本發(fā)明涉及醫(yī)療技術領域，具體涉及茶氨酸及其與6-氟-4-羥基香豆素混合物在制備預防和治療腫瘤、炎癥和心腦血管病及免疫缺陷等疾病抑制劑中的應用。

背景技術：
人胰腺癌、宮頸癌、胃癌和雌激素受體陰性的人乳腺癌等惡性腫瘤的非正常生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是導致每年數(shù)以萬記患者死亡的重要原因，其發(fā)病也保持一定的水平，已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的重大疾病。由于臨床化療和放療的毒副作用，限制了對其有效的防治。茶氨酸(又名谷氨酰乙胺)為茶葉中一種表明其品質(zhì)優(yōu)劣的特征性氨基酸，由于是無毒副作用的食品成分，使其成為無限制用量的食品添加劑，香豆素也證明在每日7克食用無毒副作用，使其得以廣泛用于食品工業(yè),研究表明：茶氨酸能夠增高抗癌藥物在腫瘤中的濃度而協(xié)同增效治療人卵巢癌(Sadzukietal.,ToxicolLett.123:159-67,2001)。我們先前的實驗證明茶氨酸有抑制肝癌和肺癌的作用(Liu，etal.,Cytotechnology59:211-217,2009；Zhangetal.BiosciBiotechnolBiochem.2002,66(4):711-6.)。組蛋白轉(zhuǎn)甲基酶EZH2抑制劑和蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑如SAHA(suberoylanilidehydroxamicacid)，valproicacid,和sodiumbutyrate等已經(jīng)在美國進行了I期或II期血液和實體腫瘤臨床試驗,EZH2和HDAC在多種人的癌癥包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、腸癌和肝癌等惡 性腫瘤中過度表達，美國對其作用抗癌藥物靶點進行了大量的研究，這些EZH2抑制劑和HDAC抑制劑被廣泛應用于各種腫瘤疾病的治療中，被認為是應用前景較好的潛在的新型抗癌藥物(Yamaguchietal.,CancerSci.,10:355-62,2010；Denis,etal.,ClinExpMetastasis25:183–189,2008；Kellyetal.,NatClinPractOncol2:150–157,2005；Martínez-Iglesiasetal.,ClinTranslOncol.10:395-8,2008)。核蛋白因子NF-κB被認為是促進多種腫瘤和炎癥及心腦血管、免疫缺陷病等疾病的蛋白因子，正成為防治這類疾病的重要藥物靶點(Ishiietal.,JClinBiochemNutr.50:91-105,2012)。高水平的受體VEGFR、EGFR和c-Met、非正常高表達的腫瘤信號傳導相關的蛋白因子K-Ras,H-Ras，Akt，CyclinD1,β-catenin和Bcl-2與多種腫瘤發(fā)生和惡化發(fā)展相關，而上調(diào)腫瘤抑制蛋白p53，p21，E-cadherin，Caspase3，Bax和胞漿細胞色素C水平顯示了對多種癌細胞生長、侵襲和(或)轉(zhuǎn)移的抑制作用(Cengel,etal.,Neoplasia9:341-8,2007；Huangetal.,BiochemPharmacol.77:794-803,2009；Prasadetal.,Oncology.73:112-7,2007)，因此，這些癌癥相關因子成為潛在的防治癌癥的重要藥物靶點，能夠有效地影響這些蛋白因子表達水平和活性的化合物具有廣泛防治癌癥的應用前景。本發(fā)明提供的茶氨酸具有顯著的影響上述一系列蛋白因子的水平和活性，在制備預防和治療腫瘤、炎癥、心腦血管疾病和免疫缺陷病等疾病抑制劑的應用中應該有廣闊的前景。

技術實現(xiàn)要素：
1、本發(fā)明的目的是提供茶氨酸及其與6-氟-4-羥基香豆素混合物在制備預防 和治療腫瘤的炎癥及心腦血管等疾病抑制劑中的應用。2、本發(fā)明提供茶氨酸在制備組蛋白轉(zhuǎn)甲基酶EZH2抑制劑中的應用。3、本發(fā)明提供茶氨酸在制備組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑中的應用。4、本發(fā)明提供茶氨酸在制備促腫瘤、炎癥和心腦血管病及免疫缺陷等疾病相關的因子NF-κB抑制劑中的應用。5、本發(fā)明提供茶氨酸在制備腫瘤、炎癥和心腦血管病及免疫缺陷等疾病相關的因子VEGFR，EGFR,c-Met,K-Ras,H-Ras，Akt,CyclinD1,β-catenin,Bcl-2/Bax抑制劑和上調(diào)p53，p21，E-cadherin,Caspase3,胞漿與線粒體細胞色素C之比激活劑中的應用。6、茶氨酸(theanine)和6-氟-4-羥基香豆素(6-Fluoro-4-hydroxycoumarin)的化學結構式如下：7、茶氨酸(編號：660981)和6-氟-4-羥基香豆素(編號：543748)可購自美國Sigma公司(網(wǎng)址：http://www.sigmaaldrich.com)，Sigma公司提供的化合物庫中的化合物。8、細胞系和細胞培養(yǎng)：人胰腺癌PANC-1和人宮頸癌Hela(epitheloidcarcinomaHela)購于美國AmericanTypeCultureCollection。PANC-1和Hela細胞分別用DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；9、儀器設備：二氧化碳培養(yǎng)箱：3111型，美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡：TE2000-U型，日本Nikon公司。倒置顯微鏡：CKX31型，日本Olympus公司；臺式高速冷凍離心機：5810R型，德國Eppendorf公司；微量加樣器：德國Eppendorf公司；細胞培養(yǎng)塑料平板(96孔)：BD公司；酶標儀：SYNERGYHT型，美國BIO-TEK公司；制冰機：XB70型，GRANT公司。具體實施方式下面結合實例及附表對本發(fā)明進行詳細描述。(一)實施例1：茶氨酸及其與6-氟-4-羥基香豆素混合物體外抑制癌細胞生長抑制實驗：實驗采用MTT法測試茶氨酸及其與6-氟-4-羥基香豆素混合物在體外條件下對癌細胞生長的抑制作用。步驟如下：1、主要試劑、細胞系和儀器:人胰腺癌PANC-1和人宮頸癌Hela細胞系和儀器如上所述。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)液：Hyclone公司；已滅活胎牛血清：Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％臺盼藍：Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：Sigma公司；2、實驗步驟:(1)用0.25％的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的癌細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，以100μl每孔接種于96孔培養(yǎng)板；(2)將培養(yǎng)板移入37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入茶氨酸16-1000μM/L、6-氟-4-羥基香豆素或茶氨酸與6-氟-4-羥基香豆素混合物(1-1000μM/L)，或陽性藥物對照(環(huán)磷酰胺CTX)，其終濃度為16-1500 μM/L。設對照孔(只加細胞懸液200μl)和無藥物空白對照孔(含溶媒0.01％DMSO)，每組均設8個復孔，置37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；(3)分別于加藥48h、72h后取出96孔板，小心吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100μl無血清的DMEM培養(yǎng)基及10μlMTT(5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，終止培養(yǎng)；(4)小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150lDMSO，室溫震蕩10-15min，使結晶充分溶解。(5)比色：選擇570nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光值(A值)，記錄結果；(6)實驗重復3次；(7)實驗結果按下式計算：相對存活率＝(各實驗組A值/細胞對照組A值)×100％中效濃度(IC50，即抑制率為50％時的藥物濃度，又稱半數(shù)抑制濃度)的計算：用回歸方程求出茶氨酸的IC50。3、實驗結果(見表1)表1茶氨酸單獨和與6-氟-4-羥基香豆素協(xié)同抑制人癌細胞的生長作用注：*p＜0.05；有關MTT測試細胞生長的方法見上述實驗方法部分?！鞛椴璋彼?T)、6-氟-4-羥基香豆素(X)或T+X處理48小時抑制50％癌細胞成活的藥物濃度(IC50)。(二)實施例2：茶氨酸及其與香豆素混合物體外抑制癌細胞侵襲抑制實驗：1、主要試劑、細胞系和儀器:人胰腺癌PANC-1和人宮頸癌Hela細胞系和儀器如上所述。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)液：Hyclone公司；已滅活胎牛血清：Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；碘化丙啶(PI)：美國Sigma公司。Matrigel、Fibronectin：美國BD公司；TranswellChamber：美國Costar公司；細胞培養(yǎng)塑料平板(24孔)：BD公司。2、實驗步驟:(1)將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，分別將Fibronectin和Matrigel按100μl/孔均勻地鋪在經(jīng)小室底部聚碳酯膜上，37℃孵育2h后置超凈工作臺中風干；(2)收集細胞，上室按5×105/ml密度加入100μl細胞懸液并同時加入不同濃度的茶氨酸(1-16μM/L)或茶氨酸與6-氟-4-羥基香豆素混合物(1-30μM/L)，或陽性藥物對照(環(huán)磷酰胺CTX)，其終濃度為10-50μM/L，設無藥物空白對照孔(含溶媒0.01％DMSO)，下室加入660μl含10％FBS的培養(yǎng)液，37℃孵育16h；(3)取出小室，加入冷甲醇固定后風干；(4)PI染色1h，去除沒有遷移或侵襲的細胞，于200倍顯微鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每膜計數(shù)上中下左右5個不同視野的透過細胞數(shù)，計算平均值，每組平行設3孔。以侵襲細胞的相對數(shù)目分別表示腫瘤細胞的侵襲能力；實驗結果按下式計算：侵襲抑制率＝(l－實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù))×100％。用回歸方程求出茶氨酸的IC50。3、實驗結果實驗結果(見表2)表2茶氨酸單獨和與6-氟-4-羥基香豆素協(xié)同抑制人癌細胞的侵襲作用注：*p＜0.05；有關測試方法見上述實驗方法部分?！鞛榘┘毎?jīng)茶氨酸(T)、6-氟-4-羥基香豆素(X)或T+X處理16小時達到50％侵襲抑制率作用的藥物濃度(IC50)。(三)實施例3：茶氨酸抑制裸鼠體內(nèi)人癌移植瘤生長作用的實驗1、實驗動物，細胞系，主要試劑和儀器:SPF級BALB/c裸小鼠，4～5周齡，18～22g，雄性，購自北京華阜康實驗動物中心，動物許可證號SCXK(京)2009-0004,飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室；IVC獨立送回風籠,蘇州蘇杭科技器材有限公司；人胰腺癌PANC-1和人宮頸癌Hela細胞系和其它儀器如上所述。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)液：Hyclone公司；已滅活胎牛血清：Hyclone公司，-20℃保存；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％臺盼藍：Sigma公司；2、實驗步驟:(1)細胞培養(yǎng)和移植性腫瘤動物模型的建立：人胰腺癌PANC-1和人宮頸癌Hela癌細胞株分別培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細胞并制備成濃度為2×107個/ml的單細胞懸液，于超凈工作臺內(nèi)每只裸小鼠于左右大腿部(對PANC-1細胞移植)或右大腿部(對Hela細胞移植)皮下分別接種0.1ml細胞懸液,每天觀察各注射點有無紅腫破潰。約2周后，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，所有裸鼠均出現(xiàn)直徑約8-10mm的皮下結節(jié),移植瘤模型建立；(2)裸鼠分組和給藥：于接種第約2周后將已建立皮下移植瘤模型的裸小鼠隨機分為3組，每組7只；陰性對照組(溶媒DMDO0.05％，腹腔注射0.2ml/只，每2-3日一次；陽性對照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺(25mg/kg)，茶氨酸組，腹腔注射茶氨酸(25mg/kg)，每2-3日一次(PANC-1腫瘤每2日一次；Hela腫瘤每3日一次)；對PANC-1移植瘤用藥治療22天，對Hela移植瘤用藥治療29天；對于檢測藥物對體內(nèi)腫瘤EZH2H和DAC酶酶活性的影響，在用藥6小時后分別切除腫瘤，分別提取總蛋白和提取核蛋白用于酶活性檢測分析，用陰性對照為DMSO(0.05％)溶媒、陽性對照SAHA(suberoylanilidehydroxamicacid)25mg/kg鼠)或化合物茶氨酸(T/25mg/kg鼠)處理小鼠6小時后取瘤，總蛋白和核蛋白提取物由總蛋白裂解液和核蛋白裂解液提取(總蛋白裂解液、核蛋白裂解液以及PMSF購于碧云天生物技術研究所)，1mg腫瘤組織加人1mL裂解液中加入10μlPMSF，反復吹打混勻，冰上放置15min；將樣品轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中，14000r/min，4℃離心10min，將上清蛋白提取物轉(zhuǎn)移到無菌EP管中用于檢測酶活性。(3)裸鼠腫瘤瘤體生長的觀察：每天觀察裸鼠的活動情況(包括進食、大小便性狀、精神狀態(tài)等)、移植瘤的出瘤時間及生長情況，每2-3天測量一次體重、瘤體的大小，用游標卡尺量瘤體的長徑a及短徑b(mm)，計算其體積，體積V＝π1/2·ab2(mm3)；(4)動物的處死：治療實驗結束，麻醉小鼠，照相；斷頸處死裸鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，稱取瘤重；檢測藥物對各器官和組織的病理和毒性影響情況。(5)通過實驗組移植瘤的瘤重與空白對照組瘤重相比較計算抑瘤率，即抑瘤率(％)＝(1-實驗組平均瘤重/對照平均瘤重)×100％。3.實驗結果(見表3)表3茶氨酸對三種人癌動物移植瘤體內(nèi)生長的抑制作用*注：*p＜0.05；有關測試方法見上述實驗方法部分?！煲种坡剩ナ桥cDMSO溶媒對照組相比較、對腫瘤重量的抑制率(％)。動物病理和毒理學分析結果表明：在實驗期間，我們使用茶氨酸處理處理正常的動物和治療的人癌移植瘤裸鼠，未見茶氨酸產(chǎn)生毒副作用，體重未見減少，心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、生殖腺、腦、骨骼肌未見毒性。陽性對照藥物環(huán)磷酰胺組小鼠有毒性反應，表現(xiàn)體重下降、厭食、用藥2周后出現(xiàn)腹部腫脹和行動避緩等現(xiàn)象。(四)實施例4：茶氨酸對動物體內(nèi)EZH2酶活性抑制作用實驗；1、實驗動物，細胞系、儀器和主要試劑、:實驗動物裸小鼠，細胞系和儀器詳見上述(四)動物實驗部分。EZH2AssayKit，購自BPSBioscience公司。檢測茶氨酸對EZH2酶活性的抑制作用，實驗方法嚴格按照試劑盒附帶的說明書操作,步驟如下：2、實驗步驟：(1)向微孔板中每個反應孔中加入150μl的TBST緩沖液,室溫下孵育15min,甩去緩沖液；(2)按照說明,配制S-腺苷甲硫氨酸和EZH2酶工作液,操作始終在冰浴上進行；(3)按照說明書所注明的比例,配制空白對照品,底物對照品,陽性對照品和抑制劑對照品；(4)將配制好的各對照品和待測試的樣品(各組腫瘤蛋白提取物取代EZH2酶)分別加入反應孔中,50μl/孔,室溫下反應1h,每個樣品均設2個平行孔；各組腫瘤蛋白提取物獲得方法詳見如上(四)動物實驗部分。洗板封閉:每個反應孔加入200μlTBST緩沖液洗板,重復3次；再向每個反應孔加入100μl封閉緩沖液,搖床上搖動封閉10min,棄去液體；(5)將稀釋好的一抗工作液加入反應孔中,100μl/孔,搖床上反應1h；(6)洗板封閉,同操作(5)；(7)將稀釋好的HRP標記的二抗工作液加入反應孔中,100μl/孔,搖床上反應30min；(8)洗板封閉,同操作(5)；(9)將HRP化學發(fā)光底物A和B在冰浴上等體積混合均勻后,加入反應孔中,100μl/孔；(10)立即在酶標儀上讀取熒光數(shù)值3、實驗結果(見表4)表4茶氨酸對體內(nèi)調(diào)節(jié)與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、心腦血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎癥等密切相關酶活性的影響注：*p＜0.05；有關測試方法見上述實驗方法部分。H3和H4乙酰化水平(％)通過WesternBlotting分析獲得，方法詳見如下(七)實施例6部分內(nèi)容。(五)實施例5：茶氨酸對組蛋白脫乙?；?HDAC)酶活性抑制作用的實驗；1、實驗動物，細胞系、儀器和主要試劑實驗動物裸小鼠，細胞系和儀器詳見上述(四)動物實驗部分。EpiQuikHDACActivity/InhibitionAssayKit(Colorimetric)，Epigentek公司；EpiQuikNuclearExtractionKit，Epigentek公司；2、實驗步驟：(1)嚴格按照EpiQuikNuclearExtractionKit說明書的操作要求，制備藥物處理的腫瘤核提取物見上述(四)動物實驗部分；每個樣品均設2個平行孔；(2)在每個反應孔中加入樣品稀釋液50μll,封板膜封板后室溫下反應30min；(3)小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液150μl，靜置30秒后棄去，如此重復2次，拍干；(4)將2μl的HDAC酶或腫瘤組織核提取物分別與28μl的樣品稀釋液混勻,加入孔中,封板膜封板后37℃下反應60min；(5)洗板3次，操作同(2)；將稀釋好的捕捉抗體工作液加入到每個反應孔中,50μl/孔,室溫下在搖床上反應60min；(6)洗板4次，操作同(2)；(7)將稀釋好的檢測抗體工作液加入到每個反應孔中,50μl/孔,室溫下反應30min；(8)洗板5次，操作同(2)；加入顯色劑,100μl/孔,室溫下避光顯色2-10min；(9)當標準品孔的顏色變?yōu)橹械葟姸鹊乃{色時,每孔加入50μl的終止液終止反應,此時藍色立轉(zhuǎn)黃色；(10)450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行；(12)酶活性抑制率按照以下公式計算:抑制率％＝[1-(OD陽性對照-OD樣品)/(OD陽性對照-OD空白對照)]*100％3、實驗結果(見表4)(六)實施例6：茶氨酸對多種腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、心腦血管疾病和免疫缺陷疾病以及炎癥等等密切相關蛋白因子水平調(diào)控作用實驗應用WesternBlotting法檢測茶氨酸對以下腫瘤相關蛋白因子水平調(diào)控作用，步驟如下：1、主要試劑和儀器:抗體：VEGFR，EGFR,c-Met,K-Ras,H-Ras，Akt,CyclinD1,β-catenin,Bcl-2,Bax,p53，p21，E-cadherin,Caspase3蛋白一抗購于美國CellSignalingTechnology公司和SantaCruzTechnology公司；H3乙?；?、H4乙?；虷DAC(HDAC3和HDAC4等)AntibodySampleKit抗體購自美國CellSignalingTechnology公司。RPMI-1640,DMEM培養(yǎng)液和已滅活胎牛血清購于Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)購于Amersco公司；蛋白質(zhì)分子Marker、0.4％臺盼藍：購于美國Sigma公司；PVDF膜購于Millipore公司；總蛋白裂解液和核蛋白裂解液以及PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液購于碧云天生物技術研究所；二抗：辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、辣根過氧化物酶標記驢抗山羊、彩色預染蛋白分子量標準、ECLPlus發(fā)光試劑盒、定影粉、顯影粉購于碧云天生物技術研究所；醫(yī)用X射線膠片購于柯達公司。2、實驗步驟:(1)細胞處理：取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞密度長至70％～80％左右，分別向細胞中加入茶氨酸和環(huán)磷酰胺，使其終濃度分別為16-1500μM/L，另設無藥物含溶媒(0.01％DMSO)等體積細胞培養(yǎng)液的對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞；(2)細胞蛋白提?。河美銹BS洗2次后，用總蛋白或核蛋白細胞裂解液裂解細胞，1mL裂解液中加入10μlPMSF，反復吹打混勻，冰上放置15min；將樣品轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中，14000r/min，4℃離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到無菌EP管中，-80℃保存；(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：使用等量的蛋白裂解液樣品分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉、先后分別使用適當?shù)囊豢购投固幚?、洗膜之后、用ECL試劑盒顯色，X光片曝光檢測印跡蛋白條帶；用Gel-ProAnalyzer進行灰度定量分析，對照與藥物處理各濃度組分別與各自的內(nèi)參的光密度值相比，所得的比值分別與對照組相比，半定量蛋白表達水平。3、實驗結果(見表5和表6)表5茶氨酸抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、心腦血管疾病免疫缺陷疾病以及炎癥等密切相關的蛋白因子注：p＜0.05；有關測試方法見上述實驗方法部分。表中有關蛋白因子均分別來自于由茶氨酸或環(huán)磷酰胺或DMSO溶媒處理的人胰腺癌PANC-1、人宮頸癌Hela、人胃癌BGC-823和人乳腺癌MDA-MB-231等細胞系的蛋白裂解液，用Westernblotting檢測分析的結果。表6茶氨酸對與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、心腦血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎癥等密切相關蛋白因子水平和酶活性的影響注：*p＜0.05；有關測試方法見上述實驗方法部分。#:有關腫瘤抑制蛋白p53、細胞周期抑制蛋白p21、細胞凋亡水解酶Caspase-3、細胞胞漿與線粒體細胞色素C之比和細胞粘附蛋白E-cadherin均分別來自于由茶氨酸或環(huán)磷酰胺或DMSO溶媒處理的人胰腺癌PANC-1、人宮頸癌Hela、人胃癌BGC-823和人乳腺癌MDA-MB-231等細胞系的蛋白裂解液，用Westernblotting檢測分析的結果。(七)實施例7：茶氨酸對核蛋白因子NF-κB(p65)-DNAbinding活性抑制作用體外實驗(EMSA)1、主要試劑和儀器:化學發(fā)光法EMSA試劑盒：美國PierceBiotechnology公司；生物素標記EMSA探針NF-κB:美國PierceBiotechnology公司；蛋白質(zhì)分子Marker和0.4％臺盼藍：美國Sigma公司；PVDF膜：Millipore公司；核蛋白裂解液、PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液：碧云天生物技術研究所彩色預染蛋白分子量標準、ECLPlus發(fā)光試劑盒、定影粉、顯影粉：碧云天生物技術研究所。醫(yī)用X射線膠片：柯達公司。2、實驗步驟:分別用16-500μM/L的茶氨酸、50-1000μM/L環(huán)磷酰胺和DMSO(0.01％)處理PANC-1細胞和Hela細胞48小時后獲得細胞核蛋白提取物，方法詳見(七)實施例6實驗部分內(nèi)容。NF-κB(p65)-DNAbinding活性抑制作用體外實驗應用美國PierceBiotechnology公司的化學發(fā)光法EMSA試劑盒，實驗方法嚴格按照試劑盒的說明書操作，具體步驟如下：(1)EMSA膠的配制EMSA膠的配制如下表所示。藥物處理的細胞經(jīng)核蛋白提取液(碧云天生物技術研究所提供)提取后的核蛋白提取物10微克/管分別用于如下所示的樣品反應和電泳檢測分析。表7-1關于4％聚丙烯酰胺凝膠的配制(2)預電泳：將膠固定在電泳槽中，加滿0.5×TBE電泳緩沖液，按照10V/厘米的電壓電泳90分鐘。探針結合反應如下：表7-2陰性對照反應表7-3樣品反應按照上表依次加在EP管中，混勻室溫靜置15分鐘，消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結合。分別加入生物素標記的探針NF-κB1μl，室溫靜置20分鐘。(3)電泳：換新鮮的0.5×TBE電泳緩沖液，按照10V/厘米的電壓電泳1.5小時，確保膠的溫度不超過30℃。(4)轉(zhuǎn)膜：EMSA膠上核蛋白因子與結合的探針轉(zhuǎn)到尼龍膜過程是在380mA冰浴中電轉(zhuǎn)40分鐘。(5)紫外交聯(lián)：將尼龍膜放在254nm的紫外燈下照射15分鐘。(6)化學發(fā)光法檢測生物素標記探針：取封閉液封閉交聯(lián)過的尼龍膜、按試劑盒要求對處理的膜X光片曝光、顯影和定影，分析結果。3、實驗結果表8茶氨酸對與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、心腦血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎癥等密切相關核蛋白因子NF-κB(p65)與DNA活性的抑制作用