交叉引用

本申請(qǐng)要求2013年12月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)no.61/915,790的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此以援引方式全文并入本申請(qǐng)并用于所有用途。

本發(fā)明涉及用于將rna遞送至細(xì)胞和生物體的納米顆粒及其制作方法和使用方法。

背景技術(shù)：

核糖核酸（rna）是一種核酸分子，與包含脫氧核糖的雙鏈dna不同，其主要是單鏈并含有核糖。rna本質(zhì)上不如dna穩(wěn)定，因其更易于水解。這使得向細(xì)胞或生物體提供rna很困難，因其容易分解，導(dǎo)致生物活性不活躍。

核糖核酸酶是催化rna降解的酶。核糖核酸酶在所有細(xì)胞中均非常常見(jiàn)，導(dǎo)致處于未受保護(hù)環(huán)境中的任何rna的壽命都非常短。已經(jīng)發(fā)展出的保護(hù)rna不受核糖核酸酶影響的自然機(jī)制包括5'端封端，3'端多聚腺苷酸化，rna蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)的折疊，和核糖核酸酶抑制劑（ri）。但是，rna向細(xì)胞或生物體的遞送，因可降解rna的核糖核酸酶的普遍存在和高耐受性而大大復(fù)雜化，給向細(xì)胞提供rna造成了困難。目前，大多通過(guò)編碼所述rna的dna來(lái)將rna遞送至細(xì)胞，例如以載體的形式，從而在細(xì)胞內(nèi)原位合成rna。但是，這種方法要求需向細(xì)胞引入一系列控制、選擇和檢測(cè)分子。所述附加分子令生產(chǎn)復(fù)雜化，且出于細(xì)胞毒性考慮，并不總是希望其存在。

rna遞送的相關(guān)問(wèn)題隨著“rna干擾”（rnai）技術(shù)——一種由fire,mello及其同事在90年代末發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制——而升級(jí)。rnai是指對(duì)靶細(xì)胞或靶器官內(nèi)的蛋白的特定向下調(diào)節(jié)。在基因治療中使用這樣的rnai，則需要將所述rnai遞送到細(xì)胞中。

類(lèi)似地，可通過(guò)將小干擾rna（sirna）分子引入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而改變細(xì)胞中的眾多多余蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。

將sirna，即一種與靶mrna具有互補(bǔ)性的雙鏈的21-23個(gè)核苷酸的rna雙鏈，分離為單鏈，即所謂的隨從鏈和引導(dǎo)鏈。在隨從鏈降解時(shí)，將引導(dǎo)鏈并入rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（risc）中，結(jié)合其互補(bǔ)mrna并通過(guò)rna酶（argonaute）激活的方式防止其翻譯。由于具有簡(jiǎn)單性和低劑量效應(yīng)，rnai技術(shù)可以看作一種具有治療多種疾病的潛力的精妙工具。

已報(bào)道了各種用于遞送sirna進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的方法，如聚合物納米顆粒（nps），脂質(zhì)體和以葉酸、膽固醇、生物素或熒光分子進(jìn)行表面修飾(guoetal.,adv.drugdel.rev.2010,62,650;kapooretal.,intjpharm,2012,427,35.;andtanetal.,small2011,7,841.)。

為了提高基因沉默效率，病毒載體也已被用于sirna遞送。盡管如此，克服病毒載體致瘤性和免疫原性仍然是基于病毒的sirna遞送的重大障礙(whiteheadetal.,nat.rev.drugdiscov.2009,8,129.)。目前，裸sirna的細(xì)胞吸收性不佳，會(huì)被rna酶快速降解，且sirna難以靶向全身性疾病位點(diǎn)，限制了sirna治療的廣泛使用（guoetal.,2010）。為了克服所述問(wèn)題，基于脂質(zhì)體或聚合物的sirna遞送體系已成功用于局部sirna遞送，尤其是對(duì)眼內(nèi)，皮內(nèi)，肝臟，神經(jīng)，肺的標(biāo)靶而言。除了有效的細(xì)胞吸收外，載體的非毒性/無(wú)免疫原性和sirna的有效細(xì)胞內(nèi)遞送，對(duì)于rnai作為治療劑發(fā)揮作用均是必需的。因此，目前的研究主要集中在非病毒載體，如基于聚合物的納米顆粒，來(lái)克服這些困難。但是，大多數(shù)非病毒載體缺乏可接受的療效，且具有高水平毒性（tanetal.,2011）。

因此，用于sirna治療的有效、安全的遞送體系仍然存在挑戰(zhàn)。

donathetal.(angew.chem.int.ed.engl.1998,37,2201.)首先記載了聚陽(yáng)離子和聚陰離子的疊層（lbl）在膠體上的自組裝?；趲д姾珊蛶ж?fù)電荷的聚合物之間的靜電相互作用的溫和裝配，是一種簡(jiǎn)單的多用途方法，具有高實(shí)用性。此前的研究集中在微顆粒/納米顆粒，例如聚苯乙烯膠乳，二氧化硅和三聚氰胺甲醛，和生物相容性更高的模板，例如碳酸鈣，聚（d，l-丙交酯-共-乙交酯）（plga）平面模板，以及生物細(xì)胞。

酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc;也稱(chēng)為骨連接素）是調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用和細(xì)胞遷移的鈣結(jié)合胞外基質(zhì)糖蛋白。sparc的表達(dá)增加與組織疤痕及纖維化之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。在纖維化疾病中觀察到sparc的表達(dá)增加，且以sparc表達(dá)為標(biāo)靶來(lái)調(diào)節(jié)纖維化已被評(píng)價(jià)為一種潛在的治療方法。

纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）的分泌和沉積，是各種疾病，如高血壓，糖尿病，肝硬化和炎癥過(guò)程的常見(jiàn)結(jié)果。在纖維化中，存在sparc表達(dá)增加，表明sparc蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。sparc的表達(dá)和向上調(diào)節(jié)已在人體組織和??動(dòng)物模型中的多種類(lèi)型的纖維化中得到報(bào)告。研究人員已經(jīng)證明，sparc表達(dá)抑制能夠降低涉及皮膚、肝、腎、肺、腸纖維化和青光眼中的纖維化。seetetal(plosone,2010,5,9415)報(bào)告，sparc的減少提高了眼部瘢痕形成的外科手術(shù)小鼠模型中的手術(shù)成功率。因此，sparc靶向表達(dá)已被看作是用于創(chuàng)傷調(diào)控和降低瘢痕形成的一種潛在的治療策略，因?yàn)閟parc向下調(diào)節(jié)還使得細(xì)胞遷移延遲，降低膠原收縮性，并降低促纖維化基因和促炎性基因的表達(dá)(seetetal.,j.cell.mol.med.2012,16,1245)。

酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc）的蛋白質(zhì)表達(dá)增加與組織疤痕形成和纖維化相關(guān)，而sparc抑制可以減少疤痕形成。因此，以sparc為標(biāo)靶的sirna是抑制sparc，減少疤痕形成的一種有潛力的方法。其困難在于，將具有生物活性的sparcsirna遞送到損傷部位。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，通過(guò)提供以下內(nèi)容來(lái)滿足向標(biāo)靶位點(diǎn)遞送完整rna的方法的要求：用于將rna遞送至細(xì)胞的多層納米顆粒，所述納米顆粒包括：核心納米顆粒，其以交替的帶正電荷和帶負(fù)電荷的聚合物層包覆，其中所述層的數(shù)目為2個(gè)或以上，且其中所述帶負(fù)電荷的聚合物層中的至少一個(gè)包括rna或由其組成。

本發(fā)明的又一方面涉及用于制備根據(jù)本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒的方法，包括以下步驟：a.提供納米顆粒核心；b.令所述納米顆粒核心與帶正電荷或帶負(fù)電荷的聚合物接觸，以在所述納米顆粒核心上形成第一聚合物層；c.令步驟b得到的被包覆的納米顆粒與帶有與步驟b使用的所述聚合物相反電荷的聚合物接觸，以在所述納米顆粒上形成第二聚合物層；d.任選地，重復(fù)步驟b和c，其中所述帶負(fù)電荷的聚合物層中的至少一個(gè)包括rna或由其組成。

本發(fā)明的又一方面涉及用于向細(xì)胞或生物體遞送rna（sirna）的方法，包括：令所述細(xì)胞或生物體與有效劑量的根據(jù)本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒接觸。

本發(fā)明的又一方面涉及用于對(duì)對(duì)象的rna治療的疾病或紊亂進(jìn)行治療的方法，包括：用有效劑量的根據(jù)本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒向所述對(duì)象給藥。

本發(fā)明的又一方面涉及本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒用于向細(xì)胞或生物體遞送rna的用途。

本發(fā)明還涵蓋如本申請(qǐng)所述用于治療rna治療的疾病或紊亂的多層納米顆粒。

本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀如下附圖和各種非限制性實(shí)施例的描述，將能夠明白本發(fā)明的其他方面。

附圖說(shuō)明

附圖不一定是按比例繪制，而是通常著重于說(shuō)明各種實(shí)施例的原理。在以下的說(shuō)明中，本發(fā)明的各種實(shí)施例將參考以下附圖進(jìn)行說(shuō)明。

圖1：a：本發(fā)明所述的一個(gè)實(shí)施例中的多層納米顆粒的制作的示意圖和b：通過(guò)將多層納米顆粒送入細(xì)胞中來(lái)遞送rna至細(xì)胞中的示意圖。

圖2.siglo（siglogreen轉(zhuǎn)染標(biāo)記，一種定位至細(xì)胞核的熒光寡核苷酸雙鏈）插入疊層（lbl）包覆的pem納米顆粒的多層中。所述pem納米顆粒上的siglo涂層通過(guò)ζ電位測(cè)定：如圖所示為來(lái)自具有正電荷的聚-l-精氨酸和帶負(fù)電荷的硫酸葡聚糖聚電解質(zhì)和siglo層的交替包覆所得的pem納米顆粒的交替的ζ電勢(shì)。將帶負(fù)電荷的sirna載入第4層和第6層，產(chǎn)生顯著的負(fù)電動(dòng)電位。如圖所示為三次獨(dú)立測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖3.總結(jié)了多層納米顆粒隨著層數(shù)增加的尺寸、分散度和ζ電勢(shì)（ha=羥基磷灰石;arg=聚-l-精氨酸，dxs=硫酸葡聚糖，sparc=sparcsirna）的表格。

圖4.細(xì)胞對(duì)含有siglo的pem納米顆粒的吸收。如圖所示為與載有siglo的pem納米顆粒共培養(yǎng)1天之后的fibrogro細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。細(xì)胞體內(nèi)部的點(diǎn)狀綠色熒光表示由fibrogro吸收的載有siglo的pem納米顆粒，其特別由透射光以及兩者的疊加來(lái)展示。

圖5.含有l(wèi)blnps的siglo的細(xì)胞相互作用。如圖所示為（a-c）與載有siglo的lblnps共培養(yǎng)1天之后的fibrogro細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。（a）細(xì)胞體內(nèi)部的點(diǎn)狀綠色熒光表示由fibrogro吸收的載有siglo的lblnps，其特別由(b)透射光以及(c)兩者的疊加來(lái)展示。未標(biāo)記的對(duì)照（與含有未標(biāo)記sirna的lblnps共培養(yǎng)的fibrogro細(xì)胞）如(d-f)的痕跡所示。(e)痕跡所示為透射，而(f)痕跡所示為疊加。細(xì)胞核用dapi染色，以便清楚地與細(xì)胞質(zhì)相區(qū)分。如圖所示為三次獨(dú)立測(cè)量的代表性共聚焦圖像。

圖6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的納米顆粒吸收。包覆有arg、dxs和siglo的ha納米顆粒與fibrogro細(xì)胞共培養(yǎng)一天。如圖所示為以載有siglo的lblnps處理的fibrogro細(xì)胞在臺(tái)盼藍(lán)終止之前（黑色圖）和之后（淺灰色圖）的直方圖。以含未標(biāo)記sirna的lblnps處理的fibrogro細(xì)胞（灰色圖）作為對(duì)照。如圖所示為三次獨(dú)立測(cè)量的代表性數(shù)據(jù)。

圖7.載有siglo的lblnps在fibrogro細(xì)胞內(nèi)的定位。如圖所示為對(duì)fibrogro細(xì)胞對(duì)該納米顆粒的吸收和伴隨溶酶體染色的clsm研究。在不同時(shí)間點(diǎn)（a）4小時(shí),（b）24小時(shí)和（c）72小時(shí)用溶酶體紅色熒光染料（lysotrackerred）進(jìn)行染色。圖3b和3c中的箭頭指向np和內(nèi)涵體（橙色）的共定位區(qū)域。在72小時(shí)后，圖3c中的彌漫綠色區(qū)域來(lái)源于從nps“釋放”的sirna分子的聚結(jié)。比例尺代表50微米。如圖所示為三次獨(dú)立測(cè)量的代表性共聚焦圖像。

圖8.sparc-sirna包覆的五層lblnps的tem圖像；比例尺(a)200nm;(b)50nm。

圖9.使用bioradchemidoc系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和抗體處理：（a）免染凝膠中的蛋白分離；（b）使用transblot?系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜。（c）以如下示例順序在chemidoc成像儀下查看底物處理后對(duì)應(yīng)于sparc（43kda）的條帶：（1）具有sparc-sirna層的lblnps，（2）具有sparc-sirna層的lblnps，（3）空白細(xì)胞，（4）帶sparc-sirna的脂質(zhì)體lipofectamine，（5）帶雜亂sirna（scrambled-sirna）的lipofectamine。

圖10.載有sparc-sirna的lblnps在fibrogro細(xì)胞中的抑制效率百分比。a：納米顆粒處理后96小時(shí)。lblnps由一層sparc-sirna，空白細(xì)胞，帶sparc-sirna的lipofectamine（lf），帶雜亂sirna的lipofectamine組成。b：2天，c：7天和d：14天。*p<0.001。實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖11.sparc的相對(duì)mrna和rpl13水平表明，使用載有sparc-sirna的lblnps在fibrogro細(xì)胞中的有效基因沉默。如圖所示為在以lbl-sparcsirna，lipofectamine-sparcsirna處理之后96小時(shí)時(shí)相對(duì)于對(duì)照的值。未經(jīng)處理的細(xì)胞和lipofectamine-雜亂sirna用作對(duì)照。*p<0.01。實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（n=3）。平均值±sd。

圖12.疊層包覆的lblnps培養(yǎng)后的fibrogro細(xì)胞的增殖模式。以下各項(xiàng)的細(xì)胞增殖測(cè)定：（a）展示了以不同量的lblnps培養(yǎng)的fibrogro細(xì)胞?？瞻祝ê谏┲竷H包含細(xì)胞培養(yǎng)基的孔。fibrogro（a，紅色）的陽(yáng)性對(duì)照指的是不添加lblnps的細(xì)胞。（b）以不同量的lblnps培養(yǎng)7天的fibrogro細(xì)胞的mtt細(xì)胞增殖測(cè)定。不同量的lblnps（每孔2,5,15和20μg）與細(xì)胞共培養(yǎng)7天，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。如圖所示為三次測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖13.通過(guò)納米顆粒進(jìn)行sirna進(jìn)入結(jié)膜的體內(nèi)遞送。在實(shí)驗(yàn)手術(shù)后，立即將5微升載有所示sirna的lblnps注射到小鼠結(jié)膜中。在手術(shù)后第7天（a）和第14天（b）收獲組織，并通過(guò)實(shí)時(shí)pcr對(duì)sparc（左）和col1a1（右）的mrna表達(dá)進(jìn)行分析。每個(gè)符號(hào)表示來(lái)自3只小鼠的組織庫(kù)，并計(jì)算為來(lái)自左眼的經(jīng)納米顆粒注射的術(shù)后組織中的表達(dá)相對(duì)于來(lái)自右眼的配對(duì)未手術(shù)組織中的表達(dá)的比率。黑色條表示每種條件的平均倍數(shù)變化。箭頭表示載有sisparc的納米顆粒相對(duì)于載有siscram的納米顆粒的改變方向。箭頭左邊的數(shù)字表示使用siscram相對(duì)于使用sisparc的平均倍數(shù)變化，箭頭右邊的數(shù)字表示比較siscram和sisparc納米顆粒注射之間的倍數(shù)變化的p值。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了作為rna載體具有顯著優(yōu)點(diǎn)的多層納米顆粒。作為高度可定制的載體體系，其具有提供高吸收效率以及局部rna釋放的潛力，如圖1所示。顆粒表面的聚電解質(zhì)可以與細(xì)胞質(zhì)的若干大分子相互作用，從而有利于多層分解。細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的生物聚合物層的逐漸降解，允該多層裝載的載荷的釋放。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及，用于將rna遞送至細(xì)胞的多層納米顆粒，所述納米顆粒包括：核心納米顆粒，其以交替的帶正電荷和帶負(fù)電荷的聚合物層包覆，其中所述層的數(shù)目為2或以上，且其中所述帶負(fù)電荷的聚合物層中的至少一個(gè)包括rna或由其組成。

本申請(qǐng)所稱(chēng)“多層納米顆?！笔侵?個(gè)或以上的層包覆在納米顆粒核心上。由于所述層優(yōu)選為使用疊層方法進(jìn)行包覆，該多層納米顆粒也可以稱(chēng)為疊層納米顆粒（lblnps）。所述至少兩層中的第一層直接包覆納米顆粒核心，即與核心表面直接接觸，稱(chēng)為最內(nèi)層。形成多層納米顆粒的外表面的頂層包覆層，即最遠(yuǎn)離核心表面的聚合物層，稱(chēng)為最外層。應(yīng)當(dāng)了解，此最外層的聚合物層可以由額外一層靶向化合物包覆，如下詳述。

所述最內(nèi)層和最外層之間，一般可以有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10層或更多層。但是，在各種實(shí)施例中，多層納米顆粒包含3至10層。

優(yōu)選地，所述多層納??米顆粒的尺寸為從約100至約5000nm，且在形式上基本為球形。如本申請(qǐng)中所描述的多層納米顆粒的直徑范圍可以為約100nm至約500nm；約120nm至約450nm；約200nm至約300nm。在一些實(shí)施例中，所述多層納米顆粒的直徑范圍在約200nm至約500nm。

如本申請(qǐng)所述的“rna”是指核糖核酸（rna）。rna可以是生物或合成來(lái)源的，且可以是單鏈或雙鏈。所述rna可以是信使rna（mrna），小核rna（snrna），核酶或用于rna干擾的rna，如microrna或小干擾rna（sirna）。在各種不同的實(shí)施例中，rna選自核酶，rnai和sirna。在本申請(qǐng)描述的某些實(shí)施例中，rna為sirna。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的“sirna”指的是小干擾rna。sirna是典型為18-25個(gè)核苷酸的短雙鏈rna分子，其中一條鏈（引導(dǎo)鏈）與細(xì)胞中的靶mrna互補(bǔ)，所述mrna是從作為“沉默”標(biāo)靶的基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)。用于遞送sirna的一種選擇，包括使用本申請(qǐng)所述的包覆納米顆粒。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的“納米顆粒核心”是指尺寸在約1nm至約250nm之間的任何顆粒。如本申請(qǐng)所述的納米顆粒核心的尺寸范圍可以為約1nm至約250nm；約1nm至約200nm；約1nm到約160nm；約1nm到約140nm；約1nm至約120nm；約1nm至約80nm；約1nm至約60nm；約1nm至約50nm；約5nm至約250nm；約8nm至約250nm；約10nm至約250nm；約20nm至約250nm；約30nm至約250nm；約40nm至約250nm；約85nm至約250nm；約100nm至約250nm；或約150nm至約250nm。在一些實(shí)施例中，納米顆粒核心的直徑范圍為約1nm至約100nm。

在各種實(shí)施例中，所述納米顆粒核心基本上是球形的。

在某些實(shí)施例中，所述核心可帶負(fù)電荷，以利于帶正電荷的第一聚合物層的包覆。在其他實(shí)施例中，該核心可以是帶正電荷，由此利于帶負(fù)電荷的第一層的包覆。

在一些實(shí)施例中，所述多層包括至少2個(gè)包含rna或由其組成的帶負(fù)電荷的聚合物層。在本實(shí)施例中，優(yōu)選地，總層數(shù)為至少5層，且?guī)ж?fù)電荷的聚合物層中的至少2個(gè)包含rna或由其組成。這樣的優(yōu)點(diǎn)在于，在細(xì)胞中提供了rna的持續(xù)釋放，由此可以在多層納米顆粒與細(xì)胞接觸后的至少兩個(gè)星期后測(cè)量所述rna的活性。當(dāng)然，可以進(jìn)一步提高該顆粒的層數(shù)，以容納3個(gè)或更多的（含）rna的層。

在各種實(shí)施例中，所述納米顆粒核心是生物相容性或可生物降解性的。

術(shù)語(yǔ)“可生物吸收性”，“可生物降解性”和“生物再吸收性”，在本申請(qǐng)中可互換使用，是指一種材料在一段時(shí)間內(nèi)由于化學(xué)和/或身體的生物作用降解或分解，并經(jīng)由自然系統(tǒng)（諸如排泄系統(tǒng)）安全地從人體排出或移除的能力。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“可生物吸收”是指可以從局部區(qū)域經(jīng)由生理代謝過(guò)程（例如骨吸收）完全除去的一種或多種組分。例如，可生物降解的納米顆粒核心可在細(xì)胞吸收時(shí)由細(xì)胞機(jī)構(gòu)分解成小亞基，如通過(guò)溶酶體或通過(guò)水解。然后，所述細(xì)胞可以重復(fù)使用或除去剩余物而不會(huì)對(duì)細(xì)胞帶來(lái)顯著毒性作用。生物降解過(guò)程的例子包括酶水解和非酶水解，氧化和還原。非酶促水解的合適條件包括，例如可生物降解材料在溶酶體（即細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器）的溫度和ph下暴露于水。降解片段對(duì)器官或細(xì)胞造成的過(guò)載或尤其過(guò)載或體內(nèi)其他不良影響造成的病理過(guò)程通常沒(méi)有或極小。

本領(lǐng)域中已知各種生物降解材料的示例，其中任何一種通常均適用于生物體并且沒(méi)有毒性，可以在本發(fā)明中使用。被認(rèn)為是可生物降解且適合使用在本發(fā)明中的材料包括，但不限于，脂肪族聚酯，聚（氨基酸），共聚（醚-酯），聚亞烷基草酸鹽，聚酰胺，聚（亞氨基碳酸酯），聚原酸酯，聚噁酯，聚酰胺酯，含酰氨基的聚噁酯，聚（酸酐），聚磷腈，聚碳酸酯，天然存在的可生物降解的聚合物，如殼聚糖，膠原蛋白，淀粉，及其共混物。聚原酸酯的示例包括聚丙交酯，聚乙交酯，聚己內(nèi)酯，聚乳酸，可生物降解的聚酰胺，可生物降解的脂肪族聚酯，和/或它其共聚物，聚乳酸（pla），聚己內(nèi)酯（pcl）和聚乳酸-共-乙醇酸（plga）。

此處所用“可生物相容”指的是，不干擾生物過(guò)程且可以看作生物或化學(xué)惰性材料的合成或天然材料。生物相容性材料的各種例子在本領(lǐng)域中是已知的，其中任一種均適用于本發(fā)明中且對(duì)所用的生物體無(wú)毒。視為生物相容且適用于本發(fā)明的材料的例子包括，但不限于，羥基磷灰石，二氧化硅，碳酸鈣，金，聚苯乙烯膠乳。

在各種實(shí)施例中，所述納米顆粒核心包含選自以下的材料或者由其組成：羥基磷灰石，二氧化硅，聚（丙交酯-共-乙交酯）（plga），聚乳酸（pla），碳酸鈣，金，聚苯乙烯乳膠，優(yōu)選為羥基磷灰石。

利用可生物相容且可生物降解的納米顆粒，諸如羥基磷灰石，是比以往任何候選描述已經(jīng)交付的rna少得多的細(xì)胞毒性。

在各種其它實(shí)施例中，所述納米顆粒核心包括脂質(zhì)體，優(yōu)選為納米脂質(zhì)體。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”是指由脂質(zhì)和/或脂質(zhì)衍生物和/或脂質(zhì)樣分子（包括磷脂）組成的任何脂質(zhì)雙層囊泡結(jié)構(gòu)。

在各種實(shí)施例中，該脂質(zhì)體可以裝載有rna，使得該rna包封在脂質(zhì)體中，然后以含有至少一個(gè)rna層的兩個(gè)或以上交替帶正電荷和帶負(fù)電荷的聚合物層包覆。最外層可以由細(xì)胞靶向肽構(gòu)成，如下所述。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“納米脂質(zhì)體”指的是納米級(jí)脂質(zhì)囊泡。脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體的形成機(jī)制基本在于兩親脂質(zhì)和水分子之間的親水-疏水相互作用。在納米級(jí)范圍內(nèi)制備囊泡用作納米顆粒核心，其隨后用包含至少一個(gè)含rna層的交替帶正電荷和帶負(fù)電荷的聚合物層包覆，如本申請(qǐng)所述。還可??以通過(guò)使用如本申請(qǐng)所述的以脂質(zhì)體或納米脂質(zhì)體作為納米顆粒核心并采用被動(dòng)或主動(dòng)靶向機(jī)制（如細(xì)胞靶向肽）的多層納米顆粒，有效地實(shí)現(xiàn)靶向治療。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“層”，指的是覆蓋在納米顆粒核心和/或其下面的層的至少一部分上的包覆膜。該層優(yōu)選為連續(xù)的，并基本上覆蓋該核心或直接在核心下方的層的整個(gè)表面。該層的厚度可通過(guò)制作條件來(lái)控制，但通常為1至110nm。

在上述的多層顆粒的各種實(shí)施例中，最外層是帶正電荷的聚合物。相比于其它遞送方法，該多層納米顆粒方法允許在將rna分子送入細(xì)胞質(zhì)的同時(shí)，以及可能在其處于細(xì)胞質(zhì)中的期間，對(duì)其更好地進(jìn)行保護(hù)，因?yàn)樽钔鈱硬⒎莚na，而是帶正電荷的聚電解質(zhì)。

在各種實(shí)施例中，最內(nèi)層是帶正電荷的聚合物。

在各種實(shí)施例中，rna層夾在兩個(gè)帶正電荷的聚合物層之間。這對(duì)保護(hù)rna具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樽钔鈱硬皇莚na，且允許rna較慢地釋放進(jìn)入細(xì)胞。

在各種實(shí)施例中，帶正電荷的聚合物為聚陽(yáng)離子。

在各種實(shí)施例中，帶負(fù)電荷的聚合物為聚陰離子。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“聚陽(yáng)離子”或“聚陰離子”，指的是具有帶電荷或可能帶電荷的重復(fù)單元的聚電解質(zhì)或聚合物。在后一種情況下，所述基團(tuán)離解在水性溶液（水）中，使聚合物帶電荷。聚陽(yáng)離子是帶凈正電荷的聚合物。聚陰離子是帶凈負(fù)電荷的聚合物。

通過(guò)用交替的帶正電荷和帶負(fù)電荷的聚合物層來(lái)包覆核心納米顆粒，所包含的rna層受到保護(hù)，直到其釋放到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并在其中有效地執(zhí)行其功能。所述多層同時(shí)提供對(duì)rna的保護(hù)和逐步釋放。

在各種實(shí)施例中，帶正電荷的聚合物包含聚（l-精氨酸）或由其組成。

在各種實(shí)施例中，帶負(fù)電荷的聚合物包括硫酸葡聚糖或由其組成。

在各種實(shí)施方式中，多層納米顆粒還包含靶向肽或蛋白作為最外層。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“靶向肽”或“蛋白質(zhì)”，指的是指引該多層納米顆粒運(yùn)輸?shù)礁信d趣細(xì)胞的蛋白質(zhì)或肽。其也可以稱(chēng)為信號(hào)肽。其可以包括識(shí)別特異細(xì)胞受體或信道的抗體或短肽（3-70個(gè)氨基酸長(zhǎng)）。在各種不同的實(shí)施例中，所述靶向肽或蛋白選自tat肽，內(nèi)吞作用介導(dǎo)的兩親性肽，和葉酸受體靶向部分。

所述的多層方法還能容易地使用靶向肽作為最外層，由此允許顆粒和sirna的靶特異性遞送。所述靶向肽包括，tat肽，內(nèi)吞作用介導(dǎo)的兩親性肽，例如endoporter?肽和葉酸受體靶向部分。

在各種實(shí)施例中，所述rna是sirna，并靶向酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc）基因。

在各種實(shí)施例中，所述sirna具有如seqidno：1（aacaagaccuucgacucuuuc）所示的核苷酸正義序列和如seqidno：2（ggaagagucgaaggucuuguu）所示的核苷酸反義序列。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于制作如本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒的方法，包括以下步驟：a）提供納米顆粒核心;b）令所述納米顆粒核心與帶正電荷或帶負(fù)電荷的聚合物接觸，以在納米顆粒核心上形成第一聚合物層；c）令步驟b得到的被包覆的納米顆粒與帶有與步驟b所述聚合物相反電荷的聚合物接觸，以在所述納米顆粒上形成第二聚合物層;d）可選地，重復(fù)步驟b和c，其中所述帶負(fù)電荷的聚合物層中的至少一個(gè)包括rna或由其組成。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于向細(xì)胞或生物體遞送rna（sirna）的方法，包括：令所述細(xì)胞或生物體與有效劑量的本申請(qǐng)所述多層納米顆粒接觸。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的rna可以遞送到體外培養(yǎng)細(xì)胞，或者其可以遞送至體內(nèi)細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，包括含有待遞送rna的任何生物體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

在各種實(shí)施例中，該生物體可以指細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物，優(yōu)選的生物體是哺乳動(dòng)物，例如大鼠，小鼠，馬，或人。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于治療對(duì)象的rna治療的疾病或紊亂的方法，包括：使用有效劑量的本申請(qǐng)所述多層納米顆粒向所述對(duì)象給藥。

術(shù)語(yǔ)“rna治療的疾病或病癥”，涉及適合于用rna治療的任何病癥。示例性疾病包括，但不限于，過(guò)度增殖性疾病，包括癌癥，以及高血壓，糖尿病，肝硬化和炎癥性疾病。

本申請(qǐng)所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”指的是細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物，優(yōu)選的生物體是哺乳動(dòng)物，例如大鼠，小鼠，馬，或人。

在各種實(shí)施例中，所述rna是抑制酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc）表達(dá)以減少對(duì)象瘢痕形成的sirna。

在各種實(shí)施方式中，在手術(shù)后用有效量的多層納米顆粒向結(jié)膜給藥，其中優(yōu)選地，所述rna為抑制酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc）表達(dá)的sirna。

本發(fā)明的又一方面涉及如本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒用于將rna遞送給細(xì)胞或有機(jī)體的用途。

本發(fā)明的又一方面涉及如本申請(qǐng)所述的多層納米顆粒用于治療rna治療的疾病或病癥的用途。

在各種實(shí)施例中，所述rna是抑制酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（sparc）表達(dá)以減少哺乳動(dòng)物疤痕，如大鼠，小鼠，馬，或人的瘢痕形成的sirna。

在各種實(shí)施例中，生物相容性羥磷灰石納米顆粒核心上包覆有聚精氨酸和硫酸葡聚糖（dxs）層，以及包含sparc-sirna或由其組成的層?？梢宰C實(shí)，所述載有sparc-sirna的多層納米顆粒，成功地由小鼠成纖維細(xì)胞吸收，以遞送sirna。這表明sparc蛋白質(zhì)在這些細(xì)胞中的成功抑制。由帶正電荷的表面層（arg）來(lái)促進(jìn)對(duì)于細(xì)胞吸收至關(guān)重要的初始細(xì)胞結(jié)合，引起內(nèi)吞作用吸收，如納米顆粒與內(nèi)涵體的共定位所示。隨后是（大部分）完整的納米顆粒的內(nèi)涵體逃逸，其中帶電荷外層促進(jìn)了內(nèi)涵體中的孔形成。單個(gè)多層納米顆粒處理中，達(dá)到了至多60％的sparc蛋白抑制。sparc和rpl13mrna的相對(duì)水平顯著降低至0.4±0.04倍，這表明有效的sparc基因沉默可以通過(guò)多層納米顆粒的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，沒(méi)有觀察到與成纖維細(xì)胞中的多層納米顆粒治療相關(guān)的細(xì)胞毒性，證明多層納米顆粒作為用于rna遞送(例如sirna)的潛在非病毒載體的安全性。總之，這些發(fā)現(xiàn)證明了疊層納米顆粒作為抑制mrna的非病毒治療方法的潛在發(fā)展。

因此，已經(jīng)展示了，由arg作為聚陽(yáng)離子和dxs作為聚陰離子構(gòu)成的載有sparc-sirna的多層納米顆粒，可以有效地將sirna遞送至成纖維細(xì)胞中，并具有低得多的毒性。此外，由多層納米顆粒進(jìn)行sparc-sirna遞送，能夠特異性地減少成纖維細(xì)胞中的靶蛋白表達(dá)水平。所述以ha（羥基磷灰石）為核心的多層納米顆粒，相對(duì)于sirna的化學(xué)結(jié)合物具有若干優(yōu)點(diǎn)。首先，該制型步驟非常簡(jiǎn)單，減少了制備sirna遞送體系的時(shí)間。如細(xì)胞毒性研究所示，所述多層納米顆粒rna遞送載體呈現(xiàn)出的毒性低。

這一發(fā)現(xiàn)代表著多層納米顆粒體系的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槭褂闷渌遣《绢w粒進(jìn)行基因遞送的限制因素在于具有毒性。

所謂“包括（comprising）”是指包含但不限于跟隨在單詞“包括”之后的任何內(nèi)容。因此，使用術(shù)語(yǔ)“包括”，表示所列元素是必要的或強(qiáng)制性的，但是其它元素是可選的，且可以存在或不存在。

“由...組成（consistingof）”是指包括且限于跟隨在短語(yǔ)“由...組成”之后的任何內(nèi)容。因此，短語(yǔ)“由......組成”表示所列元素是必要的或強(qiáng)制性的，并且不可以存在其它元素。

本申請(qǐng)說(shuō)明性地描述的發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦谌サ羧魏我环N或多種本申請(qǐng)未具體公開(kāi)的要素或限定后實(shí)施。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包括（comprising）”，“包含（including）”，“含有（containing）”等，應(yīng)作寬泛且非限制的解讀。另外，本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)，是作為描述性而非限制性的術(shù)語(yǔ)，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)無(wú)意排除所示和所述的特征的任何等同物或其部分，而應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明所要保護(hù)的范圍內(nèi)可能存在各種改進(jìn)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明具體公開(kāi)了優(yōu)選實(shí)施例和可選特征，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本申請(qǐng)中公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行改進(jìn)和變形，且所述改進(jìn)和變形應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本申請(qǐng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了廣泛的一般性描述。在此廣泛公開(kāi)范圍中的每種較窄的種類(lèi)和亞屬分類(lèi)均構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括對(duì)具有從本發(fā)明的種類(lèi)中排除任何主題的附加條件和否定限制的本發(fā)明的廣泛描述，無(wú)論所排除的材料是否在此具體說(shuō)明。。

以下權(quán)利要求及非限制性實(shí)施例中為其他實(shí)施例。

實(shí)施例

制作sirna多層納米顆粒

從任何材料制成的納米顆粒核心（例如羥基磷灰石（ha））開(kāi)始，用交替的正層和負(fù)層包括該核心。在一種典型的方案中，首先在100nm的ha顆粒上包覆陽(yáng)離子聚合物，如l-精氨酸（+ve電荷），隨后是硫酸葡聚糖（-ve電荷）；后續(xù)-ve層可以由sirna分子（其帶負(fù)電荷）制成?？梢杂蛇@種方式制得6層體系，如圖1所示。

所用的sirna分子稱(chēng)為siglo，因其具有熒光標(biāo)記。多層或疊層（lbl）納米顆粒（nps），是用市售的ha納米顆粒作為核心，包覆帶相反電荷的雙層生物聚合物層arg、dxs，且在雙層之間帶有sparc-sirna而制成的。雙層中的sparc-sirna涂層和聚電解質(zhì)的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，以建立多層nps，可觀的sirna裝載，并防止結(jié)塊。由于納入np多層的sirna涂層只有在當(dāng)隨后sirna釋放到細(xì)胞質(zhì)時(shí)發(fā)生層分離才有意義，使用納入lbl多層的sirna報(bào)告分子來(lái)研究其脫落。為了評(píng)估lblnps的細(xì)胞吸收，在lblnps的雙層中涂覆siglo-sirna轉(zhuǎn)染指示劑作為負(fù)電荷層；siglo-lblnps的粒徑為485nm，ζ電位為+43mv。包覆在雙層內(nèi)的siglo實(shí)際量是0.4pmole/μglblnps，包覆效率為98％±0.2。這里報(bào)告的量可認(rèn)為是足以用于基因沉默。

材料

羥基磷灰石（ha）納米顆粒（<200nm），聚-l-精氨酸鹽酸鹽（arg）（mw>70,000）和硫酸葡聚糖鈉鹽（dxs）（mw>360000）購(gòu)自sigma（新加坡）和mpbiomedicalsllc(新加坡.。siglogreen轉(zhuǎn)染指示劑購(gòu)自dharmacon，thermoscientific(新加坡)。溶酶體紅色熒光染料lysotrackerreddnd-99和opti-mem還原血清培養(yǎng)基購(gòu)自invitrogen（新加坡）。fibrogro人包皮成纖維細(xì)胞購(gòu)自millipore（新加坡）。杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基（高糖和l-谷氨酰胺dmem），無(wú)鈣、鎂的杜氏pbs，胰蛋白酶-edta，青霉素-鏈霉素和胎牛血清（fbs）購(gòu)自paalaboratories（新加坡）。臺(tái)盼藍(lán)儲(chǔ)備液（0.4％）購(gòu)自sigma-aldrich公司（新加坡）。mw13369g/mole和雜亂sparc-sirna從bio-rev,southkorea制得。

sparc-sirna:

正義-aacaagaccuucgacucuuuc(seqidno:1)

反義-ggaagagucgaaggucuuguu(seqidno:2)

雜亂sirna

正義-gcucacagcucaauccuaauc(seqidno:3)

反義-gauuaggauugagcugugagc(seqidno:4)

過(guò)程

將羥基磷灰石納米顆粒（nps）懸浮在0.2微米過(guò)濾的純化水（millipore）中，渦旋五分鐘，在12000rpm下進(jìn)行1分鐘離心（st16r，sorvall）收集，重復(fù)該過(guò)程以洗滌ha納米顆粒。將所述納米顆粒懸浮液加入到等量的0.5mg/ml的聚（l-精氨酸，arg）中，隨后渦旋和超聲處理10分鐘，并收集arg包覆的納米顆粒，用氯化鈉洗滌。將所述arg包覆的納米顆粒重懸于氯化鈉中，并加入0.5mg/ml葡聚糖硫酸鹽（dxs）作為陰離子層，且對(duì)于sparc-sirna，在sirna涂層中使用4μl20nm溶液，培養(yǎng)時(shí)間為30分鐘。lbl涂層的最后一層，是通過(guò)將包覆sirna的lblnps添加到arg隨后培養(yǎng)10分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)的。采集樣品以測(cè)量每一層的尺寸和電動(dòng)電位，對(duì)于sirna層，在230nm的nanodrop（v3.7，thermoscientific）中進(jìn)行測(cè)量，以估算lblnps上的sirna涂層。我們已經(jīng)在lblnps中分別納入了siglo,報(bào)告子-sirna,sparc-sirna，且lblnps命名如下：ha|arg|dxs|arg|sirna|arg。

制作了一種納米顆粒，其中唯一帶負(fù)電荷的聚合物是rna。將羥基磷灰石納米顆粒（nps）懸浮在0.2微米過(guò)濾的純化水（millipore）中，渦旋五分鐘，在12000rpm下進(jìn)行1分鐘離心（st16r，sorvall）收集，重復(fù)該過(guò)程以洗滌ha納米顆粒。將所述納米顆粒懸浮液加入到一定量的0.5mg/ml的聚（l-精氨酸，arg）中，隨后渦旋和超聲處理10分鐘，并收集arg包覆的納米顆粒，用氯化鈉洗滌。將所述arg包覆的納米顆粒重懸于氯化鈉中，并加入12μl1200pmol溶液，用于sparcsirna涂層中，培養(yǎng)時(shí)間為30分鐘。lbl涂層的最后一層，是通過(guò)將包覆sirna的lblnps添加到arg隨后培養(yǎng)10分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)的。得到多層納米顆粒結(jié)構(gòu)[ha│arg│sirna│arg]。

制作了另一種納米顆粒，其中唯一帶負(fù)電荷的聚合物為rna，且具有2層rna。將羥基磷灰石納米顆粒（nps）懸浮在0.2微米過(guò)濾的純化水（millipore）中，渦旋五分鐘，在12000rpm下進(jìn)行1分鐘離心（st16r，sorvall）收集，重復(fù)該過(guò)程以洗滌ha納米顆粒。將所述納米顆粒懸浮液加入到一定量的0.5mg/ml的聚（l-精氨酸，arg）中，隨后渦旋和超聲處理10分鐘，并收集arg包覆的納米顆粒，用氯化鈉洗滌。將所述arg包覆的納米顆粒重懸于氯化鈉中，并加入12μl1200pmol溶液中，用于sparcsirna涂層中，培養(yǎng)時(shí)間為30分鐘。lbl涂層的最后一層，是通過(guò)將包覆sirna的lblnps添加到arg隨后培養(yǎng)10分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所述arg涂層和sparcsirna涂層各以相同方式重復(fù)一次，得到多層納米顆粒結(jié)構(gòu)[ha│arg│sirna│arg│sirna│arg]。

多層納米顆粒的表征

可以在各層沉積后使用顆粒的ζ電位測(cè)量來(lái)驗(yàn)證分層，如圖2所示。

還研究了lblnps對(duì)載有sparc-sirna的lblnps的大小和表面電荷的影響，結(jié)果列于圖3中。sparc-sirna包覆的lblnps的大小為350nm，ζ電位為+43mv。所述sparc-sirna的包覆效率為97％，0.4pmolesparc/μglbl納米顆粒。對(duì)于基因沉默研究，使用此濃度（0.4pmolesparc/μglbl納米顆粒）來(lái)治療fibrogro細(xì)胞。

電泳遷移率

所述lblnps在每一層包覆后的電泳遷移率，是在室溫下，0.2微米過(guò)濾的0.1mnacl中使用malvernzetasizer2000（malverninstruments）來(lái)測(cè)量的。所述電動(dòng)電位（ζ電位）是使用smoluchowski函數(shù)ζ=μη/ε，其中η和ε分別是是溶劑的粘度和介電常數(shù)，使用電泳遷移率（μ）來(lái)計(jì)算。

向細(xì)胞遞送rna

為了確定多層納米顆粒是否可被遞送至細(xì)胞，將如上所述制作的siglo顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)，來(lái)評(píng)估顆粒向細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)入。這是通過(guò)使用經(jīng)標(biāo)記的sirna顆粒（稱(chēng)為“siglo”）來(lái)完成的。如果具有siglo涂層的顆粒進(jìn)入細(xì)胞，則通過(guò)共聚焦顯微鏡使用期望波長(zhǎng)的激光使其可見(jiàn)，如圖4所示。

基于羥基磷灰石（ha）的lbl體系，在成纖維細(xì)胞中提供了有效的基因抑制。使用聚-l-精氨酸（arg），硫酸葡聚糖（dxs）對(duì)疊層結(jié)構(gòu)的抑制效率進(jìn)行了測(cè)試，優(yōu)化了對(duì)細(xì)胞的進(jìn)入和脫落。

所述載體結(jié)合了sparc-sirna，以進(jìn)行胞內(nèi)運(yùn)輸和靶向成纖維細(xì)胞（fibrogro）中的sparc-mrna。為了研究包覆到的lblnps上的sparc-sirna的細(xì)胞結(jié)合、吸收和細(xì)胞內(nèi)加工，使用siglo-綠色轉(zhuǎn)染指示劑（siglo）作為lblnps中的一種多層成分。在fibrogro細(xì)胞中，通過(guò)共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀的方式，對(duì)納米顆粒的吸收和細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行了調(diào)查。fibrogrotm細(xì)胞中的靶蛋白表達(dá)水平，通過(guò)chemidoc?免疫印跡技術(shù)來(lái)評(píng)估，而mrna水平（lbl處理后）則通過(guò)rt-pcr來(lái)量化。

帶siglo的多層納米顆粒

細(xì)胞結(jié)合是通過(guò)帶正電荷的lblnps和細(xì)胞膜之間的靜電相互作用來(lái)進(jìn)行的。由此一來(lái)，lblnps最外層的電荷在lblnps/細(xì)胞相互作用的第一步驟中起著關(guān)鍵作用。因此，使用含arg作為最外層的多層成分的lblnps來(lái)研究fibrogro的細(xì)胞吸收。除了電荷以外，大小是影響細(xì)胞吸收速率的重要參數(shù)。多層納米顆粒相比微粒更容易被細(xì)胞吸收。對(duì)于lblnps結(jié)合和吸收，使用clsm進(jìn)行定性分析并使用流式細(xì)胞儀（fcm）進(jìn)行定量分析（2.5nglblnps/細(xì)胞）。圖5所示為培養(yǎng)1天后，相當(dāng)數(shù)量的lblnps在fibrogro細(xì)胞內(nèi)和附著在fibrogro細(xì)胞（a-c）的典型clsm圖像。含有未標(biāo)記的sirna的lblnps如痕跡d-f所示。根據(jù)透射（b，e）和疊加(c,f)圖片，熒光顆粒只存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，但不是細(xì)胞核內(nèi)。用dapi進(jìn)行的核染色支持細(xì)胞核中無(wú)法找到顆粒的結(jié)論。這表明fibrogro細(xì)胞能夠內(nèi)化載有siglo的lblnps，但是該顆粒太大而不能進(jìn)入細(xì)胞核。這一結(jié)果與zhouet.al.(macromol.biosci.2009,9,326.)的發(fā)現(xiàn)，即具有殼聚糖/藻酸鹽多層的400nmplga納米顆粒進(jìn)入肝細(xì)胞，但是共聚焦圖像中并未發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核中的定位。

fibrogro細(xì)胞中的lblnps吸收采用了流式細(xì)胞儀測(cè)量進(jìn)行研究，包括用錐蟲(chóng)藍(lán)終止以避免細(xì)胞表面粘合納米顆粒（圖6）。內(nèi)吞入細(xì)胞中的納米顆粒免受錐蟲(chóng)藍(lán)終止影響，因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)無(wú)法滲透活細(xì)胞。但是，結(jié)合至細(xì)胞膜外表面的顆粒將暴露在錐蟲(chóng)藍(lán)的影響下并隨后終止。

用含有未標(biāo)記sirna的對(duì)照l(shuí)blnps（gmean-8±0.1）處理和以終止后的載有siglo的lblnps處理（gmean-100±0.7）的fibrogro細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的對(duì)比，清??楚地表明了lbl納米顆粒的細(xì)胞吸收。在終止之前和之后用lblnps處理fibrogro細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化，表明了lblnps與fibrogro細(xì)胞在細(xì)胞吸收過(guò)程中的強(qiáng)烈相互作用。向經(jīng)含有siglo的lblnps處理的fibrogro細(xì)胞中加入臺(tái)盼藍(lán)，產(chǎn)生了相當(dāng)微小的熒光強(qiáng)度變化。因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)終止后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于對(duì)照細(xì)胞組的熒光強(qiáng)度，這表明了fibrogro細(xì)胞對(duì)lblnps的成功內(nèi)吞。

為了獲得關(guān)于載有rna的lblnps的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)定位信息，在lbl納米顆粒吸收期間執(zhí)行l(wèi)ysotracker染色。隨著細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生mrna階段的基因沉默，細(xì)胞內(nèi)的納米顆粒的去向和細(xì)胞內(nèi)定位，必須確保sirna在該空間中的可用性。從內(nèi)涵體逃逸對(duì)于sirna有效遞送到細(xì)胞質(zhì)中是重要的。

圖7描繪了在不同顆粒培養(yǎng)時(shí)間下捕捉到的活細(xì)胞共聚焦圖像：在lbl培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)后（圖7a），我們觀察到由lblnps包圍的細(xì)胞，以及細(xì)胞內(nèi)的一些點(diǎn)狀綠色熒光，表明存在于納米顆粒內(nèi)的siglo。該熒光的點(diǎn)狀性質(zhì)是源于仍然包含在納米顆粒（可能聚集）中的siglo。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加至24小時(shí)，可見(jiàn)綠色siglo熒光和紅色lysotracker的共存（橙色或黃色，在圖7b中重疊），表明lbl顆粒定位在內(nèi)涵體中。72小時(shí)，圖7c示出了細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀熒光（綠色）地區(qū)以及彌漫區(qū)域。這是源于包含siglo的納米顆粒從內(nèi)涵體成功逃逸，且伴隨一些自由siglo分子并發(fā)或連續(xù)地釋放然后聚集以形成彌漫綠色區(qū)域。

lbl納米顆粒相關(guān)的siglo釋放是從熒光擴(kuò)大和斑點(diǎn)聚結(jié)以及熒光隨后彌漫分布到整個(gè)細(xì)胞來(lái)推斷的。在未處理細(xì)胞（空白）中未觀察到sirna相關(guān)的熒光，且綠色siglo和內(nèi)涵體的共定位，以及隨后的siglo釋放，表明lblnps被成功吸收到fibrogro細(xì)胞中，且所述siglo釋放是漸進(jìn)的。除了通過(guò)透射電子顯微鏡確定的平均lbl平均粒徑為200nm（圖8a和8b）之外，sirna包覆的lblnps的球形形狀和平滑形態(tài)也可能促進(jìn)了有效細(xì)胞吸收。通過(guò)內(nèi)涵體共定位[39]觀察到，所述fibrogro細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用吸收聚（l-精氨酸）包覆的lblnps，并進(jìn)一步地，該siglo-lbl納米顆粒通過(guò)在內(nèi)涵體脂質(zhì)雙層中孔形成孔而從內(nèi)涵體逃逸。在非病毒載體的情形中，例如帶正電荷的nps和表面修飾的plganps中，細(xì)胞吸收的主要機(jī)制是通過(guò)內(nèi)吞作用。

內(nèi)涵體酸化幾乎在納米顆粒從質(zhì)膜分離后便立即開(kāi)始，因?yàn)槠鋬?nèi)腔不再與周?chē)募?xì)胞內(nèi)介質(zhì)連通。所述arg肽（其pka?11.5）的預(yù)期質(zhì)子化ph遠(yuǎn)低于11，因此，當(dāng)其進(jìn)入內(nèi)涵體時(shí)，已經(jīng)完全帶正電荷（無(wú)質(zhì)子海綿效應(yīng)）。隨后，帶正電荷的lbl納米顆粒與磷脂膜相互作用，形成足夠大可供納米顆粒鉆過(guò)的孔。此逃逸由點(diǎn)狀綠色區(qū)域（其不是單個(gè)顆粒，而可以是聚集體）確認(rèn)。接著，所述層脫落以在細(xì)胞質(zhì)中釋放siglo分子，且所述分子將積聚以形成隨培養(yǎng)時(shí)間生長(zhǎng)的彌漫綠色區(qū)域。herceetal.(physrevlett,2004,92,19)和huangetal.(biophyj.2009,97,1917)報(bào)告，陽(yáng)離子肽與雙脂層的結(jié)合引起強(qiáng)到足以在內(nèi)涵體脂質(zhì)膜中產(chǎn)生孔的內(nèi)部應(yīng)力。

細(xì)胞培養(yǎng)和lbl納米顆粒的細(xì)胞吸收

在dmem（10％fbs，青霉素/鏈霉素）中培養(yǎng)人包皮衍生fibrogro細(xì)胞，并在37℃和5％co2下培養(yǎng)。用胰蛋白酶-edta分離??細(xì)胞，并以1：2至1：4的比例傳代。

將4x10³個(gè)細(xì)胞接種至8孔玻璃底室玻片（nalgenenuncinternational,napperville,il,usa;單孔大?。?.7厘米×0.7厘米，在dmem/10％fb中s）過(guò)夜。將培養(yǎng)基更換為opti-mem，然后加入10微克載有siglo的lblnps。進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)后，用pbs代替培養(yǎng)基，以完成clsm測(cè)量。通過(guò)加入300μl300nm的dapidelectate到細(xì)胞中5分鐘，并用pbs漂洗，通過(guò)dapi染色進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。為追蹤細(xì)胞內(nèi)的酸性細(xì)胞器，根據(jù)廠商說(shuō)明加入溶酶體紅色熒光染料（lysotrackerred）。使用共聚焦激光掃描顯微鏡（clsm，zeisslsm510）捉取共聚焦顯微照片。

對(duì)于細(xì)胞-顆粒相互作用的流式細(xì)胞術(shù)分析，在6孔板上接種每孔2×10⁵fibrogro細(xì)胞并培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)基更換為opti-mem，然后加入載有siglo的lblnps。培養(yǎng)4小時(shí)后，通過(guò)在胰蛋白酶-edta中37℃培養(yǎng)5分鐘來(lái)分離細(xì)胞，并輕輕攪拌以得到單個(gè)細(xì)胞，然后加入兩倍體積的完全培養(yǎng)基。通過(guò)300rcf離心和隨后的pbs洗滌來(lái)完全除去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重新懸浮在pbs中并持續(xù)保存在冰上并避光，直到進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)量。為了進(jìn)行終止，將10μl0.4％錐蟲(chóng)藍(lán)加入到細(xì)胞中，以除去膜結(jié)合的lblnps。立即進(jìn)行細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，并提供一個(gè)代表性數(shù)據(jù)。

流式細(xì)胞術(shù)（fcm）

用fcm(facscalibur,bectondickinson,usa)分析標(biāo)記顆粒的熒光強(qiáng)度以及所述顆粒與細(xì)胞的共培養(yǎng)。在488nm的激光激發(fā)之后，在fl-1通道（帶通：530±15nm）中檢測(cè)siglogreen。在載體/細(xì)胞相互作用相關(guān)區(qū)域檢測(cè)到104次事件，并使用winmdi2.9軟件進(jìn)行分析。

共聚焦激光掃描顯微鏡學(xué)（clsm）

np/細(xì)胞相互作用和吸收的可視化，是通過(guò)clsm(zeiss,lsm510meta,jena,germany)進(jìn)行的。為了檢測(cè)siglogreen熒光強(qiáng)度，使用了ar/kr激光器（激發(fā)波長(zhǎng)：488nm），而用he/ne激光器（激發(fā)波長(zhǎng)：543nm）檢測(cè)紅色熒光（lysotrackerred）。siglo和lysotrackerred的發(fā)射則用帶通濾波器（505-530nm和560-615nm）檢測(cè)。

帶sparc-sirna的多層納米顆粒

取疊層（lbl）納米顆粒（nps）的雙層中含有sparc-sirna并以聚（l-精氨酸）（arg）和葡聚糖（dxs）作為聚電解質(zhì)的多層納米顆粒，遞送到成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。在fibrogro^tm細(xì)胞中，對(duì)lblnps的細(xì)胞結(jié)合和吸收以及sirna遞送進(jìn)行了研究。siglo-sirna和sparc-sirna有效包覆到羥基磷灰石納米顆粒上。使用動(dòng)態(tài)光散射和透射電子顯微鏡法，對(duì)多層納米顆粒進(jìn)行了關(guān)于粒徑，電動(dòng)電位以及表面形態(tài)的表征。使用chemidoc?免疫印跡技術(shù)和rt-pcr，對(duì)sparc-基因沉默和mrna水平進(jìn)行了分析。含有sparc-sirna的多層納米顆粒的直徑為約200nm，并且有效地內(nèi)吞入fibrogro^tm細(xì)胞。還用合適的報(bào)告子sirna以及l(fā)ysotracker染料標(biāo)記跟蹤其細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)；共聚焦顯微鏡法清楚地表明了顆粒的內(nèi)涵體逃逸。通過(guò)在fibrogro^tm細(xì)胞中使用0.4pmol的sirna/lbl納米顆粒，實(shí)現(xiàn)了顯著（60％）的sparc基因抑制，且sparcmrna的相對(duì)表達(dá)相對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞顯著降低（60％）。通過(guò)xcelligence實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖和mtt細(xì)胞測(cè)定評(píng)估細(xì)胞毒性，表明載有sparc-sirna的lblnps是無(wú)毒性的?？傊?，所述lblnp體系作為sirna遞送的非病毒載體，為使用生物聚合物來(lái)增強(qiáng)基因抑制效率的sirna治療的發(fā)展，提供了一種有希望的安全高效的遞送平臺(tái)。

使用免染技術(shù)評(píng)估靶向蛋白水平。圖9描繪了來(lái)自加載到免染凝膠上的所有裂解蛋白樣品的蛋白分離，對(duì)應(yīng)于凝膠中和膜中的sparc蛋白質(zhì)（43kda）的條帶，清楚地表明了該蛋白質(zhì)通過(guò)免染（sf）技術(shù)分離和轉(zhuǎn)移到膜上。底物處理后對(duì)應(yīng)于sparc（43kda的）的條帶，表明含sparc-sirna的lblnps和帶sparc-sirna的lipofectamine中，蛋白表達(dá)水平降低，但在空白細(xì)胞和lipofectamine-雜亂sirna的情形中，條帶強(qiáng)度沒(méi)有下降，表明蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有降低。

使用chemidocimagelab?軟件，對(duì)總蛋白條帶強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，將數(shù)據(jù)報(bào)告為如圖10所示的相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的抑制百分比（%）。載有sparc的lbl納米顆粒的抑制百分比為60％，而作為陽(yáng)性對(duì)照的帶lipofectamine的sparc為89％。lblnps以及雜亂-sirna相對(duì)于空白細(xì)胞的抑制效率統(tǒng)計(jì)分析，表明存在顯著差異（p<0.001）。因此，該數(shù)據(jù)表明了通過(guò)lblnps遞送sparc-sirna的靶蛋白表達(dá)減少。非特異sirna沒(méi)有產(chǎn)生抑制，表明lblnps作為非病毒遞送載體的有效性。

通過(guò)免疫印跡法評(píng)估基因抑制

取成纖維細(xì)胞（1.2×10⁵，2ml）接種到含完全dmem培養(yǎng)基的6孔室中并培養(yǎng)24小時(shí)，以sparc-sirna功能化的lblnps，帶sparc的lipofectamine，和含有400pmolsirna的雜亂-sirna的樣品對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞用作空白細(xì)胞，并在24小時(shí)的np培養(yǎng)后將optimem改變?yōu)橥耆玠mem培養(yǎng)基，且在培養(yǎng)四天后收獲細(xì)胞并進(jìn)行裂解。

在96小時(shí)的預(yù)置培養(yǎng)時(shí)間之后，使用細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行蛋白提取，每個(gè)孔中所提取的蛋白質(zhì)使用考馬斯亮藍(lán)在595nm下進(jìn)行分析。取來(lái)自不同樣品和梯度（precisionplus^tm）的等量蛋白（30微克）加載到凝膠中。蛋白質(zhì)分離后，使用chemidoc進(jìn)行成像，以確認(rèn)蛋白分離步驟，進(jìn)一步地，對(duì)于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜，使用trans-blot?(bio-rad)系統(tǒng)在200v下進(jìn)行約40分鐘。蛋白轉(zhuǎn)移之后的膜在chemidoc成像儀中可視化，以確認(rèn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜，進(jìn)一步地，在20℃下在5％脫脂乳中對(duì)該膜封閉1小時(shí)。

以在2.5％脫脂牛奶中1：:1000稀釋的一級(jí)抗體（小鼠單克隆igg1，santacruz）作為膜探針（membranesprobing）來(lái)完成抗體處理，并在20℃下培養(yǎng)1小時(shí)，進(jìn)一步地，所述膜用tbst每次間隔10分鐘地洗滌3次。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二級(jí)抗體（jacksonimmunolabs）在2.5％脫脂牛奶中進(jìn)行1：1000稀釋。帶二級(jí)抗體的膜在20下℃培養(yǎng)1小時(shí)，并用tbst每次間隔5分鐘地洗滌6次。在chemidoc成像儀中，使用化學(xué)發(fā)光底物令條帶，數(shù)字可視化，且使用quantityone軟件（bio-rad）捉取圖像。在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜后，獲取總蛋白的圖像，且將所有的印跡針對(duì)對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行歸一化。對(duì)于sparc蛋白質(zhì)水平的相對(duì)定量，以三聯(lián)式樣測(cè)定選擇對(duì)應(yīng)于43kd的sparc的條帶，并報(bào)告平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

定量rt-pcr研究

為了確認(rèn)sparc蛋白質(zhì)抑制是由fibrogro細(xì)胞中的mrna表達(dá)減少來(lái)介導(dǎo)的，我們測(cè)量了lbl-sparc和lipofectamine-sparc處理后96小時(shí)的相對(duì)sparc和rpl13mrna水平（圖10）。在lbl-sparc納米顆粒處理的細(xì)胞中，mrna水平降低到0.4±0.04倍（相對(duì)于對(duì)照或未處理細(xì)胞），且與lipofectamine-sparc處理的細(xì)胞的mrna水平相仿。雜亂-sirna和未經(jīng)處理的細(xì)胞中，相關(guān)的mrna水平并沒(méi)降低，此前，wongetal.(j.cell.mol.med.2012,16,1245)報(bào)告了對(duì)于人眼球筋膜囊成纖維細(xì)胞（humantenon’scapsulefibroblasts，htf）中的sparc蛋白質(zhì)的抑制的相似結(jié)果。以lblnps處理的mrna水平的顯著（p<0.01）降低，清楚地表明了sparc-sirna被有效遞送入細(xì)胞以用于沉默sparc基因的表達(dá)。此外，證實(shí)了lblnps在所述成纖維細(xì)胞中有效降低mrna水平以及sparc蛋白質(zhì)表達(dá)。

靶向sparc蛋白并減少fibrogro細(xì)胞中mrna水平的lbl納米顆粒，明顯證實(shí)了使用sirna作為最小化纖維化的治療策略是一種有希望的方法。

第2天，第7和第14天的小鼠成纖維細(xì)胞體外sparc沉默

以lbl濃度進(jìn)行細(xì)胞處理：每孔30,000個(gè)細(xì)胞。處理過(guò)的lblnps：200uglbl（20ul的lbl懸浮液）。以qpcr使用所述納米顆粒測(cè)定sparcmrna表達(dá)，其中僅有的帶負(fù)電荷的聚合物是如上所述的rna。結(jié)果示于圖10b-d中。

rna制備、cdna合成和定量實(shí)時(shí)pcr

lbl-sparc納米顆粒處理后的mrna水平，通過(guò)以120,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞置入六孔組織培養(yǎng)板中的dmem培養(yǎng)基中24小時(shí)來(lái)測(cè)定。用各對(duì)應(yīng)于400pmolsirna的載有sparc-sirna的lblnps，lipofectamine-sparc和lipofectamine–雜亂sirna對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并在處理4天后評(píng)估m(xù)rna表達(dá)。

根據(jù)廠商說(shuō)明，使用rneasy試劑??盒（qiagen，新加坡）提取總rna。根據(jù)廠商說(shuō)明，用250ng總rna提取物和50ng的1μl50ng/μl的隨機(jī)六聚體引物（(invitrogenco.，新加坡），以superscriptiii逆轉(zhuǎn)錄酶（(invitrogenco.，新加坡）合成第一鏈cdna。在384孔微量滴定板中的總體積10μl中執(zhí)行定量實(shí)時(shí)pcr（qpcr）。每個(gè)反應(yīng)由0.5μl第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，上游和下游引物各0.25μl（各10μm），5μlpowersybrgreenpcrmastermix混合液（appliedbiosystems,ca,usa）和4μl不含dnase-rnase的蒸餾水(sigma-aldrichcorp.,mo,usa)。cdna片段的擴(kuò)增和分析是使用rochelightcycler480系統(tǒng)（rochediagnosticscorp,indianapolis,usa）進(jìn)行的。所有pcr反應(yīng)一式三份進(jìn)行。所有mrna水平測(cè)定為ct閾值水平，并以相應(yīng)的60s核糖體蛋白l13'（rpl13）ct值進(jìn)行歸一化。數(shù)值表示為經(jīng)2^-δδct方法相對(duì)于fibrogro對(duì)照細(xì)胞的未處理的增加/減少的倍數(shù)。rt-pcr中采用了下列引物：

rpl13基因:正向引物catcgtggctaaacaggtactg(seqidno:5)

反向引物gcacgaccttgagggcagcc(seqidno:6)

sparc基因正向引物gtgcagaggaaaccgaagag(seqidno:7)

反向引物tgtttgcagtggtggttctg(seqidno:8)

多層納米顆粒的細(xì)胞毒性測(cè)試

xcelligence實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖測(cè)定

xcelligence系統(tǒng)（roche）通過(guò)測(cè)量集成在組織培養(yǎng)板上的微電極兩端的電阻抗來(lái)提供對(duì)細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。所用的96孔電極板，首先用完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，隨后以每孔4x10³個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種。將不同量的lblnps加入到細(xì)胞中，并將板在室溫下培養(yǎng)30分鐘，然后置入xcelligence儀器中。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)約7天，以5分鐘為間隔進(jìn)行25次掃描，然后以15分鐘為間隔進(jìn)行24次掃描，隨后以1小時(shí)為間隔進(jìn)行測(cè)量。樣品一式三份進(jìn)行測(cè)試，并重復(fù)三次。如圖所示為所有測(cè)量的代表性圖表。

mtt細(xì)胞增殖測(cè)定

在96孔板（tpp）的完全培養(yǎng)基中接種每孔4x10³個(gè)細(xì)胞并培養(yǎng)過(guò)夜。將不同量的lbl納米顆粒（0.04-0.4μg/μl）加入到細(xì)胞中，一式三份，并小心地放置在培養(yǎng)箱中1至7天。添加占總培養(yǎng)基體積10%的mtt（5mgml-1，在pbs中），并在37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。隨后，小心地將溶液從孔中除去，并將100μldmso加入到每個(gè)孔中。輕輕搖動(dòng)所述板1小時(shí)以上，使晶體溶解而其余部分持續(xù)覆蓋，并保持遠(yuǎn)離直射光。然后，在595nm的波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。

可生物相容性和低細(xì)胞毒性是對(duì)可接受的sirna遞送體系的關(guān)鍵要求，通過(guò)xcelligence和mtt測(cè)定的方式，兩種細(xì)胞增殖方法，對(duì)lbl納米顆粒進(jìn)行為時(shí)7天的濃度依賴(lài)性研究（圖12）。圖12a表示沒(méi)有任何的lblnps的fibrogro細(xì)胞的生物狀態(tài)以及隨著納米顆粒量增加時(shí)的生物狀態(tài)。較低的顆粒量（2μg，5μg和10μg）呈現(xiàn)出類(lèi)似細(xì)胞指數(shù)值，僅略低于未處理的對(duì)照細(xì)胞。對(duì)于較高的lblnps量（15μg和20μg），細(xì)胞隨著納米顆粒量的增加，呈現(xiàn)出顯著更低的細(xì)胞指數(shù)值。

lblnps對(duì)fibrogro細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用使用mtt法進(jìn)行了交叉研究。如從圖12c觀察到的，fibrogro細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)立于顆粒量的類(lèi)似細(xì)胞增殖，這已經(jīng)由xcelligence測(cè)定所表明。在7天內(nèi)，對(duì)所有顆粒濃度均未觀察到顆粒對(duì)細(xì)胞活性的顯著影響。所述結(jié)果表明了基于lblnps的sparc-sirna遞送體系在成纖維細(xì)胞中的高生物相容性。

生物體的rna體內(nèi)遞送

在體內(nèi)研究中，對(duì)于1sirnasparc層的qpcr，僅在第2天觀察到體內(nèi)抑制，證實(shí)僅在第2天的sparc和膠原的沉默。第7天呈現(xiàn)出對(duì)sparc的顯著沉默，但對(duì)膠原沒(méi)有沉默。第10天未見(jiàn)對(duì)sparc或膠原蛋白的抑制。

持續(xù)抑制需要多層（2）sirna而不是單層。在通過(guò)納米顆粒進(jìn)行sirna進(jìn)入結(jié)膜的體內(nèi)遞送中，將5ml載有所示sirna的lblnps在實(shí)驗(yàn)手術(shù)后立即注射到小鼠結(jié)膜中。在手術(shù)后第7和14天收集組織，并通過(guò)實(shí)時(shí)pcr對(duì)sparc（左）和膠原col1a1（右）的mrna表達(dá)進(jìn)行分析。每個(gè)符號(hào)表示來(lái)自3只小鼠的組織庫(kù)，并計(jì)算為來(lái)自左眼的經(jīng)納米顆粒注射的術(shù)后組織中的表達(dá)相對(duì)于來(lái)自右眼的配對(duì)未手術(shù)組織中的表達(dá)的比率。黑色條表示每種條件的平均倍數(shù)變化。箭頭表示載有sisparc的納米顆粒相對(duì)于載有siscram的納米顆粒的改變方向。箭頭左邊的數(shù)字表示使用siscram相對(duì)于使用sisparc的平均倍數(shù)變化，箭頭右邊的數(shù)字表示比較siscram和sisparc納米顆粒注射之間的倍數(shù)變化的p值。

該數(shù)據(jù)表明，具有多層sirna的lbl可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)抑制。

所述體系（lbl）的應(yīng)用，可以用作以系統(tǒng)和疾病為標(biāo)靶的sirna持續(xù)遞送的寶貴調(diào)查、研究和開(kāi)發(fā)工具，并可能發(fā)展成為持續(xù)sirna療法。

統(tǒng)計(jì)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（sd）。所有值表示為三聯(lián)試樣測(cè)量的平均值；統(tǒng)計(jì)顯著性（p<0.001）使用雙尾t檢驗(yàn)來(lái)確定。