本申請(qǐng)是要求2013年8月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/868,112的優(yōu)先權(quán)的國(guó)際申請(qǐng)，所述臨時(shí)申請(qǐng)整體以引用方式并入本文。

背景技術(shù)：

骨組織是乳腺癌和前列腺癌轉(zhuǎn)移的優(yōu)選位點(diǎn)。骨轉(zhuǎn)移出現(xiàn)在高達(dá)75％的晚期癌患者中。目前，還無法治愈轉(zhuǎn)移性乳腺癌，也無用于治療骨轉(zhuǎn)移的副作用極低的可靠干預(yù)藥物。

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種影響著大約20％的美國(guó)成年人的普遍性疾病。該疾病導(dǎo)致關(guān)節(jié)(包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨)的退化。OA的病理特征在于關(guān)節(jié)軟骨的喪失，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)空間變窄、關(guān)節(jié)摩擦增加和可能的結(jié)構(gòu)重塑。當(dāng)前的治療包括鍛煉、生活方式改變和止痛劑。如果癥狀變嚴(yán)重，則通常施行關(guān)節(jié)置換術(shù)。迄今為止，尚無可用于治療OA的特定藥物干預(yù)措施。

連接蛋白半通道在細(xì)胞和組織功能中發(fā)揮著重要作用，并且已知連接蛋白半通道的功能異常會(huì)導(dǎo)致各種病理病癥。因此，仍需要用于治療與半通道活性相關(guān)的病理病癥(例如炎癥、骨關(guān)節(jié)炎或骨轉(zhuǎn)移)的另外療法以及用于確定此類療法的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)移靶標(biāo)的細(xì)胞中打開的半通道對(duì)癌生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。某些實(shí)施方案提供用來鑒定調(diào)節(jié)半通道的打開以治療癌轉(zhuǎn)移的化合物的工具和/或方法。在某些方面，可將藥物用于抑制或緩解癌癥向骨、腦或肝的轉(zhuǎn)移。在某些方面，半通道可在骨、腦或肝細(xì)胞中表達(dá)。在又一個(gè)方面，半通道可以是骨細(xì)胞半通道、肝細(xì)胞半通道或星形膠質(zhì)細(xì)胞半通道。在某些方面，半通道可以是連接蛋白Cx43、Cx32、Cx46、Cx37、Cx40、Cx50、Cx59、Cx62、Cx26、Cx31、Cx30.3、Cx31.1、Cx30、Cx25、Cx45、Cx47、Cx30.2、Cx36、Cx31.9、Cx39、Cx40.1、Cx23或Cx29半通道。在某一方面，半通道是Cx43或Cx 32半通道。例如，骨細(xì)胞中連接蛋白43(Cx43)半通道的打開對(duì)向骨骼的轉(zhuǎn)移具有抑制作用，并可抑制骨轉(zhuǎn)移。

半通道打開可通過使用比如熒光黃(Lucifer yellow)、溴化乙錠、Alexa 350、Alexa 485、Alexa 594染料等熒光染料進(jìn)行的染料攝取測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。半通道打開的特異性可通過使用抑制半通道打開并因此抑制靶向試劑活性的連接蛋白特異性抗體進(jìn)行驗(yàn)證。因此，所述工具和/或方法可用于篩選、測(cè)試和鑒定打開半通道并抑制轉(zhuǎn)移的試劑。

某些實(shí)施方案涉及鑒定打開半通道的化合物的方法。其它實(shí)施方案涉及正調(diào)節(jié)半通道的打開以抑制或緩解骨轉(zhuǎn)移的方法。

本發(fā)明提供抗半通道的抗體，編碼此類抗體和治療性蛋白的核酸，制備抗半通道單克隆抗體和其它治療性蛋白的方法，以及用于治療諸如轉(zhuǎn)移癌的疾病的方法。在某些方面，該抗體結(jié)合具有FLSRPTEKTI(SEQ ID NO:13)、KRDPCPHQVD(SEQ ID NO:14)或LSAVYTCKR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的表位。在一個(gè)特定的方面，抗體結(jié)合具有FLSRPTEKTI(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的表位。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合到半通道的分離抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的輕鏈。

在某些方面，第一重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:2的殘基13至37的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2的殘基46至66的氨基酸序列；并且第三重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:2的殘基97至116的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:4的殘基9至40的氨基酸序列的氨基酸序列；第二輕鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4的殘基49至58的氨基酸序列；并且第三輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:4的殘基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合到半通道和間隙連接部的分離抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的輕鏈。

在某些方面，第一重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:6的殘基13至37的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:6的殘基46至66的氨基酸序列；并且第三重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:6的殘基97至116的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:8的殘基9至42的氨基酸序列的氨基酸序列；第二輕鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8的殘基51至60的氨基酸序列；并且第三輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:8的殘基66至125的氨基酸序列的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合到間隙連接部的分離抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的輕鏈。

在某些方面，第一重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:10的殘基10至34的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:10的殘基43至59的氨基酸序列；并且第三重鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:10的殘基94至109的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:12的殘基9至40的氨基酸序列的氨基酸序列；第二輕鏈區(qū)具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:12的殘基49至58的氨基酸序列；并且第三輕鏈區(qū)包含具有SEQ ID NO:12的殘基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。

在某些方面，抗體包括全長(zhǎng)抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙特異性抗體、微抗體、域抗體、合成抗體和抗體融合體及其片段。

又一個(gè)實(shí)施方案提供包含如本文所述的抗體與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。還提供了用作治療劑以用于治療癌癥和抑制癌轉(zhuǎn)移的本發(fā)明的抗體或藥物組合物。

又一個(gè)實(shí)施方案提供治療或預(yù)防癌轉(zhuǎn)移的方法。治療方法可包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呤┯糜行Я康谋疚乃龅姆蛛x抗體。還提供了如本文所述的抗體在制造用于治療或預(yù)防癌轉(zhuǎn)移的藥劑中的用途。

某些方面涉及使用抗體、化合物或試劑抑制軟骨細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)的體外方法。在某些方面，方法涉及通過以下方面來確定對(duì)軟骨細(xì)胞中Cx43半通道打開的抑制的作用：(i)使用熒光黃或Alexa染料通過染料攝取測(cè)定法測(cè)定半通道打開，(ii)評(píng)估IL-1β對(duì)半通道打開的抑制作用，(iii)通過流體流動(dòng)剪切應(yīng)力形式的機(jī)械負(fù)荷測(cè)試試劑對(duì)半通道打開的抑制作用。

某些方面涉及通過以下方面來確定抗體、化合物或試劑對(duì)抑制IL-1β和機(jī)械負(fù)荷所誘發(fā)的炎性反應(yīng)的作用的方法：(i)測(cè)定對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的核因子-кB(NF-кB)活化的抑制，(ii)測(cè)定對(duì)體流動(dòng)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的NF-кB活化的抑制。

其它方面涉及使用單克隆抗體、化合物或試劑治療OA或確定OA的體內(nèi)方法，該方法包括：(i)將抗體、化合物或試劑注射進(jìn)入膝蓋骨腔中，(ii)評(píng)估對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NF-кB活化的抑制，(iii)通過X射線、組織學(xué)分析和身體運(yùn)動(dòng)評(píng)估OA發(fā)展。

如本文所用，術(shù)語“抗原”是能夠被抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子。在某些實(shí)施方案中，對(duì)抗體之外的結(jié)合部分進(jìn)行工程改造以特異性結(jié)合到抗原，例如適配子、高親合性多聚體(avimer)等。

術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”用于包括完整的抗體及其結(jié)合片段/區(qū)段。通常，片段與得到所述片段的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)與抗原的特異性結(jié)合。片段包括單獨(dú)的重鏈、輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc和Fv。片段/區(qū)段通過重組DNA技術(shù)或通過酶促方式或化學(xué)方式分離完整的免疫球蛋白而產(chǎn)生。術(shù)語“抗體”還包括與其它蛋白化學(xué)綴合或表達(dá)為融合蛋白的一條或多條免疫球蛋白鏈。術(shù)語“抗體”還包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。雙特異性抗體可通過多種方法產(chǎn)生，包括融合雜交瘤或連接Fab'片段。參見例如Songsivilai和Lachmann,Clin Exp Immunol 79:315-21,1990；Kostelny等,J.Immunol.148:1547–53,1992。

術(shù)語“分離的”可以指基本不含其來源中的細(xì)胞物質(zhì)、細(xì)菌物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí))或者化學(xué)前體或其它化學(xué)品(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))的核酸或多肽。另外，分離的化合物是指可作為分離的化合物施用給受試者的化合物；換言之，如果該化合物吸附到柱上或包埋在瓊脂糖凝膠中則不會(huì)被簡(jiǎn)單地認(rèn)為是“分離的”。另外，“分離的核酸片段”或“分離的肽”是不天然作為片段形式存在的和/或通常不處于功能狀態(tài)的核酸或蛋白片段。

本發(fā)明的部分(諸如多肽、肽、抗原或免疫原)可以綴合或者共價(jià)或非共價(jià)連接至其它部分(諸如佐劑、蛋白、肽、支持物、熒光部分或標(biāo)記)。廣義地使用術(shù)語“綴合”或“免疫綴合”定義一個(gè)部分與另一試劑的可操作連接，無意單獨(dú)指任何類型的可操作連接，尤其不限于化學(xué)“綴合”。

術(shù)語“提供”使用其普通含義，指“提供或配備來使用”。在一些實(shí)施方案中，通過施用蛋白來直接提供所述蛋白，而在其它實(shí)施方案中，通過施用編碼蛋白的核酸來有效地提供所述蛋白。在某些方面，本發(fā)明設(shè)想的組合物包括核酸、抗原、肽和/或表位的各種組合。

短語與靶標(biāo)“特異性結(jié)合”或“具有特異性免疫反應(yīng)性”是指在存在其它生物分子的異質(zhì)群體的情況下決定分子的存在性的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，指定的分子優(yōu)先結(jié)合到特定的靶標(biāo)，而不會(huì)大量結(jié)合到樣品中存在的其它生物分子?？贵w與靶標(biāo)在此類條件下的特異性結(jié)合需要針對(duì)與靶標(biāo)的特異性來選擇抗體。多種免疫測(cè)定法可用于選擇與特定的蛋白具有特異性免疫反應(yīng)性的抗體。例如，通常使用固相ELISA免疫測(cè)定法來選擇與蛋白具有特異性免疫反應(yīng)性的單克隆抗體。有關(guān)可用于測(cè)定特定免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定法和條件的描述，參見例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1988。

在本申請(qǐng)中討論了本發(fā)明的其它實(shí)施方案。相對(duì)于本發(fā)明的一個(gè)方面討論的任何實(shí)施方案適用于本發(fā)明的其它方面，反之亦然。本文所述的每個(gè)實(shí)施方案應(yīng)被理解為適用于本發(fā)明所有方面的本發(fā)明的實(shí)施方案。據(jù)設(shè)想，本文所討論的任何實(shí)施方案可相對(duì)于本發(fā)明的任何方法或組合物進(jìn)行實(shí)施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。

詞語“一個(gè)”與術(shù)語“包括”在權(quán)利要求書和/或說明書中結(jié)合使用時(shí)可意指“一個(gè)”，但是也與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”的含義一致。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“約”用于表示數(shù)值包括測(cè)定該數(shù)值所用裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)差。

除非明確地僅指出某些可選方式或可選方式之間互相排斥，否則權(quán)利要求中使用術(shù)語“或”意指“和/或”，但本公開也支持僅指某些可選方式和“和/或”的定義。

如本說明書和權(quán)利要求書中所用，詞語“包含”(以及任何形式的包含)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包括”(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何形式的含有)是包含性質(zhì)的或者開放式的，且不排除另外的未陳述的要素或方法步驟。

通過以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，該詳細(xì)描述和具體實(shí)例雖然指明了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是僅以舉例說明的方式給出，因?yàn)橥ㄟ^該詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將變得顯而易見。

附圖說明

以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，并包括在內(nèi)以進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些方面。通過結(jié)合這里所展示的說明書實(shí)施方案的詳細(xì)描述來參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)可以更好地理解本發(fā)明。

圖1示出了流體流動(dòng)回路設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案。

圖2示出了在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗體的情況下用20μM AD處理MLO-Y4骨細(xì)胞30分鐘的結(jié)果。進(jìn)行了溴化乙錠染料攝取試驗(yàn)，并與未處理的基礎(chǔ)攝取水平相比進(jìn)行了定量。在鈣條件下進(jìn)行了研究。將低鈣條件用作對(duì)照(打開半通道)。還示出了用AD或AD和Cx43(E2)抗體處理MLO-A5成骨細(xì)胞的結(jié)果。

圖3示出了模型系統(tǒng)，其用于研究骨細(xì)胞Cx43半通道在調(diào)節(jié)AD對(duì)癌細(xì)胞遷移的作用中的角色。骨細(xì)胞中的Cx43半通道通過AD或FFSS打開。AD處理或FFSS處理的CM中釋放的因子減少癌細(xì)胞遷移。用對(duì)照CM處理的癌細(xì)胞表現(xiàn)出正常的遷移。

圖4A和4B示出了使用軟瓊脂糖非貼壁依賴性生長(zhǎng)測(cè)定法進(jìn)行的研究，該測(cè)定法不同于貼壁依賴性生長(zhǎng)。只有癌細(xì)胞才能在軟瓊脂上生長(zhǎng)，并且其在這種基質(zhì)上的生長(zhǎng)表明癌細(xì)胞增殖的程度。來自骨細(xì)胞的CM-AD減少M(fèi)DA-MB-231集落形成。

圖5A和5B示出了使用傷口愈合遷移測(cè)定法進(jìn)行的研究的結(jié)果。來自骨細(xì)胞的CM-AD抑制了MDA-MB-231細(xì)胞遷移。

圖6示出了另一傷口愈合遷移測(cè)定的結(jié)果。AD對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移無直接作用。

圖7A和7B示出了得自transwell遷移測(cè)定的結(jié)果。(B)點(diǎn)表示遷移到插件的相對(duì)端并且已被染色的細(xì)胞。較小的點(diǎn)是所述細(xì)胞遷移通過的孔。在該測(cè)定中，將蛋白A用于從CM移除E2Ab，并且這導(dǎo)致遷移效應(yīng)與添加E2Ab之前相同。

圖8示出了得自另一transwell遷移測(cè)定的結(jié)果。MDA-MB-231遷移不受來自MLO-A5成骨細(xì)胞的CM-AD的影響。

圖9示出了得自另一transwell遷移測(cè)定的結(jié)果。MDA-MB-231遷移通過來自機(jī)械負(fù)荷所刺激的骨細(xì)胞的CM而減少。

圖10A和10B示出了得自注射到Cx43條件性敲除(cKO)小鼠的Py8119乳腺癌細(xì)胞的結(jié)果。Py8199腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移在Cx43cKO小鼠中增加。(B)腫瘤擴(kuò)散到Cx43cKO小鼠中的其它組織。

圖11示出了得自注射到Cx43cKO小鼠中的Py8119的結(jié)果。Py8119腫瘤生長(zhǎng)在Cx43cKO小鼠中增加。

圖12示出了通過三種mAb對(duì)Cx43進(jìn)行免疫標(biāo)記。將骨細(xì)胞MLO-Y4細(xì)胞在-20℃下用70％乙醇固定20分鐘，阻斷過夜，用mAb在室溫在上文所示的濃度下溫育3h。將山羊抗小鼠FITC二抗用于評(píng)估三種mAb的活性。作為細(xì)胞標(biāo)記物的WGA以紅色進(jìn)行標(biāo)記。

圖13顯示了通過在pH 7.4下經(jīng)過Cx43 E2柱而親和純化的雜交瘤上清液。對(duì)每種單克隆抗體以1:100稀釋進(jìn)行了western印跡。多克隆Cx43Ab稀釋度為1:300。

圖14顯示了M1阻斷半通道，但不阻斷間隙連接部；M2阻斷間隙連接部，但不阻斷半通道；而M3則阻斷兩者。(A)將MLO-Y4細(xì)胞用含有低Ca²⁺和Mg²⁺的培養(yǎng)基溫育，這種條件誘導(dǎo)Cx43半通道的打開。在存在EtBr具有或不具有mAb的情況下進(jìn)行了20分鐘的染料攝取測(cè)定。(B)將用Cx43轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞用mAb溫育3h，將信號(hào)細(xì)胞與AlexaFluor 488一起顯微注射以評(píng)價(jià)針對(duì)間隙連接部測(cè)定的染料轉(zhuǎn)移程度。

圖15示出了降落染料轉(zhuǎn)移(parachuting dye transfer)測(cè)定，顯示了M2和M7但非M1阻斷間隙連接通道。將用Cx43轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞用于降落染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。將供體細(xì)胞用5μM可滲透到間隙連接部的鈣黃綠素紅-橙-AM(790Da)和5μM不可滲透到間隙連接部的俄勒岡綠488BAPTA-2-AM(1752Da)在37℃溫育40分鐘。將供體細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并將分離的預(yù)加載細(xì)胞在未標(biāo)記的受體細(xì)胞頂部以1:4的供體與受體比率分層(“降落”)。使細(xì)胞貼壁90分鐘。在熒光顯微鏡下檢查細(xì)胞。

圖16.顯示了通過M1和M7但非M2阻斷了機(jī)械負(fù)荷所誘導(dǎo)的半通道打開。將MLO-Y4細(xì)胞用或不用mAb預(yù)處理20分鐘。使細(xì)胞接受8達(dá)因/cm²的流體流動(dòng)剪切應(yīng)力10分鐘，并用100μM EtBr進(jìn)行5分鐘的染料攝取。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行漂洗、固定，并在熒光顯微鏡下獲取圖像。

圖17.顯示了在小鼠體內(nèi)骨細(xì)胞中M1阻斷了機(jī)械負(fù)荷所誘導(dǎo)的半通道打開。將小鼠IgG或Cx43(M1)mAb(25mg/kg)并在2小時(shí)后將伊文思藍(lán)(Evans blue)染料注射到WT和Cx43cKO小鼠中。染料注射后30分鐘，對(duì)左(L)脛骨施加一次10分鐘的機(jī)械負(fù)荷。對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，并灌注50ml PBS。分離脛骨，固定，制作骨組織切片。條，40mm。箭頭指示染料攝取。

圖18.顯示了Cx43在軟骨細(xì)胞表面上的表達(dá)。(A)Cx43在原代軟骨細(xì)胞表面上的表達(dá)。(B)流體流動(dòng)剪切(16達(dá)因/cm2)(FSS)打開了半通道，而這種打開被Cx43特異性抗體明顯阻斷。FSS與所有其它條件相比，***，P<0.001。

具體實(shí)施方式

各種細(xì)胞能夠通過由連接蛋白形成的半通道和間隙連接部與彼此以及與胞外環(huán)境通訊。連接蛋白在整個(gè)體內(nèi)遍在表達(dá)。六個(gè)連接蛋白構(gòu)成一個(gè)半通道，而2個(gè)半通道構(gòu)成1個(gè)間隙連接通道。間隙連接部是一簇通道，它們位于相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜中并介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。半通道是來自間隙連接通道的單獨(dú)實(shí)體。半通道允許分子在細(xì)胞內(nèi)隔室與細(xì)胞外環(huán)境之間交換。

骨細(xì)胞表達(dá)稱為連接蛋白(Cx)43半通道的半通道。這些骨細(xì)胞半通道通常是關(guān)閉的，并可在暴露于機(jī)械刺激時(shí)打開，這導(dǎo)致各種因子釋放到骨微環(huán)境中。半通道打開所釋放的因子可介導(dǎo)其它過程，這些過程可減少腫瘤細(xì)胞遷移和骨轉(zhuǎn)移。

某些實(shí)施方案涉及鑒定調(diào)節(jié)連接蛋白的打開的試劑的方法。在某些方面，該方法鑒定正調(diào)節(jié)連接蛋白半通道的打開的化合物或藥物。其它實(shí)施方案涉及通過向患有癌癥的患者施用打開半通道的化合物而治療癌癥的方法。在某些方面，患者具有原發(fā)性腫瘤。在某些方面，打開Cx43半通道的化合物可用于抑制或減少向骨骼的轉(zhuǎn)移。

當(dāng)癌癥從其起源的身體部分(例如，乳腺或前列腺)擴(kuò)散到其它身體部分(例如，肝或骨)時(shí)即發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，并確立繼發(fā)性腫瘤。骨骼是癌轉(zhuǎn)移最常見的部位之一。轉(zhuǎn)移到骨骼的癌癥包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌和皮膚癌(例如，黑素瘤)。在高達(dá)75％的晚期乳腺癌和前列腺癌患者中可以確定骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移(mets)與許多嚴(yán)重的臨床和生活質(zhì)量后果相關(guān)，諸如但不限于難治性疼痛、病理性骨折、脊髓和神經(jīng)壓迫、骨髓浸潤(rùn)和運(yùn)動(dòng)性受損。在許多情況下，癌癥的全身性存在也可使癌癥無法治愈。

正常的骨骼由三大細(xì)胞類型構(gòu)成：形成骨骼的成骨細(xì)胞，再吸收骨骼的破骨細(xì)胞，和骨細(xì)胞。骨細(xì)胞占骨骼細(xì)胞的大約95％，并通過協(xié)調(diào)溶骨和成骨活動(dòng)而維持骨重建過程。當(dāng)癌細(xì)胞侵襲骨骼時(shí)，許多正常的骨骼功能受到影響。癌細(xì)胞與局部微環(huán)境相互作用，以經(jīng)由骨骼破壞和血管形成而促進(jìn)癌細(xì)胞存活。

已證實(shí)，骨細(xì)胞中的Cx43半通道通過用阿侖膦酸鹽(AD)處理而打開，阿侖膦酸鹽是一種有效且常用的雙膦酸鹽藥物。雙膦酸鹽是一類已知用于治療許多骨病(包括骨轉(zhuǎn)移)的藥物。Powles等已顯示施用雙膦酸鹽與乳腺癌患者中的骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率降低和死亡率降低相關(guān)。AD已與減少的腫瘤生長(zhǎng)以及降低的骨破壞和疼痛相關(guān)。AD抑制破骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)骨細(xì)胞中Cx43半通道的打開(Plotkin等，2002)。然而，AD施用伴隨著多種嚴(yán)重的副作用。

I.與作為骨轉(zhuǎn)移抑制劑的候選藥物篩選相關(guān)的方法

A.體外測(cè)定

某些實(shí)施方案涉及使用染料攝取測(cè)定法在體外檢測(cè)半通道的打開。在某些方面，染料是熒光示蹤劑染料(例如，溴化乙錠或熒光黃)。

在檢測(cè)半通道打開的體外測(cè)定法的一個(gè)實(shí)例中，可以使用流體流動(dòng)回路設(shè)備(FFLA)(平行板流動(dòng)小室)或其改進(jìn)形式。FFLA設(shè)備的一個(gè)實(shí)例在圖1中示意性示出。FFLA模擬骨骼中的動(dòng)態(tài)流體微環(huán)境以產(chǎn)生流體流動(dòng)剪切應(yīng)力(FFSS)。將細(xì)胞在平行板流動(dòng)小室中培養(yǎng)，從而將細(xì)胞暴露于穩(wěn)態(tài)層流流體流動(dòng)。

骨細(xì)胞感測(cè)骨細(xì)胞骨陷窩/骨小管網(wǎng)絡(luò)中FFSS所產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)變。已有人提出，骨骼流體流動(dòng)受血管外壓力以及骨細(xì)胞施加的循環(huán)機(jī)械負(fù)荷驅(qū)動(dòng)，并且峰值生理負(fù)荷為8至30達(dá)因/cm²。在某些方面，F(xiàn)FSS水平在之前測(cè)量骨骼內(nèi)的流體流動(dòng)的研究所報(bào)道的生理值范圍內(nèi)。流體剪切應(yīng)力幅度可通過調(diào)整流動(dòng)回路的柱高而改變。

用于評(píng)估半通道功能的測(cè)定可使用足夠小以穿過半通道的孔的熒光示蹤劑分子。如果半通道關(guān)閉，則分子無法通過。如果半通道打開，則染料可從中通過并導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生熒光，從而允許對(duì)熒光進(jìn)行定量。當(dāng)溴化乙錠連接到DNA時(shí)，其變得發(fā)出熒光。熒光黃在位于細(xì)胞內(nèi)后產(chǎn)生熒光。

染料轉(zhuǎn)移方法可包括將細(xì)胞暴露于胞外熒光滲透性示蹤劑。胞外滲透性示蹤劑是保持在細(xì)胞外部的分子，除非一些條件增加了細(xì)胞膜的滲透性才會(huì)進(jìn)入分子內(nèi)部。在某些方面，示蹤劑的質(zhì)量低于1、2或3kDa。在其它方面，示蹤劑將具有凈電荷。此類滲透性示蹤劑包括但不限于陰離子染料熒光黃(LY；凈電荷＝-1)和陽離子探針溴化乙錠(Etd；凈電荷＝+1)、碘化丙啶(PI；凈電荷＝+2)。EtBr的熒光在結(jié)合到DNA時(shí)增強(qiáng)，從而增加對(duì)比對(duì)并使得可以更容易地進(jìn)行鑒定。在某些方面，在不同的時(shí)期或在施加刺激以打開半通道后移除胞外染料，并對(duì)每個(gè)細(xì)胞保持的熒光強(qiáng)度定量。在某些方面，在快照?qǐng)D片中對(duì)熒光強(qiáng)度定量。

圖2示出了得自體外染料轉(zhuǎn)移測(cè)定的一個(gè)實(shí)例的結(jié)果。將MLO-Y4骨細(xì)胞在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗體的情況下用20μM AD處理30分鐘。進(jìn)行了溴化乙錠染料攝取測(cè)定，并與未處理的基礎(chǔ)攝取水平相比進(jìn)行了定量。測(cè)定在存在鈣的情況下進(jìn)行。將低鈣條件用作對(duì)照(打開半通道)。此外，將MLO-A5成骨細(xì)胞用AD處理或?qū)D+Cx43(E2)抗體用作陰性對(duì)照–AD不打開成骨細(xì)胞中的Cx43半通道，并且由AD誘導(dǎo)的骨細(xì)胞半通道的打開被Cx43(E2)抗體阻斷。

在體外測(cè)定的某些方面用于鑒定半通道的正調(diào)節(jié)物的材料包括：

半通道表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞系?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法和/或表達(dá)載體獲得、分離或工程改造表達(dá)各種連接蛋白半通道的細(xì)胞或細(xì)胞系。

骨細(xì)胞：從動(dòng)物(包括小鼠、大鼠、兔、雞)分離的原代骨細(xì)胞等或骨細(xì)胞系，包括但不限于MLO-Y4細(xì)胞及其它細(xì)胞。

癌細(xì)胞：乳腺癌細(xì)胞系，包括ER、PR、HER和TP53陽性/陰性細(xì)胞(例如MD-MBA-231、MCF7、T47D或ZR751)。MDA-MB-231是乳腺導(dǎo)管癌。從C57Bl/6MMTV-PyMT雌性(小鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多瘤居中T轉(zhuǎn)基因)小鼠中產(chǎn)生的自發(fā)性乳腺腫瘤建立了Py8119乳腺腫瘤細(xì)胞系。癌基因(多瘤居中T轉(zhuǎn)基因)的表達(dá)受小鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。

前列腺癌細(xì)胞系：包括雄性激素受體和5α-還原酶陽性/陰性和雄性激素敏感/非敏感細(xì)胞系(例如，LNCaP-Rf、BM18、pRNA-1-1/ras、RC58T/hTERT、PPC-1等)。

成骨細(xì)胞：將MLO-A5成骨細(xì)胞用作對(duì)照，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)連接蛋白43，但它們似乎在由阿侖膦酸鹽刺激時(shí)不打開。

待測(cè)試的“試劑”包括化合物、肽、蛋白、反義寡聚物和/或微RNA。

示蹤劑分子包括但不限于熒光黃、溴化乙錠、伊文思藍(lán)、Alexa350、Alexa488和Alexa594。

Cx43(E2)：Cx43(E2)抗體為Cx43半通道特異性的。Cx43E2結(jié)合Cx43半通道的第2個(gè)胞外環(huán)，并防止半通道打開。

確定試劑是否打開半通道的方法包括以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)：

(a)分離、獲得或產(chǎn)生連接蛋白表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞系。例如，從顱骨分離原代骨細(xì)胞。可使用本領(lǐng)域已知的其它方法分離其它細(xì)胞類型。在某些方面，從動(dòng)物(例如，16天胚胎雞顱骨或新生小鼠)分離顱骨骨細(xì)胞。將動(dòng)物斷頭處死，解剖顱骨，快速浸入70％酒精中。然后將顱骨放入αMEM中，用PBS洗滌多次。將清洗后的骨骼置入新鮮的αMEM中。將骨骼剁碎，切成1.5mm大小的片?？蓪⒐瞧媚z原酶處理以移除軟組織和類骨質(zhì)，然后使用EDTA脫鈣。最后，通過用膠原酶處理并用力攪拌而將骨細(xì)胞從骨碎片中釋放出來。

(b)從長(zhǎng)骨分離原代骨細(xì)胞。可從2-3周大的小鼠或大鼠分離長(zhǎng)骨骨細(xì)胞。例如，向小鼠給予超劑量的麻醉，使頸椎脫位，斷頭處死，并浸入70％乙醇中。分離關(guān)節(jié)末端仍然完整的股骨和脛骨。將腿快速浸入70％酒精中然后置入αMEM中。將αMEM中的腿用PBS洗滌。移除大部分肌肉，并與肌腱/韌帶脫離。將清洗后的骨骼置入新鮮的αMEM中。清洗所有骨骼后，將每塊骨骼的兩端用手術(shù)刀切掉，然后立即使用PBS沖洗出骨髓。將骨骼切成1.5至2mm長(zhǎng)，并用膠原酶處理。在一個(gè)實(shí)例中，將骨片用膠原酶相繼處理9次，以移除所有組織和類骨質(zhì)，然后使用EDTA脫鈣。

(c)培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系。例如，將原代和/或骨細(xì)胞系在膠原包被的板上培養(yǎng)，然后浸入含有滲透性示蹤劑的記錄培養(yǎng)基(不含HCO₃的HEPES緩沖α-MEM培養(yǎng)基)浴中。

(d)施用測(cè)試試劑。將培養(yǎng)的細(xì)胞置于與測(cè)試試劑接觸所需的時(shí)長(zhǎng)。

(e)測(cè)定滲透性示蹤劑攝取。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的示蹤劑的量測(cè)定滲透性示蹤劑攝取。在某些方面，使用延時(shí)記錄?？稍诓煌募?xì)胞中在所關(guān)注的區(qū)域記錄熒光，其中顯微鏡上的eclipse濾光片基于所用的示蹤劑或其它探針的熒光波長(zhǎng)。在某些方面，通過快速冷卻的數(shù)碼相機(jī)每2分鐘獲取一次圖像，并通過ImageJ軟件進(jìn)行圖像處理。收集到的數(shù)據(jù)可示為初始熒光和所關(guān)注時(shí)間的熒光與基礎(chǔ)熒光相比的倍數(shù)差異。

對(duì)于快照?qǐng)D片，可將細(xì)胞暴露于滲透性示蹤劑5-10分鐘，用PBS漂洗多次，然后用甲醛固定。在某些方面，用顯微鏡獲取熒光場(chǎng)的至少三個(gè)顯微相片。通過ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。測(cè)量隨機(jī)細(xì)胞的像素密度的平均值。

在某些方面，確認(rèn)連接蛋白半通道的打開?？衫缤ㄟ^將骨細(xì)胞與Cx43(E2)抗體(特異性抑制Cx43半通道的多克隆抗體)與測(cè)試試劑一起溫育而進(jìn)行確認(rèn)。如果試劑打開Cx43半通道，則該通道打開將被Cx43(E2)抗體阻斷。為了控制Cx43半通道的打開，將骨細(xì)胞用流體流動(dòng)剪切應(yīng)力和/或AD處理，兩者已知均可打開骨細(xì)胞中的半通道。

在一個(gè)特定的實(shí)例中，將MLO-Y4骨細(xì)胞在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗體的情況下用20μM AD處理30分鐘。進(jìn)行了溴化乙錠染料攝取試驗(yàn)，并與未處理的基礎(chǔ)攝取水平相比進(jìn)行了定量。測(cè)定在存在鈣的情況下進(jìn)行。低鈣條件可用作對(duì)照(打開半通道)。AD誘導(dǎo)的骨細(xì)胞半通道的打開被Cx43(E2)抗體阻斷。

骨細(xì)胞Cx43半通道的打開介導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞遷移的負(fù)面效應(yīng)。骨細(xì)胞中的Cx43半通道通過施用AD或FFSS而打開。打開的半通道使得各種因子可以釋放到產(chǎn)生條件培養(yǎng)基(CM)的培養(yǎng)基中。AD或FFSS處理的CM中釋放的因子減少癌細(xì)胞遷移，如通過軟瓊脂和傷口愈合測(cè)定法所確定。軟瓊脂測(cè)定法的實(shí)例在圖3中示意性地示出。如圖4中所示，用對(duì)照CM處理的癌細(xì)胞表現(xiàn)出正常的遷移。軟瓊脂測(cè)定法是非貼壁依賴性生長(zhǎng)測(cè)定法，與貼壁依賴性生長(zhǎng)相對(duì)。只有癌細(xì)胞才能在軟瓊脂上生長(zhǎng)，并且其在這種基質(zhì)上的生長(zhǎng)表明癌細(xì)胞增殖的程度。

在某些方面，所述方法包括將原代骨細(xì)胞或骨細(xì)胞系用測(cè)試試劑在α-MEM中溫育各種時(shí)間段，并在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集上清液(條件培養(yǎng)基)。在某些方面，將乳腺癌或前列腺癌細(xì)胞用CM溫育，并測(cè)定癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

可使用WST-1(水溶性四唑鎓鹽)測(cè)定法、使用臺(tái)盼藍(lán)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)法、BrdU DNA結(jié)合和細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)定癌細(xì)胞生長(zhǎng)和活力。對(duì)于WST-1測(cè)定法，通過Synergy HT多模式酶標(biāo)儀(Biotek)以450nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量細(xì)胞增殖。

細(xì)胞遷移測(cè)定通常在24孔組織培養(yǎng)板(BD Biosciences)中的transwell膜過濾器插件中進(jìn)行。transwell膜過濾器插件可以為例如6.5-mm直徑、8-μm孔徑和10-nm厚的聚碳酸酯膜。

侵襲測(cè)定在BD Biocoat低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠侵襲小室(BD Biosciences)中進(jìn)行。收獲癌細(xì)胞系并與或不與測(cè)試試劑一起重懸在得自骨細(xì)胞的CM中。將癌細(xì)胞懸液添加到插件的上側(cè)。將細(xì)胞在37℃溫育各種時(shí)間段。移除未穿過過濾器遷移的細(xì)胞，并將穿過插件遷移的細(xì)胞固定且用Hema 3Stat Pack(Fisher Scientific)染色。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)每個(gè)插件5個(gè)視野中的遷移細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。

在某些方面，當(dāng)在得自用AD或FFSS處理以刺激Cx43半通道打開的骨細(xì)胞的CM中溫育時(shí)，乳腺癌遷移減少。當(dāng)骨細(xì)胞Cx43半通道被E2抗體阻斷時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞遷移的這種抑制作用減弱。當(dāng)用從成骨細(xì)胞收集的CM溫育時(shí)或直接用AD處理時(shí)，未見癌細(xì)胞遷移的這種降低。Cx43半通道的打開防止乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。

B.體內(nèi)測(cè)定

其它實(shí)施方案涉及體內(nèi)檢測(cè)連接蛋白半通道的打開。用來發(fā)現(xiàn)可用于治療癌癥向骨骼轉(zhuǎn)移的試劑的體內(nèi)測(cè)定法的一個(gè)實(shí)例包括確定候選試劑對(duì)骨細(xì)胞中Cx43半通道的作用以及對(duì)體內(nèi)癌向骨轉(zhuǎn)移的作用。在某些方面，通過以下方式測(cè)定骨細(xì)胞中的Cx43調(diào)節(jié)：將候選試劑注射到長(zhǎng)骨中并使用熒光示蹤劑染料(例如，鈣黃綠素或伊文思藍(lán))原位檢測(cè)骨細(xì)胞中半通道的打開。

體內(nèi)測(cè)定化合物對(duì)骨組織的骨細(xì)胞中半通道打開的作用。分析骨細(xì)胞中的半通道的體內(nèi)測(cè)定法的一個(gè)實(shí)例使用3-4個(gè)月大的小鼠或大鼠。對(duì)動(dòng)物稱重。將測(cè)試試劑通過腹膜內(nèi)(IP)注射而引入動(dòng)物體內(nèi)。2-4小時(shí)后，將熒光示蹤劑染料(即，伊文思藍(lán)、Alexa 594)注射到動(dòng)物的側(cè)尾靜脈中或進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。注意：可注射動(dòng)物體重的最多1％(體積)。在某些方面，在尾靜脈注射之前給動(dòng)物保暖以擴(kuò)張尾靜脈。2-4小時(shí)后，將動(dòng)物處死，解剖不含肌肉組織的脛骨和股骨，用PBS洗滌數(shù)次。將骨骼固定在多聚甲醛中，在14％EDTA溶液中在4℃脫鈣兩周或在室溫在恒定攪拌下脫鈣3-5天。將骨骼在PBS中洗滌，浸泡在30％的蔗糖的PBS溶液中過夜，然后包埋在OCT化合物中。通常根據(jù)需要調(diào)整骨骼在模具中的位置。使用低溫恒溫器切割五微米厚的冷凍切片，將切片在PBS中漂洗，然后使用50％的甘油的PBS溶液固定。在熒光顯微鏡下檢查骨切片，并使用Image J對(duì)骨中骨細(xì)胞攝取示蹤劑染料的程度定量。

骨細(xì)胞中Cx43半通道的打開可通過對(duì)脛骨施加機(jī)械負(fù)荷以打開骨細(xì)胞中的Cx43半通道而確認(rèn)。這可用作體內(nèi)骨細(xì)胞中半通道打開的陽性對(duì)照。對(duì)于陰性對(duì)照，使用骨細(xì)胞中Cx43存在缺陷的小鼠。這種小鼠通過將10-kb DMP-1 Cre與Cx43 flox小鼠雜交而產(chǎn)生。

使用脛骨內(nèi)注射骨轉(zhuǎn)移模型和/或心內(nèi)注射癌轉(zhuǎn)移測(cè)定法測(cè)定測(cè)試試劑對(duì)體內(nèi)對(duì)骨轉(zhuǎn)移的作用。

脛骨內(nèi)注射骨轉(zhuǎn)移模型。該方法包括將1個(gè)月大的正?；蛎庖叩拖滦∈笥卯惙槁樽?。向小鼠給予鹽酸丁丙諾啡(0.3mg/ml)作為止痛劑。使用表達(dá)熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的癌細(xì)胞進(jìn)行脛骨內(nèi)注射(例如，對(duì)于正常小鼠為表達(dá)Luc-GFP的Py8119細(xì)胞，或?qū)τ诿庖叩拖滦∈鬄楸磉_(dá)Luc-GFP的MD-MBA-231)。通過由配有30號(hào)針的Hamilton注射器預(yù)先產(chǎn)生的孔，將癌細(xì)胞接種到右脛骨的骨髓區(qū)中。將PBS注入左脛骨作為對(duì)照。將測(cè)試試劑或鹽水經(jīng)腹膜內(nèi)施用，每周兩次，持續(xù)5周。從腫瘤細(xì)胞接種后3天開始，每周通過生物發(fā)光成像或熒光來監(jiān)測(cè)脛骨內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。在足夠的生物發(fā)光成像后的研究終止時(shí)，獲取X射線圖像以測(cè)試骨質(zhì)量并觀察標(biāo)記的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞集落，且通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。

心內(nèi)注射骨轉(zhuǎn)移模型。將兩個(gè)月大的正常或免疫低下小鼠通過異氟烷麻醉，并且還給予鹽酸丁丙諾啡(0.3mg/ml)作為止痛劑。將表達(dá)熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的癌細(xì)胞(例如，對(duì)于正常小鼠為表達(dá)Luc-GFP的Py8119細(xì)胞，或?qū)τ诿庖叩拖滦∈鬄長(zhǎng)uc-GFP-MD-MBA-231)注射到小鼠的左心室中。程序包括：將針保持向操作者成一角度且向右，將其插入第二肋間隙，距離胸骨左側(cè)約3mm。推進(jìn)約5mm并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)針頭，直到觀察到鮮紅動(dòng)脈血的脈動(dòng)流進(jìn)入針座。在30秒中注射細(xì)胞懸液。取出針，在注射部位使用酒精棉施壓30秒。將小鼠置于溫暖的表面上，直到其完全從麻醉中恢復(fù)。從腫瘤細(xì)胞接種后3天每周在心內(nèi)注射后進(jìn)行生物發(fā)光或熒光成像以驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞的分布。在足夠的生物發(fā)光成像后的研究終止時(shí)，獲取X射線圖像以評(píng)估骨質(zhì)量并觀察標(biāo)記的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞集落，且通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。

Cx43條件性敲除(cKO)小鼠。由于純合Cx43整體敲除是致命的，并且還由于本發(fā)明人想要研究在骨細(xì)胞中表達(dá)的Cx43的作用，因此產(chǎn)生了骨細(xì)胞特異性Cx43敲除小鼠。將floxed Cx43基因純合的小鼠與Cx43整體雜合小鼠雜交有利于骨細(xì)胞中Cx43的完全缺失。然后將Cx43fl/-小鼠(50％的子代)與表達(dá)由人類DMP-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶的小鼠雜交。這產(chǎn)生了為Cx43fl/-、DMP1 Cre+或Cx43 fl/-、DMP1 Cre-的小鼠(小百分比的為Cx43fl/fl或Cx43-/-)。通過免疫組織化學(xué)確認(rèn)了Cx43缺陷骨細(xì)胞。

研究可包括4組小鼠：用阿侖膦酸鹽(AD)處理的WT，用阿侖膦酸鹽處理的KO，無AD的WT，和無阿侖膦酸鹽的KO。將AD以150μg/kg體重施用給小鼠。對(duì)于AD處理，預(yù)期骨轉(zhuǎn)移在KO中與WT小鼠相比將會(huì)增加。而在無AD的情況下，骨轉(zhuǎn)移在WT與敲除小鼠之間應(yīng)相似。

II.治療與連接蛋白半通道相關(guān)的病癥的方法

在某些實(shí)施方案中，可將連接蛋白半通道的調(diào)節(jié)劑用于治療與連接蛋白半通道相關(guān)的障礙，包括炎性障礙，諸如骨關(guān)節(jié)炎(OA)和脊椎損傷。本文所述的方法和組合物還可用于治療傷口，諸如角膜和皮膚傷口。

A.骨關(guān)節(jié)炎(OA)

骨關(guān)節(jié)炎是一種影響著大約20％的美國(guó)成年人的普遍性疾病。該疾病導(dǎo)致關(guān)節(jié)(包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨)的退化。OA的病理特征在于關(guān)節(jié)軟骨的喪失，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)空間變窄、關(guān)節(jié)摩擦增加和可能的結(jié)構(gòu)重塑。當(dāng)前的治療包括鍛煉、生活方式改變和止痛劑。如果癥狀變嚴(yán)重，則通常施行關(guān)節(jié)置換術(shù)。迄今為止，尚無可用于治療OA的特定藥物干預(yù)措施。

軟骨細(xì)胞表達(dá)連接蛋白(Cx)43半通道，并且這些通道介導(dǎo)小分子(低于1kDa)在細(xì)胞內(nèi)/外之間的傳遞。在正常條件下，軟骨細(xì)胞中的Cx43半通道保持關(guān)閉；然而，這些通道在炎癥條件下打開并釋放諸如促炎性因子的小分子。機(jī)械負(fù)荷和白介素-β1誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中Cx43半通道的打開，促進(jìn)炎性反應(yīng)，釋放諸如前列腺素E2(PGE2)和ATP的促炎性因子。

抑制軟骨細(xì)胞中Cx43半通道的打開(例如，通過化學(xué)試劑等)可抑制骨關(guān)節(jié)炎的炎癥和發(fā)展。軟骨細(xì)胞中的半通道打開可使用本文所述的方法進(jìn)行檢測(cè)。Cx43半通道釋放的促炎性因子(PGE2和ATP)使用ELISA測(cè)定法測(cè)量。阻斷半通道打開的藥劑可用作炎性疾病諸如OA的治療劑。

升高的白介素1β(IL-1β)是OA的誘導(dǎo)劑。不正常的關(guān)節(jié)負(fù)荷已知也會(huì)增加OA的風(fēng)險(xiǎn)。IL-1β的暴露導(dǎo)致軟骨細(xì)胞釋放前列腺素和NO。釋放的PGE₂通過抑制蛋白聚糖的合成并誘導(dǎo)膠原的降解而發(fā)揮分解代謝作用。已證實(shí)，機(jī)械負(fù)荷打開Cx43半通道。Cx43充當(dāng)PGE₂釋放進(jìn)骨細(xì)胞的入口。Cx43在軟骨細(xì)胞的表面上(參見18)以及在關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)。IL-1β和機(jī)械負(fù)荷導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中Cx43半通道的打開(圖18)，而這種打開受半通道特異性Cx43抗體抑制。當(dāng)半通道被Cx43(E2)抗體阻斷時(shí)，由IL-1β誘發(fā)的炎性反應(yīng)受到抑制。

基于以上證據(jù)，軟骨細(xì)胞中的Cx43半通道被IL-1β或機(jī)械負(fù)荷打開，并且半通道釋放的PGE₂導(dǎo)致OA的發(fā)展。軟骨細(xì)胞中Cx43半通道的特異性阻斷可用于治療性策略以治療由升高的IL-1β或創(chuàng)傷(不正常的負(fù)荷)導(dǎo)致的OA。

用于評(píng)價(jià)Cx43通道活性的體外細(xì)胞模型。從小鼠腿骨關(guān)節(jié)分離原代軟骨細(xì)胞?？蓹z測(cè)藥劑對(duì)軟骨細(xì)胞中Cx43半通道打開和間隙連接部偶合的作用，并對(duì)時(shí)間和劑量依賴性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，使用熒光黃或Alexa染料通過染料攝取測(cè)定法來評(píng)估半通道打開。通過使用ELISA測(cè)定法來檢測(cè)PGE₂和ATP的釋放而測(cè)量下游效應(yīng)。

對(duì)于脊柱損傷，局部炎癥和腫脹通常由局部損傷、創(chuàng)傷或感染導(dǎo)致，而這些事件也可以是全身炎癥的致因。炎癥的特征通常在于增加的發(fā)紅、腫脹、體溫、疼痛，以及在受累區(qū)域中的一些功能喪失。在某些方面，抑制半通道打開的藥劑可用于緩解與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和/或脊髓損傷相關(guān)的炎癥。

傷口愈合代表了另一個(gè)重要的健康問題，并且采用復(fù)雜的生物過程而不論原因如何。一般來講，在相關(guān)炎性反應(yīng)過程中，傷口由浸潤(rùn)細(xì)胞和體液清洗。該初始炎癥階段之后是增生階段，其中不同的細(xì)胞類型提供傷口愈合或被適當(dāng)?shù)募?xì)胞(諸如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞以及許多其它細(xì)胞)填入所必需的因子和組織環(huán)境。隨著上皮細(xì)胞逐漸填入傷口，諸如血管生成和傷口收縮的另外事件也在發(fā)生。該階段往往持續(xù)約7-10天，具體取決于傷口的嚴(yán)重性和炎癥階段的效率。諸如更大的年齡、免疫缺陷以及壓力等情況和其它環(huán)節(jié)因素可影響傷口愈合。傷口的長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致增加的感染可能性、不良炎癥作用以及結(jié)疤和可能的慢性傷口。一般來講，傷口愈合過程以成熟和重塑階段而結(jié)束。膠原得以更換、重塑和交聯(lián)，從而增加新產(chǎn)生的組織的強(qiáng)度，并且非必需血管、細(xì)胞和組織從傷口部位緩慢移除。隨著身體傾向于最終愈合階段，該最終階段可持續(xù)數(shù)年。

傷口的治療通常涉及應(yīng)用抗生素以及防護(hù)外部環(huán)境的藥劑，諸如繃帶、縫線、第二皮膚、密封劑或其它霜?jiǎng)┖退幐?。另外，許多化合物也可用于在傷口愈合的早期治療炎癥，通常與甾體類抗炎化合物或藥物相結(jié)合。本文所述的或通過本文所述的方法鑒定的藥劑可用于調(diào)節(jié)與傷口愈合相關(guān)的炎癥過程。

III.抗體

本發(fā)明的某些方面涉及正或負(fù)調(diào)節(jié)半通道功能的抗體。鑒定和分離單克隆抗體的實(shí)例在下文描述。

如本文所用的術(shù)語“CDR”是指抗體可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)。CDR中所包括的殘基的系統(tǒng)性鑒定已由Kabat等(1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda)開發(fā)。可變輕鏈(VL)CDR在本文定義為包括位置27-32(CDR1)、50-56(CDR2)和91-97(CDR3)處的殘基。可變重鏈(VH)CDR在本文定義為包括位置27-33(CDR1)、52-56(CDR2)和95-102(CDR3)處的殘基。

如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本文所公開的CDR還可以包括變體。一般來講，各個(gè)變體CDR之間的氨基酸同一性為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，“變體CDR”是與本發(fā)明的親本CDR具有指定的同一性的CDR并且共有生物功能，包括但不限于至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的親本CDR的特異性和/活性。

盡管要預(yù)先確定用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)或區(qū)域，但是突變本身不需要預(yù)先確定。例如，為了優(yōu)化突變?cè)诮o定位點(diǎn)的性能，可以在靶密碼子或靶區(qū)域處實(shí)施隨機(jī)誘變，并針對(duì)所需活性的最佳組合，篩選表達(dá)的抗原結(jié)合蛋白CDR變體。在具有已知序列的DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生置換突變的技術(shù)是熟知的，例如，M13引物誘變和PCR誘變。使用如本文所述的抗原結(jié)合蛋白活性測(cè)定法進(jìn)行突變體的篩選。

氨基酸置換一般是單個(gè)殘基；插入通常將在約一個(gè)(1)至約二十個(gè)(20)氨基酸殘基的級(jí)別上，但也可以容許明顯更大的插入。缺失的范圍為約一個(gè)(1)至約二十個(gè)(20)氨基酸殘基，但在一些情況下缺失可以大得多。

置換、缺失、插入或其任意組合可以用來獲得最終的衍生物或變體。一般來講，在少許氨基酸上進(jìn)行這些改變，以便使分子的改變(特別是抗原結(jié)合蛋白的免疫原性和特異性)最小化。然而，在某些情況下可以容許較大的改變。

如本文所用的“Fab”或“Fab區(qū)域”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。Fab可以指分離情況下的這種區(qū)域，或在全長(zhǎng)抗體、抗體片段或Fab融合蛋白或如本文概述的任何其它抗體實(shí)施方案的情境下的這種區(qū)域。

如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv區(qū)域”意指包含單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的多肽。

如本文所用的“骨架”意指抗體可變結(jié)構(gòu)域的不包括定義為CDR的那些區(qū)域的區(qū)域。每個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域骨架可以進(jìn)一步再劃分成由CDR分隔的連續(xù)區(qū)域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

如本文所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱為“抗體部分”)是指保留與抗原(例如，半通道)特異性結(jié)合的能力的一種或多種抗體片段。已證實(shí)，抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括，(i)Fab片段，一種由VL/VK、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)實(shí)質(zhì)上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab的Fab'片段(參見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul編著，第3版，1993)；(iv)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(v)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；和(viii)納米抗體，一種含有單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定域的重鏈可變區(qū)。

術(shù)語“特異性結(jié)合”(“或免疫特異性結(jié)合”)無意表示抗體專有地結(jié)合其預(yù)期靶標(biāo)。相反，如果抗體與其預(yù)期靶標(biāo)的親和力比其與非靶標(biāo)分子的親和力高大約5倍，則抗體“特異性結(jié)合”。適宜地，不存在與不希望的物質(zhì)的明顯的交叉反應(yīng)或交叉結(jié)合?？贵w與靶標(biāo)分子的親和力將比其與非靶標(biāo)分子的親和力高至少約5倍，諸如10倍，諸如25倍，尤其是50倍，特別是100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，抗體或其它結(jié)合劑與抗原之間的特異性結(jié)合意指至少10⁶M^-1的結(jié)合親和力。抗體可例如以至少約10⁷M^-1，諸如介于約10⁸M^-1至約10⁹M^-1、約10⁹M^-1至約10¹⁰M^-1或約10¹⁰M^-1至約10¹¹M^-1的親和力進(jìn)行結(jié)合?？贵w可例如以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或更優(yōu)選地10pM或更小的EC₅₀進(jìn)行結(jié)合。

小鼠mAb純化方案。蛋白G而非蛋白A是選擇用來純化小鼠IgG的柱，因?yàn)樾∈驣gG1與蛋白G的結(jié)合好得多。15天后收集無胎牛血清的得自雜交瘤培養(yǎng)物的上清液以便產(chǎn)生IgG。

在實(shí)驗(yàn)中，使用了GammaBind Plus^TM瓊脂糖快速流動(dòng)柱。對(duì)柱子進(jìn)行清洗，然后用結(jié)合緩沖液平衡。這些步驟的每一個(gè)使用約30ml緩沖溶液。然后將具有結(jié)合緩沖液的稀釋雜交瘤上清液上樣到柱子中。收集1.5ml級(jí)分(洗脫液)。將150μl 1M Tris緩沖液(pH 8)用于中和pH。將柱子用結(jié)合緩沖液(30-50ml)再平衡。最后，添加20μl疊氮化鈉以便儲(chǔ)存。柱結(jié)合能力為18mg/ml小鼠IgG。使用1ml/min的流量。將50mM磷酸鈉緩沖鹽水(pH 7)用作結(jié)合緩沖液，并將0.1M甘氨酸(pH 2.7)用作洗脫緩沖液。將上清液與結(jié)合緩沖液按1:1混合。

在某些實(shí)施方案中，將小鼠單克隆抗體(M1)用于研究形成間隙連接部或/和半通道的連接蛋白Cx43的功能，其中單克隆抗體的重鏈具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，而單克隆抗體M1的輕鏈具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，將小鼠單克隆抗體(M2)用于研究形成間隙連接部或/和半通道的連接蛋白Cx43的功能，其中單克隆抗體的重鏈具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，而單克隆抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，將小鼠單克隆抗體(M7)用于研究形成間隙連接部或/和半通道的連接蛋白Cx43的功能，其中單克隆抗體的重鏈具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，而單克隆抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

免疫印跡。將MLO-Y4細(xì)胞以3x10⁵個(gè)接種到60mm平皿中維持48h。在裂解緩沖液(5mM Tris，5mM EDTA，5mM EGTA+蛋白酶抑制劑，20μl/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)，20μl/ml N-乙基馬來酰亞胺，10μl/ml NaVO₄和10μl/ml亮肽素)中收集小鼠心臟組織，勻化并以100,000xg在4℃下離心30分鐘然后重懸在裂解緩沖液中。將粗制膜蛋白通過10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用識(shí)別Cx43的C端的抗Cx43CT(1:300稀釋)或識(shí)別Cx43的第二胞外環(huán)的抗Cx43 E2(1:500稀釋)或抗Cx43的第二胞外環(huán)的單克隆抗體(1:100稀釋)印跡。通過Odyssey紅外檢測(cè)系統(tǒng)(LI-COR,Lincoln,NE,USA)檢測(cè)二抗即紅外800抗兔IgG(1:15000)(LI-COR,Lincoln,NE,USA)的熒光。

免疫熒光：將MLO-Y4細(xì)胞在膠原包被的蓋玻片上培養(yǎng)。將細(xì)胞用PBS漂洗2次，并用70％冷乙醇在-20℃溫育20分鐘。使用PFA破壞表位，該表位富含賴氨酸，因此不予推薦。然后，將細(xì)胞用PBS漂洗兩次以便移除乙醇。之后，將細(xì)胞用阻斷溶液(2％山羊血清、2％魚皮明膠和1％牛血清白蛋白的PBS溶液)阻斷過夜。然后，將細(xì)胞用PBS中不同濃度的單克隆抗體標(biāo)記，再用FITC綴合的山羊抗小鼠抗體和WGA-alexa594(Invitrogen)(分別在阻斷溶液中以1:400和1:1500稀釋)標(biāo)記。通過Olympus BH-2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，并通過NIH Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行離線處理。

半通道活性的染料攝取。使用快照照片評(píng)價(jià)了染料攝取測(cè)量結(jié)果。將MLO-Y4細(xì)胞鋪板到膠原包被的35mm平皿上，并用以下記錄培養(yǎng)基溫育：不含HCO₃^–的鹽水培養(yǎng)基，用10mM以下HEPES鹽組合物緩沖(單位mM)：154NaCl、5.4KCl、1.8CaCl₂、1.0MgCl₂、5葡萄糖。向具有低濃度二價(jià)陽離子的培養(yǎng)基(低[X²])添加0.5mM EGTA但不添加CaCl₂和MgCl₂。記錄培養(yǎng)基或低[X²]含有50μM EtBr用于快照記錄。將細(xì)胞暴露于100μM EtBr 5分鐘，然后用PBS漂洗3次，再用2％甲酰胺固定。在具有若丹明濾光片的倒置顯微鏡(Carl Zeiss)中，通過10倍干物鏡獲取熒光場(chǎng)的至少3張顯微照片。通過image J軟件離線分析圖像。測(cè)量30個(gè)隨機(jī)細(xì)胞的像素密度的平均值。

間隙連接部的染料偶合測(cè)定。將MLO-Y4細(xì)胞鋪板到膠原包被的35mm平皿上，并用記錄培養(yǎng)基(不含HCO₃^–的αMEM培養(yǎng)基，用10mM HEPES緩沖)溫育。在37℃下通過alexafluor 350(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)(10mM的PBS溶液)使用均得自Eppendorf(Eppendorf)的顯微操縱器InjectMan NI 2和Femtojet進(jìn)行細(xì)胞的顯微注射。在alexafluor 350注射后2分鐘測(cè)量染料轉(zhuǎn)移。對(duì)發(fā)生染料轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，從而記錄染料偶合指數(shù)。在配備氙弧燈照明和Nikon eclipse(Nikon,Japan)(激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)高于420nm)的倒置顯微鏡下觀察染料偶合。

間隙連接部的細(xì)胞降落染料轉(zhuǎn)移測(cè)定。使MLO-Y4細(xì)胞在12孔板中生長(zhǎng)到匯合。將供體細(xì)胞用5μM鈣黃綠素紅-橙-AM(790Da)和5μM俄勒岡綠488BAPTA-2-AM(1752Da)在37℃溫育40分鐘。間隙連接部分子間通訊可通過用可滲透間隙連接部的示蹤劑染料鈣黃綠素紅-橙和不可滲透間隙連接通道的俄勒岡綠488BAPTA-2同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞而跟蹤。通過胰蛋白酶消化從板移除預(yù)加載的供體細(xì)胞。使預(yù)加載的細(xì)胞在以1:4供體與受體比率培養(yǎng)的未標(biāo)記受體細(xì)胞的頂部分層(“降落”)。使細(xì)胞貼壁1小時(shí)的時(shí)間段，然后小心洗滌3次，在新鮮的2％PFA中在室溫下固定10分鐘，然后再漂洗3次。通過熒光顯微鏡檢查細(xì)胞。對(duì)于鈣黃綠素紅-橙轉(zhuǎn)移，調(diào)整閾值以清楚區(qū)分染料轉(zhuǎn)移邊界。染料轉(zhuǎn)移陽性標(biāo)準(zhǔn)是檢測(cè)鈣黃綠素紅-橙/俄勒岡綠488BAPTA-2，其中接觸的細(xì)胞呈鈣黃綠素紅-橙陽性和俄勒岡綠488BAPTA-2陰性。染料轉(zhuǎn)移幾乎不可檢測(cè)(<1％)。在我們發(fā)現(xiàn)俄勒岡綠488BAPTA-2綠陽性細(xì)胞的地方獲取圖像。

流體流動(dòng)剪切應(yīng)力打開半通道。通過限定厚度的墊圈隔開的平行板流動(dòng)小室以重力驅(qū)動(dòng)的流體流使用蠕動(dòng)泵形成流體流。墊圈厚度決定通道高度，將其與流量一起調(diào)整以產(chǎn)生16達(dá)因/cm²的應(yīng)力水平。循環(huán)培養(yǎng)基為10mM HEPES緩沖的α-MEM。

將所提供的實(shí)施例以及附圖包括在內(nèi)以闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，實(shí)施例或附圖中所公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中能很好發(fā)揮作用的技術(shù)，并因此可被視為構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐模式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)所公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行多種修改，并仍得到相同或相似的結(jié)果。

IV.藥物組合物

某些方面包括組合物，例如藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分中的一種或組合。此類組合物可包含本文所述的(例如，兩種或更多種不同的)抗體或免疫綴合物中的一種或組合。例如，本發(fā)明的藥物組合物可包含結(jié)合到靶抗原上的不同表位或具有互補(bǔ)活性的抗體的組合。

本發(fā)明的藥物組合物還可以作為聯(lián)合療法而施用，即，與其它藥劑聯(lián)合。例如，聯(lián)合療法可包括與至少一種其它抗癌劑聯(lián)合的抗半通道抗體。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腸胃外施用(例如，通過注射或輸注)。取決于施用途徑，可將活性化合物(即，抗體或免疫綴合物)用材料包衣以避免化合物受到可使化合物失活的酸和其它自然條件的作用。

可用于本發(fā)明的藥物組合物的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物，植物油，諸如橄欖油，和注射用有機(jī)酯，諸如油酸乙酯?？衫缤ㄟ^使用包衣材料(諸如卵磷脂)、通過維持所需的粒度(就分散體而言)以及通過使用表面活性劑而維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。將這種介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則均設(shè)想了其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。補(bǔ)充性活性化合物也可摻入組合物中。

治療性組合物通常必須為無菌的且在制造和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。組合物可配制成溶液、微乳液、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？衫缤ㄟ^使用包衣料(諸如卵磷脂)、通過維持所需的粒度(就分散體而言)以及通過使用表面活性劑而維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，將優(yōu)選的是，在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。注射用組合物的延遲吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠而實(shí)現(xiàn)。

無菌注射用溶液可通過以下方式制備：將活性化合物按所需的量與上文列舉的成分中的一種或組合一起摻入合適的溶劑中，然后進(jìn)行除菌微濾。一般來講，分散體通過以下方式制備：將活性化合物摻入無菌媒介物中，該媒介物含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文列舉的那些成分的所需其它成分。就用于制備無菌注射用溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方式是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其從之前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分與任何另外的所需成分的粉末。

可與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑量形式的活性成分的量將根據(jù)進(jìn)行治療的受試者和特定的施用模式而變化?？膳c載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑量形式的活性成分的量一般將為產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般來講，在100％之中，該量將為約0.01％至約99％的活性成分，優(yōu)選約0.1％至約70％，最優(yōu)選約1％至約30％的活性成分與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。

對(duì)劑量方案進(jìn)行調(diào)整以提供最佳的所需反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單次大劑量，可隨著時(shí)間施用多個(gè)分劑量，或成比例降低或增加劑量，如治療情形的緊急性所指示。尤其有利的是，以劑量單位形式配制腸胃外組合物，以便于施用和實(shí)現(xiàn)劑量均勻性。如本文所用的劑量單位形式是指適合用作待治療的受試者的單一劑量的物理分散單元；每個(gè)單元包含預(yù)定量的經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生所需治療效果的活性化合物連同所需的藥物載體。本發(fā)明的劑量單位形式規(guī)格受控于并直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，以及(b)配混這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物領(lǐng)域中固有的限制。

對(duì)于抗體的施用，劑量在從約0.0001至100mg/kg、更通常0.01至5mg/kg宿主體重的范圍內(nèi)。例如，劑量可以為0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內(nèi)。示例性治療方案采用每周施用一次、每?jī)芍苁┯靡淮?、每三周施用一次、每四周施用一次、一個(gè)月施用一次、每3個(gè)月施用一次或每3至6個(gè)月施用一次。本發(fā)明的抗半通道抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)由靜脈內(nèi)施用1mg/kg體重或3mg/kg體重，其中抗體使用以下給藥計(jì)劃給予：(i)每四周一次持續(xù)六個(gè)劑量，然后每三個(gè)月一次；(ii)每三周一次；(iii)每三周一次3mg/kg體重，然后1mg/kg體重。

在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或更多種單克隆抗體，在這種情況下，所施用的每種抗體的劑量落在指定的范圍內(nèi)?？贵w通常多次施用。單個(gè)劑量之間的間隔可例如為每周、每個(gè)月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，如通過測(cè)量患者體內(nèi)針對(duì)靶抗原的抗體的血液水平所指明。在一些方法中，調(diào)整劑量以實(shí)現(xiàn)約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度并在一些方法中實(shí)現(xiàn)約25-300μg/ml的血漿抗體濃度。

本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，以便獲得這樣的活性成分量，其對(duì)于特定患者、組合物和施用模式而言達(dá)到所需的治療反應(yīng)，而對(duì)患者無毒。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明的特定組合物的活性，施用途徑，施用時(shí)間，所采用的特定化合物的排泄率，治療持續(xù)時(shí)間，與所采用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料，所治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和先前醫(yī)療史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。

“治療有效劑量”的抗半通道抗體導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性減輕、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加或預(yù)防因疾病困擾所導(dǎo)致的損傷或殘疾。治療有效量的治療化合物或抗體可減少受試者體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移或以其它方式緩解癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠基于諸如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和所選的特定組合物或施用途徑等因素來確定這種量。

本發(fā)明的組合物可使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一種或多種通過一種或多種施用途徑進(jìn)行施用。如技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，施用途徑和/或模式將根據(jù)所需的結(jié)果而變化。本發(fā)明的抗體的優(yōu)選施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或其它腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文所用的短語“腸胃外施用”意指腸道和局部施用之外的施用模式(通常通過注射施用)并包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。