本發(fā)明涉及一種靶向納米微泡的制備方法，該納米微泡可以通過被動和主動兩種靶向效應(yīng)準確定位到葉酸受體高表達的腫瘤細胞，并被腫瘤細胞攝取，從而實現(xiàn)該腫瘤細胞的特異性超聲分子成像，屬于醫(yī)療藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
超聲檢查由于其無創(chuàng)無輻射、操作方便、價格低廉、對設(shè)備場地要求低等優(yōu)勢，是臨床診斷腫瘤的重要手段，超聲造影在多年的臨床應(yīng)用中已經(jīng)證實在腫瘤的檢出和定性診斷中有著重要的意義。超聲造影優(yōu)于常規(guī)造影，與CT、MRI相比擁有更多的優(yōu)越性。安全高效的超聲造影劑是超聲造影的基礎(chǔ)與關(guān)鍵，目前臨床常用的是二代微泡造影劑SonoVue即脂質(zhì)微泡造影劑，但長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)其對腫瘤組織的特異性不強，對病變組織缺乏親和力，并且由于微泡粒徑大多集中在2～10μm范圍內(nèi)(平均粒徑為3～5μm)，而毛細血管內(nèi)皮間隙約為380～780nm，因此微米級微泡是無法穿透血管內(nèi)皮間隙而到達腫瘤組織中，實際為微血管的非特異性顯影，缺乏血管外腫瘤組織細胞的特異性；盡管多數(shù)腫瘤的血供豐富，然而對于乏血供的腫瘤就容易漏檢，這大大限制了聲學顯像對于腫瘤鑒別診斷的效能。近來研究者們開始了靶向超聲微泡(第三代微泡造影劑)的研究，靶向超聲造影劑是將特異性抗體或配體連接到聲學造影劑表面，依靠抗原-抗體/配體-受體之間特異性識別并結(jié)合，通過血液循環(huán)積聚到帶有相應(yīng)抗原/受體的靶器官或靶組織，從而使器官或組織在超聲檢查中得到特異性增強。與普通微泡相比，靶向超聲造影通過特異性作用于病變區(qū)生物分子組成成分，來突出顯示病變部位，從而提高超聲診斷的準確性與敏感性。研究表明，腫瘤細胞膜表面或腫瘤供應(yīng)血管表面存在著一些受體并在腫瘤組織中存在異常表達，與相應(yīng)配體或配體類似物能特異結(jié)合。受體與配體的結(jié)合具有特異性、選擇性、飽和性、親合力強和生物效應(yīng)明顯的特點，為腫瘤的靶向診治提供了靶向途徑。其中葉酸受體(folatereceptor,FR)是目前研究較多的一種，其是一種糖基化磷脂酰肌醇(GPI)連接的膜糖蛋白，與葉酸(FA)具有高親和力，可通過受體介導的內(nèi)吞作用將葉酸(FA)攝入細胞胞漿。葉酸受體(FR)在正常組織中的表達高度保守，F(xiàn)Rα主要在上皮細胞系腫瘤(如卵巢癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、腦瘤、肺腺癌等)中高水平表達。雖然在正常細胞中FR可選擇性的表達在細胞表面但是其呈極性分布，血液循環(huán)中的靶向制劑不能接近該受體，亦不能進入正常細胞，而惡性腫瘤細胞中FR分布失去極性，血液循環(huán)中的靶向制劑可接觸該受體。與大分子抗體相比，葉酸(FA)屬于小分子物質(zhì)，F(xiàn)A-FR的配體/受體結(jié)合具有高親和力(Kd＝10-10mol/L)，化學性質(zhì)簡單，易于修飾，體積小(Mr＝441.4)，高度化學穩(wěn)定性和生物學穩(wěn)定性，與有機溶劑的生理相容性，低免疫原性，達到靶點時間短、血液清除速度快、穿透能力強、低成本等諸多優(yōu)點，使得FA成為腫瘤診斷和治療理想的靶向載體之一，并且FA的靶向作用已經(jīng)在核素PET-CT、MRI的靶向顯像中得到證實。經(jīng)檢索，利用有序超分子膜層層自組裝原理，構(gòu)建葉酸受體介導的靶向納米超聲造影劑未見文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種新型應(yīng)用于腫瘤細胞超聲分子成像的葉酸受體靶向超聲造影納米微泡的制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種葉酸受體靶向超聲造影納米微泡的制備方法，該納米微泡由核心模板和外殼構(gòu)成，其特征在于所述的核心模板為液態(tài)氟碳納米乳化劑，所述的外殼為葉酸接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物，所述的液態(tài)氟碳納米乳化劑包括如下組分及質(zhì)量體積百分比濃度：全氟辛溴烷2.895％～4.825％；甘油2.25％～2.5％；泊洛沙姆1880.4％～0.8％；油酸0.15％～0.25％；蛋黃卵磷脂2.2％～2.6％；其余為水，包括如下步驟：①將甘油、泊洛沙姆188、油酸、蛋黃卵磷脂及超純水混合配成乳化劑混懸液，將全氟辛溴烷加入到乳化劑混懸液渦旋混合后，在超聲波作用下，形成核心模板材料；②配置葉酸接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物，形成外殼材料；③將核心模板材料逐滴加入到外殼材料中并磁力旋轉(zhuǎn)攪拌，離心，純化水洗，滅菌，過濾，得到產(chǎn)物；所述超聲滿足如下條件：超聲用時5～15分鐘，超聲啟動5～15秒，間隔時間5～15秒，超聲溫度20～30℃。進一步，步驟①中所述的核心模板材料通過如下步驟制得：將甘油、泊洛沙姆188、油酸及蛋黃卵磷脂渦旋混合于超純水中形成混懸液，該混懸液在30～40℃條件下孵育0.5小時至1.5小時，形成乳狀液；再渦旋混合下逐滴加入全氟辛溴烷，定容，超聲，離心，獲得納米乳化劑。進一步，步驟②中所述的外殼材料通過如下步驟制得：將葉酸(250～300mg)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(230～250mg)、N-羥基丁二酰亞胺(120～150mg)共同溶解于二甲基亞砜(5～6ml)中，20～30℃下反應(yīng)6～8小時，生成葉酸活性酯，過濾去除沉淀，備用；將α-羧基-ω-氨基聚乙二醇(0.8～1.2g)添加到上述的葉酸活性酯中，形成羧基-聚乙二醇-葉酸；將羧基-聚乙二醇-葉酸在無水嘧啶中孵育2～4小時，透析24～30小時，超純水透析48～50小時；過濾去除不溶物，冰凍干燥獲得產(chǎn)物羧基-聚乙二醇-葉酸；將殼聚糖(200～250mg)溶解于重量百分比為2％的醋酸水溶液(20～25ml)中，獲得殼聚糖醋酸水溶液，備用；將羧基-聚乙二醇-葉酸(200～250mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(20～25mg)、N-羥基丁二酰亞胺(10～15mg)溶解于二甲基亞砜中，預(yù)激活4～6小時，然后逐滴加入到前述的殼聚糖醋酸水溶液中，暗室中攪拌20～24小時直至反應(yīng)完成，生成的產(chǎn)物超純水透析72～80小時，脫水，冷凍真空干燥制得葉酸-聚乙二醇-殼聚糖干粉；用無水乙醇配制濃度為10mg/ml的異硫氰酸熒光素溶液10～15ml，嫁接于合成的葉酸-聚乙二醇-殼聚糖作為熒光示蹤劑，2％醋酸水溶液配制濃度為4～6mg/ml的葉酸-聚乙二醇-殼聚糖，磁力攪拌下將上述異硫氰酸熒光素溶液逐滴加入到上述步驟(2)制備的葉酸-聚乙二醇-殼聚糖的醋酸水溶液中，避光反應(yīng)2～3h，使兩者結(jié)合完成熒光標記，pH調(diào)整為9.0，離心去除上清，2％醋酸水溶液重懸至20ml，重復(fù)多次離心至上清無色，最后用1％的醋酸水溶液重懸沉淀，4-6℃葉酸-聚乙二醇-殼聚糖避光保存?zhèn)溆?進一步，所述步驟③如下：取制備的異硫氰酸熒光素-殼聚糖-聚乙二醇-葉酸醋酸水溶液用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5～6.5，取核心模板材料(2～3ml)，磁力攪拌下緩慢滴加入異硫氰酸熒光素-殼聚糖-聚乙二醇-葉酸醋酸水溶液中，攪拌，36～38℃孵育25～35mim，15000rpm～16000rpm高速冷凍離心(冷凍同時離心)，沉淀超純水清洗，滅菌，過濾去除雜質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：以液態(tài)氟碳納米乳化劑為核心模板，以葉酸接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物為外殼獲得的納米微泡具有穩(wěn)定性較佳、無體外毒性作用、靜脈注射生物相容性較好、具有較高特異性結(jié)合力的優(yōu)點。附圖說明圖1為實施例1中液態(tài)氟碳核心模板乳劑的強度-粒徑分布圖；圖2為實施例1中液態(tài)氟碳核心模板乳劑的Zeta電位分布圖；圖3為實施例1中液態(tài)氟碳核心模板乳劑的普通光鏡圖像(400×)；圖4為實施例1中液態(tài)氟碳核心模板乳劑的透射電鏡圖像(80000.0V-120000×)；圖5為實施例1中DMSO測得的FA和FA-PEG-COOH的氫核磁共振波譜圖；圖6為實施例1中CS.0、FA-PEG-COOH、FA-PEG-CS的紅外光譜圖；圖7為實施例1中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的強度-粒徑分布圖；圖8為實施例1中熒光分光光度計檢測葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的熒光吸收情況；圖9為實施例1中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的透射電鏡圖像(80000.0V-120000×)；圖10為實施例5中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的體外安全性評價數(shù)據(jù)；圖11為實施例5中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的體外靶向熒光成像圖；圖12為實施例5中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的靶向攝取流式細胞檢測圖；圖13為實施例5中葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的體外超聲成像圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1，葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡核心模板納米乳劑的制備。稱取0.1125g甘油(2.25％(w/v))作為等滲調(diào)劑劑和助乳化劑，與乳化劑0.12g精制蛋黃卵磷脂(2.4％,w/v)和0.03g泊洛沙姆188(0.6％,w/v)及穩(wěn)定劑0.01g油酸(0.2％,w/v)渦旋混合于4ml超純水中形成混懸液，將制備的混懸液放置于37℃振蕩孵育1h制成乳狀液，再渦旋混合下逐滴加入100μl全氟辛溴烷，超純水定容至5ml，裝入15ml康寧離心管中，迅速上機超聲，溫度控制在20～30℃，以40％超聲強度作用10min，超聲啟動10s，暫停10s,制得液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑，所獲得的液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑取1ml超純水稀釋10倍數(shù)后，將適量該溶液用動態(tài)光散射法測定其粒徑并使用激光粒度儀檢測未稀釋乳劑的Zeta電位，光學顯微鏡及透射電鏡進行表面形貌和構(gòu)成物質(zhì)觀察。圖1所示結(jié)果平均粒徑為(131.5±4.3)nm，其中300nm以下粒子強度占93.5％，PDI為(0.265±0.006)，電位分布曲線圖2所示，Zeta電位值為(－42.8±1)mV。pH計顯示酸堿度值為(6.73±0.11)符合靜注乳劑對pH的要求。PFOB(全氟辛溴烷)核心模板乳劑外觀呈勻勻半透明狀；如圖3所示為普通光學顯微鏡和圖4透射電鏡下觀察PFOB核心模板乳劑，外觀似球形，分布較勻勻。(2)FITC熒光標記的FA-PEG-CS合成。葉酸FA(264.84mg，0.6mmol)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺DCC(242.2mg，1.2mmol)和N-羥基丁二酰亞胺NHS(135.2mg，1.2mmol)共同溶解于二甲基亞砜DMSO中，室溫下反應(yīng)過夜(6－8h)，生成葉酸活性酯備用。α-羧基-ω-氨基聚乙二醇NH2－PEG－COOH(1g，0.32Mmol)溶于DMSO后加入至葉酸活性酯溶液形成FA－PEG一COOH。混合物在無水吡啶(1.2ml，14.72mmol)中室溫孵育2～4h，隨后DMSO透析(MWCO1000)24h，超純水透析48h。產(chǎn)物過濾去除不溶性產(chǎn)物，冰凍干燥獲得FA－PEG－COOH。殼聚糖(CS)(200mg)溶解于20ml2％的醋酸水溶液備用。FA－PEG－COOH(200mg,52umol)溶于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(20.6mg，0.1mmol)及NHS(11.5mg，0.1mmol)的5ml無水DMSO中預(yù)激活4h，而后逐滴加入到上述配制的殼聚糖(CS)溶液中,暗室中持續(xù)攪拌直至反應(yīng)完成大約20h。生成的產(chǎn)物用超純水透析(MWCO8－14KD)72h，透析脫水劑脫去多余的水份，至冷凍干燥儀真空干燥制得FA-PEG-CS干粉。用無水乙醇配制濃度為10mg/ml的FITC溶液10ml，2％醋酸水溶液配制濃度為5mg/ml的FA-PEG-CS20m1，磁力攪拌下將FITC溶液逐滴加入到FA-PEG-CS醋酸水溶液中，避光2h，配制1mol/LNaOH將反應(yīng)溶液pH調(diào)整為9.0，離心去除上清，2％醋酸水溶液重懸，重復(fù)多次離心至上清無色，最后用1％的醋酸水溶液定容至20ml重懸沉淀，4℃避光保存?zhèn)溆?。葉酸溶于DMSO中的1HNMR圖譜，各個峰的歸屬如圖5中所示a、b、c、d、e、f、g是識別葉酸的特征峰。FA-PEG-COOH的1HNMR圖譜，位于6.0～9.0ppm之間的三個峰e、d、g是葉酸的特征峰，而位于h處3.1ppm～3.8ppm的峰是聚乙二醇-(CH2-CH2)-重復(fù)單元中氫的位移,2.5ppm為溶劑DMSO的特征峰。位于FAρ苯環(huán)上的4個質(zhì)子在6.65ppm和7.55ppm處出現(xiàn)特征峰e、d可證實FA成功連接到PEG上。從圖6中可看出殼聚糖的O-H和-N-H伸縮振動吸收峰位于3446cm-1附近，1645cm-1和1607cm-1處吸收峰分別對應(yīng)殼聚糖酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶，連接FA-PEG-COOH后1100cm-1左右的峰明顯增強，且殼聚糖1604cm-1處的吸收峰減弱，F(xiàn)A-PEG-COOH1712cm-1處的吸收峰也隨之消失，在FA-PEG-CS取而代之的是在1561cm-1出現(xiàn)新的較強的特殊吸收峰，由此證明殼聚糖的氨基和FA-PEG-COOH的羧基發(fā)生聚合形成了酰胺鍵。如圖8所示用異硫氰酸熒光素標記殼聚糖從而獲得熒光效果，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長在490～495nm，發(fā)射波長在520－530nm。熒光分光光度計檢測譜顯示FITC一CS－PEG－FA合成物在492nm處有吸收峰，同時在518nm處有發(fā)射峰，證實FA－PEG－CS已成功標記上FITC。(3)層層自組裝構(gòu)建完整的靶向造影納米微泡及物理性質(zhì)測定。FITC－CS－PEG－FA配制成濃度為5％該物質(zhì)的醋酸水溶液，1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以體積比2：1的比例取PFOB納米乳劑核心，在磁力攪拌下緩慢滴加入FITC－CS－PEG－FA醋酸水溶液中充分攪拌，37度孵育30min，制得混懸液。將納米混懸液4度15000rpm高速冷凍離心10min，沉淀超純水清洗3次，經(jīng)低頻超聲在超純水中分散并經(jīng)0.45um的濾膜濾過去除較大雜質(zhì)。將最終合成的靶向納米超聲造影微泡用超純水稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)激光粒度儀測定平均粒徑及Zeta電位，pH計測定其酸堿度，透射電鏡觀察表面形貌。如圖7所示為所測得的FITC-CS-PEG-FA/PFOB超聲納米微泡粒徑，25℃條件下測量所得平均粒徑分別為(229.5±7.5)nm，PDI指數(shù)顯示為(0.205±0.014)，且相關(guān)數(shù)據(jù)顯示FITC-CS-PEG-FA/PFOB粒徑大多分布在91.28-615.1之間，小于500nm的粒子強度占到98.8％，Zeta電位平均值為(44.7±0.6)mV。由于包裹上了一層FA－PEG－CS使得其粒徑及電位與PFOB核心模板納米乳劑有顯著的差別。該納米粒子長時間保存后雖會出現(xiàn)分層，但輕搖后可混勻、大小無明顯變化。并通過透射電鏡對其進行了進一步觀察，如圖9所示粒子外層明顯包裹上一層殼聚糖并且粒子呈球形，大小較均一。實施例2，(1)制成葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡核心模板納米乳劑。稱取0.1125g甘油(2.25％(w/v))作為等滲調(diào)劑劑和助乳化劑，與乳化劑0.12g精制蛋黃卵磷脂(2.4％,w/v)和0.04g泊洛沙姆188(0.8％,w/v)及穩(wěn)定劑0.0125g油酸(0.25％,w/v)渦旋混合于4ml超純水中形成混懸液，將制備的混懸液放置于37℃振蕩孵育1h制成乳狀液，再渦旋混合下逐滴加入100μl全氟辛溴烷，超純水定容至5ml，裝入15ml康寧離心管中，迅速上機超聲，溫度控制在20-30℃，以40％超聲強度作用10min，超聲啟動10s，暫停10s,制得液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑，所獲得的液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑取1ml超純水稀釋10倍數(shù)后，將適量該溶液用動態(tài)光散射法測定其粒徑并使用激光粒度儀檢測未稀釋乳劑的Zeta電位，光學顯微鏡及透射電鏡進行表面形貌和構(gòu)成物質(zhì)觀察。所示結(jié)果平均粒徑為(145.5±5.6)nm，其中300nm以下粒子強度占90.3％，PDI為(0.196±0.008)，電位分布，Zeta電位值為(－45.2±2.5)mV。pH計顯示酸堿度值為(6.85±0.21)符合靜注乳劑對pH的要求。(2)FITC熒光標記的FA-PEG-CS合成。(3)層層自組裝構(gòu)建完整的靶向造影納米微泡及物理性質(zhì)測定。FITC－CS－PEG－FA配制成濃度為5％該物質(zhì)的醋酸水溶液，1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以體積比2：1的比例取PFOB納米乳劑核心，在磁力攪拌下緩慢滴加入FITC－CS－PEG－FA醋酸水溶液中充分攪拌，37度孵育30min，制得混懸液。將納米混懸液4度15000rpm高速冷凍離心10min，沉淀超純水清洗3次，經(jīng)低頻超聲在超純水中分散并經(jīng)0.45um的濾膜濾過去除較大雜質(zhì)。將最終合成的靶向納米超聲造影微泡用超純水稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)激光粒度儀測定平均粒徑及Zeta電位，pH計測定其酸堿度，透射電鏡觀察表面形貌。所測得的FITC-CS-PEG-FA/PFOB超聲納米微泡粒徑，25℃條件下測量所得平均粒徑分別為(238.8±8.2)nm，PDI指數(shù)顯示為(0.221±0.02)，且相關(guān)數(shù)據(jù)顯示FITC-CS-PEG-FA/PFOB粒徑大多分布在68.06.28-712.4之間，小于500nm的粒子強度占到92.2％，Zeta電位平均值為(45.1±0.6)mV。由于包裹上了一層FA－PEG－CS使得其粒徑及電位與PFOB核心模板納米乳劑有顯著的差別。該納米粒子長時間保存后雖會出現(xiàn)分層，但輕搖后可混勻、大小無明顯變化。并通過透射電鏡對其進行了進一步觀察，粒子外層明顯包裹上一層殼聚糖并且粒子呈球形，大小較均一。實施例3，制成葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡核心模板納米乳劑。稱取0.125g甘油(2.5％(w/v))作為等滲調(diào)劑劑和助乳化劑，與乳化劑0.11g精制蛋黃卵磷脂(2.2％,w/v)和0.04g泊洛沙姆188(0.8％,w/v)及穩(wěn)定劑0.0075g油酸(0.15％,w/v)渦旋混合于4ml超純水中形成混懸液，將制備的混懸液放置于37℃振蕩孵育1h制成乳狀液，再渦旋混合下逐滴加入125μl全氟辛溴烷，超純水定容至5ml，裝入15ml康寧離心管中，迅速上機超聲，溫度控制在20-30℃，以45％超聲強度作用10min，超聲啟動15s，暫停15s,制得液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑，所獲得的液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑取1ml超純水稀釋10倍數(shù)后，將適量該溶液用動態(tài)光散射法測定其粒徑并使用激光粒度儀檢測未稀釋乳劑的Zeta電位，光學顯微鏡及透射電鏡進行表面形貌和構(gòu)成物質(zhì)觀察。結(jié)果平均粒徑為(198.5±4.9)nm，其中300nm以下粒子強度占92.5％，PDI為(0.186±0.012)，電位分布曲線圖2所示，Zeta電位值為(－47.2±1.8)mV。pH計顯示酸堿度值為(6.65±0.32)符合靜注乳劑對pH的要求。(2)FITC熒光標記的FA-PEG-CS合成。(3)層層自組裝構(gòu)建完整的靶向造影納米微泡及物理性質(zhì)測定。FITC－CS－PEG－FA配制成濃度為5％該物質(zhì)的醋酸水溶液，1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以體積比2：1的比例取PFOB納米乳劑核心，在磁力攪拌下緩慢滴加入FITC－CS－PEG－FA醋酸水溶液中充分攪拌，37度孵育30min，制得混懸液。將納米混懸液4度15000rpm高速冷凍離心10min，沉淀超純水清洗3次，經(jīng)低頻超聲在超純水中分散并經(jīng)0.45um的濾膜濾過去除較大雜質(zhì)。將最終合成的靶向納米超聲造影微泡用超純水稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)激光粒度儀測定平均粒徑及Zeta電位，pH計測定其酸堿度，透射電鏡觀察表面形貌。所測得的FITC-CS-PEG-FA/PFOB超聲納米微泡粒徑，25℃條件下測量所得平均粒徑分別為(301.2±6.8)nm，PDI指數(shù)顯示為(0.235±0.05)，且相關(guān)數(shù)據(jù)顯示FITC-CS-PEG-FA/PFOB粒徑大多分布在105.07-955.4之間，小于500nm的粒子強度占到88.9％，Zeta電位平均值為(40.5±0.8)mV。由于包裹上了一層FA－PEG－CS使得其粒徑及電位與PFOB核心模板納米乳劑有顯著的差別。該納米粒子長時間保存后雖會出現(xiàn)分層，但輕搖后可混勻、大小無明顯變化。并通過透射電鏡對其進行了進一步觀察，粒子外層明顯包裹上一層殼聚糖并且粒子呈球形，大小較均一。實施例4，制成葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡核心模板納米乳劑。稱取0.125g甘油(2.5％(w/v))作為等滲調(diào)劑劑和助乳化劑，與乳化劑0.11g精制蛋黃卵磷脂(2.2％,w/v)和0.03g泊洛沙姆188(0.6％,w/v)及穩(wěn)定劑0.0075g油酸(0.15％,w/v)渦旋混合于4ml超純水中形成混懸液，將制備的混懸液放置于37℃振蕩孵育1h制成乳狀液，再渦旋混合下逐滴加入150μl全氟辛溴烷，超純水定容至5ml，裝入15ml康寧離心管中，迅速上機超聲，溫度控制在20-30℃，以35％超聲強度作用10min，超聲啟動10s，暫停10s,制得液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑，所獲得的液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑取1ml超純水稀釋10倍數(shù)后，將適量該溶液用動態(tài)光散射法測定其粒徑并使用激光粒度儀檢測未稀釋乳劑的Zeta電位，光學顯微鏡及透射電鏡進行表面形貌和構(gòu)成物質(zhì)觀察。結(jié)果平均粒徑為(204.1±3.5)nm，其中300nm以下粒子強度占87.8％，PDI為(0.258±0.013)，電位分布，Zeta電位值為(－40.1±3.4)mV。pH計顯示酸堿度值為(6.67±0.38)符合靜注乳劑對pH的要求。(2)FITC熒光標記的FA-PEG-CS合成(3)層層自組裝構(gòu)建完整的靶向造影納米微泡及物理性質(zhì)測定。FITC－CS－PEG－FA配制成濃度為5％該物質(zhì)的醋酸水溶液，1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以體積比2：1的比例取PFOB納米乳劑核心，在磁力攪拌下緩慢滴加入FITC－CS－PEG－FA醋酸水溶液中充分攪拌，37度孵育30min，制得混懸液。將納米混懸液4度15000rpm高速冷凍離心10min，沉淀超純水清洗3次，經(jīng)低頻超聲在超純水中分散并經(jīng)0.45um的濾膜濾過去除較大雜質(zhì)。將最終合成的靶向納米超聲造影微泡用超純水稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)激光粒度儀測定平均粒徑及Zeta電位，pH計測定其酸堿度，透射電鏡觀察表面形貌。所測得的FITC-CS-PEG-FA/PFOB超聲納米微泡粒徑，25℃條件下測量所得平均粒徑分別為(323.2±4.6)nm，PDI指數(shù)顯示為(0.229±0.12)，且相關(guān)數(shù)據(jù)顯示FITC-CS-PEG-FA/PFOB粒徑大多分布在105.07-1281之間，小于500nm的粒子強度占到85.7％，Zeta電位平均值為(47.2±1.5)mV。由于包裹上了一層FA－PEG－CS使得其粒徑及電位與PFOB核心模板納米乳劑有顯著的差別。該納米粒子長時間保存后雖會出現(xiàn)分層，但輕搖后可混勻、大小無明顯變化。并通過透射電鏡對其進行了進一步觀察，粒子外層明顯包裹上一層殼聚糖并且粒子呈球形，大小較均一。實施例5，制成葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡核心模板納米乳劑。稱取0.125g甘油(2.5％(w/v))作為等滲調(diào)劑劑和助乳化劑，與乳化劑0.13g精制蛋黃卵磷脂(2.6％,w/v)和0.02g泊洛沙姆188(0.4％,w/v)及穩(wěn)定劑0.01g油酸(0.2％,w/v)渦旋混合于4ml超純水中形成混懸液，將制備的混懸液放置于37℃振蕩孵育1h制成乳狀液，再渦旋混合下逐滴加入75μl全氟辛溴烷，超純水定容至5ml，裝入15ml康寧離心管中，迅速上機超聲，溫度控制在25℃，以35％超聲強度作用5min，超聲啟動15s，暫停15s,制得液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑，所獲得的液態(tài)氟碳核心模板納米乳劑取1ml超純水稀釋10倍數(shù)后，將適量該溶液用動態(tài)光散射法測定其粒徑并使用激光粒度儀檢測未稀釋乳劑的Zeta電位，光學顯微鏡及透射電鏡進行表面形貌和構(gòu)成物質(zhì)觀察。結(jié)果平均粒徑為(148.9±6.9)nm，其中300nm以下粒子強度占93.1％，PDI為(0.212±0.012)，電位分布，Zeta電位值為(－40.5±3.8)mV。pH計顯示酸堿度值為(6.77±0.35)符合靜注乳劑對pH的要求。(2)FITC熒光標記的FA-PEG-CS合成。(3)層層自組裝構(gòu)建完整的靶向造影納米微泡及物理性質(zhì)測定。FITC－CS－PEG－FA配制成濃度為5％該物質(zhì)的醋酸水溶液，1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以體積比2：1的比例取PFOB納米乳劑核心，在磁力攪拌下緩慢滴加入FITC－CS－PEG－FA醋酸水溶液中充分攪拌，37度孵育30min，制得混懸液。將納米混懸液4度15000rpm高速冷凍離心10min，沉淀超純水清洗3次，經(jīng)低頻超聲在超純水中分散并經(jīng)0.45um的濾膜濾過去除較大雜質(zhì)。將最終合成的靶向納米超聲造影微泡用超純水稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)激光粒度儀測定平均粒徑及Zeta電位，PH計測定其酸堿度，透射電鏡觀察表面形貌。如圖7所示為所測得的FITC-CS-PEG-FA/PFOB超聲納米微泡粒徑，25℃條件下測量所得平均粒徑分別為(248.6±5.5)nm，PDI指數(shù)顯示為(0.222±0.08)，且相關(guān)數(shù)據(jù)顯示FITC-CS-PEG-FA/PFOB粒徑大多分布在68.06-955.4之間，小于500nm的粒子強度占到91.6％，Zeta電位平均值為(39.8±1.3)mV。由于包裹上了一層FA－PEG－CS使得其粒徑及電位與PFOB核心模板納米乳劑有顯著的差別。該納米粒子長時間保存后雖會出現(xiàn)分層，但輕搖后可混勻、大小無明顯變化。并通過透射電鏡對其進行了進一步觀察，粒子外層明顯包裹上一層殼聚糖并且粒子呈球形，大小較均一。葉酸受體介導的靶向超聲造影納米微泡的體外性質(zhì)評價。穩(wěn)定性分析：取制備靶向超聲造影納米微泡(FITC-CS-PEG-FA/PFOB)測定其置備后儲存于含5％(w/v)的甘露醇水溶液中4℃冰箱中避光保存，分別取即刻、7天、15天的平均粒徑、PDI和pH值的變化，從而確定其長期穩(wěn)定性，每組重復(fù)3次，取平均值。表1穩(wěn)定性試驗結(jié)果經(jīng)單因素方差分析表平均粒徑之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05),隨后的兩兩比較T檢驗證實第1天和第7天之間存在統(tǒng)計學差異,P＝0.04(P<0.05),而第7天和第15天之間無顯著的統(tǒng)計學差異P＝0.088(P>0.05)；PDI方面亦經(jīng)單因素方差分析證實各組間不存在顯著的統(tǒng)計學差異(P>0.05)。由此表明在4℃保存時該納米微泡在一定時間內(nèi)是可以保持相對穩(wěn)定的。細胞毒性能力測試：普通1640培養(yǎng)基培養(yǎng)正常人肝細胞系L02，待達到對數(shù)生長期后，0.25％的胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)后培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度接種于96孔板，細胞濃度為1x104個/孔，培養(yǎng)箱中孵育24h。用不含葉酸的培養(yǎng)基調(diào)整FITC-CS-PEG-FA/PFOB濃度為5.58nmol/L、2.79nmol/L、1.40nmol/L和0.70nmol/L，分別取200ul的上述溶液加入96孔板接種的正常人肝細胞系L02共培養(yǎng)24h，同時用等量普通新鮮培養(yǎng)基為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后去除培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，每孔加入CellTiter96Aqueous20ul和不含葉酸的1640培養(yǎng)基100ul，混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)1h。1h后上酶標儀設(shè)定490nm和630nm波長獲得OD值，計算細胞抑制率。圖10中MTS結(jié)果：正常人肝細胞L02孵育24h后FA-PEG-CS/PFOB納米微泡濃度在5.58nmol/L的細胞毒性較強細胞存活率僅48.3％，隨著微泡濃度的減小毒性也隨之減小，當濃度達到2.79nmol/L時細胞毒性較小細胞存活達89.5％，隨后微泡濃度減小毒性基本保持不變，各組濃度間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，細胞存活率較高。因此濃度在2.79nmol/L以下葉酸靶向超聲納米微泡對正常肝細胞并無體外毒性作用。溶血能力測定：通過靜脈抽取健康捐獻者的血液樣本4ml，保存于含肝素鋰的收集管中。2000g離心5min快速分離出紅細胞。將得到的lml紅細胞重懸于50ml生理鹽水中形成含2％(w/v)紅細胞的懸液，取FITC-CS-PEG-FA/PFOB調(diào)整濃度至5.58nmol/L、2.79nmol/L、1.40nmol/L和0.70nmol/L。各取0.3ml與2.5ml的紅細胞懸液混合加入其中再用生理鹽水定容至5ml，分別以生理鹽水和超純水作為陰性(0％)和陽性(100％)對照。37℃孵育3h后，樣品2000g離心5min，取100nl上清液加入2ml乙醇/Hcl混合液(39份99％的乙醇(V/V)和1份37％鹽酸(W/V))。利用酶標儀設(shè)定波長409nm檢測血紅蛋白的釋放量，溶血百分比的計算公式如下：溶血百分比(％)＝As－A0/A100－A0x100％。其中As為樣本吸光度，A0為陰性對照的吸光度，A100為陽性對照的吸光度。圖10溶血實驗結(jié)果：兩種超聲造影納米微泡都隨濃度的減小溶血性逐漸減小，當濃度達2.79nmol/L時溶血性都小于10％，當濃度至0.7nmol/L時幾乎不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，因此在0.7nmol/L以下兩種納米粒子對于靜脈注射生物相容性較好。體外尋靶能力研究：先用不含葉酸的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞系Bel7402和正常人肝細胞系L02，傳代常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整濃度至5x105/孔接種在6孔板中培養(yǎng)24h，2種細胞各分3組每組設(shè)制3個重復(fù)組，去除1640培養(yǎng)基，PBS清洗，胰酶消化后，加入無葉酸的1640培養(yǎng)基重懸同時加入液態(tài)氟碳超聲造影微泡與細胞共培養(yǎng)2h，爬片用PBS沖洗干凈，PBS沖洗2－3次，加入500μL無水乙醇/丙酮(1:1)于-20℃固定15min，PBS沖洗后熒光顯微鏡下觀察。以下為分組情況：第一組為空白組，細胞培養(yǎng)板中加入100ulPBS；第二組為FA－PEG－CS/PFOB組，細胞培養(yǎng)板中加入100ul合成的液態(tài)氟碳靶向超聲造影劑；將上述細胞與對數(shù)生長其傳代，調(diào)整濃度至2x105/孔接種于12孔板中。將細胞分為空白組和FA－PEG－CS/PFOB組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入不含葉酸的1640培養(yǎng)基1ml培養(yǎng)24h。更換不含葉酸的1640培養(yǎng)基，分別加入相關(guān)微泡造影劑100nl共培養(yǎng)2h常規(guī)消化，1000rpm離心5min，去除上層液體加入500μL無水乙醇/丙酮(1:1)于-20℃固定15min，1000rpm離心5min后加入PBS0.5ml重懸，流式細胞儀檢測各組細胞吸收的熒光強度。結(jié)果：圖11所示肝癌細胞系Bel7402和正常肝細胞系L02在微泡造影劑存在的環(huán)境下孵育2小時所得到的熒光圖像。光鏡下可見靶向造影劑組中Bel7402細胞周圍聚集大量液態(tài)氟碳納米粒而正常人肝細胞系L02周圍納米粒較少。如圖12所示為流式細胞術(shù)測試結(jié)果，靶向?qū)嶒灲M人肝癌細胞系Bel7402攜帶熒光的比例為(97.3±1.55)％，而靶向?qū)嶒灲M正常人肝細胞系L02攜帶熒光的比例為(61.57±6.96)％，兩種細胞的空白對照組帶熒光的比例分別為(0.15±0.05)％和(0.23±0.13)％，上述研究結(jié)果表明葉酸靶向納米粒與葉酸受體高表達的Bel7402肝癌細胞具有較高的特異性結(jié)合力。體外超聲成像能力研究：將FA－PEG－CS/PFOB濃度分別調(diào)整至14.20nmol/L、7.10nmol/L、3.55nmol/L和1.78nmol/L，各取2ml加入乳膠手套中扎實，超純水作為耦合劑，以生理鹽水作為陰性對照，以聲諾維作為陽性對照。使用超聲診斷儀，設(shè)置成淺表器官常規(guī)測試模式，收集儲存圖片。結(jié)果：體外超聲成像能夠間接的預(yù)測FA-PEG-CS/PFOB造影微泡在體內(nèi)成像的效果，從圖13中我們的能夠直觀的看到超聲成像測試實驗組液態(tài)氟碳靶向超聲造影納米粒具有較強的增強效果，與陽性對照組的聲諾維相比雖強度有所減弱但有其自身的優(yōu)勢，而比陰性對照的水具有明顯的增強，并且隨FA-PEG-CS/PFOB造影微泡濃度的增加超聲增強信號也隨之增加。超聲成像完成后光鏡下納米粒仍形態(tài)完整，呈球形；經(jīng)粒度檢測粒徑變化不明顯且電位有所減少。