟(優(yōu)選采取較短的時(shí)間，例如1-6小時(shí))中，所述效應(yīng)物探針通過它的次級(jí)靶向部分(secondarytargetingmoiety)結(jié)合到所述(預(yù))結(jié)合的預(yù)靶向探針。所述次級(jí)靶(存在于所述預(yù)靶向探針上)和所述次級(jí)靶向部分(存在于所述效應(yīng)物探針上)應(yīng)該以高特異性和高親和性快速結(jié)合，并且在體內(nèi)應(yīng)該是穩(wěn)定的。對(duì)于成像，預(yù)靶向的一般概念在圖1中繪出。在這里，所述效應(yīng)物探針是包含用于成像模式的可檢測(cè)標(biāo)記物的成像探針。所述效應(yīng)物探針通過其次級(jí)靶向基團(tuán)結(jié)合到所述(預(yù))結(jié)合的預(yù)靶向探針。次級(jí)靶/次級(jí)靶向部分對(duì)的一般例子是生物素/抗生蛋白鏈菌素或抗體/抗原體系。為了有效，所述效應(yīng)物探針必需快速?gòu)捏w內(nèi)排出(例如通過腎臟)以提供所希望的具有相對(duì)低的非靶積累的高腫瘤積累。因此，這些探針通常很小。在核成像和放射療法中，預(yù)靶向的概念具有進(jìn)一步的益處，因?yàn)榛ㄙM(fèi)時(shí)間的預(yù)靶向步驟可以不必使用放射性核素實(shí)施，而使用放射性核素的次級(jí)靶向步驟能夠更快地實(shí)施。后者使得能夠使用較短壽命的放射性核素，具有將對(duì)病人的放射劑量最小化的優(yōu)點(diǎn)，例如使用PET試劑代替SPECT試劑。結(jié)合多齒配體體系(抗生蛋白鏈菌素、樹枝狀聚合物(dendrimers))在MRI中使用預(yù)靶向方法能夠在靶位點(diǎn)處提供信號(hào)放大。此外，通常該方法有利于通用對(duì)比劑的使用。通常在生物學(xué)中(如抗體-抗原)和特別在預(yù)靶向中(生物素-抗生蛋白鏈菌素、抗體/半抗原、反義寡核苷酸)實(shí)施高度選擇性相互作用的實(shí)體非常大。因此，使用肽和小有機(jī)部分作為初級(jí)靶向基團(tuán)的預(yù)靶向，以及代謝成像和細(xì)胞內(nèi)靶成像，由于次級(jí)靶的尺寸使得小初級(jí)基團(tuán)的使用毫無(wú)意義而仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)。而且，現(xiàn)有的預(yù)靶向體系被與它們的生物特性相關(guān)的因素所限制。生物素是內(nèi)源分子，并且它的綴合物(conjugates)能夠通過血清酶生物素酶斷開。當(dāng)使用反義預(yù)靶向時(shí)，所述寡核苷酸會(huì)受到RNAse和DNAse的攻擊。蛋白質(zhì)和肽也經(jīng)歷自然分解途徑。這些相互作用可被它們的非共價(jià)和動(dòng)態(tài)特性以及有限的靶上駐留時(shí)間進(jìn)一步削弱。而且，內(nèi)源性生物素與生物素綴合物競(jìng)爭(zhēng)抗生蛋白鏈菌素結(jié)合。最后，抗生蛋白鏈菌素是高度免疫原性的。近來的一個(gè)發(fā)展是避免與僅基于天然/生物靶向結(jié)構(gòu)(即生物素/抗生蛋白鏈菌素、抗體/半抗原、反義寡核苷酸)的預(yù)靶向相關(guān)的缺點(diǎn)。這方面的一篇文獻(xiàn)是WO2010/051530，其中基于某些二烯例如四嗪類和親雙烯體例如反式-環(huán)辛烯醇(trans-cyclooctenol,TCO)之間的反應(yīng)性對(duì)預(yù)靶向進(jìn)行了討論。這方面的一篇進(jìn)一步的文獻(xiàn)是Li等,ChemicalCommunications,2010,46(42),p.8043-8045，其描述了基于3,-二芳基-s-四嗪和18F-標(biāo)記的反式-環(huán)辛烯之間的Diels-Alder反應(yīng)的用于生物結(jié)合的放射標(biāo)記方法。Rossin等,Angew.Chem.Int.,Ed2010,49,p.3375-3378涉及通過使用逆電子需求的Diels-Alder反應(yīng)(inverse-electron-demandDiels-Alderreaction)的腫瘤預(yù)靶向。Blackman等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,p.13518-13519描述了基于逆電子需求的Diels-Alder反應(yīng)性的快速生物結(jié)合。Royzen等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,p.3760-3761涉及通過金屬絡(luò)合驅(qū)動(dòng)的官能化的反式-環(huán)辛烯的光化學(xué)合成。盡管在這些體系的基礎(chǔ)上能夠獲得相對(duì)快速的反應(yīng)，但這還遠(yuǎn)不如上述生物素-抗生蛋白鏈菌素體系的反應(yīng)性。因此，避免后者的缺點(diǎn)，卻犧牲了所述反應(yīng)的主要要求，即速度。因此，希望提供一種體系，其不以如上討論的生物分子為基礎(chǔ)，并且還具有理想的快速反應(yīng)速率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了更好地滿足上述愿望，本發(fā)明一方面提供了用于靶向的醫(yī)學(xué)成像和/或治療的試劑盒(kit)，其包含至少一種預(yù)靶向探針和至少一種效應(yīng)物探針，其中所述預(yù)靶向探針包含初級(jí)靶向部分和第一生物正交反應(yīng)性基團(tuán)，和其中所述效應(yīng)物探針包含效應(yīng)物部分(例如標(biāo)記物或藥學(xué)活性化合物)和第二生物正交反應(yīng)性基團(tuán)，其中所述第一和第二生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的任一個(gè)是親雙烯體(dienophile)，而所述第一和第二生物正交反應(yīng)性基團(tuán)中的另一個(gè)是二烯，其中所述親雙烯體是滿足式(1)的8元環(huán)親雙烯體：其中R的位置是平伏的(equatorial)和Ra的位置是直立的(axial)，其中X、Y、R、和Ra的每一個(gè)獨(dú)立地代表H，或者最多六次(inatmostsixinstances)代表選自由以下組成的組的取代基：烷基、芳基、O-芳基、O-烷基、S-芳基、S-烷基、S(O)-芳基、S(O)-烷基、S(O)2-芳基、S(O)2-烷基、Si-芳基、Si-烷基、Si-O-烷基、OCO-烷基、OCO-芳基、SCO-烷基、SCO-芳基、OCS-烷基、OCS-芳基、SCS-烷基、SCS-芳基、F、Cl、Br、I、N3、SO2H、SO3H、SO4H、PO4H、OH、SH、NO2、NO、CN、OCN、SCN、NCO、NCS、CF3、NR’R”其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基、C(=O)O-烷基、C(=O)O-芳基、C(=S)O-烷基、C(=S)O-芳基、C(=O)S-烷基、C(=O)S-芳基、C(=S)S-烷基、C(=S)S-芳基、C(=O)NR’R’’其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基、NR’CO-烷基其中R’是H、烷基或芳基、NR’CO-芳基其中R’是H、烷基或芳基、NR’C(=O)O-烷基其中R’是H、烷基或芳基、NR’(C=O)O-芳基其中R’是H、烷基或芳基、OCONR’-烷基其中R’是H、烷基或芳基、OCONR’-芳基其中R’是H、烷基或芳基、NR’CONR’’-烷基其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基、NR’CONR’’-芳基其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基、NR’CSNR’’-烷基其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基和NR’CSNR’’-芳基其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基、CR’NR’’其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、烷基或芳基；其中Ra中的一個(gè)包含在任選地通過間隔體至所述預(yù)靶向探針或效應(yīng)物探針的連接體部分(LinkerMoiety)中；其中兩個(gè)R或Ra部分可以一起形成環(huán)；和其中至少一個(gè)且最多四個(gè)Ra不是氫。另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)靶向方法，以及其中使用的預(yù)靶向試劑，和其中使用該試劑盒的靶向的醫(yī)學(xué)成像或療法。再一方面，本發(fā)明是滿足上述式(1)的化合物，其用于動(dòng)物或人類中的預(yù)靶向方法中。又一方面，本發(fā)明在于具有一個(gè)或多個(gè)直立取代基(axialsubstituents)的反式-環(huán)辛烯在基于逆Diels-Alder反應(yīng)的預(yù)靶向方法中作為親雙烯體反應(yīng)物的用途。附圖說明圖1描繪了如上所述的預(yù)靶向概念的一般方案。圖2提供了用于[4+2]Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)方案；在(3,6)-二-(2-吡啶基)-s-四嗪和E-環(huán)辛烯之間，接著是其中形成產(chǎn)物和分子氮的逆Diels-Alder反應(yīng)。因?yàn)樗龇词?環(huán)辛烯衍生物不像經(jīng)典Diels-Alder反應(yīng)中那樣包含吸電子基團(tuán)，所以這種類型的Diels-Alder反應(yīng)與經(jīng)典的Diels-Alder反應(yīng)不同，并且通常稱為“逆電子需求Diels-Alder反應(yīng)”。在下文中，兩個(gè)反應(yīng)步驟序列即最初的Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)(典型地是逆電子需求Diels-Alder環(huán)加成)和后續(xù)的逆Diels-Alder反應(yīng)將簡(jiǎn)稱為“逆Diels-Alder反應(yīng)”或“逆DA”。圖3(a和b)描繪了利用逆Diels-Alder化學(xué)用于預(yù)靶向的一般方案。圖4提供了利用涉及TCO-改性的mAb(B)和放射標(biāo)記的四嗪(A)的逆-DA的腫瘤預(yù)靶向方案。圖5到圖10示出了實(shí)施例中涉及的化合物的合成方案。圖11示出了環(huán)辛烯醇的以下討論的E-次要和E-主要異構(gòu)體，以及Z異構(gòu)體的對(duì)比，示出了立體化學(xué)。圖12示出了四嗪-DOTA探針28的結(jié)構(gòu)。圖13描繪了三種不同的環(huán)辛烯親雙烯體在小鼠中的體內(nèi)穩(wěn)定性。圖14示出了活小鼠的SPECT/CT投影。圖15描繪了四嗪探針28的替代合成過程，和相應(yīng)的Gd-絡(luò)合物，28-GdIII的合成。圖16示出了四嗪模型探針35、38、40和42的合成路線。圖17示出了新型TCOs的合成路線。圖18提供了在PBS中在低濃度下TCO(20a或20b)和載體加入的(carrieradded)177Lu-四嗪28(1eq.)之間的歸一化反應(yīng)收率。圖19提供了對(duì)血液清除進(jìn)行校正的CC49-結(jié)合的TCO20b的體內(nèi)穩(wěn)定性。所述數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值和所述誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖20示出了CC49-TCO(20b)結(jié)構(gòu)的血液曲線。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值和誤差棒表示一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖21提供了無(wú)腫瘤小鼠中CC49-TCO(20b)結(jié)構(gòu)的生物分布。柱代表平均值和誤差棒代表一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖22示出了125I-CC49和125I-CC49-TCO44b(7.5)在無(wú)腫瘤小鼠(n=3)中的血液動(dòng)力學(xué)。數(shù)據(jù)以具有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差棒)的百分比注射劑量/克(%ID/g)給出。圖23提供了mAb注射4天后125I-CC49(空心柱)和125I-CC49-TCO44b(7.5)(實(shí)心柱)在無(wú)腫瘤小鼠中(n=3)中的生物分布。所述柱代表具有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差棒)的百分比注射劑量/克(%ID/g)。圖24示出了結(jié)合到CC49的TCO44b的體內(nèi)穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)點(diǎn)是具有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(誤差棒)的三次測(cè)量的平均，擬合為二階多項(xiàng)式(PrismGraphPadv.5.01)。具體實(shí)施方式下文中以E-環(huán)辛烯表示本發(fā)明中使用的張力環(huán)辛烯(strainedcyclooctene)親雙烯體。根據(jù)常規(guī)命名法，將理解作為取代X或Y的結(jié)果，取決于取代基的位置和分子量，相同的環(huán)辛烯異構(gòu)體形式上可以變成表示為Z-異構(gòu)體。在本發(fā)明中，本發(fā)明的任何取代變體，無(wú)論是否形式上是“E”或“Z”，或“順式”或“反式”異構(gòu)體，都將被認(rèn)為是未取代的反式-環(huán)辛烯，或未取代的E-環(huán)辛烯的衍生物。術(shù)語(yǔ)“反式-環(huán)辛烯”(TCO)以及E-環(huán)辛烯可以互換使用并且對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的所有親雙烯體，以及對(duì)于取代基形式上將需要相反的命名的情況，都適用。即本發(fā)明涉及其中如下編號(hào)的碳原子1和6位于E(entgegen)或反式位置的環(huán)辛烯。在一般意義上，本發(fā)明基于這樣一個(gè)認(rèn)識(shí)：在使用衍生的反式-環(huán)辛烯，例如以反式-環(huán)辛烯醇的形式，作為親雙烯體的體系中，選擇其中用于衍生成連接體結(jié)構(gòu)的羥基處于直立位置的異構(gòu)體。E-環(huán)辛烯醇，其處于所謂的冠式構(gòu)象(crownconformation)，具有兩種異構(gòu)體，在平伏位置(equatorialposition)具有OH的一種是主要異構(gòu)體和在直立位置具有OH的一種是次要異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明選擇所述后一種異構(gòu)體，并且在下文以“E-次要”表示。不希望被理論所限，本發(fā)明人相信，基于這一發(fā)現(xiàn)，TCO上一個(gè)或多個(gè)直立取代基的存在為解決基于所述逆Diels-Alder反應(yīng)的預(yù)靶向中對(duì)于更高反應(yīng)性的需求提供了答案。廣義上，本發(fā)明因此擴(kuò)展到超出關(guān)于如上提供的式(1)給出的取代基定義。存在一個(gè)或多個(gè)直立取代基的事實(shí)據(jù)信導(dǎo)致較高的HOMO能量。HOMO，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，代表最高占據(jù)分子軌道。根據(jù)本發(fā)明，使用MOPAC模擬來確定所述TCO的HOMO能量。MOPAC(MolecularOrbitalPackage，分子軌道包)是計(jì)算化學(xué)領(lǐng)域中公知的軟件。所述MOPAC軟件包包括幾種眾所周知的半經(jīng)驗(yàn)分子軌道方法，包括AM1和PM3。術(shù)語(yǔ)AM1和PM3是指不同的哈密頓函數(shù)(Hamiltonians)，即AustinModel1和參數(shù)化的模型3哈密頓函數(shù)(對(duì)于AM1，還請(qǐng)見M.J.S.Dewar等,J.Am.Chem.Soc.,107,3902(1985)；對(duì)于PM3，還請(qǐng)見J.J.P.Stewart,.J.Comput.Chem.,10,209(1989)和J.Comput.Chem.,10,221(1989))。在本發(fā)明中，使用包含以下的方法：在計(jì)算機(jī)環(huán)境中，提供環(huán)辛烯的衍生物的分子結(jié)構(gòu)，通過確定最低形成能量?jī)?yōu)化各分子結(jié)構(gòu)，確定所述AM1和PM3哈密頓函數(shù)并從而確定最高占據(jù)分子軌道(HOMO)。表6中的MOPAC數(shù)據(jù)顯示直立取代基的存在服務(wù)于在所述反式-環(huán)辛烯環(huán)中提供增加的HOMO能量的目的。將就特定的實(shí)施方案并參考某些附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些所限制而只由權(quán)利要求限制。權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記都不應(yīng)解釋為限制范圍。所描述的附圖僅僅是示意性的而非限定性的。在所述附圖中，出于說明目的一些要素的尺寸可能被夸大并且不按比例畫出。在本說明書和權(quán)利要求中當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“comprising”時(shí)，其并不排除其它要素或步驟。當(dāng)涉及單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“a”或“an”、“the”時(shí)，除非另外特別說明否則其包括多個(gè)(種)所述名詞。此外，還要注意說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)“comprising”不應(yīng)被解釋為限于隨后列舉的設(shè)備；其不排除其它要素或步驟。因此，表述“包含設(shè)備A和B的裝置”的范圍不應(yīng)被限定為僅由組件A和B組成的裝置。其表示，就本發(fā)明而言，所述裝置的僅有相關(guān)組件是A和B。在幾個(gè)化學(xué)式中涉及“烷基”和“芳基”。在這方面，“烷基”各自獨(dú)立地表示不超過十個(gè)碳原子的脂肪族直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基基團(tuán)，其可包括1-3個(gè)雜原子例如O、N或S，優(yōu)選具有1-6個(gè)碳原子，和“芳基”各自獨(dú)立地表示不超過十個(gè)碳原子的芳基或雜芳基，其可包括1-3個(gè)雜原子例如N或S。在幾個(gè)化學(xué)式中，關(guān)于字母例如“A”、“B”、“X”、“Y”和各種編號(hào)的“R”基團(tuán)表示了基團(tuán)或取代基。這些字母的定義將參考各式進(jìn)行解讀，即在不同的式中，除非另外說明，否則這些字母可各自獨(dú)立地具有不同的意義。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在以下幾個(gè)化學(xué)式中涉及“烷基”和“芳基”。在這方面，“烷基”各自獨(dú)立地表示不超過10個(gè)碳原子的脂肪族的、直鏈的、支鏈的、飽和的、不飽和的和/或環(huán)狀的烴基，其可包括1-10個(gè)雜原子例如O、N、或S，和“芳基”各自獨(dú)立地表示不超過20個(gè)碳原子的芳基或雜環(huán)芳基，其可以是被取代的，并且其可以包括1-10個(gè)雜原子例如O、N、P或S。“芳基”還包括“烷芳基”或“芳烷基”(簡(jiǎn)單的例子：芐基)?！巴榛?、“芳基”、“烷芳基”和“芳烷基”包含的碳原子數(shù)可以通過此類術(shù)語(yǔ)前面的稱號(hào)表示(即C1-C10烷基指所述烷基可包含1到10個(gè)碳原子)。本發(fā)明的某些化合物具有手性中心和/或互變異構(gòu)體，并且所有的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體(diasteriomers)和互變異構(gòu)體，以及它們的混合物都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。逆Diels-Alder反應(yīng)逆Diels-Alder耦合化學(xué)通常包括耦合以形成不穩(wěn)定中間體的反應(yīng)物對(duì)，所述中間體通過逆Diels-Alder反應(yīng)消除作為唯一副產(chǎn)物的小分子（取決于起始化合物其可以是例如N2、CO2、RCN）以形成穩(wěn)定產(chǎn)物。所述成對(duì)反應(yīng)物包括作為一種反應(yīng)物(即一種生物正交反應(yīng)性基團(tuán))的適合的二烯，例如四嗪衍生物如缺電子四嗪，和作為另一種反應(yīng)物(即另一種生物正交反應(yīng)性基團(tuán))的根據(jù)式(1)的張力(strained)環(huán)辛烯。例如缺電子(取代的)四嗪與本發(fā)明的張力E-環(huán)辛烯的異?？焖俚姆磻?yīng)導(dǎo)致了連接反應(yīng)中間體(ligationintermediate)，其在[4+2]逆Diels-Alder環(huán)加成中通過消除作為唯一副產(chǎn)物的N2重排為穩(wěn)定的二氫噠嗪。這在圖2中示出。這兩種反應(yīng)性物類是非生物的，因此不經(jīng)歷快速的體內(nèi)代謝。它們是生物正交的，例如它們?cè)谏斫橘|(zhì)中彼此選擇性地反應(yīng)。關(guān)于這點(diǎn)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于所述二烯和所述環(huán)辛烯都基本上對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面上的生物分子和所有其它區(qū)域如血清等是非反應(yīng)性的。因此，本發(fā)明的化合物和方法能夠在活細(xì)胞、組織或生物體(organism)中使用。而且，所述反應(yīng)性基團(tuán)相對(duì)較小并且能夠引入生物試樣或活生物體中而不顯著改變生物學(xué)尺寸。利用所述[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)，可以利用小的反應(yīng)參與者例如四嗪或環(huán)辛烯將大尺寸的初級(jí)靶向部分例如抗體與標(biāo)記物或其它分子結(jié)合。甚至更有利地，利用(匹配的)相對(duì)小的反應(yīng)參與者例如四嗪和環(huán)辛烯，可以使相對(duì)小的初級(jí)靶向部分例如肽與標(biāo)記物或其它分子結(jié)合。所述預(yù)靶向探針和效應(yīng)物探針的尺寸和性質(zhì)不受所述次級(jí)靶和次級(jí)靶向部分的大影響，使得(預(yù))靶向方案能夠用于小的靶向部分。因?yàn)檫@樣，能夠靶向其它組織，即所述探針的目的地不限于脈管系統(tǒng)(vascularsystem)和胞間隙(目前使用抗體-抗生蛋白鏈菌素的靶向通常是限于脈管系統(tǒng)和胞間隙)。關(guān)于逆電子需求Diels-Alder反應(yīng)和反應(yīng)性物類對(duì)的行為的文獻(xiàn)包括：Thalhammer,F;Wallfahrer,U;Sauer,J,TetrahedronLetters,1990,31(47),6851-6854;Wijnen,JW;Zavarise,S;Engberts,JBFN,JournalOfOrganicChemistry,1996,61,2001-2005;Blackman,ML;Royzen,M;Fox,JM,JournalOfTheAmericanChemicalSociety,2008,130(41),13518-19),R.Rossin,P.RenartVerkerk,SandraM.vandenBosch,R.C.M.Vulders,l.Verel,J.Lub,M.S.Robillard,AngewChemIntEd2010,49,3375,N.K.Devaraj,R.Upadhyay,J.B.Haun,S.A.Hilderbrand,R.Weissleder,AngewChemIntEd2009,48,7013和Devaraj等,Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,1-5。應(yīng)該理解，廣義上，根據(jù)本發(fā)明上述耦合化學(xué)基本上可以應(yīng)用于預(yù)靶向中能夠使用的任何分子、基團(tuán)或部分對(duì)。即一個(gè)這樣的對(duì)將包含初級(jí)靶向部分，其能夠結(jié)合到初級(jí)靶，和進(jìn)一步包含至少一個(gè)次級(jí)靶。另一個(gè)將是適合用于結(jié)合到所述次級(jí)靶的次級(jí)靶向部分，和進(jìn)一步包含適合發(fā)揮治療作用(典型地是藥學(xué)活性化合物)，或適合通過成像技術(shù)定位(即標(biāo)記物)或兩者的部分。因此，根據(jù)本發(fā)明，所述預(yù)靶向探針和所述效應(yīng)物探針中的任一被上面限定的直立取代的環(huán)辛烯官能化，而另一個(gè)被四嗪或其它適合的二烯官能化。這在圖3中示出。上部的方案（圖3a）示出了預(yù)靶向探針，含有通過連接體部分（任選包含柔性間隔體）與作為初級(jí)靶向部分的抗體連接的二吡啶基四嗪，和效應(yīng)物探針，含有通過連接體（柔性間隔體）與可檢測(cè)標(biāo)記物連接的環(huán)辛烯（作為次級(jí)靶向部分）。下面的方案（圖3b）示出了正好相反的方案，即包含環(huán)辛烯的預(yù)靶向探針和包含四嗪的效應(yīng)物探針。盡管所述圖中沒有清楚示出立體化學(xué)，應(yīng)該理解，在本發(fā)明中所述環(huán)辛烯是依照如上定義的式(1)的直立取代的環(huán)辛烯。親雙烯體本發(fā)明的一個(gè)基本成就在于選擇親雙烯體，即根據(jù)如上定義的式(1)的直立取代的TCO，其使得對(duì)于所述生物正交耦合反應(yīng)能夠獲得高達(dá)10倍或更多的增加的反應(yīng)速率?；蛘邠Q一種說法，反應(yīng)時(shí)間僅是原來需要的時(shí)間的10%?；蛘咴贀Q一種說法，一種反應(yīng)物的濃度可以低10倍。所述親雙烯體，廣義上，是具有至少一個(gè)直立取代基的反式-環(huán)辛烯，即其中至少一個(gè)飽和碳原子的至少一個(gè)直立位置不是氫。如以上解釋的那樣，至少一個(gè)且最多四個(gè)Ra不是氫，意味著這種Ra是取代基或是連接體結(jié)構(gòu)的一部分。優(yōu)選地，非氫Ra的數(shù)量是1或2。更優(yōu)選地，所述至少一個(gè)和最多四個(gè)所述非氫Ra位于選自由R2a、R3a、R4a和R5a組成的組的位置。仍更優(yōu)選地，R2a、R3a、R4a和R5a中的一個(gè)或兩個(gè)不是氫。最優(yōu)選地，取代基或連接體結(jié)構(gòu)作為R3a和R4a中的一個(gè)或這兩者存在。優(yōu)選地，所述取代基選自以上關(guān)于如上定義的式(1)定義的基團(tuán)。更優(yōu)選地，上述Ra是烷基或O-烷基，更優(yōu)選地是甲基或O-叔丁基。應(yīng)該注意的是，Ra的選擇和優(yōu)選選項(xiàng)與另一碳原子上或相同碳原子上在平伏位置是否存在任何取代基(即如上定義的式(1)中的R基團(tuán))無(wú)關(guān)。優(yōu)選地，除了一個(gè)或兩個(gè)直立取代基以外，還存在一個(gè)或兩個(gè)平伏取代基，所述取代基優(yōu)選包括是連接體結(jié)構(gòu)的一部分的R或Ra。但是，在另一優(yōu)選項(xiàng)中，考慮到在合成工作和反應(yīng)性之間達(dá)成平衡，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)Ra不是氫，而所有其它R和Ra都是氫。在一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選項(xiàng)中，X和/或Y是O-烷基或烷基，更優(yōu)選地是甲基。二烯本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在所述逆Diels-Alder反應(yīng)中具有反應(yīng)性的大量二烯。優(yōu)選的二烯參考式(2)-(5)在下文給出。其中R1選自由以下組成的組：H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、OR’、SR’、C(=O)R’、C(=S)R’、C(=O)O-R’、C(=O)S-R’、C(=S)O-R’、C(=S)S-R’、C(=O)NR’R’’、C(=S)NR’R’’、NR’R’’、NR’C(=O)R’’、NR’C(=S)R’’、NR’C(=O)OR’’、NR’C(=S)OR’’、NR’C(=O)SR’’、NR’C(=S)SR’’、NR’C(=O)NR’’R’’’、NR’C(=S)N’R’’R’’’其中R’、R’’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基；A和B各自獨(dú)立地選自由烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N+O-、N+R其中R為烷基組成的組，條件是A和B不都是碳；X選自由O、N-烷基和C=O組成的組，和Y是CR其中R選自由以下組成的組：H、烷基、芳基、C(=O)OR’、C(=O)SR’、C(=S)OR’、C(=S)SR’、C(=O)NR’R’’其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基；對(duì)于環(huán)辛烯特別適合作為反應(yīng)參與者的二烯是：其中R1和R2各自獨(dú)立地選自由以下組成的組：H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(=O)R’、C(=S)R’、OC(=O)R’’’、SC(=O)R’’’、OC(=S)R’’’、SC(=S)R’’’、S(=O)R’、S(=O)2R’’’、S(=O)2NR’R’’、C(=O)O-R’、C(=O)S-R’、C(=S)O-R’、C(=S)S-R’、C(=O)NR’R’’、C(=S)NR’R’’、NR’R’’、NR’C(=O)R’’、NR’C(=S)R’’、NR’C(=O)OR’’、NR’C(=S)OR’’、NR’C(=O)SR’’、NR’C(=S)SR’’、OC(=O)NR’R’’、SC(=O)NR’R’’、OC(=S)NR’R’’、SC(=S)NR’R’’、NR’C(=O)NR’R’’、NR’C(=S)N’R’R’’，其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基，和R’’’獨(dú)立地是芳基或烷基；A選自由N-烷基、N-芳基、C=O和CN-烷基組成的組；B是O或S；X選自由以下組成的組：N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)R’、CC(=S)R’、CS(=O)R’、CS(=O)2R’’’、CC(=O)O-R’、CC(=O)S-R’、CC(=S)O-R’、CC(=S)S-R’、CC(=O)NR’R’’、CC(=S)NR’R’’，R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基和R’’’獨(dú)立地是芳基或烷基；Y選自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-組成的組；對(duì)于環(huán)辛烯另一種特別適合作為反應(yīng)參與者的二烯是：其中R1和R2各自獨(dú)立地選自由以下組成的組：H、烷基、芳基、CF3、CF2-R’、NO2、OR’、SR’、C(=O)R’、C(=S)R’、OC(=O)R’’’、SC(=O)R’’’、OC(=S)R’’’、SC(=S)R’’’、S(=O)R’、S(=O)2R’’’、S(=O)2NR’R’’、C(=O)O-R’、C(=O)S-R’、C(=S)O-R’、C(=S)S-R’、C(=O)NR’R’’、C(=S)NR’R’’、NR’R’’、NR’C(=O)R’’、NR’C(=S)R’’、NR’C(=O)OR’’、NR’C(=S)OR’’、NR’C(=O)SR’’、NR’C(=S)SR’’、OC(=O)NR’R’’、SC(=O)NR’R’’、OC(=S)NR’R’’、SC(=S)NR’R’’、NR’C(=O)NR’R’’、NR’C(=S)N’R’R’’，其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基，和R’’’獨(dú)立地是芳基或烷基；A選自由N、C-烷基、C-芳基和N+O-組成的組；B是N；X選自由以下組成的組：N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)R’、CC(=S)R’、CS(=O)R’、CS(=O)2R’’’、CC(=O)O-R’、CC(=O)S-R’、CC(=S)O-R’、CC(=S)S-R’、CC(=O)NR’R’’、CC(=S)NR’R’’，其中R’和R’’各自獨(dú)立地是H、芳基或烷基和R’’’獨(dú)立地是芳基或烷基；Y選自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N+O-組成的組；特別有用的四嗪衍生物是缺電子四嗪類，即被通常不被認(rèn)為供電子的基團(tuán)或部分取代的四嗪，優(yōu)選帶有吸電子取代基。這些缺電子四嗪類通常符合以下結(jié)構(gòu)式：在此，R1和R2各自獨(dú)立地代表選自由以下組成的組的取代基：H、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,6-嘧啶基、2,5-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-嘧啶基、或苯基，任選地被一個(gè)或多個(gè)吸電子基團(tuán)例如NO2、F、Cl、CF3、CN、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CHO、COR、SO2R、SO2OR、NO、Ar取代，其中R是C1-C6烷基和Ar代表芳基，特別是苯基、吡啶基或萘基。在根據(jù)式(2)-(5)每一個(gè)的化合物中，所述R1和R2基團(tuán)(包括在X或Y上的那些)可以進(jìn)一步提供有如下所述的適合的連接體或間隔體部分。類似地，并且與其獨(dú)立地，如上定義的式(1)的親雙烯體也可以進(jìn)一步提供有如下所述的適合的連接體或間隔體部分。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明被用于靶向的成像。根據(jù)該實(shí)施方案，特定的初級(jí)靶的成像通過所述預(yù)靶向探針的初級(jí)靶向部分的特異性結(jié)合以及利用所述效應(yīng)物探針中包含的可檢測(cè)標(biāo)記物檢測(cè)這種結(jié)合實(shí)現(xiàn)。初級(jí)靶本發(fā)明中使用的“初級(jí)靶(primarytarget)”涉及在診斷和/或成像方法中待被檢測(cè)，和/或待被通過藥學(xué)活性化合物或其它治療形式調(diào)制、結(jié)合或?qū)ぶ返陌?。所述初?jí)靶可以選自人類或動(dòng)物體內(nèi)或病原體或寄生物上的任何適合的靶，例如包含以下的組：細(xì)胞例如細(xì)胞膜和細(xì)胞壁、受體例如細(xì)胞膜受體、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)例如高爾基體或線粒體、酶、受體、DNA、RNA、病毒或病毒顆粒、抗體、蛋白質(zhì)、碳水化合物、單糖、多糖、細(xì)胞活素、荷爾蒙、類固醇、生長(zhǎng)抑素受體、單胺氧化酶、毒蕈堿性受體、心肌交感神經(jīng)系統(tǒng)(myocardialsympaticnervesystem)、白三烯受體(例如在白細(xì)胞上)、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑受體(uPAR)、葉酸鹽受體、細(xì)胞凋亡標(biāo)志物、(抗)血管生成標(biāo)志物、胃泌素受體、多巴胺能系統(tǒng)、serotonergic系統(tǒng)、GABA能系統(tǒng)(GABAergicsystem)、腎上腺素反應(yīng)系統(tǒng)、膽堿能系統(tǒng)、阿片受體、GPIIb/IIIa受體和其它血栓相關(guān)受體、纖維蛋白、降鈣素受體、促吞噬素受體、整合素受體、VEGF/EGF受體、EGF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、P/E/L-選擇素受體、LDL受體、P-糖蛋白、神經(jīng)降壓素受體、神經(jīng)肽受體、P物質(zhì)受體、NK受體、CCK受體、σ受體、白細(xì)胞介素受體、單純皰疹病毒酪氨酸激酶、人酪氨酸激酶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，所述初級(jí)靶是蛋白質(zhì)例如受體。作為可選選擇，所述初級(jí)靶可以是代謝途徑，其在疾病例如感染或癌癥期間表達(dá)上調(diào)，例如DNA合成、蛋白質(zhì)合成、膜合成和碳水化合物攝取。在患病組織中，上述標(biāo)志物能夠不同于健康組織并提供早期檢測(cè)、特異性診斷和治療特別是靶向的治療的獨(dú)特可能。預(yù)靶向探針預(yù)靶向探針包含能夠與感興趣的初級(jí)靶結(jié)合的部分。靶向部分典型地是對(duì)細(xì)胞表面靶(例如膜受體)、結(jié)構(gòu)蛋白(例如淀粉樣斑)或細(xì)胞內(nèi)靶(例如RNA、DNA、酶、細(xì)胞信號(hào)通路)具有親和性的結(jié)構(gòu)。這些部分可以是抗體(片段)、蛋白質(zhì)、適體、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、擬肽和已知在特定的疾病或障礙處積累的有機(jī)藥物化合物。本文描述了用于本發(fā)明試劑盒的適合初級(jí)靶向部分的特定實(shí)施方案，并包括受體結(jié)合性肽和抗體。本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案涉及小靶向部分例如肽的使用，從而獲得可透過細(xì)胞的靶向探針。本發(fā)明中使用的“初級(jí)靶向部分”涉及結(jié)合到初級(jí)靶的靶向探針部分。初級(jí)靶向部分的特定例子是結(jié)合到受體的肽或蛋白質(zhì)。初級(jí)靶向部分的其它例子是結(jié)合到細(xì)胞化合物的抗體或其片段?？贵w可以針對(duì)非蛋白質(zhì)化合物和蛋白質(zhì)或肽生成。其它初級(jí)靶向部分可以由適體、寡肽、寡核苷酸、寡糖、以及擬肽和有機(jī)藥物化合物構(gòu)成。初級(jí)靶向部分優(yōu)選以高特異性、高親和性、任選地甚至共價(jià)結(jié)合，并且與所述初級(jí)靶的結(jié)合優(yōu)選在體內(nèi)是穩(wěn)定的。為了使得特異性靶向以上列舉的初級(jí)靶，所述靶向探針的初級(jí)靶向部分可以含有化合物，其包括但不限于：抗體、抗體片段例如Fab2、Fab、scFV、雙價(jià)抗體(diabodies)、聚合物(依靠EPR效應(yīng)的腫瘤靶向)、蛋白質(zhì)、肽例如奧曲肽和衍生物、VIP、MSH、LHRH、趨化肽、鈴蟾肽、彈性蛋白、肽類似物、碳水化合物、單糖、多糖、病毒、全細(xì)胞(wholecells)、噬菌體、藥物、化療劑、受體激動(dòng)劑和拮抗劑、細(xì)胞活素、荷爾蒙、類固醇。在本發(fā)明的內(nèi)容中設(shè)想的有機(jī)化合物的例子是或衍生自：雌激素類例如雌二醇、雄激素類、孕激素類、皮質(zhì)類固醇類、紫杉醇、足葉乙甙、doxorubricin、甲氨喋呤、葉酸和膽固醇。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，所述初級(jí)靶是受體，并且適合的初級(jí)靶向部分包括但不限于此類受體的配體或仍結(jié)合到該受體的配體部分，例如在受體結(jié)合性蛋白質(zhì)配體的情況下受體結(jié)合性肽。蛋白質(zhì)性質(zhì)的初級(jí)靶向部分的其他例子包括干擾素，例如α、β和γ干擾素，白細(xì)胞介素和蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子，例如腫瘤生長(zhǎng)因子，例如α、β腫瘤生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，uPAR靶向蛋白，載脂蛋白，LDL，膜聯(lián)蛋白V，內(nèi)皮抑素和血管生長(zhǎng)抑制素。初級(jí)靶向部分的可選擇的例子包括DNA、RNA、PNA和LNA，其例如與所述初級(jí)靶互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，使用了小的親脂性初級(jí)靶向部分，其能夠結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)初級(jí)靶。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的特定實(shí)施方案，選擇所述初級(jí)靶和初級(jí)靶向部分從而導(dǎo)致特異性的或增加的組織或疾病的靶向，所述組織或疾病例如癌癥、炎癥、感染、心血管疾病例如血栓、動(dòng)脈粥樣硬化病變、缺氧位置例如中風(fēng)、腫瘤、心血管障礙、腦失調(diào)、細(xì)胞凋亡、血管生成、器官和報(bào)告基因/酶。這可以通過選擇具有組織、細(xì)胞或疾病特異性表達(dá)的初級(jí)靶實(shí)現(xiàn)。例如，膜葉酸受體介導(dǎo)葉酸鹽及其類似物例如甲氨喋呤的細(xì)胞內(nèi)積累。正常組織內(nèi)表達(dá)是有限的，但受體在各種腫瘤細(xì)胞類型中被過度表達(dá)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述預(yù)靶向探針和所述效應(yīng)物探針可以是多體化合物(multimericcompounds)，其包含多個(gè)初級(jí)和/或次級(jí)靶和/或靶向部分。這些多體化合物可以是聚合物、樹枝狀聚合物、脂質(zhì)體、聚合物顆?；蚱渌酆衔锝Y(jié)構(gòu)。對(duì)于放大檢測(cè)信號(hào)特別感興趣的是具有多于一個(gè)次級(jí)靶的靶向探針，其使得能夠結(jié)合數(shù)個(gè)效應(yīng)物探針。所述預(yù)靶向探針進(jìn)一步含有上述第一生物正交反應(yīng)性基團(tuán)。該基團(tuán)充當(dāng)“次級(jí)靶”，即作為提供用于所述逆Diels-Alder耦合化學(xué)的第一反應(yīng)參與者的靶向探針部分。如上所述，所述次級(jí)靶可以是所述耦合反應(yīng)的任一參與者。即，在一個(gè)實(shí)施方案中，其是缺電子四嗪。在另一實(shí)施方案中，其是上述式(1)的直立取代的TCO。在所述預(yù)靶向探針中，所述初級(jí)靶向部分和所述第一生物正交反應(yīng)性基團(tuán)可以彼此直接相連。它們還可以通過連接體彼此結(jié)合，此外它們可以都與初級(jí)靶向支架(scaffold)例如生物聚合物如多肽連接。即在最簡(jiǎn)單的情況下，所述連接體部分是鍵。適合的連接體部分進(jìn)一步包括，但不限于，具有從2到200，特別是3到113和優(yōu)選5-50個(gè)重復(fù)單元的聚乙二醇(PEG)鏈。通過調(diào)節(jié)PEG鏈長(zhǎng)，能夠影響所述探針在生理體系中的循環(huán)時(shí)間。這對(duì)于預(yù)靶向探針是特別相關(guān)的(因?yàn)閷⑺龀跫?jí)靶向部分連接到所述初級(jí)靶的初始靶向步驟可能涉及相對(duì)慢的過程，需要相對(duì)長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間)。連接體部分任選地包括生物聚合物片段，例如寡-或多肽或聚交酯(polylactides)。應(yīng)該理解，本發(fā)明包括其中所述二烯和所述親雙烯體與所述預(yù)靶向或效應(yīng)物探針任一連接的任何可想到的方式。實(shí)施對(duì)這些探針的結(jié)合的方法，例如通過反應(yīng)性氨基酸例如賴氨酸或半胱氨酸，已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。效應(yīng)物探針效應(yīng)物探針包含能夠提供想要的診斷、成像和/或治療效果的效應(yīng)物部分。所述效應(yīng)物探針進(jìn)一步包含次級(jí)靶向部分。所述次級(jí)靶向部分涉及形成用于可用的次級(jí)靶(即所述預(yù)靶向探針中包含的一個(gè)或多個(gè)生物正交反應(yīng)性基團(tuán))的反應(yīng)參與者的效應(yīng)物探針部分。將理解，在所述次級(jí)靶是如上定義的式(1)的直立取代的TCO的情況下，所述次級(jí)靶向部分將是二烯例如四嗪，反之亦然。所述效應(yīng)物部分可以是例如可檢測(cè)的標(biāo)記物。這里使用的“可檢測(cè)標(biāo)記物”涉及使得例如當(dāng)存在于細(xì)胞、組織或生物體中時(shí)所述探針能夠被檢測(cè)的效應(yīng)物探針部分。在本發(fā)明的內(nèi)容中，所設(shè)想的可檢測(cè)標(biāo)記物的一種類型是對(duì)比提供劑。在本發(fā)明的內(nèi)容中設(shè)想了不同類型的可檢測(cè)標(biāo)記物并在下文加以描述。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，本發(fā)明的預(yù)靶向試劑盒和方法被用于成像，特別是醫(yī)學(xué)成像。為了識(shí)別所述初級(jí)靶，使用包含一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記物的成像探針作為所述效應(yīng)物探針。所述成像探針的可檢測(cè)標(biāo)記物的特定例子是用于常規(guī)成像體系的對(duì)比提供部分例如可MRI-成像的結(jié)構(gòu)、自旋標(biāo)記物、光學(xué)標(biāo)記物、超聲響應(yīng)結(jié)構(gòu)、X射線響應(yīng)部分、放射性核素、(生物)發(fā)光和FRET類型染料。在本發(fā)明的內(nèi)容中所設(shè)想的示例性的可檢測(cè)標(biāo)記物包括但不一定局限于熒光分子(例如自發(fā)熒光分子(autofluorescentmolecules)、與試劑接觸時(shí)發(fā)熒光的分子等)、放射標(biāo)記物；生物素(例如將要經(jīng)由用抗生物素蛋白結(jié)合生物素進(jìn)行檢測(cè)的生物素)；熒光標(biāo)簽，用于MRI的成像結(jié)構(gòu)，包括順磁性金屬，成像試劑，例如在U.S.Pat.No.4,741,900和5,326,856中描述的那些)等。用于成像的放射性核素可以例如是選自由以下組成的組的同位素：3H、11C、13N、15O、18F、19F、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、8OBr、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99Tc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl、和203Pb。在某些應(yīng)用中也可以將其它元素和同位素例如被用于治療的元素或同位素用于成像。所述可MRI成像的部分可以是例如順磁性離子或超順磁性顆粒。所述順磁性離子可以是選自由以下組成的組的元素：Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。所述超聲響應(yīng)部分可以包含微泡，其殼由磷脂和/或(可生物降解的)聚合物、和/或人血清白蛋白構(gòu)成。所述微泡可以用氟化氣體或液體填充。所述X射線響應(yīng)部分包括但不限于碘、鋇、硫酸鋇、gastrografin或可以包含用碘化合物和/或硫酸鋇填充的囊泡、脂質(zhì)體或聚合物膠囊。此外，本發(fā)明的內(nèi)容中所設(shè)想的可檢測(cè)標(biāo)記物還包括能夠通過抗體結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)的肽或多肽，例如通過結(jié)合可檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記的抗體或通過經(jīng)由夾心式檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)合的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是小尺寸有機(jī)PET和SPECT標(biāo)記物，例如18F、11C或123I。由于它們的小尺寸，有機(jī)PET或SPECT標(biāo)記物完美地適合用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)的事件，因?yàn)樗鼈円话悴粫?huì)很大地影響靶向器件的性能并且特別是其膜輸送。包含PET標(biāo)記物和作為次級(jí)靶向部分的任一逆Diels-Alder活性部分的成像探針是親脂性的并且能夠被動(dòng)地?cái)U(kuò)散進(jìn)和擴(kuò)散出細(xì)胞直到它找到它的結(jié)合參與者。而且，兩種組分都不妨礙越過血腦屏障并從而使得能夠在腦內(nèi)區(qū)域成像。當(dāng)所述效應(yīng)物探針打算包含基于金屬例如用于MRI對(duì)比增強(qiáng)的鑭系金屬(例如Gd)的可檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，其優(yōu)選以螯合物的形式提供。在這種情況下，所述效應(yīng)物探針優(yōu)選包含能夠與此類金屬形成配位絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)部分。關(guān)于此的一個(gè)好例子是衍生自1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(H4dota)和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-α,α’,α,”α’”-四甲基-1,4,7,10-四乙酸(H4dotma)的大環(huán)鑭系元素(III)螯合物。所述效應(yīng)物部分還可以是治療部分例如藥學(xué)活性化合物。本文提供了藥學(xué)活性化合物的例子。治療探針還可以任選地包含可檢測(cè)標(biāo)記物。因此，根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的預(yù)靶向試劑盒和方法被用于靶向的治療。這通過利用含有次級(jí)靶向部分和一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)活性試劑(即藥物或用于放射療法的放射性同位素)的效應(yīng)物探針實(shí)現(xiàn)。用于靶向的藥物遞送情況的適合藥物已為本領(lǐng)域所知。任選地，所述治療探針還可以包括可檢測(cè)的標(biāo)記物，例如一種或多種成像劑。用于治療的放射性核素可以是例如選自由以下組成的組的同位素：24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、111In、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra和225Ac。作為選擇，所述治療探針中的藥物選自用于光動(dòng)力療法的感光劑(sensitizers)。作為選擇，所述治療探針包含結(jié)合到體內(nèi)治療實(shí)體，例如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或其它內(nèi)源性結(jié)構(gòu)例如蛋白質(zhì)，的識(shí)別部分。在所述效應(yīng)物探針中，所述次級(jí)靶向部分即所述第二生物正交反應(yīng)性基團(tuán)和所述效應(yīng)物部分可以直接彼此連接。它們還可以通過連接體彼此結(jié)合，此外它們可以都與次級(jí)靶向支架連接。所述連接體可以獨(dú)立地選自如上所述的相同部分，例如聚乙二醇。所述次級(jí)靶向支架可以是例如生物聚合物如多肽。本發(fā)明還涉及利用逆Diels-Alder反應(yīng)的預(yù)靶向方法。在這里，將包含初級(jí)靶向部分(例如抗體和抗體片段或受體結(jié)合性肽)的預(yù)靶向探針注入到受試者中，其中所述預(yù)靶向探針分別用適合的二烯，優(yōu)選根據(jù)上述式(2)-(5)任意一個(gè)的化合物，或用根據(jù)上述式(1)的環(huán)辛烯官能化。在結(jié)合到靶(例如原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤病變、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、梗死區(qū)域、炎癥或感染位置等)并從循環(huán)系統(tǒng)和從非靶組織(例如血液、肝臟、脾臟、腎臟等)清除之后，注入效應(yīng)物探針，其含有次級(jí)靶向部分例如分別攜帶E-環(huán)辛烯或四嗪衍生物(即存在于所述預(yù)靶向探針中的生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的反應(yīng)性對(duì)應(yīng)物)和藥物或可成像標(biāo)記物。所述效應(yīng)物探針結(jié)合到所述初級(jí)靶向部分并提供高對(duì)比或選擇性治療所述疾病位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及一般的代謝途徑的靶向，所述一般的代謝途徑在疾病(例如感染或癌癥)期間表達(dá)上調(diào)如DNA、蛋白質(zhì)和膜合成以及碳水化合物攝取。適合的探針包含被二烯或親雙烯體標(biāo)記的氨基酸、糖、核酸和膽堿，本領(lǐng)域中目前使用的代謝示蹤劑類似物，[11C]-蛋氨酸、[18F]-氟脫氧葡萄糖(FDG)、脫氧-[18F]-氟胸苷(FLT)和[11C]-膽堿。具有高代謝或增殖的細(xì)胞具有對(duì)這些構(gòu)建單元(buildingblock)的較高攝取。在該方法中，例如四嗪或E-環(huán)辛烯衍生物進(jìn)入這些或其它通路并在細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞上積累。在充分積聚并清除游離探針后，將經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的或攜帶藥物的(細(xì)胞可透過)的四嗪探針或E-環(huán)辛烯探針(或攜帶根據(jù)本發(fā)明的其它二烯/親雙烯體的探針)送入以分別結(jié)合積累的E-環(huán)辛烯或四嗪代謝物。作為優(yōu)于普通FDG(氟18氟脫氧葡萄糖)類型成像的一個(gè)益處，可以獲得足夠的時(shí)間使得能夠在送入放射性之前高度積聚所述靶向部分，從而增大靶對(duì)非靶比。作為選擇，可以靶向疾病特異性的代謝途徑和/或代謝物。本發(fā)明還涉及細(xì)胞內(nèi)靶的預(yù)靶向。由于它們的小尺寸，有機(jī)PET標(biāo)記物(18F,11C)非常適合用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)事件，因?yàn)樗鼈兺ǔ２粫?huì)很大地影響所述靶向器件的性能，特別是其膜輸送(和大的和極性的放射金屬螯合物結(jié)構(gòu)綴合物相反)。盡管在本發(fā)明中使用的被取代的四嗪部分和所述E-環(huán)辛烯不一定是小的，但是它們是相對(duì)非極性的，并且能夠用于蛋白質(zhì)、mRNA、信號(hào)通路等的分子內(nèi)成像。所述次級(jí)(例如PET標(biāo)記的)取代的四嗪部分或E-環(huán)辛烯探針(即所述效應(yīng)物探針)能夠被動(dòng)地?cái)U(kuò)散進(jìn)和擴(kuò)散出細(xì)胞直到它找到它的結(jié)合參與者或經(jīng)歷活性攝取機(jī)理。這些性能還允許將逆Diels-Alder反應(yīng)用于腦內(nèi)預(yù)靶向，因?yàn)閮煞N組分都不妨礙越過血腦屏障。本發(fā)明還涉及預(yù)靶向的信號(hào)放大和/或多價(jià)裝配。至少一個(gè)初級(jí)靶向器件與含有多個(gè)四嗪部分的樹枝狀聚合物(dendrimer)、聚合物或納米顆粒結(jié)合。在受體結(jié)合后，注入與用于核成像(例如放射金屬螯合物、放射性鹵素等)或MRI(例如Gd螯合物)的一個(gè)或多個(gè)對(duì)比部分結(jié)合的(一種或多種)環(huán)辛烯。隨后的逆Diels-Alder反應(yīng)導(dǎo)致在靶組織處MRI對(duì)比劑的高濃度。此外，在靶位點(diǎn)的多價(jià)將增大與所述直立取代的TCO效應(yīng)物綴合物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，提供例如MRI對(duì)比劑的有效靶積累。當(dāng)然，所述直立取代的TCO也可以用于所述靶向器件綴合物中而所述四嗪(或本發(fā)明的其它二烯)連接到報(bào)告物(reporter)。連接途徑和試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及逆Diels-Alder反應(yīng)作為用于將成像劑和藥物連接到靶向結(jié)構(gòu)例如肽的途徑的用途。所述效應(yīng)物可以包含有機(jī)PET或SPECT核素標(biāo)記的輔基、用于PET/SPECT/MRI的金屬絡(luò)合物和用于超聲成像的微泡、用于光學(xué)成像的熒光團(tuán)以及用于放射療法的α和β輻射源和通常細(xì)胞毒素抗癌劑。所述成像/治療劑可以用側(cè)基四嗪或其它適合的二烯部分官能化和用直立取代的TCO衍生物將靶向基團(tuán)官能化，反之亦然。本發(fā)明的途徑對(duì)用于核成像和放射療法的試劑特別有利：考慮到放射性核素的衰變，作為預(yù)靶向步驟實(shí)施最耗時(shí)的步驟(受試者體內(nèi)的實(shí)際靶向)是有益的。根據(jù)本發(fā)明，選擇直立取代的TCO，以獲得上述非?？焖俚哪鍰iels-Alder化學(xué)用于次級(jí)靶向，使得能夠使用多種放射性核素，包括與現(xiàn)有方法相比使用壽命更短的那些。直立取代的TCO官能化的效應(yīng)物探針和適合的二烯例如攜帶四嗪的預(yù)靶向探針能夠在極低濃度在體內(nèi)耦合而不需要效應(yīng)物部分(例如所述放射性核素)的持續(xù)血液循環(huán)。將理解，這對(duì)與二烯特別是四嗪官能化的效應(yīng)物探針結(jié)合的帶有直立取代的TCO的預(yù)靶向探針同樣適用。而且，所述反應(yīng)性基團(tuán)有利地是穩(wěn)定的，并因此展現(xiàn)了較長(zhǎng)壽命的反應(yīng)性而不過于容易地發(fā)生副反應(yīng)。將理解，以上提供了益處例如最小化對(duì)病人的放射劑量。而且，其導(dǎo)致能夠利用PET即正電子發(fā)射斷層成像劑代替SPECT即單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像劑(singlephotonemissioncomputerizedtomographyagents)。而且，增加的反應(yīng)性使得能夠在體內(nèi)以較低的濃度應(yīng)用。本發(fā)明特別適合用于多模式成像，任選地使用不同的成像劑以使相同的靶可視化。作為選擇，所述成像探針包含至少兩種不同的標(biāo)記物以使得能夠?qū)崿F(xiàn)多模式成像。本發(fā)明的改善的[4+2]逆Diels-Alder化學(xué)在分子成像中的應(yīng)用向所有類型和尺寸的靶向結(jié)構(gòu)打開了預(yù)靶向之門。這允許細(xì)胞內(nèi)和代謝成像以從可通過預(yù)靶向積聚獲得的高靶積累和低背景受益。同樣，對(duì)于較小的和更多種多樣的靶向器件，預(yù)靶向的信號(hào)放大方案例如多四嗪和/或多樹枝狀聚合物或脂質(zhì)體變得可行。由于所述反應(yīng)參與者是非生物的和生物正交的，因此使用利用直立取代的TCO作為上述親雙烯體的[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的預(yù)靶向不受內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)和代謝/分解妨礙，并提供穩(wěn)定的共價(jià)鍵。選擇靶代謝途徑，以及相應(yīng)的四嗪-代謝物衍生物，憑借其與正常細(xì)胞相比在例如腫瘤細(xì)胞中的高通量，提供了在細(xì)胞中或在靶細(xì)胞表面上高密度人工四嗪受體或其它化學(xué)柄的裝配，避免有時(shí)可能處于低水平的內(nèi)源細(xì)胞表面受體的使用。本發(fā)明的進(jìn)一步的特定實(shí)施方案涉及包含代謝前體和成像探針，更特別地是包含可檢測(cè)標(biāo)記物的成像探針的試劑盒，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是用于常規(guī)成像體系的對(duì)比劑。此類可檢測(cè)標(biāo)記物可以是但不限于選自由可MRI成像的結(jié)構(gòu)、自旋標(biāo)記物、光學(xué)標(biāo)記物、超聲響應(yīng)試劑、X-射線響應(yīng)試劑、放射性核素和FRET類染料組成的組的標(biāo)記物。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用了報(bào)告物探針。這種報(bào)告物探針可以是酶的底物，更特別地是對(duì)于所述細(xì)胞不是內(nèi)源性的，但已經(jīng)通過基因療法或使用外來試劑感染而引入的酶。在本文中涉及細(xì)胞或組織內(nèi)的基因的非內(nèi)源性用于表示所述基因在所述細(xì)胞或組織內(nèi)并不天然存在和/或表達(dá)。作為選擇，此類報(bào)告物探針是通過受體或泵的方式引入到細(xì)胞中的分子，其可以是內(nèi)源性的或通過基因療法或使用外來試劑感染引入到細(xì)胞內(nèi)。作為選擇，所述報(bào)告物探針是對(duì)細(xì)胞或組織環(huán)境內(nèi)的某些(變化)條件起反應(yīng)的分子。本發(fā)明還包括用于上述試劑盒中的試劑。一種此類試劑是包含初級(jí)靶向部分和生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的預(yù)靶向劑，其中所述生物正交反應(yīng)性基團(tuán)是[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。特定反應(yīng)參與者在上文描述，即通常是上述缺電子四嗪或其它適合的二烯，或是根據(jù)本發(fā)明的直立取代的環(huán)辛烯。本發(fā)明還涉及這些試劑在靶向的醫(yī)學(xué)成像或靶向的治療中的用途，和涉及用于這種方法中的所述試劑。特別地，本發(fā)明涉及這些試劑在預(yù)靶向方法中的這些用途，和涉及在這種方法中使用的這些試劑。另一種此類試劑是包含可檢測(cè)標(biāo)記物和生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的成像探針，其中所述生物正交反應(yīng)性基團(tuán)是[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。本發(fā)明還涉及包含可檢測(cè)標(biāo)記物和生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的成像探針，其中所述生物正交反應(yīng)性基團(tuán)是[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含藥學(xué)活性化合物和生物正交反應(yīng)性基團(tuán)的治療探針，其中所述生物正交反應(yīng)性基團(tuán)是[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。本發(fā)明的一部分還是預(yù)靶向方法，包括將如上所述的預(yù)靶向試劑給予受試者并使所述試劑在受試者的體系中循環(huán)有效實(shí)現(xiàn)所述初級(jí)靶向部分對(duì)初級(jí)靶的結(jié)合的一段時(shí)間，接著從身體清除未結(jié)合的試劑。用于其的典型時(shí)間為12到96小時(shí)，特別地為約48小時(shí)。此外，本發(fā)明提供了成像方法，包括如上所述實(shí)施預(yù)靶向方法，接著給予同樣根據(jù)本發(fā)明的成像探針，其中所述預(yù)靶向試劑中和所述成像探針中的生物正交反應(yīng)性基團(tuán)一起形成[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。類似地，本發(fā)明提供了受試者中靶向的醫(yī)學(xué)治療方法，其包括如上所述實(shí)施預(yù)靶向方法，接著給予同樣根據(jù)本發(fā)明的治療探針，其中所述預(yù)靶向試劑中和所述成像探針中的生物正交反應(yīng)性基團(tuán)一起形成[4+2]逆Diels-Alder反應(yīng)的反應(yīng)參與者。本發(fā)明還涉及用于如上所述的成像或治療方法的上述預(yù)靶向試劑?？偨Y(jié)而言，在逆Diels-Alder化學(xué)的基礎(chǔ)上，生物正交預(yù)靶向的分子成像和治療用于給病人帶來極大益處。一方面，其用于承擔(dān)獲得靶組織例如癌癥和心血管病變的優(yōu)良圖像。另一方面，能夠大大減少源自放射性化合物和通常潛在毒性藥物給予的固有副作用，同時(shí)增加到達(dá)患病組織的有效劑量。此外，其將大大擴(kuò)展引起疾病的可追蹤分子事件的收集。特別地，這種技術(shù)能夠允許使用遠(yuǎn)離血管的靶組織并將促進(jìn)信息豐富的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的成像。將參考以下非限定性實(shí)施例和隨附的非限定性附圖說明本發(fā)明。實(shí)施例材料所有試劑和溶劑都從商業(yè)來源獲得(從Sigma-Aldrich、Acros、ABCR、Invitrogen和Merck獲得試劑，從Biosolve、Merck和CambridgeIsotopeLaboratories獲得普通和氘代溶劑)，并除非另外說明都不經(jīng)進(jìn)一步的純化即使用。1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸(21)從Polypure獲得。[111In]氯化銦和[125I]碘化鈉溶液購(gòu)自PerkinElmer。通過milli-Q水過濾系統(tǒng)(Millipore)蒸餾和去離子化水(18MΩcm)。用Chelex-100樹脂(BioRadLaboratories)處理標(biāo)記緩沖液過夜，然后經(jīng)過0.22μm過濾并在4℃貯存。Indogen碘化管、用于二喹啉甲酸(BCA)檢驗(yàn)的試劑盒、gelcode藍(lán)色蛋白染色溶液和Zeba脫鹽離心柱(spincolumns)（40kDaMW截止,0.5-2mL）購(gòu)自PierceProteinResearch(ThermoFisherScientific)。用于制備磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4的片劑從Calbiochem(Merck)獲得。AmiconUltra-4和Ultra-15離心過濾器單元(50kDaMW截至)購(gòu)自Millipore。小鼠血清購(gòu)自InnovativeResearch。四嗪28的合成和放射標(biāo)記如Rossin等,AngewChemIntEd2010,49,3375中描述的那樣實(shí)施。方法使用BrukerDPX300波譜儀或BrukerAvance600波譜儀在CDCl3或[D6]DMSO中記錄NMR譜。使用DEPT脈沖序列區(qū)分13C-NMR多重性(q=四重、t=三重、s=二重和p=一重(primary))。在AgilentESI-TOF質(zhì)譜儀上記錄了高分辨率ESI質(zhì)譜(HRMS)，以陽(yáng)離子模式測(cè)量。在CombiflashCompanion設(shè)備(TeledyneIsco)上使用SiliCycle硅膠柱實(shí)施制備柱色譜。使用裝配有C18Zorbax柱(21.2×150mm,5μm顆粒)的Agilent1200儀器，應(yīng)用含有0.1%TFA的水和MeCN梯度，實(shí)施制備HPLC。在裝配有Gabi放射性探測(cè)器(Raytest)的Agilent1100系統(tǒng)上實(shí)施分析放射-HPLC。將試樣加載在AgilentEclipseXDB-C18柱(4.6×150mm,5μm顆粒)上，其用含有0.1%TFA的MeCN在水中的線性梯度以1mL/min洗脫(10%MeCN2min，接著在11min內(nèi)增大到45%MeCN)。將UV波長(zhǎng)預(yù)設(shè)在254nm。在裝配有Gabi放射性探測(cè)器的Agilent1200系統(tǒng)上實(shí)施體積排阻(SEC)HPLC。將試樣加載在BioSep-SEC-S2000柱(300×7.8mm，5μm顆粒，Phenomenex)上并用20mM磷酸鹽、150mMNaCl、pH6.8以1mL/min洗脫。UV波長(zhǎng)預(yù)設(shè)在260和280nm。使用用在0.9%NaCl水溶液中的200mMEDTA洗脫并在磷光體成像儀(FLA-7000，F(xiàn)ujifilm)上成像的ITLC-SG條(Pall)通過放射-TLC測(cè)定了111In和177Lu標(biāo)記產(chǎn)率。在這些條件下，游離111In和177Lu以Rf=0.9遷移，而111In/177Lu-四嗪保留在原位。125I-標(biāo)記產(chǎn)率也通過放射-TLC測(cè)定，使用用1:1MeOH/醋酸乙酯混合物洗脫并在磷光體成像儀上成像的ITLC-SG條。在這些條件下，游離125I和125I-SHPP以Rf=0.9遷移，而125I-mAbs保留在原位。在Phastgel系統(tǒng)上分別使用IEF-3-9凝膠和7.5%PAGE均勻凝膠(homogeneousgels)(GEHealthcareLifeSciences)實(shí)施等電聚焦(IEF)分析和SDS-PAGE。IEF校準(zhǔn)溶液(寬PI，pH3-10)購(gòu)自GEHealthcare和蛋白質(zhì)MW標(biāo)準(zhǔn)溶液(PrecisionPlus雙色標(biāo)準(zhǔn))購(gòu)自BioRad。在電泳時(shí)，用gelcode藍(lán)將所述凝膠染色2小時(shí)，在水中脫色過夜然后用常規(guī)平板掃描儀數(shù)字化。用NanoDrop1000分光光度計(jì)(280nm處的吸光率；ThermoFisherScientific)或采用BCA測(cè)試測(cè)定CC49溶液的濃度。LS174T腫瘤模型(tumormodel)。人克隆癌細(xì)胞系LS174T從ATCC獲得并保存在以10%熱滅活的胎牛血清(Gibco)、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)和2mMGlutamax補(bǔ)充的Eagle’s最小必需培養(yǎng)基(Sigma)中。用100μL無(wú)菌PBS中的5×106細(xì)胞對(duì)裸雌性Balb/C小鼠(20-25克體重，CharlesRiverLaboratories)進(jìn)行皮下接種。實(shí)施例1如圖3a中所示，作為將四嗪衍生的部分連接到抗體的一個(gè)實(shí)例，制備了分子1(見圖5)。相應(yīng)的探針2(衍生自E-環(huán)辛烯)的一個(gè)實(shí)例在圖6中示出。兩種分子都含有PEG鏈。分子1包含用于將所述分子與抗體中存在的氨基基團(tuán)耦合的N-羥基琥珀酰亞胺基部分。2中DOTA衍生的部分可以用于攜帶稀土金屬離子例如用于MR成像的Gd或用于核成像和治療(SPECT)的Lu-177。圖5中示出了1的合成。根據(jù)Blackman等(Blackman,ML;Royzen,M;Fox,JM,JournalofTheAmericanChemicalSociety,2008,130(41),13518-19)制備了起始的四嗪衍生的分子5。通過與戊二酸酐反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化成酸6，接著形成它的N-羥基琥珀酰亞胺基酯7。該N-羥基琥珀酰亞胺基酯用于通過與商購(gòu)獲得(IRISbiochem)的PEG衍生物8反應(yīng)形成酸9，其進(jìn)而被轉(zhuǎn)化成它的N-羥基琥珀酰亞胺基酯1。圖6中示出了2的合成。根據(jù)Yap等(Yap,GPA;Royzen,M;Fox,JM,JournalofTheAmericanChemicalSociety,2008,130(12),3760–61)制備了(E)-環(huán)辛-4-烯醇(10)。其在商購(gòu)獲得的(Aldrich)異氰酸酯衍生物11的幫助下被轉(zhuǎn)化成酯12，接著皂化成酸13。使由13形成的N-羥基琥珀酰亞胺基酯14與衍生自DOTA和PEG的胺18反應(yīng)，以形成終產(chǎn)物2。使17脫保護(hù)后制備DOTA衍生物18，所述17進(jìn)而由DOTA衍生物15和PEG衍生物16(都可商購(gòu)獲得)(分別來自Macrocyclics和IRISBiotech)制備。實(shí)施例2本實(shí)施例闡述了實(shí)施例1的分子的相反對(duì)，圖7中示出了用于結(jié)合到抗體后形成所述預(yù)靶向部分的所述E-環(huán)辛烯衍生物3。能夠用作圖3b中示出的效應(yīng)物探針的四嗪/DOTA衍生的探針4在圖8中示出。E-環(huán)辛烯衍生物3通過如下方式形成：商購(gòu)獲得(IRISbiochem)的PEG衍生物8(也見圖5)與N-羥基琥珀酰亞胺基酯14反應(yīng)以形成酸19，接著形成源自這種酸的N-羥基琥珀酰亞胺基衍生物(圖7)。圖8中示出了所述四嗪/DOTA衍生的探針4的合成。所述探針通過DOTA和PEG衍生的胺18(見圖6)與N-羥基琥珀酰亞胺基酯7(見圖5)的反應(yīng)制備。實(shí)施例3本實(shí)施例示于圖9中，其提供了用于合成(E)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯(TCO-O-PEG10-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，主要和次要異構(gòu)體分別是23a和23b)的方案。標(biāo)記為(數(shù)字)a的化合物代表E-主要和標(biāo)記為(數(shù)字)b的化合物代表E-次要。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-((環(huán)辛-4-烯基氧基)甲基)苯甲酸酯(20a)。根據(jù)文獻(xiàn)過程(M.Royzen,G.P.A.Yap,J.M.Fox,J.Am.Chem.Soc.2008，130,3760)合成了(E)-環(huán)辛-4-烯醇(10a，主要異構(gòu)體，含有約13%所述Z-異構(gòu)體)。將60%氫化鈉分散體(1.8g，45mmol)加入冰浴冷卻的10a(1.70g，13.5mmol)在60mLDMF中的溶液中。在室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將4-溴甲基苯甲酸(3.85g，17.9mmol)分份加入并在室溫將懸浮液攪拌過夜。將混合物倒入水(100mL)中，加入叔丁基甲基醚(100mL)，接著加入37%鹽酸(5mL)。分離后，用叔丁基甲基醚(2×100mL)提取水層。用水(25mL)洗滌合并的有機(jī)層，用MgSO4干燥并蒸發(fā)。用4:1己烷/乙酸乙酯使剩余物通過薄硅膠層。將蒸發(fā)后獲得的剩余物在70℃溶解在庚烷(50mL)中，然后冷卻，提供19a。將所述產(chǎn)物溶解在二氯甲烷(40mL)中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.57g，4.9mmol)，將混合物在冰浴中冷卻，接著加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(1.03g，4.99mmol)。30分鐘后除去冰浴并在室溫?cái)嚢杷龇磻?yīng)混合物18小時(shí)。過濾并蒸發(fā)后，通過柱色譜在硅膠上使用乙酸乙酯在庚烷(0-15%)中的梯度純化剩余物。接著，將所述剩余物溶解在叔丁基甲基醚(20mL)中并倒入庚烷(50mL)中，得到白色固體形式的20a(1.42g，29%)。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯(23a)。將20a(100mg，0.280mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液滴加入在冰浴中攪拌的21(175mg，0.283mmol)和三乙胺(290μL，2.08mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將蒸發(fā)后所獲得的粗中間體22a溶解在二氯甲烷(5mL)中并在冰浴中冷卻。加入雙(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(170mg，0.664mmol)和吡啶(28μL，0.35mmol)，并在室溫將反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)。過濾混合物并蒸發(fā)，通過柱色譜在硅膠上使用甲醇在二氯甲烷(5-10%)中的梯度純化產(chǎn)物，得到粘性油形式的23a(119mg，39%)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-((環(huán)辛-4-烯基氧基)甲基)苯甲酸酯(20b)。根據(jù)上述文獻(xiàn)過程合成(E)-環(huán)辛-4-烯醇(10b，次要異構(gòu)體)。將60%氫化鈉分散體(2.1g，53mmol)加入冰浴冷卻的10b(2.53g，20.1mmol)在50mL四氫呋喃中的溶液中。在室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將混合物再次冷卻并用5分鐘的時(shí)間分份加入4-溴甲基苯甲酸(4.53g，21.1mmol)。加入25mL四氫呋喃并在將所述懸濁液在室溫?cái)嚢?天。加入冰，接著加入12.0g檸檬酸。用150mL叔丁基甲基醚萃取所述混合物兩次。有機(jī)層用25mL水洗滌、干燥并蒸發(fā)。通過使用80g硅膠和含有逐步增加的量的醋酸乙酯的庚烷作為洗脫液的色譜法純化剩余物。合并產(chǎn)物級(jí)分(產(chǎn)物和起始醇之間未完全分離)并從約30mL庚烷重結(jié)晶(冷卻到-15℃)，得到白色固體形式的19b(0.86g，17%)。將其溶解在40mL二氯甲烷中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.48g，4.17mmol)并在冰中冷卻混合物。加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(0.80g，3.88mmol)并將混合物在冰中攪拌30分鐘，然后在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。通過過濾、用二氯甲烷洗滌、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以及在25g硅膠上用庚烷-醋酸乙酯作為洗脫液的色譜法提供了產(chǎn)物。將蒸發(fā)的產(chǎn)物級(jí)分與75mL叔丁基甲基醚混合并將混合物加溫到60℃以提供溶液。將所述溶液濃縮到20mL。逐步加入50mL庚烷獲得所述產(chǎn)物的沉淀。通過過濾收集和用庚烷洗滌提供1.05g20b(15%)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯基-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯(23b)。該化合物以與23a相似的方式從20b開始制備。以93%的產(chǎn)率獲得粘性油形式的23b。實(shí)施例4本實(shí)施例示于圖10中，其給出了用于合成(E)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-(((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯的反應(yīng)方案。標(biāo)記為(數(shù)字)a的化合物代表E-主要和標(biāo)記為(數(shù)字)b的化合物代表E-次要。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯甲酸酯14a。將N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(9.50g，0.046mol)分份加入在冰中冷卻的4-氨基苯甲酸(5.84g，0.043mol)、N-羥基琥珀酰亞胺(5.0g，0.044mmol)和60mL異丙醇的混合物中。在室溫?cái)嚢?6小時(shí)后過濾懸濁液并用60mL異丙醇將所獲得的固體再攪拌一小時(shí)。將過濾并真空下干燥后獲得的粗固體24與100mL二氯甲烷混合并在冰中冷卻。加入20%碳酰氯在甲苯中的溶液(26mL，49.4mmoL)并攪拌30分鐘后獲得溶液。將蒸發(fā)后獲得的固體用100mL甲苯洗滌兩次并在高真空下干燥。獲得4.03g白色固體形式的25(36%)。將所述固體分份加入10a(1.40g，11.1mmol)在35mL二氯甲烷中的溶液中。將所述懸浮液攪拌過夜，并然后在40℃加溫2小時(shí)。在二氧化硅上用二氯甲烷洗脫，接著從甲苯重結(jié)晶后，獲得1.77g固體形式的14a(41%)。所述產(chǎn)物包含約12%的Z-異構(gòu)體，其不能通過色譜法或結(jié)晶除去。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-(((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯27a。將14a(100mg，0.26mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液滴加加入在冰浴中攪拌的21(160mg，0.26mmol)和三乙胺(400μL，2.9mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中。將所述反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將蒸發(fā)后獲得的粗中間體26a溶解在二氯甲烷(5mL)中，并在冰浴中冷卻。加入雙(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(89mg，0.35mmol)和吡啶(28μL，0.35mmol)并將所述反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。過濾混合物，用3mL水提取3次和用3mL鹽水提取一次。用硫酸鎂干燥并蒸發(fā)后獲得1.23g粘性油形式的27a(47%)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯甲酸酯14b。以與制備14a相似的方式但從10b開始以32%產(chǎn)率獲得該化合物。由于獲得了純凈的10b，因此該產(chǎn)物不含所述Z-異構(gòu)體。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-(((環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)羰基)氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧雜-2-氮雜四十一烷-41-酸酯27b：以與制備27a相似的方式，但從14b開始以89%產(chǎn)率獲得該化合物。實(shí)施例5四嗪放射標(biāo)記將DOTA-結(jié)合的四嗪(28；圖12，在Rossin等AngewChemIntEd2010,49,3375中描述)溶解(1mg/mL)在0.2M醋酸銨pH7.0中并且使用前在-80℃貯存。將等分量的28與適合量的[111In]氯化銦或[177Lu]氯化镥組合并在37℃在輕柔攪拌下培育10分鐘。然后加入5μL10mmDTPA并將所述溶液再額外培育5分鐘。通過對(duì)于所述四嗪加入0.9摩爾當(dāng)量的InCl3或LuCl3實(shí)施載體加入的標(biāo)記反應(yīng)。典型地，采用該方法獲得了大于98%的定量標(biāo)記產(chǎn)率和放射化學(xué)純度。與反式環(huán)辛烯(TCO)NHS酯14、20、23、27的mAb結(jié)合在這里，以及在后續(xù)步驟中，所有化合物編號(hào)都是指所述a和b異構(gòu)體兩者。典型地，用總體積為250μLPBS的0.6摩爾(用于動(dòng)力學(xué)測(cè)量)或10摩爾(用于體內(nèi)研究)當(dāng)量的TCO-NHS結(jié)構(gòu)改性1mgCC49(在PBS中的5mg/mL溶液)。用1M碳酸鈉緩沖液將pH調(diào)節(jié)到9。在黑暗中在攪拌下室溫實(shí)施反應(yīng)30分鐘。隨后，使用AmiconUltra-15離心裝置用PBS徹底洗滌TCO-改性的mAbs。用四嗪滴定(下文描述)確定每個(gè)抗體的TCO基團(tuán)數(shù)量。用載體加入的177Lu放射標(biāo)記四嗪-DOTA28。將用約0.6摩爾當(dāng)量的TCO改性的mAb(25μg)與3摩爾當(dāng)量的177Lu-28(0.5nM)反應(yīng)。將用約10摩爾當(dāng)量的TCO改性的mAb(25μg)與15摩爾當(dāng)量的177Lu-28(2.5nM)反應(yīng)。在50μLPBSpH7.4中在37℃實(shí)施反應(yīng)10分鐘。通過SDS-PAGE和磷光體成像儀(phosphorimager)分析反應(yīng)混合物，并從對(duì)應(yīng)所述mAb的譜帶中的放射性確定反應(yīng)產(chǎn)率。計(jì)數(shù)用AIDAImageAnalyzer軟件(Raytest)定量。發(fā)現(xiàn)TCO-mAb結(jié)合產(chǎn)率為80-90%。mAb放射標(biāo)記向在50μLPBS中的足量[125I]碘化鈉(5-15MBq)加入1μL的1mg/mLBolton-Hunter試劑(N-琥珀酰亞胺基-3-[4-羥基苯基]丙酸酯(SHPP))在DMSO中的溶液和25μL的4mg/mL氯胺-T(N-氯4-甲基苯磺酰胺，鈉鹽)在PBS中的溶液。將所獲得的溶液混合10-20秒，向小瓶中加入5μLDMF和100μL甲苯，125I-SHPP被提取在有機(jī)相中，然后將其轉(zhuǎn)移到玻璃小瓶中。在溫和N2流下將甲苯吹出，之后加入CC49-TCO溶液(0.1-0.5mg在50-250μLPBS中)，用1M碳酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)到9，并在溫和振蕩下在RT培育反應(yīng)混合物30分鐘。培育后，通過radio-ITLC確定標(biāo)記產(chǎn)率。然后將所述粗反應(yīng)混合物加載到Zeba離心脫鹽柱上，所述Zeba離心脫鹽柱用鹽水溶液預(yù)先平衡(pre-equilibrated)。用20μL鹽水溶液沖洗所述反應(yīng)小瓶并將所述沖洗液也加載到所述柱上。Zeba純化后，通過放射-ITLC、放射-HPLC和SDS-PAGE確定125I-CC49-TCO溶液的放射化學(xué)純度；通過BCA檢測(cè)確定蛋白質(zhì)濃度。典型地，采用這個(gè)過程，對(duì)于純化的125I-CC49-TCO物種獲得大于70%的125I-SHPPmAb結(jié)合和>98%的放射化學(xué)純度。反應(yīng)速率用載體加入的177Lu以3MBq/μg的比活度放射標(biāo)記四嗪-DOTA28。使177Lu-28(33nM)與用1eq.的TCO改性的增加濃度的CC49(0.33、1和1.67μM)在200μLPBS、pH7.4中在37℃反應(yīng)5分鐘。在選定的時(shí)間(15、30、45、60、90、120、180和300秒)抽取20μL試樣并用四嗪6(圖5；在Rossin等AngewChemIntEd2010,49,3375中描述)(1.5μL,5mg/mL在DMF中)猝滅。通過SDS-PAGE和磷光體成像儀分析等分量的各個(gè)混合物，并從對(duì)應(yīng)所述mAb的譜帶中的放射性確定環(huán)加成產(chǎn)率。計(jì)數(shù)使用AIDAImageAnalyzer軟件(Raytest)定量。表1：CC49-TCO結(jié)構(gòu)和177Lu-28之間反應(yīng)的二級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。O=醚連接；C=氨基甲酸酯(carbamate)連接實(shí)施例6反式-環(huán)辛烯體內(nèi)穩(wěn)定性用CC49-PEG10-TCO-O主要(CC49-23a；8.4TCO每CC49；300μg/100μL每小鼠)、CC49-PEG10-TCO-C次要(CC49-27b；3.3TCO每CC49，μg/100μL每小鼠)和無(wú)間隔體的CC49-TCO-O主要(CC49-20a；8.0TCO每CC49，300μg/100μL每小鼠)對(duì)無(wú)腫瘤小鼠(n=3每組)進(jìn)行靜脈注射。在選定的時(shí)間點(diǎn)(從注射后1小時(shí)到不超過4天)從隱靜脈(venasaphena)抽取血液試樣并收集在包含肝素的小瓶中。稱重所述血液試樣并加入過量的111In-四嗪28。在37℃培育20分鐘后，用PBS將血液等分試樣稀釋10倍并通過SDS-PAGE分析。從對(duì)應(yīng)所述mAb的譜帶中的放射性確定環(huán)加成產(chǎn)率，并用AIDAImageAnalyzer軟件定量計(jì)數(shù)。在三個(gè)單獨(dú)的小鼠組(n=3)中評(píng)估在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血液中存在的mAb的量(%ID/g血液)，其中所述小鼠被注射相應(yīng)的125I-CC49-TCO(300μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)。所述數(shù)據(jù)(對(duì)于mAb清除進(jìn)行校正)歸一化到在t=0時(shí)的100%IDTCO。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，除了由于mAb從血液清除導(dǎo)致的TCO生理減少外，在被注射了其中所述TCO通過PEG10間隔體被結(jié)合到CC49的結(jié)構(gòu)的兩組小鼠中，循環(huán)反應(yīng)性TCO基團(tuán)的量隨著時(shí)間存在進(jìn)一步減少(圖13A和B)。對(duì)于被注射了其中所述TCO不經(jīng)間隔體被連接到所述mAb的結(jié)構(gòu)的小鼠則不是這樣的情況(圖13C)。這表明了在體內(nèi)無(wú)間隔體CC49-TCO結(jié)構(gòu)相對(duì)于所述CC49-PEG10-TCO結(jié)構(gòu)的更高穩(wěn)定性。實(shí)施例7生物分布實(shí)驗(yàn)通過用具有和不具有PEG10間隔體的125I-標(biāo)記的CC49-TCO結(jié)構(gòu)(100μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)，并在24或72小時(shí)后用111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約0.8MBq)對(duì)攜帶腫瘤的小鼠(n=3)進(jìn)行靜脈注射實(shí)施雙同位素生物分布實(shí)驗(yàn)。給予四嗪三小時(shí)后，用異氟醚麻醉所述動(dòng)物并通過頸脫位處死。通過心臟穿刺抽取血液，并采收、剝離干(blotteddry)并稱重感興趣的器官和組織。在γ-計(jì)數(shù)器中測(cè)量所述試樣連同標(biāo)準(zhǔn)物的放射性以確定所述%ID/克。對(duì)于125I和111In分別將所述能量窗設(shè)定為10-80keV和100-510keV。放射標(biāo)記的mAbs和111In-四嗪的分布在表2-5中示出。表2：雙同位素生物分布數(shù)據(jù)注射177Lu-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約0.5MBq)3小時(shí)后，給予125I-CC49-PEG10-TCO-O主要(CC49-23a；100μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)27小時(shí)或99小時(shí)后。數(shù)據(jù)以%ID/克±SD給出。表3：?jiǎn)我煌凰厣锓植紨?shù)據(jù)注射111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約0.5MBq)3小時(shí)后，給予CC49-TCO-O主要(CC49-20a；100μg/100μL每小鼠)27小時(shí)或75小時(shí)后。數(shù)據(jù)以%ID/克±SD給出。表4：雙同位素生物分布數(shù)據(jù)注射111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約0.5MBq)3小時(shí)后，給予125I-CC49-TCO-C次要(CC49-14b；100μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)27小時(shí)或75小時(shí)后。數(shù)據(jù)以%ID/克±SD給出。表5：雙同位素生物分布數(shù)據(jù)注射111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約0.5MBq)3小時(shí)后，給予125I-CC49-TCO-O次要(CC49-20b；100μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)27小時(shí)或75小時(shí)后。數(shù)據(jù)以%ID/克±SD給出。所述生物分布數(shù)據(jù)證實(shí)了缺少所述間隔體的CC49-TCO結(jié)構(gòu)(constructs)相對(duì)于第一代CC49-PEG10-TCO-O主要23a的更高體內(nèi)穩(wěn)定性。在注射所述四嗪前用CC49-PEG10-TCO-O主要(CC49-23a)預(yù)處理24小時(shí)的小鼠中，由于所述TCO和所述四嗪的之間的反應(yīng)，所述腫瘤中存在的大量mAb(15.81±0.22%ID/克)導(dǎo)致3.09±0.01%ID/克的177Lu積累(表3)。不幸的是，177Lu-四嗪與血液中循環(huán)的大量mAb-TCO的反應(yīng)(5.55±1.85%ID/克)還導(dǎo)致低的腫瘤對(duì)血液比(T/B=3.1±1.0)。當(dāng)在所述mAb4天后給予所述放射標(biāo)記的四嗪時(shí)，由于mAb的清除，所述T/B比值顯著改善(21.3±4.0)。但是，此時(shí)也觀察到約四倍低的177Lu-四嗪在腫瘤中的積累(0.86±0.39%ID/克)。絕對(duì)四嗪積累的這種減少并非mAb-TCO從組織釋放的結(jié)果(腫瘤中仍存在10.99±4.24%ID/克125I-mAb)，而合理地是由注射之間的4天期間TCO的體內(nèi)降解所導(dǎo)致。相反，當(dāng)用缺少所述PEG10間隔體的CC49-TCO結(jié)構(gòu)預(yù)處理所述小鼠時(shí)，觀察到mAb注射3天后111In-四嗪的腫瘤攝取相對(duì)于mAb注射1天后沒有減少(表4-6)。同時(shí)，由于mAb-TCO從血液清除，所述T/B比從約2增加到超過4。在這段時(shí)間內(nèi)腫瘤結(jié)合的TCO的得到保持的反應(yīng)性表明其相對(duì)于所述第一代CC49-PEG10-TCO的更高穩(wěn)定性。實(shí)施例8成像實(shí)驗(yàn)接受100μg不含PEG10間隔體(spacer)的CC49-TCO結(jié)構(gòu)3或4天后用111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，20-50MBq)注射攜帶腫瘤的小鼠。約1小時(shí)后，麻醉所述小鼠并放置在裝備有用于麻醉的鼻錐和用于呼吸監(jiān)控的傳感器的動(dòng)物床上。注射四嗪2小時(shí)后采用四頭多針孔小動(dòng)物SPECT/CT成像體系(NanoSPECT，BioscanInc.)實(shí)施單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(Singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT)。使用1.4mm直徑的針孔和120-140秒的采集時(shí)間/視圖(24次投影)實(shí)施所述SPECT采集(總共1小時(shí))。對(duì)于111In將所述能量窗設(shè)定在245keV±15%和171keV±20%。第一次掃描兩到四天后，通過過量麻醉對(duì)所述小鼠進(jìn)行安樂死并過夜獲取第二次SPECT/CT掃描。每次SPECT期之前實(shí)施CT掃描(2秒/投影，360次投影)以獲得關(guān)于放射性分布的解剖學(xué)信息。所述采集之后，使用制造商的軟件(InVivoScope1.39，patch1)迭代重建數(shù)據(jù)。對(duì)于腫瘤、肝臟、腎臟和大腿肌肉，手工繪制感興趣的區(qū)域(ROIs)，一式三份。用填充了已知量的111In的體模來標(biāo)定用于組織放射性定量的掃描儀。圖13A-C中分別示出了注射了CC49-TCO-O次要(CC49-20b)、CC49-TCO-O主要(CC49-20a)和CC49-TCO-C次要(CC49-14b)的三只小鼠在代表性的時(shí)間尺度上的圖像。圖13：(左)給予(A)CC49-TCO-O次要(CC49-20b)，(B)CC49-TCO-O主要(CC49-20a)或(C)CC49-TCO-C次要(CC49-14b)(100μg/100μL每小鼠)3-4天后，注射111In-四嗪28(21μg/75μL每小鼠，約40MBq)2小時(shí)后活小鼠的SPECT/CT投影。(右)，所述第一次成像期2-4天后相同小鼠的死后SPECT/CT掃描。白色箭頭表示腫瘤。小鼠中縱向SPECT/CT研究顯示用CC49-TCO-O(主要和次要兩種形式)預(yù)處理3天后腫瘤中的高111In-四嗪攝取，并因此證實(shí)這些TCO-結(jié)構(gòu)的體內(nèi)穩(wěn)定性(圖13A和B)。此時(shí)(左圖)，大多數(shù)非腫瘤結(jié)合的mAb-TCO已經(jīng)從循環(huán)清除，并因此由于111In-四嗪的尿排泄除了所述腫瘤以外唯一可見的器官是腎臟和膀胱。重要的是，在血液和富血液的器官例如肝臟中觀察不到放射性。非常低的背景放射性是相對(duì)于使用第一代CC49-PEG10-TCO(見R.Rossin,P.RenartVerkerk,SandraM.vandenBosch,R.C.M.Vulders,l.Verel,J.Lub,M.S.Robillard,AngewChemIntEd2010,49,3375)獲得的結(jié)果的根本改進(jìn)，并將轉(zhuǎn)化為對(duì)病人中骨髓和其它劑量限制器官的更低劑量。值得注意的是，所述用CC49-TCO-O預(yù)處理的小鼠的腫瘤在注射111In-四嗪72-96小時(shí)后仍是高放射性的，表明所述TCO-四嗪環(huán)加成產(chǎn)物的高的體內(nèi)穩(wěn)定性。在晚的時(shí)間點(diǎn)，在所述小鼠腎臟內(nèi)仍可見一些活性，并且一些在肝臟中積累，合理地是由于抗原脫落和由于注射四嗪時(shí)仍在血液內(nèi)循環(huán)的所述mAb的清除所導(dǎo)致。當(dāng)目標(biāo)是癌癥病人中的預(yù)靶向的RIT時(shí)，腫瘤中放射性保持延長(zhǎng)的時(shí)間也是非常重要的。實(shí)際上，治療性放射性核素被結(jié)合到靶組織的時(shí)間越長(zhǎng)，遞送到腫瘤的劑量越高。出人意料地，在給予CC49-TCO-C次要后注射了111In-四嗪的小鼠中觀察到相當(dāng)?shù)偷姆派湫詳z取(uptake)，可能是兩次處理之間的4天延遲所導(dǎo)致(圖13C)。但是，也是在這種情況中，在早期掃描2天之后，腫瘤中的信號(hào)仍存在，證實(shí)由所述體內(nèi)Diels-Alder反應(yīng)獲得的環(huán)加成產(chǎn)物的體內(nèi)穩(wěn)定性。實(shí)施例9該實(shí)施例涉及在反式環(huán)辛烯的不同位置上的各種取代基的電腦模擬(insilico)測(cè)試。對(duì)于不同取代的環(huán)辛烯，使用MOPAC軟件(CambridgestwareMopacProversion8.03)計(jì)算了HOMO能量。結(jié)果在以下表6中提供。表6通過Mopac對(duì)不同取代基確定的HOMO能量。在這里(a)代表直立；(e)代表平伏。碳原子根據(jù)以下結(jié)構(gòu)進(jìn)行編號(hào)：實(shí)施例10四嗪28的替代性合成過程，和相應(yīng)的Gd-絡(luò)合物，28-Gd的合成。參考圖15，其示出了合成路線。5-氧代-5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,4-二氫-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)戊酸(30)。根據(jù)文獻(xiàn)過程(M.L.Blackman,M.Royzen,M.J.Fox,J.Am.Chem.Soc.2008,130,13518-13519)合成了6-(6-(吡啶-2-基)-1,4-二氫-1,2,4,5-四嗪-3-基)-吡啶-3-胺(29)。將29(428mg，1.69mmol)和戊二酸酐(231mg，2.03mmol)在THF(10mL)中的混合物在氬氣惰性氣氛下在60℃加熱40小時(shí)。冷卻后，用THF(5mL)洗滌橙色沉淀并干燥以獲得橙色固體形式的30(537mg，87%)。5-氧代-5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)戊酸(6)將化合物30(166mg；0.452mmol)懸浮在醋酸(3mL)中并加入亞硝酸鈉(93.5mg；1.36mmol)。觀察到快速著色成紫色懸浮液。攪拌15分鐘后，過濾所述反應(yīng)混合物，用水(2×6mL)和丙酮(3mL)洗滌，并干燥，以獲得紫色固體形式的產(chǎn)物(152mg；92%)。(37,41-二氧代-41-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧雜-36-氮雜四十一烷基)氨基甲酸叔丁酯(31)。將PyBOP(148mg，0.284mmol)加入在0℃的6(94.4mg，0.258mmol)、氨基-PEG10-氨基-Boc(150mg，0.233mmol)和N,N-二異丙基乙基胺(新蒸餾，100mg，0.774mmol)在DMF(2mL)中的攪拌混合物中。使所述混合物加溫至室溫并繼續(xù)攪拌15分鐘。蒸發(fā)所述透明的、深紅色溶液至干燥，并將產(chǎn)物重新溶解在氯仿(5mL)中，用0.2MKH2PO4(pH=4.5,3×3mL)和飽和Na2CO3(2×3mL)洗滌，然后在二乙基醚(20mL)中沉淀。通過離心收集并通過在二氧化硅上使用甲醇在氯仿中的梯度(0-10%)的柱色譜純化所述沉淀，提供紫色蠟狀固體形式的31(148mg，64%)。2,2’,2’’-(10-(2,40,44-三氧代-44-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十一氧雜-3,39-二氮雜四十四烷基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(28)。將產(chǎn)物31(72.3mg，0.0727mmol)溶解在DCM(1mL)中，并加入TFA(1mL)。在室溫?cái)嚢杷龌旌衔?小時(shí)。蒸發(fā)后，將剩余物溶解在乙腈(1.5mL)中并在二乙基醚(15mL)中沉淀。通過過濾分離紫色沉淀從而以定量的產(chǎn)率提供32的TFA-鹽。將其溶解在DMF(1.5mL)中，并加入DOTA-NHS(69.6mg，0.075mmol)和N,N-二異丙基乙基胺(新蒸餾，44mg，0.341mmol)。在室溫?cái)嚢杷龌旌衔?0分鐘。蒸發(fā)透明的、深紅/紫色溶液后，將粗材料溶解在水中并通過制備HPLC純化。冷凍干燥后獲得28(80.5mg，87%產(chǎn)率)。28的GdIII-絡(luò)合物，(28-GdIII)將化合物28(204mg，0.160mmol)溶解在醋酸銨水溶液(0.1M，pH=5.5,5mL)中，并加入醋酸釓(III)水合物(96.8mg，0.239mmol)。在室溫?cái)嚢杷龌旌衔?0分鐘，接著立即通過制備HPLC純化。冷凍干燥后，獲得紫色固體形式的GdIII-絡(luò)合物(188mg，82%產(chǎn)率)。MS(ESI，m/z)：計(jì)算值C57H89N13O20Gd+([M+H]+):1433.56，實(shí)測(cè)值:1433.58。實(shí)施例11新模型四嗪探針的化學(xué)合成合成了包含可選擇的四嗪部分的幾種四嗪模型探針。參考圖16，其示出了所述合成路線。3-(5-丁酰氨基-2-吡啶基)-6-(5-(三氟甲基)-2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(35)在氬氣惰性氣氛下將2-氰基-5-三氟甲基-吡啶(200mg，1.16mmol)、2-氰基-5-氨基-吡啶(300mg，2.52mmol)和硫磺(80mg，2.52mmol)在乙醇(2mL)中攪拌。加入水合肼(0.60g；12.0mmol)并將所述混合物在80℃加熱過夜。使反應(yīng)混合物冷卻并加入水(2mL)。離心獲得固體，用水/乙醇=1/2洗滌所述固體并將其干燥以提供135mg粗產(chǎn)物33。向合并的離心上清液加入水，導(dǎo)致進(jìn)一步批次的粗材料(188mg)的沉淀，通過離心將其分離并干燥。將該粗胺產(chǎn)物(33)和丁酸酐(285mg；1.80mmol)在THF(5mL)中攪拌并在65℃加熱過夜。濃縮所述反應(yīng)混合物，并在己烷/二乙基醚=3/1中攪拌剩余物。用玻璃過濾器過濾該懸浮液并通過使用己烷/丙酮混合物作為洗脫液的二氧化硅柱色譜純化剩余物，獲得90mg粗產(chǎn)物34(約60%純度)。將未精制的酰胺化的二氫四嗪34(62mg)懸浮在THF(1.5mL)和水(2.0mL)的混合物中。攪拌的同時(shí)，加入NaNO2(88mg；1.28mmol)，并然后在0℃滴加硫酸(130mg；1.33mmol)在水(1mL)中的溶液。觀察到快速著色成紅色懸浮液。攪拌3分鐘后，用氯仿和水稀釋所述反應(yīng)混合物，留下紫色沉淀，所述紫色沉淀通過用玻璃過濾器過濾分離。濃縮濾出液中的有機(jī)層并用二乙基醚稀釋以誘導(dǎo)紫色固體第二次收獲的沉淀。用氯仿和二乙基醚的混合物磨碎(triturated)合并的固體，并通過過濾分離以提供純四嗪35(約25mg，8%總產(chǎn)率，從2-氰基-5-三氟甲基-吡啶計(jì)算)。1HNMR(CDCl3/CD3OD):δ=9.2(s,1H),8.9(d,1H),8.75(多重信號(hào),3H),8.3(d,1H),2.45(t,2H),1.8(m,2H),1.05(t,3H)ppm.19FNMR(CDCl3/CD3OD):δ=-62.9ppm.LC-MS/PDA:色譜中的一個(gè)峰,m/z=390.2(M+H+)和800.8(2M+Na+),λmax=329和526nm。3-(5-氟-2-吡啶基)-6-(5-丁酰胺基-2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(38)在氬氣惰性氣氛下在乙醇(1.5mL)中攪拌2-氰基-5-氟-吡啶(100mg，0.82mmol)、2-氰基-5-氨基-吡啶(200mg，1.68mmol)和硫磺(55mg，1.72mmol)。加入水合肼(0.35g；7.0mmol)并在90℃加熱所述混合物過夜。使所述反應(yīng)混合物冷卻并加入乙醇(5mL)。用玻璃過濾器過濾獲得固體，用己烷洗滌并然后干燥，以提供90mg粗產(chǎn)物36。接著，在THF(1.5mL)中攪拌該粗胺產(chǎn)物36和丁酸酐(93mg；0.59mmol)并在65℃加熱。在氬氣下反應(yīng)過夜后，將所述反應(yīng)混合物冷卻，用一些己烷(約3mL)稀釋并用玻璃過濾器(glassfilter)過濾。通過應(yīng)用己烷/丙酮混合物作為洗脫劑的二氧化硅柱色譜純化剩余物，獲得純的酰胺化的產(chǎn)物37(約28mg，10%總產(chǎn)率，從2-氰基-5-氟-吡啶計(jì)算)。1HNMR(CDCl3/CD3OD):δ=9.25(bs,1H,NH),8.7(s,1H),8.5(s,1H,NH),8.4(多重信號(hào),2H),8.2(m,1H),8.1(m,1H),7.95(m,1H),7.5(m,1H),2.4(t,2H),1.75(m,2H),1.05(t,3H)ppm.13CNMR(CDCl3/CD3OD):δ=172.8,161.6,159.0,146.6,146.1,143.5(d),141.6,139.3,136.8,136.6,136.4,127.0,124.0,123.8,122.6,121.5,38.9,18.8,13.5ppm(由于C-F耦合，一些碳的信號(hào)是雙重峰)。LC-MS/PDA:色譜中的一個(gè)峰,m/z=342.1(M+H+),λmax=288nm。將所述酰胺化的二氫四嗪37(28mg；0.082mmol)懸浮在THF(2mL)和水(2mL)的混合物中。攪拌的同時(shí)，在0℃滴加NaNO2(85mg；1.23mmol)，和硫酸(120mg；1.23mmol)在水(2mL)中的溶液。觀察到快速著色成紫色懸浮液。攪拌3分鐘后，加入氯仿和水。用水洗滌所述紫色氯仿層兩次，然后濃縮。在少量氯仿中攪拌固體剩余物，然后向其中加入己烷。將幾乎無(wú)色的上清液倒出，干燥固體以獲得21mg紫色粉末38(產(chǎn)率：75%)。1HNMR(CDCl3/CD3OD):δ=8.8(多重信號(hào)，5H),7.75(m,1H),2.45(t,2H),1.8(m,2H),1.05(t,3H)ppm.13CNMR(CDCl3/CD3OD):δ=173.4,162.9,162.6,162.4,159.8,146.0,143.2,141.3,139.7和139.4,138.8,126.9,125.8(d),125.2,124.4,124.2,39.0,18.7,13.5ppm(由于C-F耦合，一些碳的信號(hào)是雙重峰)。19FNMR(CDCl3/CD3OD):δ=-120.4ppm.LC-MS/PDA:色譜中的一個(gè)峰，m/z=340.2(M+H+),λmax=324和529nm。3-(2-吡啶基)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪(40)在氬氣惰性氣氛下在乙醇(5mL)中攪拌2-氰基吡啶(500mg，4.8mmol)、乙脒鹽酸鹽(2.00g，21.2mmol)和硫磺(155mg，4.8mmol)。加入水合肼(2.76g；55.2mmol)并在20℃攪拌所述混合物過夜。過濾渾濁的混合物并蒸發(fā)濾出液至干燥，獲得2.9g橙色的粗產(chǎn)物39。接著，將該粗產(chǎn)物(800mg)懸浮在THF(3mL)和醋酸(4mL)的混合物中。在0℃加入NaNO2(2.0g；29.0mmol)在水(3mL)中的溶液。觀察到立刻著色成紅色/紫色懸浮液。在0℃攪拌5分鐘后，加入氯仿和水。用水洗滌所述紫色氯仿層兩次，然后濃縮。在氯仿和己烷的1:1混合物中攪拌固體剩余物，然后過濾。濃縮濾出液并通過應(yīng)用氯仿/丙酮混合物作為洗脫液的二氧化硅柱色譜純化所述粗產(chǎn)物，獲得純產(chǎn)物40(48mg，21%總產(chǎn)率，從2-氰基吡啶計(jì)算)。1HNMR(CDCl3):δ=8.96(d,2H),8.65(d,2H),7.99(t,2H),7.56(dd,3H),3.17(s,3H)ppm.13CNMR(CDCl3):δ=168.1.163.6,150.9,150.3,137.4,126.3,123.9,21.4ppm.LC-MS/PDA:色譜中的一個(gè)峰,m/z=174.3(M+H+),λmax=274和524nm。3,6-雙(4-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(42)在氬氣惰性氣氛下在90℃加熱4-氰基吡啶(858mg；8.24mmol)和一水合肼(1.24g；24.7mmol)16小時(shí)。使所述混合物冷卻到室溫并然后用水(3mL)稀釋。過濾橙色沉淀(41)并用水(3mL)洗滌，隨后將其溶解在DMSO(10mL)中。向該溶液加入DDQ(372mg；1.64mmol)。觀察到立即著色成深紅色溶液。60分鐘后，加入飽和碳酸氫鈉溶液(20mL)并用氯仿(3次30mL)提取產(chǎn)物。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層并將其蒸發(fā)至干燥以獲得粉色固體形式的標(biāo)題化合物(52mg；5%總產(chǎn)率，從4-氰基吡啶計(jì)算)。1H-NMR(CDCl3):δ8.97(d,4H),8.52(d,4H)ppm.LC-MS/PDA:色譜中的一個(gè)峰,m/z=237.2(M+H+),λmax=271和523nm。實(shí)施例12額外的反式-環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成參考圖17，其詳細(xì)描述合成路線。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)醋酸酯(44a)向冰冷卻的10a(1.73g，13.73mmol，包含約10%順式異構(gòu)體)在THF(40mL)中的溶液加入在油中的氫化鈉(60%，2.60g，65.0mmol)。在RT攪拌所述混合物15分鐘，然后將其加熱到50℃達(dá)1小時(shí)。在冰中冷卻所述混合物，加入溴乙酸(2.50g，17.9mmol)。在冰中攪拌所述懸浮液1小時(shí)，然后在約25℃攪拌64小時(shí)，加入更多的THF以保持可攪拌的懸浮液(總體積約100mL)。在50℃加熱1小時(shí)后，冷卻所述混合物，緩慢加入水。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分THF并加入更多的水(總體積50mL)。用MTBE(2×75mL)提取含水混合物，并用25mL水洗滌有機(jī)層。用16g檸檬酸酸化合并的水層，并用2×75mLMTBE提取產(chǎn)物。干燥并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)留下剩余物，通過柱色譜(40gSiO2)將其純化。合并產(chǎn)物級(jí)分，從含有痕量MTBE的庚烷重結(jié)晶剩余物。這提供了810mg的產(chǎn)物43a(810mg，4.40mmol，32%，含有少量順式異構(gòu)體)。1H-NMR(CDCl3):δ1.4–2.45(m,10H),3.1–3.2(m,1H),3.9–4.1(AB,2H),5.3–5.65(m,2H)。將產(chǎn)物43a溶解在30mL二氯甲烷中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(715mg，6.22mmol)并在冰中冷卻混合物。加入DCC(1.42g，6.89mmol)并在冰中攪拌所述混合物30分鐘，然后在RT攪拌4小時(shí)。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和進(jìn)行在40g硅膠上使用庚烷/EtOAc梯度的色譜提供44a。合并產(chǎn)物級(jí)分，并從含有少量MTBE的庚烷重結(jié)晶。刮擦之后產(chǎn)物結(jié)晶。過濾后獲得180mg的產(chǎn)物(0.64mmol，15%，含有約20%順式異構(gòu)體)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)醋酸酯(44b)向冰冷卻的10b(0.78g，6.19mmol)在THF(30mL)中的溶液加入在油中的氫化鈉(60%，0.94g，23.5mmol)。在RT攪拌所述混合物15分鐘，然后加熱到50℃達(dá)1小時(shí)。在冰中冷卻所述混合物，加入溴乙酸(1.41g，10.14mmol)。在約25℃攪拌懸浮液20小時(shí)(試樣表明還未發(fā)生耦合)，然后在55℃攪拌6小時(shí)，在25℃攪拌3天，并在55℃再攪拌6小時(shí)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分THF，并加入50mLMTBE，接著加入冰和25mL水。分離層，并用30mLMTBE提取水層。用25mL水洗滌相繼的有機(jī)層。在冰中冷卻合并的水層，加入50mLMTBE，接著加入5.1g檸檬酸。分離層，并用50mLMTBE提取水層。干燥和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)留下剩余物(43b)，將其就這樣用于下一步驟。1H-NMR(CDCl3):δ1.2–2.45(m,10H),3.65–3.75(m,1H),4.1(s,2H),5.45–5.65(m,2H)。將產(chǎn)物43b溶解在30mL二氯甲烷中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.60g，13.91mmol)并在冰中冷卻所述混合物。加入DCC(3.11g，15.10mmol)并在冰中攪拌混合物30分鐘，然后在RT攪拌3小時(shí)。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和進(jìn)行在40g硅膠上使用甲苯然后是二氯甲烷作為洗脫液的色譜提供了44b，將其與溴乙酸的NHS酯混合。將混合物溶解在25mLMTBE中，向所述溶液加入25mL庚烷。攪拌2小時(shí)后，過濾混合物(固體是溴乙酸的NHS酯)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾出液，將剩余物溶解在溫MTBE中，加入一些庚烷，然后將溶液冷卻到RT。其沉淀出產(chǎn)物。過濾提供30mg產(chǎn)物44b(0.11mmol，2%)。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)-2-苯基乙酸酯(46a)向10a(3.0g，23.8mmol，含有<10%順式異構(gòu)體)在THF(40mL)中的溶液加入在油中的60%NaH(3.0g，75.0mmol)。在RT攪拌混合物10分鐘，然后將其加熱到50℃達(dá)1.5小時(shí)。在冰中冷卻后，分份加入DL-2-溴苯乙酸(3.87g，18.0mmol)。向稠糊狀物加入THF(20mL)并在25℃攪拌懸浮液18小時(shí)。在55℃通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分THF并加入50mLMTBE。在冷水中冷卻混合物并加入一些冰，接著加入50mL水。分離層并用50mLMTBE提取水層。用25mL水洗滌相繼的有機(jī)層。在冰中冷卻合并的水層，加入50mLMTBE，接著加入10g檸檬酸。分離層并用50mLMTBE提取水層。干燥和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)留下5.05g產(chǎn)物45a，將其就這樣用于下一步驟。將產(chǎn)物45a溶解在50mL二氯甲烷中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(2.51g，21.8mmol)并在冰中冷卻所述混合物。加入DCC(5.03g，24.4mmol)并在冰中攪拌混合物15分鐘，然后在RT攪拌3小時(shí)。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和進(jìn)行在55g硅膠上使用甲苯/二氯甲烷梯度的色譜提供2.8g46a(7.83mmol，33%基于10a，包含約5%順式異構(gòu)體)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)-2-苯基乙酸酯(46b)向在0℃的10b(1.0g，7.9mmol)在THF(60mL)中的溶液加入在油中的60%NaH(1.26g，31.5mmol)，并將混合物加熱到50℃1.5小時(shí)。冷卻到0℃后，將DL-2-溴苯乙酸(2.22g，10.3mmol)以在THF(5mL)中的溶液形式加入，并在RT劇烈攪拌粘性懸浮液16小時(shí)。再加熱到40℃24小時(shí)后，將混合物倒入檸檬酸(9.2g)在水(100mL)中的溶液中。用MTBE(3×50mL)提取含水混合物，用Na2SO4干燥并蒸發(fā)溶劑以獲得黃色油。通過柱色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH2%)純化提供產(chǎn)物、未反應(yīng)的TCO和副產(chǎn)物的混合物。通過溶解在MTBE和水(其用33%NaOH溶液堿化)中實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步純化。水層用MTBE洗滌，用檸檬酸酸化并然后用MTBE(3×)提取。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，溶劑蒸發(fā)后獲得黃色油形式的化合物45b(463mg，1.8mmol，23%產(chǎn)率)。向在0℃的45b(463mg，1.8mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(250mg，2.2mmol)在THF(9mL)中的溶液加入DCC(372mg，1.8mmol)在THF(2mL)中的溶液。在RT攪拌所述反應(yīng)混合物16小時(shí)，之后通過過濾除去沉淀。在真空中濃縮濾出液并通過柱色譜(SiO2、庚烷/EtOAc梯度25%-40%)純化以提供無(wú)色漿形式的46b(451mg，1.3mmol，71%產(chǎn)率)。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)-2-甲基丙酸酯(49a)向在冰浴中冷卻的10a(3.0g，23.8mmol)在THF(120mL)中的溶液加入在油中的60%氫化鈉(3.8g，95mmol)。除去冰浴并在RT攪拌所述混合物30分鐘，然后在50℃攪拌1小時(shí)。在冰中冷卻后，緩慢加入DL-2-溴丙酸(3.3mL，35.6mmol)。在所述加入期間混合物變得十分粘稠，用THF(50mL)將其稀釋。所述添加完成后，除去冰浴并在RT攪拌所述反應(yīng)混合物16小時(shí)。通過NMR跟蹤反應(yīng)的進(jìn)度，其在16小時(shí)后呈現(xiàn)40%的轉(zhuǎn)化率。然后在35℃將混合物再攪拌24小時(shí)，獲得84%的轉(zhuǎn)化率。在真空中濃縮反應(yīng)混合物，用MTBE稀釋并然后用水(200mL)猝滅(quenched)。分離層并用檸檬酸(22.5g)在水(60mL)中的溶液酸化水層。用MTBE(3×200mL)提取所述水層。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層并蒸發(fā)所述溶劑以提供包含47a的混合物(5.19g)。所述材料未經(jīng)進(jìn)一步純化用于接下來的步驟。向在-70℃的二異丙胺(13mL，92mmol)在THF(200mL)中的溶液緩慢加入在己烷中的2.5M正丁基鋰(32mL，80mmol)。然后將所述混合物緩慢加溫到-20℃并再次冷卻到-70℃。以在THF中的溶液形式加入化合物47a(5.19g)并使所述混合物加溫到-20℃。在該溫度加入碘甲烷(10.7mL，172mmol)并將所述混合物加溫到5℃。取試樣并根據(jù)NMR分析所述反應(yīng)完成了。將反應(yīng)混合物倒入檸檬酸(40g)在水(200mL)中的溶液并用MTBE(3×150mL)提取。用檸檬酸水溶液和鹽水洗滌合并的有機(jī)層。用Na2SO4干燥并蒸發(fā)所述溶劑后獲得黃色油(9.4g)。通過柱色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH梯度1%-4%)純化提供黃色漿形式的純48a(1.15g，5.4mmol，兩個(gè)步驟23%產(chǎn)率)。1H-NMR(CDCl3):δ1.1–2.45(m)和1.4(2s)(16H),3.2–3.3(m,1H),5.3–5.7(m,2H)。向在0℃的48a(1.15g，5.4mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(622mg，5.4mmol)在THF(27mL)中的溶液加入DCC(1.12g，5.4mmol)在THF(5mL)中的溶液。加入之后，將所述混合物加溫至RT并在此溫度攪拌16小時(shí)。用MTBE稀釋混合物，并過濾掉沉淀。蒸發(fā)溶劑后，通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc梯度20%-40%)純化剩余物。從庚烷/EtOAc結(jié)晶提供無(wú)色晶體形式的49a(707mg，2.3mmol，42%產(chǎn)率)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)-2-甲基丙酸酯(49b)向在冰浴中冷卻的10b(1.5g，11.9mmol)在THF(60mL)中的溶液加入在油中的60%氫化鈉(1.9g，48mmol)。除去冰浴并在50℃攪拌所述混合物1.5小時(shí)。在冰中冷卻后，緩慢加入DL-2-溴丙酸(1.7mL，17.8mmol)。添加期間混合物變得非常粘稠并用THF(35mL)稀釋。添加完成后除去冰浴并在RT攪拌所述反應(yīng)混合物16小時(shí)。然后將所述混合物加熱到43℃保持24小時(shí)。在真空中濃縮所述反應(yīng)混合物，用MTBE稀釋并然后用水(200mL)猝滅。分離層，并用檸檬酸在水中的溶液酸化水層。用MTBE(3×100mL)提取所述水層。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層并蒸發(fā)溶劑以提供包含47b的混合物(2.26g)。所述材料未經(jīng)進(jìn)一步純化用于接下來的步驟。向在-70℃的二異丙胺(5.6mL，39.6mmol)在THF(100mL)中的溶液緩慢加入在己烷中的2.5M正丁基鋰(13.5mL，33.8mmol)。然后緩慢將所述混合物加溫到0℃并再次冷卻到-70℃。以在THF中溶液的形式加入化合物47b(2.26g)并將所述混合物加溫到-20℃。在該溫度下加入碘甲烷(4.6mL，73.9mmol)并使所述混合物加溫到15℃。取樣并根據(jù)NMR分析所述反應(yīng)完成了。將反應(yīng)混合物倒入檸檬酸(20g)在水(140mL)中的溶液中并用MTBE(3×100mL)提取。用檸檬酸水溶液和鹽水洗滌合并的有機(jī)層。用Na2SO4干燥并蒸發(fā)溶劑后獲得黃色漿(4.6g)。通過柱色譜(SiO2，CH2Cl2/MeOH梯度1%-4%)重復(fù)純化提供白色結(jié)晶固體形式的純48b(181mg，0.85mmol，2個(gè)步驟7%產(chǎn)率)。向在0℃的48b(181mg，0.85mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(98mg，0.85mmol)在THF(5mL)中的溶液加入DCC(175mg，0.85mmol)在THF中的溶液。加入后，將所述混合物加溫到RT并在該溫度攪拌5小時(shí)。用MTBE稀釋混合物并過濾掉沉淀。蒸發(fā)所述溶劑后，通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc梯度25%)純化剩余物以提供白色固體形式的49b(257mg，0.83mmol，98%產(chǎn)率)。(E-主要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)苯甲酸酯(52a)向冰冷卻的10a(3.45g，27.38mmol)在THF(50mL)的溶液加入在油中的氫化鈉(60%，2.5g，62.5mmol)。在冰中將所述混合物攪拌15分鐘，然后加熱到50℃達(dá)1小時(shí)。在冰中冷卻所述混合物，并用5分鐘的時(shí)間加入溶解在5mLTHF中的4-氟苯甲酰氯(1.72g，10.84mmol)。在25℃攪拌所述混合物2天(試樣的NMR表明存在很多產(chǎn)物，但也存在4-氟苯甲酸的TCO-酯)，然后在50℃攪拌3小時(shí)。用水冷卻所述混合物，并緩慢加入10mL水，接著加入2g氫氧化鈉和5mL水。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，加入THF和2g氫氧化鈉并將所述混合物在50℃加溫4小時(shí)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑并向剩余的糊狀物加入甲醇。將所述混合物在50℃加溫2小時(shí)，接著在55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。用50mL水稀釋余下的懸浮液。加入MTBE(100mL)，分離層并用25mL水洗滌有機(jī)層。所述有機(jī)層包含a.o.反式環(huán)辛烯醇。用20g檸檬酸處理合并的冰冷卻的水層，并用2×75mLMTBE提取產(chǎn)物。干燥和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)留下固體剩余物，其由產(chǎn)物和4-氟苯甲酸的混合物組成。將所述固體用40mL甲醇加溫。將水(15-20mL)緩慢加入所述溫溶液中直到其變得渾濁。過濾并冷卻濾出液沉淀出產(chǎn)物。過濾、用1/1甲醇/水洗滌和在真空下干燥提供0.827g想要的產(chǎn)物51a(3.36mmol，基于4-氟苯甲酰氯為30%)。用DCC(1.46g，7.08mmol)處理冰冷卻的主要反式酸51a(1.14g，4.63mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(725mg，6.30mmol)在50mL二氯甲烷中的混合物。在冰中攪拌所述混合物1小時(shí)，然后在RT攪拌3小時(shí)。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和實(shí)施在40g硅膠上使用庚烷/EtOAc梯度的色譜提供52a級(jí)分(其被順式異構(gòu)體污染)。合并接下來的產(chǎn)物級(jí)分，并用庚烷和醋酸乙酯的混合物將其加溫到60℃。使懸浮液冷卻到RT，然后過濾。這提供了0.973g產(chǎn)物52a(2.83mmol，61%)。(E-次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(環(huán)辛-4-烯-1-基氧基)苯甲酸酯(52b)向冰冷卻的10b(2.82g，22.38mmol)在THF(40mL)中的溶液加入在油中的氫化鈉(60%，2.0g，50mmol)。在冰中攪拌所述混合物15分鐘，在RT攪拌30分鐘，然后加熱到50℃達(dá)1小時(shí)。在冰中冷卻所述混合物，并用15分鐘的時(shí)間加入溶解在8mLTHF中的4-氟苯甲酰氯(1.72g，10.84mmol)。在RT攪拌所述混合物18小時(shí)(試樣的NMR表明存在許多反式環(huán)辛烯醇)，然后在50℃攪拌6小時(shí)，在25℃攪拌3天，和在50℃再攪拌1小時(shí)。緩慢加入2.0g氫氧化鈉在5mL水中的溶液，接著加入5mL水。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分THF并向所獲得的糊狀物加入40mL甲醇。將混合物在50℃加溫3小時(shí)，加入20mLTHF并繼續(xù)加熱4小時(shí)。在25℃攪拌所述混合物過夜(NMR表明仍存在少量的酯)，然后在50℃加熱4小時(shí)，接著旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。用50mL水稀釋余下的懸浮液。加入MTBE(100mL)，分離層并用25mL水洗滌有機(jī)層。所述有機(jī)層包含a.o.反式環(huán)辛烯醇。用15g檸檬酸處理合并的冰冷卻的水層并用2×75mLMTBE提取產(chǎn)物。干燥和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)留下固體剩余物，其由產(chǎn)物和4-氟苯甲酸的混合物組成。用40mL甲醇加溫所述固體。向所述溫溶液緩慢加入水(25mL)，接著使其冷卻到RT并然后攪拌過夜。過濾，用1/1甲醇/水洗滌并在真空下干燥提供0.76g想要的產(chǎn)物51b(3.09mmol，基于4-氟苯甲酰氯為28%)。用DCC(0.95g，4.61mmol)處理冰冷卻的所述次要反式酸51b(0.66g，2.68mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(460mg，4.0mmol)在50mL二氯甲烷中的混合物。在冰中攪拌所述混合物1小時(shí)，然后在RT攪拌16小時(shí)。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和實(shí)施在30g硅膠上使用二氯甲烷作為洗脫液的色譜。將產(chǎn)物溶解在5mL醋酸乙酯中。加入庚烷并在60℃部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所述溶液直到出現(xiàn)沉淀。加入庚烷并在60℃攪拌所述混合物5分鐘，然后使其冷卻到RT。過濾提供0.437g產(chǎn)物52b(1.27mmol，47%)。(E-主要，次要)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(1-甲基環(huán)辛-4-烯-1-基)醋酸酯(58)將35%的過氧化氫溶液(25mL，300mmol)加入醋酸鈀(45%Engelhard，1.0g，2mmol)、苯醌(432mg，4mmol)和1,5-環(huán)辛二烯(27mL，200mmol)的混合物中。在30℃攪拌所述混合物5天直到NMR分析顯示所述起始材料95%的轉(zhuǎn)化率。將所述混合物倒入Et2O(1L)中并加入水(1L)。用33%的NaOH溶液緩慢堿化所述混合物同時(shí)用冰冷卻。分離層并用Et2O(2×)提取水層。用1NNaOH洗滌合并的有機(jī)層兩次并用Na2SO4干燥。小心蒸發(fā)溶劑提供黃色油形式的粗53(16.1g，130mmol，65%產(chǎn)率)。將1.6M正丁基鋰在己烷中的溶液(45mL，72mmol)加入二異丙胺(14mL，100mmol)在THF(250mL)中的溶液中，冷卻到-80℃。將所述混合物逐漸加溫到0℃并然后冷卻到-80℃。加入膦?；宜崛阴?triethylphosphonoacetate)(15mL，75mmol)在THF(100mL)中的溶液，并在-70℃攪拌所述混合物45分鐘。然后加入53(6.21g，50mmol)在THF(50mL)中的溶液并將混合物緩慢加溫到RT。16小時(shí)后將所述混合物進(jìn)一步加熱至回流8小時(shí)直到NMR分析顯示完全轉(zhuǎn)化。將所述混合物倒入水(250mL)中并用MTBE(3×)提取。用鹽水洗滌合并的有機(jī)層并用Na2SO4干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑并通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc5%)純化后獲得無(wú)色油形式的54(4.74g，24mmol，49%產(chǎn)率)。將1.6M的甲基鋰溶液(59mL，94mmol)加入在冰浴中冷卻的碘化銅(I)(9.53g，50mmol)在Et2O(21mL)中的懸浮液中。在0℃在真空中濃縮灰色溶液并用CH2Cl2剝離(stripped)兩次。將剩余物懸浮在冷的CH2Cl2(100mL)中并在緩慢加入TMSCl(4.0mL，46.5mmol)前冷卻到-80℃。然后通過滴加的方式加入54(4.74g，24mmol)在CH2Cl2(60mL)中的溶液，并用2小時(shí)使所述混合物加溫到RT。在將所述混合物猝滅入(quenchedinto)飽和的NH4Cl水溶液(150mL)中之前將其在RT另外攪拌16小時(shí)。在RT攪拌混合物并加入氨(50mL)。過濾混合物，用CH2Cl2(3×75mL)提取濾出液。用水洗滌并用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑并通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc3%)純化提供無(wú)色油形式的55(4.47g，21mmol，89%產(chǎn)率)。1H-NMR(CDCl3):δ0.8–1.9(m),1.05(s)和1.25(t)(16H),2.15–2.3(m,2H),4.0–4.2(q,2H),5.4–5.55(m,1H),5.65–5.75(m,1H)。用庚烷/Et2O3:1v/v(約500mL)的混合物填充燒瓶，所述燒瓶裝配有汞燈并且與泵和填充有10%硝酸銀(I)浸漬的硅膠(36g，在底部具有一些普通等級(jí)硅膠)的柱連接。加入55(4.47g，21.3mmol)和苯甲酸甲酯(2.7mL，21.3mmol)在少量Et2O中的溶液后，開啟汞燈。使被照射的溶液連續(xù)流動(dòng)經(jīng)過所述柱照射20小時(shí)后，在反應(yīng)器內(nèi)容物的NMR分析中沒有觀察到起始材料，用在庚烷中的30%MTBE洗滌所述柱。用氨處理柱內(nèi)容物并用CH2Cl2(3×)提取。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在蒸發(fā)溶劑并通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc梯度3%>4%)純化后獲得無(wú)色油形式的化合物56(1.41g，6.7mmol，31%產(chǎn)率)。所述主要和次要異構(gòu)體無(wú)法分離，因此所述異構(gòu)體以混合物形式被進(jìn)一步使用。1H-NMR(CDCl3):δ0.8–1.9(m),1.0(s)和1.25(t)(16H),2.1–2.4(m,2H),4.0–4.2(q,2H),5.5–5.65(m,2H)。將氫氧化鋰一水合物(84mg，2.0mmol)在水(1mL)和EtOH(1mL)中的溶液加入56(210mg，1.0mmol)中。為了更好地溶解所述化合物，加入THF(1mL)和MeOH(2mL)。在RT攪拌16小時(shí)后轉(zhuǎn)化仍未完全。加入額外的氫氧化鋰(85mg)并將所述混合物加熱到45℃4小時(shí)，在30℃16小時(shí)和在50℃4小時(shí)直到轉(zhuǎn)化完全。在真空中濃縮所述混合物并用檸檬酸溶液中和。用MTBE(3×)提取并用Na2SO4干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑提供黃色油形式的57(150mg，0.82mmol，82%產(chǎn)率)。1H-NMR(CDCl3):δ1.0(2s,3H),1.3–2.0(m,10H),2.1–2.45(m,2H),5.5–5.65(m,2H)。向冰冷卻的57(150mg，0.82mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(113mg，0.98mmol)在THF(5mL)中的溶液加入DCC(170mg，0.82mmol)在THF(1mL)中的溶液。在RT攪拌所述混合物16小時(shí)并然后用MTBE稀釋。通過過濾除去沉淀并在蒸發(fā)溶劑并通過柱色譜(SiO2，庚烷/EtOAc梯度10%>30%)純化后獲得無(wú)色油形式的化合物58(197mg，0.71mmol，86%產(chǎn)率)。1H-NMR(CDCl3):δ1.05和1.1(2s,3H),1.35–2.35(m,10H),2.4(s,1H),2.5-2.75(AB,1H),2.85(s,4H),5.5–5.65(m,2H)。實(shí)施例13新TCOs的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)關(guān)于其對(duì)四嗪28的反應(yīng)性評(píng)估了所述新合成的TCO結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5中描述了過程。表7：CC49-TCO結(jié)構(gòu)和177Lu-28之間的反應(yīng)的二級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。對(duì)于所有TCOs，在所述主要(平伏)和所述次要(直立)異構(gòu)體之間都存在深遠(yuǎn)和一致的反應(yīng)性差異，后者比前者具有大得多的反應(yīng)性。此外，TCO58的高反應(yīng)性支持了沒有至抗體的連接體的直立位置中的取代基仍提供所述反式環(huán)辛烯環(huán)的增加的反應(yīng)性。實(shí)施例14新模型四嗪探針的穩(wěn)定性和反應(yīng)性關(guān)于它們?cè)谒械姆磻?yīng)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)了包含可選擇的四嗪部分的幾種四嗪模型探針。四嗪類的水解穩(wěn)定性測(cè)試用PBS緩沖液(3mL)稀釋10μL的特定四嗪在DMSO中的溶液(25mM)，并過濾溶液。使用UV光譜監(jiān)測(cè)在525nm處的吸收帶的降低，并從該數(shù)據(jù)測(cè)定水解速率和半衰期。四嗪類對(duì)反式-環(huán)辛-4-烯-1-醇(次要異構(gòu)體，10b)的反應(yīng)性實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)以確定特定四嗪和3-(5-乙酰胺基-2-吡啶基)-6-(2-吡啶基)-1,2,4,5-四嗪(將其選擇作為參比四嗪)在與反式-環(huán)辛-4-烯-1-醇(次要異構(gòu)體，10b)的逆電子需求Diels-Alder反應(yīng)中的反應(yīng)性比。向乙腈(0.100mL)加入5μL所述特定四嗪在DMSO(25mM)中的溶液和5μL所述參比四嗪在DMSO(25mM)中的溶液。用水(0.9mL)稀釋該混合物，通過LC-MS/PDA分析測(cè)定兩種四嗪的絕對(duì)量。接著，加入反式-環(huán)辛-4-烯-1-醇(次要異構(gòu)體，10b)在DMSO(25μL2.5mM)中的溶液，并攪拌所述混合物5分鐘。再次通過LC-MS/PDA分析測(cè)定兩種四嗪的絕對(duì)量，并計(jì)算兩種四嗪的轉(zhuǎn)化率。從這些轉(zhuǎn)化率確定兩種四嗪的反應(yīng)性比。表8：模型四嗪探針的反應(yīng)性和穩(wěn)定性從表8清楚地看到在四嗪上的取代基對(duì)穩(wěn)定性和反應(yīng)性都有深遠(yuǎn)的影響，因此能夠用于為特定應(yīng)用特制的探針的設(shè)計(jì)。實(shí)施例15主要vs次要TCO，20avs20b與四嗪探針28的體外反應(yīng)性差異實(shí)施該實(shí)驗(yàn)以證明在兩種試劑的低濃度下更高TCO反應(yīng)性轉(zhuǎn)化為與放射標(biāo)記的四嗪的更高反應(yīng)產(chǎn)率。為了這一目的，我們使用了連接到CC49的TCO主要20a(k2=19600±1400M-1s-1)和TCO次要20b(k2=136700±2300M-1s-1)(對(duì)于主要和次要分別為6.1和6.6TCOs/分子)。在PBS中稀釋兩種mAb溶液以獲得1×10-5M到1×10-8M的TCO濃度，并使其與載體加入的177Lu-四嗪(相對(duì)于mAb為1當(dāng)量)在37℃反應(yīng)1分鐘。等分量的反應(yīng)混合物(20μL)然后用過量四嗪6猝滅，加入非還原性的試樣緩沖液并通過SDS-PAGE分析。從對(duì)應(yīng)所述mAb的譜帶中的放射性測(cè)定環(huán)加成產(chǎn)率并用AIDAImageAnalyzer軟件定量計(jì)數(shù)。重復(fù)所述實(shí)驗(yàn)三次。如對(duì)雙分子反應(yīng)所預(yù)期的那樣，培育1分鐘后溶液中所述兩種反應(yīng)性物種的濃度的降低轉(zhuǎn)化為更低的反應(yīng)產(chǎn)率(圖18)。但是，當(dāng)使用所述直立TCO20b時(shí)，在微摩爾濃度和更低濃度下，由于與所述四嗪的更快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)產(chǎn)率明顯高于使用平伏TCO20a獲得的那些。實(shí)施例16TCO20b的體內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)施該實(shí)驗(yàn)以擴(kuò)展實(shí)施例6中描述的系列體內(nèi)TCO穩(wěn)定性測(cè)量。在那個(gè)系列中，發(fā)現(xiàn)用PEG間隔體結(jié)合到CC49的TCOs主要和次要(23a和27b)在體內(nèi)不穩(wěn)定，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不含PEG間隔體的TCO主要(20a)在體內(nèi)穩(wěn)定至少4天(圖13)。在所述新實(shí)驗(yàn)中，遵循相同的過程，我們測(cè)試了不含PEG間隔體的CC49-結(jié)合的TCO次要(20b，6.9當(dāng)量結(jié)合)的體內(nèi)穩(wěn)定性。圖19中示出了對(duì)mAb清除進(jìn)行校正的所述體內(nèi)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)所述CC49-結(jié)合的TCO20b在體內(nèi)僅緩慢降解，進(jìn)一步支持了具有至抗體的短連接體的TCOs在體內(nèi)比通過更長(zhǎng)連接體結(jié)合的TCOs更穩(wěn)定的發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例17用不同量TCO20b部分官能化的CC49抗體的血液動(dòng)力學(xué)和生物分布實(shí)施了一系列研究以評(píng)估每個(gè)CC49分子上TCO(20b)基團(tuán)數(shù)量對(duì)血液循環(huán)和腫瘤靶向的影響。預(yù)期用過多的TCO部分改性抗體會(huì)導(dǎo)致血液循環(huán)半衰期的下降并將影響CC49-TCO結(jié)構(gòu)的腫瘤攝取。CC49-TCO結(jié)構(gòu)的血液動(dòng)力學(xué)(見圖20和21)用攜帶0、4.9、9.3或15.8個(gè)TCO(20b)基團(tuán)/mAb的125I-CC49對(duì)雌性裸Balb/C小鼠(20-25g體重，CharlesRiverLaboratories，n=3)進(jìn)行注射(100μg/100μL每小鼠，約0.5MBq)。在選擇的時(shí)間點(diǎn)(5分鐘，3、6小時(shí)，1、2、3天)從隱靜脈抽取血液試樣，稱重并用1mLPBS稀釋。注射mAb四天后，麻醉所述動(dòng)物并通過頸脫位處死，通過心臟穿刺收集血液并采收、剝離干、稱重感興趣的器官和組織，并加入1mLPBS。在γ-計(jì)數(shù)器(gamma-counter，WizardII，PerkinElmer)中連同標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)量所有試樣中的放射性以確定每克組織的百分比注射劑量(%ID/g)。CC49-TCO結(jié)構(gòu)在血液中的半衰期用GraphPadPrism(version5.01)計(jì)算(通過將血液曲線擬合成two-phasedecay)。表9：CC49-TCO(20b)的動(dòng)力學(xué)血液參數(shù)。CC49-TCO(20b)結(jié)構(gòu)的腫瘤靶向用采用0、8.5、12.7或18.7個(gè)TCO20b基團(tuán)/mAb官能化的125I-CC49對(duì)攜帶腫瘤的小鼠(見方法部分；100mm3腫瘤尺寸)進(jìn)行注射(100μg/100μL每小鼠，0.2-0.4MBq，n=4)。注射mAb4天后處死接受了125I-CC49的小鼠。注射mAb72小時(shí)后用111In-DOTA-四嗪28對(duì)接受了125I-CC49-TCO20b的小鼠進(jìn)行注射(相對(duì)于mAb為25當(dāng)量，約0.8MBq)并在注射四嗪后3個(gè)小時(shí)將其處死。處死時(shí)，通過心臟穿刺收集血液并采收、剝離干、稱重感興趣的器官和組織，并加入1mLPBS。在γ-計(jì)數(shù)器(Wizard3，PerkinElmer)中采用雙同位素方案(對(duì)于125I和111In能量窗分別設(shè)定為10-80keV和100-510keV)連同標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定所有試樣中的放射性以確定每克組織的百分比注射劑量(%ID/g)。表10：注射mAb3天后(*除外)125I-CC49-TCO20b結(jié)構(gòu)在攜帶腫瘤的小鼠中的生物分布。數(shù)據(jù)以平均%ID/g±SD(n=4)給出*mAb注射4天后處死小鼠**低免疫反應(yīng)性。表11：111In-四嗪28(注射3小時(shí)后)在用CC49-TCO20b結(jié)構(gòu)預(yù)處理的小鼠中的生物分布。數(shù)據(jù)以平均%ID/g±SD(n=4)給出從表9-11中的數(shù)據(jù)可以清楚看到TCO改性比不應(yīng)超過9。實(shí)施例18CC49-TCO44b的血液動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)穩(wěn)定性血液動(dòng)力學(xué)用125I-標(biāo)記的CC49對(duì)無(wú)腫瘤的小鼠(n=3/組)進(jìn)行注射(100μg每小鼠，0.2-0.4MBq)，CC49已用7.5TCO44b基團(tuán)改性。在選擇的時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、24、48和72小時(shí))從隱靜脈抽取血液試樣并收集在含有肝素的小瓶中。注射mAb四天后，麻醉所述小鼠并通過頸脫位處死。通過心臟穿刺抽取血液并采收、剝離干、稱重感興趣的器官和組織，加入1mLPBS，在γ-計(jì)數(shù)器(Wizard3，PerkinElmer)中連同標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定每個(gè)器官的百分比注射劑量(%ID)。在該研究中，TCO-改性的CC49呈現(xiàn)出比未改性的CC49稍快的清除(圖22)。對(duì)于CC49-TCO和CC49，從曲線下的面積計(jì)算的血液中的半衰期(T1/2=ln2×AUC/C0)分別為22.2小時(shí)和26.3小時(shí)。我們將這歸因于所述mAb上Lys殘基的官能化。作為較短血液循環(huán)的結(jié)果，在所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在大多數(shù)器官中還觀察到較少量的125I-CC49-TCO，所述器官在計(jì)數(shù)之前不灌注(perfused)(圖23)。體內(nèi)穩(wěn)定性用125I-標(biāo)記的CC49-TCO44b(220μg每小鼠，0.4MBq)對(duì)單獨(dú)組的無(wú)腫瘤小鼠(n=3)進(jìn)行注射。在選定的時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、24、48和72小時(shí))從隱靜脈抽取血液試樣(約50微升)并收集在包含肝素的小瓶中。注射mAb四天后，麻醉所述小鼠并通過頸脫位處死。通過心臟穿刺抽取血液并除去胃和甲狀腺，剝離干并在γ-計(jì)數(shù)器中連同標(biāo)準(zhǔn)物一起計(jì)數(shù)以確定每個(gè)器官的百分比注射劑量(%ID)。這些器官中的低125I攝取(在胃中為0.17±0.03%ID和在甲狀腺中為0.88±0.33%ID)證實(shí)所述放射標(biāo)記的mAb在4天評(píng)價(jià)期間保持了體內(nèi)標(biāo)記物。稱重所述血液試樣，用PBS稀釋至100μL并加入過量的以0.1MBq/μg比活性放射標(biāo)記的載體加入的177Lu-四嗪28。在37℃培育所述混合物20分鐘并以400×g離心5分鐘以分離血細(xì)胞。然后向ZebaDesalt離心柱(0.5ml，40kDaMW截止，Pierce)施加30μL上清液。離心后，從筒洗脫高M(jìn)WDiels-Alder反應(yīng)產(chǎn)物，同時(shí)保留過量的四嗪。在γ-計(jì)數(shù)器中采用雙同位素方案(對(duì)于125I為10-80keV窗和對(duì)于177Lu為155-380keV窗)測(cè)量所述洗出液中包含的放射性。將僅包含177Lu-四嗪的血清試樣用于校正來自所述筒的177Lu泄露。關(guān)于放射性衰減校正125I計(jì)數(shù)并然后計(jì)算177Lu/125I比。177Lu/125I比的減小表明小鼠血液試樣中存在的過量177Lu-四嗪和125I-CC49-TCO之間更低的反應(yīng)產(chǎn)率，并且因此表明所述TCO基團(tuán)的體內(nèi)失活。圖24作為%完好TCO示出了177Lu/125I比隨著時(shí)間的變化(t=0時(shí)歸一化為100%)。值得注意的是，mAb注射后不超過48小時(shí)所述TCO44b基團(tuán)看起來在體內(nèi)是完全穩(wěn)定的(97.8±1.6%完好TCO)，而在更晚的時(shí)間點(diǎn)觀察到一些降解(注射mAb4天后為80.4±1.8%完好TCO)。實(shí)施例19177Lu-四嗪28在用CC49-TCO44b預(yù)靶向的攜帶腫瘤的小鼠中的生物分布用125I-CC49對(duì)攜帶腫瘤的小鼠(見方法部分；100mm3腫瘤尺寸；n=4)進(jìn)行注射(100μg每小鼠，約0.2MBq)，所述125I-CC49用7.5TCO44b基團(tuán)官能化。注射mAb三十和48小時(shí)后，小鼠接受一個(gè)劑量的清除劑(半乳糖-MSA-四嗪，160μg/劑量)接著2小時(shí)后使其接受177Lu-四嗪28(相對(duì)于所述mAb為10當(dāng)量，約0.5MBq)。注射四嗪三小時(shí)后，麻醉所述小鼠并通過頸脫位處死，通過心臟穿刺抽取血液，采收感興趣的器官和組織并剝離干。稱重所有收集的試樣并加入1mLPBS。在γ-計(jì)數(shù)器中采用雙同位素方案(對(duì)于125I為10-80keV窗口和對(duì)于177Lu為155-380keV窗口)連同標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定試樣放射性以確定每克組織的百分比注射劑量(%ID/g)。生物分布數(shù)據(jù)顯示125I-CC49-TCO44b的高腫瘤攝取。所述腫瘤攝取高于用其它TCO結(jié)構(gòu)(見下文)獲得的那些，合理地是因?yàn)橛?.5TCO-44b基團(tuán)官能化的CC49的長(zhǎng)血液循環(huán)。相反，由于給予了兩劑量的清除劑，所述清除劑捕捉循環(huán)CC49-TCO并將其導(dǎo)向肝臟，在那里其被迅速代謝，因此在所有其它器官中mAb保留都是低的。作為腫瘤中較高mAb攝取的結(jié)果，177Lu-四嗪的攝取也明顯高于在先前實(shí)驗(yàn)中獲得的那些(見下文)。而且，由于在給予四嗪之前的追蹤步驟(chasestep)中除去了非腫瘤結(jié)合的CC49-TCO，在所有其它器官中的177Lu攝取是可忽略的。作為四嗪尿排泄的結(jié)果只有腎臟呈現(xiàn)相當(dāng)高的177Lu保留。這導(dǎo)致除腎臟外在所有考慮的器官中高的靶對(duì)非靶比。值得注意的是，腫瘤和血液中存在的34±4%和10±1%的TCOs已經(jīng)分別與四嗪反應(yīng)。表12：注射177Lu-四嗪28(8.5μg/80μL每小鼠，約0.5MBq)3小時(shí)后，給予125I-CC49-TCO-44b(100μg/100μL每小鼠，約0.2MBq)50小時(shí)后的雙同位素生物分布數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以%ID/克±SD或腫瘤/器官比±SD(n=4)給出。