本申請涉及硒有機(jī)組合物和化合物的組合物，和它們用于各種生物途徑以提高線粒體功能、治療疾病和抑制或增強(qiáng)特定類型的動(dòng)物和人類細(xì)胞中的特定過程的方法。

發(fā)明背景

硒(Se)是在許多生物過程中起關(guān)鍵作用的必需微量元素，所述生物過程例如生殖、甲狀腺激素代謝、DNA合成和保護(hù)免于氧化損傷和感染。硒在各種硒依賴性酶的催化位點(diǎn)處摻入，所述酶例如谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、硫氧還蛋白還原酶和一種亞砜甲硫氨酸還原酶。這些含硒酶促進(jìn)代謝活性的調(diào)節(jié)、免疫功能、抗氧化防御、胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)和線粒體功能。

稱為線粒體(“MT”)的細(xì)胞器是高等生物細(xì)胞中的主要能量來源。線粒體提供廣泛的細(xì)胞呼吸、氧化和代謝過程的直接和間接生物化學(xué)調(diào)節(jié)。這些過程包括電子傳遞鏈(ETC)活性，其驅(qū)動(dòng)氧化磷酸化以產(chǎn)生呈腺苷三磷酸(ATP)形式的代謝能量，并且其還是胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中重要的線粒體功能的基礎(chǔ)。線粒體呼吸發(fā)生在線粒體內(nèi)膜上，經(jīng)過電子傳遞系統(tǒng)通過電子流實(shí)現(xiàn)，所述電子傳遞系統(tǒng)包含四種復(fù)合物(復(fù)合物I、II、III和IV)，以及用作ATP合成(ATP合酶)位點(diǎn)的另一種復(fù)合物(復(fù)合物V)。任何復(fù)合物的活性的損害或降低破壞電子流并可導(dǎo)致線粒體呼吸功能障礙(參見例如，Schildgen等, Exp Hematol 2011;39:666-67510,11; Arthur等, Mol Neurodegener 2009;4:37)。

導(dǎo)致細(xì)胞死亡、活性氧物質(zhì)產(chǎn)生、氧化DNA損傷增加、自噬增加和線粒體膜電位損失的線粒體功能障礙與病況，例如糖尿病、肥胖、年齡相關(guān)神經(jīng)變性(包括阿爾茨海默病)、中風(fēng)、胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。已經(jīng)表明無機(jī)形式的硒，亞硒酸鈉，在某些情況下影響線粒體功能。Mehta等表明線粒體生物發(fā)生的標(biāo)志物PGC1a在缺血的腦組織中增加，并且在缺血和再循環(huán)后亞硒酸鈉進(jìn)一步增加PGC1a。(Mehta等, BMC Neuroscience 2012 13:79)。Tirosh等表明，高劑量而非中等劑量的亞硒酸鈉阻止因結(jié)腸組織中半抗原誘導(dǎo)的炎癥導(dǎo)致的半抗原誘導(dǎo)的線粒體功能損害。(Tirosh等Nutrition 2007 23:878)。這些結(jié)果表明，無機(jī)硒可影響遭受損害的細(xì)胞中的線粒體功能。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉的生物利用度低于其它形式的硒，質(zhì)疑其功效。(Rider等, J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 2010 94(1):99–110)。

此外，文獻(xiàn)中的結(jié)果表明，不同化學(xué)形式的硒具有不同的生物活性。例如，selenozolidine在降低肺腫瘤數(shù)量方面比硒代甲硫氨酸更有效。(Poerschke等, J Biochem Molecular Toxicology 2012 26:344)。Barger等表明，飼喂不同來源的硒例如硒甲硫氨酸、亞硒酸鈉和硒化酵母的小鼠，對基因表達(dá)和對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的特定功能途徑具有不同的影響。(Barger等, Genes and Nutrition 2012 7:155)。

因?yàn)椴煌瘜W(xué)形式的硒的生物活性和利用度明顯不同，因此需要鑒定硒的化學(xué)形式和表征它們對生物過程的作用。對生物過程的這些作用的表征可導(dǎo)致重要的生物過程的醫(yī)學(xué)調(diào)節(jié)，以預(yù)防或?qū)辜膊?，例如與線粒體功能障礙有關(guān)的那些疾病。與線粒體功能障礙有關(guān)的疾病可通過給予在一種或多種類型的動(dòng)物或人類細(xì)胞中減少線粒體功能障礙或上調(diào)線粒體功能的特定化學(xué)形式的硒來預(yù)防或治療。對生物活性變化的一種解釋可能是不同形式的硒在分子水平上對生物途徑具有不同的作用。

發(fā)明簡述

本申請涉及硒-有機(jī)化合物、組合物和使用所述化合物和組合物的方法。所述化合物包括5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)、Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物D”)、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸(“化合物E”)、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合。如本文所述，組合物和其組合可用于增強(qiáng)線粒體功能，治療線粒體功能障礙，治療阿爾茨海默病和以組織特異性和組織合適的方式調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。

在本申請的一個(gè)方面，不同化學(xué)形式的有機(jī)硒鑒定為具有生物活性。如本文所述的含硒化合物可獲自硒化酵母或可如本文所述經(jīng)化學(xué)合成。硒化酵母包含許多硒和硫化合物，但硒化酵母中并非所有的硒化合物都影響生物過程。此外，已經(jīng)表明硒化酵母中硒和硫化合物的混合物彼此抑制或負(fù)面影響生物過程。

本申請的另一方面提供本文所述的生物活性硒化合物的類似物或衍生物。含硒化合物的類似物和/或衍生物可經(jīng)合成制備。在一些實(shí)施方案中，類似物具有增加的穩(wěn)定性、降低的氧化作用、增加的半壽期和/或?qū)⒒衔锇邢蛱囟ńM織。

在本申請的另一方面，不同化學(xué)形式的硒顯示具有不同的組織特異性(例如，一些化合物對神經(jīng)元細(xì)胞有活性，但對肝細(xì)胞沒有活性)。此外，所述含硒組合物可激活一個(gè)細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄激活物，而其使不同細(xì)胞類型中的所述轉(zhuǎn)錄激活物失活。不同含硒化合物和其組合的這些不同的活性和組織特異性是令人驚訝和意想不到的。

本申請的一個(gè)方面提供包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式II的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物的組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在其它實(shí)施方案中，組合物可排除5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸或谷氨酰基硒代半胱氨酸中的一種或多種，因?yàn)檫@些化合物的一種或多種可能對于組合物是不必要的，或抑制組合物中的其它化合物。

本申請的另一方面提供使用本文所述的組合物增強(qiáng)線粒體功能、治療線粒體功能障礙、治療阿爾茨海默病和/或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。

在實(shí)施方案中，用于治療阿爾茨海默病的方法包括：給予受試者有效量的組合物，所述組合物包含5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物或其混合物。在其它實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在仍其它的實(shí)施方案中，用于治療阿爾茨海默病的方法包括：給予受試者有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在其它實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚的方法包括：給予所述一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其混合物的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量抑制在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中的B淀粉樣蛋白積聚。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚的方法包括：給予一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量抑制在神經(jīng)元細(xì)胞中的B淀粉樣蛋白積聚。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的方法包括：給予所述一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其混合物的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量抑制在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中的tau磷酸化。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些化合物中的一種或多種。

在其它實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的方法包括：給予所述一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量抑制在神經(jīng)元細(xì)胞中的tau磷酸化。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含5’-甲基硒代腺苷或式(I)的化合物或其硒代糖苷。在仍其它的實(shí)施方案中，組合物可排除谷氨酰基硒代半胱氨酸、甲硫氨酸或硒代甲硫氨酸，因?yàn)樵诮M合物中它們對組合物中的活性化合物的可能的抑制作用。

在一些實(shí)施方案中，給予受試者的有效量是每天200微克或更少。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物每天一次給予受試者。

在另一方面，用于在選自骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和其組合的一種或多種細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的方法包括：給予所述一種或多種細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增強(qiáng)線粒體功能。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在其它實(shí)施方案中，用于在一種或多種肝細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的方法包括：給予所述一種或多種肝細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增強(qiáng)線粒體功能。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在另一方面，在選自肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和其混合物的一種或多種細(xì)胞中調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法，所述方法包括：給予所述一種或多種細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，在一種或多種肝細(xì)胞中降低葡萄糖6磷酸酶復(fù)合物的表達(dá)的方法，包括：給予所述一種或多種細(xì)胞有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量抑制葡萄糖6磷酸酶的表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

附圖簡述

結(jié)合到本說明書中并構(gòu)成其一部分的附圖舉例說明了本發(fā)明的數(shù)個(gè)方面，并且和本說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。附圖的簡單描述如下：

圖1表明在用5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)而非Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物D”)處理HEK293T腎細(xì)胞時(shí)線粒體(“MT”)電位(熒光)提高。在相同的曝光時(shí)間和放大倍數(shù)下在熒光顯微鏡下捕獲圖像。

圖2表明在用化合物C (5’-甲基硒代腺苷)和D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)處理時(shí)在骨骼肌C2C12細(xì)胞中的線粒體(“MT”)電位提高。硫類似物H (5’-甲基硫代腺苷)和I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)在所有濃度下降低線粒體電位。

圖3表明在用化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)或其組合處理的IMR-32人神經(jīng)元細(xì)胞中在6小時(shí)和24小時(shí)時(shí)線粒體(“MT”)電位的瞬時(shí)增加。它們的硫類似物H (5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)、J (γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸)和其組合也顯示線粒體功能的瞬時(shí)增加。數(shù)據(jù)通過染色的細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。*表示與對照的P值。

圖4表明C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)或它們的硫類似物H (5’-甲基硫代腺苷)、I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)、J (γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸)的重復(fù)處理提高IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的線粒體(MT)電位。細(xì)胞用化合物處理一次，持續(xù)48小時(shí)(hr.) (上圖)或用化合物處理兩次，共48小時(shí)(hr. )(下圖)。數(shù)據(jù)通過染色的細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

圖5表明化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)或其組合經(jīng)72小時(shí)時(shí)間對人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞的成活力(通過OD490 nm表示)缺少毒性作用。相比之下，硫類似物H (5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)、J (γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸)和其組合顯示經(jīng)72小時(shí)時(shí)間成活力略微降低。結(jié)果顯示為平均值 +sem; n=8。

圖6表明在由10微摩爾鈣應(yīng)激的大鼠皮層細(xì)胞中通過化合物D和E恢復(fù)線粒體功能。該圖表明正常線粒體(最高線)的呼吸圖，其中最終OCR為圖線的末端與X-軸之間的測量距離。最低線表明通過10微摩爾鈣抑制線粒體呼吸。中間的兩條線表示在化合物C或D和10微摩爾鈣存在時(shí)的線粒體呼吸。

圖7表明與H (5’-甲基硫代腺苷)、I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)和J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)的組合相比在6和24小時(shí)時(shí)，在用硒化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)(各化合物150 ppb)的組合處理的AML-12小鼠肝細(xì)胞中線粒體(MT)電位的顯著增加。數(shù)據(jù)通過染色的細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。柱狀圖中顯示的P值通過比較CDE組與對照或HIJ組確定。

圖8表明在AML-12小鼠肝細(xì)胞中線粒體解偶聯(lián)蛋白2 (Ucp2)的顯著表達(dá)，和通過化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合(各化合物150ppb)下調(diào)其表達(dá)。(A) 在正常AML-12細(xì)胞中(用水溶媒處理6小時(shí)后)線粒體解偶聯(lián)蛋白1 (Ucp1)和Ucp2的相對表達(dá)。n=4，如柱中所示。(B) C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合對Ucp1表達(dá)無影響。(C) C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)的組合下調(diào)Ucp2表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為各柱中指示的樣品數(shù)的平均值 + sem。在柱狀圖中不同的字母(a與b)意指在這些組中的顯著差異(P< 0.05)。

圖9表明化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)、E (γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)和其組合或它們的硫類似物H (5’-甲基硫代腺苷)、I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)、J (γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸)和其組合對AML-12小鼠肝細(xì)胞的成活力(通過OD490 nm表示)無毒性作用。

圖10表明在用C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)(各化合物150ppb)化合物的組合處理后下調(diào)人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的Ucp2、Ucp3和早老素(PSEN)表達(dá)。(A) 在6和24小時(shí)的Ucp2 mRNA表達(dá)。(B) 在6和24小時(shí)的Ucp3 mRNA表達(dá)。(C) 用溶媒(水)處理的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中在6和24小時(shí)的相對PSEN1和PSEN2 mRNA水平。(D) 用C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)、E (γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合(各化合物150ppb)或H (5’-甲基硫代腺苷)、I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)和J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)的組合(各化合物150ppb)處理的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中根據(jù)肌動(dòng)蛋白β (ACTB) mRNA水平的量標(biāo)準(zhǔn)化后在6和24小時(shí)的PSEN mRNA表達(dá)。(E) 在用C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合或H (5’-甲基硫代腺苷)、I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)和J (γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸)的組合處理的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中根據(jù)(ACTB) mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化后在6和24小時(shí)的PSEN2表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為3-4個(gè)樣品/組的平均值 + sem。柱狀圖中的不同字母(a與b)和不同的數(shù)字(1與2)意指在這些組中顯著差異(P< 0.05)。

圖11表明γ分泌酶復(fù)合物PSEN和Nicastrin是化合物C (5’-甲基硒代腺苷)的靶標(biāo)，如通過蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(“RT-PCR”)分析所測定的。(A) 用150ppb化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)或E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)處理6和24小時(shí)的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的各種蛋白(對阿爾茨海默病(AD)中的斑塊形成是關(guān)鍵的)的蛋白質(zhì)印跡分析照片。(B-C) 上述蛋白質(zhì)印跡中(B) PSEN和(C) Nicastrin蛋白水平的定量分析(用所列化合物處理24小時(shí)后，右圖)。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品的平均值 + sem。(D-G) 用水溶媒(對照)和所列的化合物處理(D、F) 6和(E、G) 24 hr的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的(D-E) PSEN和(F-G) Nicastrin表達(dá)的定量RT-PCR分析。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)樣品的平均值 + sem。柱狀圖中的不同的字母(a與b、a與c或b與c)意指在這兩個(gè)組之間顯著差異(P < 0.05)。字母“a,b”表示與a或b無顯著差異。

圖12表明化合物C(5’-甲基硒代腺苷)是Tau磷酸化的新的抑制劑，和糖原合酶激酶3 β (“GSK3b”)下調(diào)劑(downregulator)，如通過蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR分析所測定的。(A) 用150ppb的化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)或E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)處理6和24小時(shí)的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的各種蛋白(對于AD中纏結(jié)形成是關(guān)鍵的)的蛋白質(zhì)印跡分析照片。(B-E) 上述蛋白質(zhì)印跡（24小時(shí)處理后，右圖）中(B)位置396的絲氨酸殘基上的磷酸化Tau (“pTau S396”)和(C) 位置400的絲氨酸殘基、位置403的蘇氨酸殘基和位置404的絲氨酸殘基上的磷酸化Tau (“pTau S400/T403/S404”)、(D) 總Tau和(E) 合并的pTauS396和pTau S400/T403/S404/總Tau蛋白水平的定量分析。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品的平均值 + sem。(F) 用水溶媒(對照)或化合物處理24小時(shí)的IMR-32細(xì)胞的上述蛋白質(zhì)印跡中GSK3b蛋白水平的定量分析。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品的平均值 + sem。(G-H) 用水溶媒(對照)和所列的化合物處理(G) 6和(H) 24小時(shí)的人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中GSK3b mRNA表達(dá)的定量RT-PCR分析。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)樣品的平均值 + sem。柱狀圖中的不同的字母(a與b、a與c或b與c)意指在這兩個(gè)組之間顯著差異(P < 0.05)。字母“a,b”或“b,c”表示與a或b或c無顯著差異。

圖13表明通過化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合(各化合物150ppb)導(dǎo)致的在人IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中FOXO磷酸化降低和PGC1a蛋白表達(dá)增加。

圖14表明各種其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的蛋白質(zhì)印跡分析，所述其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包括在用化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)或E ( γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)處理的IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中的在蘇氨酸28上磷酸化的磷酸化forkhead box蛋白O4 (“pFOXO4 T28”)、forkhead box蛋白O4 (“FOXO4”)、在蘇氨酸308上的磷酸化鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (“pAktT308”)、在絲氨酸471上的磷酸化鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (“pAktS471”)、Akt和過氧化物酶體增殖子活化受體γ共活化劑1α (“PGC1a”)，各化合物150ppb。(A) 蛋白質(zhì)印跡照片。(B-C) 用所列化合物處理(B) 6和(C) 24小時(shí)的AML-12細(xì)胞的上述蛋白質(zhì)印跡中在位置28的蘇氨酸上的磷酸化forkhead box蛋白O4 (pFOXO4 T28)的定量分析。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品的平均值 + sem。柱狀圖中的不同的字母(a與b)意指在這兩個(gè)組之間顯著差異(P < 0.05)。字母“a,b”表示與a或b無顯著差異。

圖15表明在用C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合處理6小時(shí)的小鼠肝AML-12細(xì)胞中(各化合物150ppb)各種其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的蛋白質(zhì)印跡分析，所述其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包括FOXOs、PDK1、AKT、Gsk3a/b、4EBP1、Elf2be和PGC1a。(A) 蛋白質(zhì)印跡照片。(B-C) 上述蛋白質(zhì)印跡中所示的AML-12細(xì)胞中(B) 在T32的磷酸化FOXO3和(C) 在T28的磷酸化FOXO4的定量分析。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品的平均值 + sem。柱狀圖中的不同的字母(a與b)意指在這兩個(gè)組之間顯著差異(P < 0.05)。

圖16表明用溶媒(水，對照)或各自150 ppb的化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)或E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)處理6和24小時(shí)后，在小鼠肝AML-12細(xì)胞中各種所列分子的蛋白質(zhì)印跡分析。

圖17表明小鼠肝AML-12細(xì)胞中的葡萄糖6磷酸酶催化亞基(“G6pc”)表達(dá)被化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E ( γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)的組合顯著地下調(diào)，但不被單獨(dú)的化合物下調(diào)。細(xì)胞用溶媒(對照)、單獨(dú)的硒化合物(十億分之150份(150ppb))或CDE組合(各化合物150 ppb)以及它們各自的硫類似物處理48小時(shí)，然后進(jìn)行定量RT-PCR。在柱狀圖中數(shù)據(jù)表示為4個(gè)樣品的平均值 + sem。

圖18表明化合物CDE的組合在肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)G6pc表達(dá)的示意圖。

圖19表明在人Gsk3b、PSEN和NICASTRIN基因的啟動(dòng)子區(qū)中存在FOXO結(jié)合基序，以及化合物C對在神經(jīng)元細(xì)胞的斑塊和纏結(jié)形成中重要介質(zhì)的調(diào)節(jié)的作用示意圖。子圖(A)表明在人GSK3B啟動(dòng)子上5個(gè)FOXO1/3/4結(jié)合基序的位置。子圖(B)表明在人PSEN啟動(dòng)子上兩個(gè)FOXO1/3/4結(jié)合基序的位置。子圖(C)表明在人Nicastrin (NCSTN)啟動(dòng)子上FOXO1/3/4結(jié)合基序的位置。子圖(D)表明化合物C對在神經(jīng)元細(xì)胞的斑塊和纏結(jié)形成中重要介質(zhì)的調(diào)節(jié)的作用示意圖。

發(fā)明詳述

定義

本文使用的術(shù)語"給藥"和"給予"是指給予藥物、前藥或其它試劑或治療性處理(例如本申請的組合物)至受試者(例如受試者或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)的行為。給藥至人體的示例性的途徑可通過眼(經(jīng)眼)、口(經(jīng)口)、皮膚(局部或經(jīng)皮)、鼻(經(jīng)鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(含服)、耳、直腸、陰道、通過注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)等)等。

術(shù)語"烷基"是指1-24個(gè)碳原子的支鏈或非支鏈飽和的烴基。本文優(yōu)選的"烷基"包含1-16個(gè)碳原子；即C_1-16 烷基。烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、新己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基和十六烷基。最優(yōu)選"低級烷基"，其指1-6個(gè)、更優(yōu)選1-4個(gè)碳原子的烷基。烷基可任選被?；?、氨基、酰胺基、疊氮基、羧基、烷基、芳基、鹵代、胍基、氧代、硫烷基、亞氧硫基、磺?；?、雜環(huán)基或羥基取代。

術(shù)語“堿金屬”是指金屬鹽，包括但不限于合適的堿金屬(la族)鹽、堿土金屬(Ila族)鹽和其它生理學(xué)可接受的金屬。這樣的鹽可自鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備。

術(shù)語"烯基"是指含有至少1個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈碳鏈。在示例性的實(shí)施方案中，"烯基"是指含有2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子的烴，即C_1-10 烯基。烯基的實(shí)例包括但不限于乙烯、丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯和癸烯。烯基可任選被氨基、烷基、鹵代或羥基取代。

術(shù)語"酰胺基"是指C-酰胺基例如 --CONR'R''或N酰胺基例如--NR'COR''，其中該定義中使用的R'和R''獨(dú)立地是氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基。"磺酰胺基"包括--NR'--SO₂--R''。最優(yōu)選R'和R''是氫、烷基、芳基或芳烷基。

術(shù)語"炔基"是指含有至少1個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈碳鏈。在示例性的實(shí)施方案中，"炔基"是指含有2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子的烴，即，C_2-10 炔基。炔基的實(shí)例包括但不限于乙炔、丙炔、丁炔、戊炔、己炔、庚炔、辛炔、壬炔和癸炔。炔基可任選被氨基、烷基、鹵代或羥基取代。

術(shù)語"芳基"是指含有1、2或3個(gè)環(huán)的碳環(huán)芳族系統(tǒng)，其中所述環(huán)可以側(cè)接的方式連接在一起，或可以是稠合的。術(shù)語"稠合"意指第二個(gè)環(huán)通過具有兩個(gè)與第一個(gè)環(huán)共同(即，共享)的相鄰原子而存在(即，連接或形成)。術(shù)語"稠合"等同于術(shù)語"縮合"。術(shù)語"芳基"包含芳族基團(tuán)，例如苯基、萘基、四氫萘基、1,2,3,4-四氫化萘、二氫化茚、茚和聯(lián)苯基。芳基可任選地被氨基、烷基、鹵代、羥基、碳環(huán)、雜環(huán)或另一芳基取代。

術(shù)語"環(huán)烷基"是指單環(huán)飽和的或部分飽和的碳環(huán)，其中環(huán)原子的數(shù)量通過數(shù)值范圍表示。在示例性的實(shí)施方案中，"環(huán)烷基"是指上述定義的含有3-12個(gè)環(huán)原子的碳環(huán)(即C_3-12 環(huán)烷基)。如本文使用的，環(huán)烷基包括單環(huán)、橋接、螺、稠合、二環(huán)和三環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基、環(huán)庚烯基、降冰片基、十氫化萘、金剛烷基和環(huán)辛基。環(huán)烷基可任選被氨基、烷基、鹵代或羥基取代。

術(shù)語"芳烷基"是指芳基-取代的烷基部分。優(yōu)選的芳烷基是具有與1-6個(gè)碳原子的烷基連接的芳基的"低級芳烷基"。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括芐基、二苯甲基、三苯甲基、苯基乙基和二苯乙基。術(shù)語芐基和苯基甲基可互換使用。

術(shù)語"芳基氧基"是指與氧原子連接的上文定義的芳基。芳基氧基可任選地被鹵代、羥基或烷基取代。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括苯氧基、4-氯-3-乙基苯氧基、4-氯-3-甲基苯氧基、3-氯-4-乙基苯氧基、3,4-二氯苯氧基、4-甲基苯氧基、3-三氟甲氧基苯氧基、3-三氟甲基苯氧基、4-氟苯氧基、3,4-二甲基苯氧基、5-溴-2-氟苯氧基、4-溴-3-氟苯氧基、4-氟-3-甲基苯氧基、5,6,7,8-四氫萘基氧基、3-異丙基苯氧基、3-環(huán)丙基苯氧基、3-乙基苯氧基、4-叔丁基苯氧基、3-五氟乙基苯氧基和3-(1,1,2,2-四氟乙氧基)苯氧基。

術(shù)語"烷氧基"是指被烷基或環(huán)烷基取代的含有氧基的基團(tuán)。實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基、叔丁氧基和環(huán)己基氧基。最優(yōu)選具有1-6個(gè)碳原子的"低級烷氧基"。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、異丙氧基和叔丁氧基。

術(shù)語"芳烷氧基"是指通過氧原子與其它基團(tuán)連接的含有氧基的芳烷基。"低級芳烷氧基"是與上文所述的低級烷氧基連接的那些苯基。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括芐基氧基、1-苯基乙氧基、3-三氟甲氧基芐基氧基、3-三氟甲基芐基氧基、3,5-二氟芐基氧基、3-溴芐基氧基、4-丙基芐基氧基、2-氟-3-三氟甲基芐基氧基和2-苯基乙氧基。

術(shù)語"?；?是指 –C(=O)R，其中該定義中使用的R是氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基。最優(yōu)選R是氫、烷基、芳基或芳烷基。

術(shù)語"羧基"是指--R'C(=O)OR''，其中該定義中使用的R'和R''獨(dú)立地是氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、雜環(huán)烷基、芳基、醚或芳烷基，或R'可另外是共價(jià)鍵。"羧基"包括羧酸和羧酸酯兩者。術(shù)語"羧酸"是指其中R''是氫或鹽的羧基。這樣的酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、2-甲基丙酸、環(huán)氧乙烷-甲酸和環(huán)丙烷甲酸。術(shù)語"羧酸酯"或"酯"是指其中R''是烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基的羧基。羧酸的實(shí)例包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、環(huán)丙烷甲酸、環(huán)丁烷甲酸、環(huán)戊烷甲酸、環(huán)己烷甲酸、環(huán)庚烷甲酸、環(huán)辛烷甲酸或環(huán)壬烷甲酸。

術(shù)語“羰基”是指是指C=O部分，亦稱為“氧代”基團(tuán)。

術(shù)語"雜環(huán)"或"雜環(huán)基"或“雜環(huán)狀環(huán)”是指具有3-12或5-6個(gè)碳原子的任選取代的、飽和的或非飽和的、芳族或非-芳族的環(huán)狀烴，其中至少1個(gè)環(huán)原子是O、N、S、P或Se。例如在一些實(shí)施方案中，來自雜環(huán)基的環(huán)N原子是與-C(O) 形成酰胺、氨基甲酸酯或脲的成鍵原子。在示例性的實(shí)施方案中，"雜環(huán)基"是指含有4、5或6個(gè)環(huán)原子的上文描述的環(huán)狀烴(即，C_4-6 雜環(huán)基)。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于氮丙啶、環(huán)氧乙烷、硫雜環(huán)丙烷、氮雜環(huán)丁烷、環(huán)氧丙烷、硫雜環(huán)丁烷、吡咯烷、咪唑、四氫呋喃、吡喃、噻喃、硫代嗎啉、硫代嗎啉S-氧化物、噁唑啉、四氫噻吩、哌啶、四氫吡喃、硫雜環(huán)己烷(thiane)、咪唑烷、氧代二氧雜環(huán)戊烯基、噁唑烷、噻唑烷、二氧雜環(huán)戊烷、二硫雜環(huán)戊烷、哌嗪、噁嗪、二硫雜環(huán)己烷、二噁烷、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、吡咯基、噻吩基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、噻二唑基、嘧啶基、噁唑基、三嗪基和四唑基。示例性的雜環(huán)包括苯并咪唑、二氫噻吩、二氧雜環(huán)己烯、二噁烷、二氧雜環(huán)戊烷、二硫雜環(huán)己烷、二噻嗪、二噻唑、二硫雜環(huán)戊烷、呋喃、吲哚、3-H吲唑、3-H-吲哚、吲嗪、異吲哚、異噻唑、異噁唑、嗎啉、噁唑、噁二唑、噁噻唑、噁噻唑烷、噁嗪、噁二嗪、哌嗪、哌啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、嘧啶、噠嗪、吡咯、吡咯烷、四氫呋喃、四嗪、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、噻吩、三嗪和三唑。雜環(huán)可任選被氨基、烷基、烯基、炔基、鹵代、羥基、碳環(huán)、硫代、其它雜環(huán)或芳基取代。

術(shù)語"雜芳基"是指環(huán)狀烴，其中至少1個(gè)環(huán)原子是O、N、S、P或Se，所述環(huán)的特征為環(huán)成員中共享的離域[pi]電子(芳族性)，和其中環(huán)原子數(shù)通過數(shù)值范圍指示。本文定義的雜芳基部分具有C、N、S、P或Se成鍵側(cè)基(bonding hands)。例如在一些實(shí)施方案中，來自雜芳基的環(huán)N原子是與-C(O)形成酰胺、氨基甲酸酯或脲的成鍵原子。在示例性的實(shí)施方案中，"雜芳基"是指含有5或6個(gè)環(huán)原子的上文描述的環(huán)狀烴(即C_5-6 雜芳基)。雜芳基的實(shí)例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、異噁唑、異噻唑、咪唑、吡唑、噁二唑、噻二唑、三唑、四唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪和三嗪。

術(shù)語"羥基"或"羥基"是指取代基–OH。

術(shù)語"氧代"是指取代基=O。

術(shù)語"硝基"是指NO₂。

術(shù)語“疊氮基”是指N₃。

術(shù)語“硫類似物”是指目的化合物的類似物，其中1個(gè)或多個(gè)硒原子分別被1個(gè)或多個(gè)硫原子替換。

術(shù)語"硫烷基"是指 --SR'，其中該定義中使用的R'是氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基。

術(shù)語"亞氧硫基"是指 --SOR'，其中該定義中使用的R'是氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基。

術(shù)語"磺?；?是指 --SOR'，其中R'是指氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基。

術(shù)語"酮"是指含有至少1個(gè)羰基的部分，其中羰基碳與兩個(gè)其它碳原子結(jié)合。在示例性的實(shí)施方案中，"酮"是指含有3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子的上文描述的含有羰基的部分(即C_3-10 酮)。酮基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、環(huán)丁酮、環(huán)戊酮、環(huán)己酮、環(huán)庚酮、環(huán)辛酮、環(huán)壬酮和環(huán)癸酮。

術(shù)語"氨基"是指式--NR'R''的伯、仲或叔氨基，其中該定義中使用的R'和R''獨(dú)立地是氫、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、羧基、環(huán)烷基、雜環(huán)或其它氨基(在酰肼的情況下)或R'和R''與它們所連接的氮原子一起形成具有4-8個(gè)原子的環(huán)。因此，術(shù)語"氨基"包括未取代的、單取代的(例如一烷基氨基或一芳基氨基)和二取代的(例如二烷基氨基或芳烷基氨基)氨基。氨基包括--NH₂、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基-乙基氨基、吡咯烷-1-基或哌啶子基、嗎啉代等。其它示例性的形成環(huán)的"氨基"包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、異噻唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吲嗪基、咪唑基、異吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基。含有氨基的環(huán)可任選被另一氨基、烷基、烯基、炔基、鹵代或羥基取代。

術(shù)語“胺”是指式--NR'R''的伯、仲或叔氨基，其中該定義中使用的R'和R''獨(dú)立地是氫、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、芳基、羧基、環(huán)烷基、雜環(huán)或其它氨基(在酰肼的情況下)或R'和R'' 與它們所連接的氮原子一起形成具有4-8個(gè)原子的環(huán)。因此，本文使用的術(shù)語"氨基"包括未取代的、單取代的(例如一烷基氨基或一芳基氨基)和二取代的(例如二烷基氨基或芳烷基氨基)氨基。氨基包括--NH₂、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基-乙基氨基、吡咯烷-1-基或哌啶子基、嗎啉代等。其它示例性的形成環(huán)的"氨基"包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、異噻唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吲嗪基、咪唑基、異吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基。含有氨基的環(huán)可任選被另一氨基、烷基、烯基、炔基、鹵代或羥基取代。

術(shù)語“醇”是指"羥基"或"羥基"是指取代基 –OH。

術(shù)語"氨基醇"是指含有醇和胺基團(tuán)兩者的官能團(tuán)。如本文使用的，"氨基醇"還指具有替換羧酸基團(tuán)的與醇結(jié)合的碳的上文定義的氨基酸。在示例性的實(shí)施方案中，術(shù)語"氨基醇"是指其中胺與鄰接帶有醇的碳的碳結(jié)合的上文定義的氨基醇。在示例性的實(shí)施方案中，"氨基醇"是指含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)碳原子的上文定義的含有胺和醇的部分(即，C_1-12 氨基醇)。氨基醇的實(shí)例包括但不限于乙醇胺、庚胺醇、乙基異丙腎上腺素、去甲腎上腺素、丙醇胺、鞘氨醇、甲醇胺、2-氨基-4-巰基丁-1-醇、2-氨基-4-(甲基硫代)丁-1-醇、半胱氨醇、苯基甘氨醇、脯氨醇、2-氨基-3 -苯基- 1-丙醇、2-氨基-l-丙醇、環(huán)己基甘氨醇、4-羥基-脯氨醇、亮氨醇、叔-亮氨醇、苯基丙氨醇、a-苯基甘氨醇、2-吡咯烷甲醇、酪氨醇、纈氨醇、絲氨醇、2-二甲基氨基乙醇、組氨醇、異亮氨醇、亮氨醇、甲硫氨醇、l-甲基-2-吡咯烷甲醇、蘇氨醇、色氨醇、丙氨醇、精氨醇、甘氨醇、谷氨醇、4-氨基-5-羥基戊酰胺、4-氨基-5-羥基戊酸、3-氨基-4-羥基丁酸、賴氨醇、3-氨基-4-羥基丁酰胺和4-羥基-脯氨醇。

術(shù)語"氨基酸"是指含有羧酸和與緊接羧酸基團(tuán)的碳原子結(jié)合的胺的基團(tuán)，包括天然和合成的氨基酸兩者。氨基酸的實(shí)例包括但不限于精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。羧基被H、鹽、酯、烷基或芳烷基取代。氨基被H、酰基、烷基、烯基、炔基、羧基、環(huán)烷基、芳烷基或雜環(huán)基取代。

術(shù)語"醚"是指基團(tuán)--R'--O--R''，其中該定義中使用的R'和R''獨(dú)立地是氫、烷基、烯基、炔基、碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或芳烷基，和R'可另外是與碳連接的共價(jià)鍵。

術(shù)語"鹵素"是指氟、氯、溴或碘原子。

術(shù)語"鹵化物"是指含有與氟、氯、溴或碘原子鍵合的原子的官能團(tuán)。本文公開的示例性的實(shí)施方案可包括"烷基鹵化物"、"烯基鹵化物"、"炔基鹵化物"、"環(huán)烷基鹵化物"、"雜環(huán)基鹵化物"或"雜芳基鹵化物"基團(tuán)。在示例性的實(shí)施方案中，"烷基鹵化物"是指含有碳-鹵素鍵的部分，其含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子(即，C_1-10 烷基鹵化物)。烷基鹵化物基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于氟甲基、氟乙基、氯甲基、氯乙基、溴甲基、溴乙基、碘甲基和碘乙基。除非另外說明，本文涉及的任何含碳基團(tuán)可包含1個(gè)或多個(gè)碳-鹵素鍵。通過非限制性實(shí)例的方式，Ci烷基可以是但不限于甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、溴甲基、二溴甲基、三溴甲基、碘甲基、二碘甲基、三碘甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基和二氟氯甲基。

在本文所述的化合物中，雜原子能夠帶有多個(gè)不同的原子價(jià)。通過非限制性實(shí)例的方式，S、Se和N可以是中性的或帶有正電荷，和O可以是中性的或帶有正電荷或負(fù)電荷。

在一些實(shí)施方案中，式(I)、(II)或(III)的化合物包括所示化合物的非對映體和對映體。對映體定義為彼此成鏡像和不重疊的一對分子實(shí)體之一。非對映體或非對映異構(gòu)體定義為并非對映體的立體異構(gòu)體。非對映體或非對映異構(gòu)體是不作為鏡像相關(guān)的立體異構(gòu)體。非對映異構(gòu)體通過物理性質(zhì)的差異來表征。

本文所示的術(shù)語“化合物C”或“化合物C”是指5'-甲基硒代腺苷；亦稱為(2R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((甲基硒烷基)甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，CAS登記號5135-40-0，和包括其任何藥學(xué)上可接受的鹽。

本文所示的術(shù)語“化合物D”或“化合物D”是指5'-硒代腺苷高半胱氨酸；(2R)-2-氨基-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基)硒烷基)丁酸，CAS登記號4053-91-2和包括其任何藥學(xué)上可接受的鹽。

本文所示的術(shù)語“化合物E”或“化合物E”是指γ-谷氨酰基-甲基硒代-半胱氨酸或γ-L-谷氨?；?Se-甲基-L-半胱氨酸；亦稱為N5-(1-羧基-2-(甲基硒烷基)乙基)-L-谷氨酰胺或其任何藥學(xué)上可接受的鹽。

本文所示的術(shù)語“化合物H”或“化合物H”是指5’-甲基硫代腺苷；5'-S-甲基-5'-硫代腺苷，CAS登記號2457-80-9或其藥學(xué)上可接受的鹽。

術(shù)語“化合物I”或“化合物I”是指S-腺苷-L-高半胱氨酸，亦稱為(S)-5'-(S)-(3-氨基-3-羧基丙基)-5'-硫代腺苷，CAS登記號979-92-0或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本文所示的術(shù)語“化合物J”或“化合物J”是指γ-L-谷氨酰基-甲基-L-半胱氨酸，亦稱為γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。

術(shù)語“化合物CDE”是指化合物C、化合物D和化合物E或其藥學(xué)上可接受的鹽的混合物。

術(shù)語“化合物HIJ”是指化合物H、化合物I和化合物J或其藥學(xué)上可接受的鹽的混合物。

術(shù)語"類似物"和"衍生物"可互換使用，并且是指給定分子的至少1個(gè)位置的天然或非天然的修飾。例如，給定化合物或分子的衍生物通過添加官能團(tuán)或原子、除去官能團(tuán)或原子或改變官能團(tuán)或原子為不同的官能團(tuán)或原子(包括但不限于同位素)而被修飾。

術(shù)語“包含”是指包括和不排除其它要素或方法步驟的組合物、化合物、制劑或方法。

術(shù)語“由……組成”是指排除任何其它組分或方法步驟的存在的化合物、組合物、制劑或方法。

術(shù)語“基本上由……組成”是指包括另外的要素或方法步驟的組合物、化合物、制劑或方法，所述另外的要素或方法步驟在實(shí)質(zhì)上不影響組合物、化合物、制劑或方法的特征。

術(shù)語"化合物"是指任何一種或多種化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物等，其可用于治療或預(yù)防身體機(jī)能的疾病、生病、不適或病癥?；衔锇阎蜐撛诘闹委熜曰衔飪烧??？赏ㄟ^使用本申請的篩選方法進(jìn)行篩選確定化合物為治療性的。"已知的治療性化合物"是指已經(jīng)表明(例如通過動(dòng)物試驗(yàn)或給予至人的在先實(shí)驗(yàn))在所述治療中有效的治療性化合物。換句話說，已知的治療性化合物不限于在治療疾病(例如神經(jīng)變性疾病)中有效的化合物。

術(shù)語"組合物"是指一種或多種化合物與或不與另一種試劑，例如但不限于載體試劑的組合(例如一種或多種含硒化合物與惰性或活性的載體，使得組合物特別適合于體外、體內(nèi)或離體診斷或治療用途)。

術(shù)語“組分”是指化合物或組合物的組成部分。例如，組合物的組分可包括化合物、載體和組合物中存在的任何其它試劑。

術(shù)語"有效量"是指足以實(shí)現(xiàn)有益或所需結(jié)果的組合物或化合物的量。有效量可在一次或多次施用或劑量中給予，和不意欲限制于具體制劑或給藥途徑。

術(shù)語"水合物"是指以分子形式與水締合的本文公開的化合物，即，其中H- OH鍵未斷裂，并且可表示為例如式R x H₂O，其中R是本文公開的化合物。給定的化合物可形成超過一種水合物，包括例如一水合物(R x H₂O)、二水合物(R₂ x H₂O)、三水合物(R₃ x H₂O)等。

術(shù)語“抑制性”或“拮抗性”是指降低、限制或阻斷另一化合物的作用或功能的化合物的性質(zhì)。

術(shù)語“分離的”是指混合物中一種材料與至少一種其它材料分離，或與天然伴隨該材料的材料分離。例如，合成的化合物與原料或中間體分離。

術(shù)語“線粒體電位”是指跨越線粒體內(nèi)膜的電壓差，其通過跨膜的凈正電荷移動(dòng)來維持。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指化合物自已知或確定狀態(tài)的狀態(tài)(例如，活性或量)變化。

"任選的"或"任選地"是指其中其后描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生的情況，和該描述包括其中所述事件或情況發(fā)生的例子和其中所述事件或情況不發(fā)生的例子。"任選地"包括其中所述條件存在的實(shí)施方案和其中所述條件不存在的實(shí)施方案。例如，"任選取代的苯基"意指苯基可以被取代，或可以不被取代，和該描述包括未取代的苯基和其中存在取代的苯基兩者。"任選地"包括其中所述條件存在的實(shí)施方案和其中所述條件不存在的實(shí)施方案。

術(shù)語"有機(jī)硒"或“硒有機(jī)化合物”是指其中硒替換硫的任何有機(jī)化合物。因此，有機(jī)硒可指通過酵母生物合成的任何這樣的化合物，或其可指化學(xué)合成的游離的有機(jī)硒化合物。后者的實(shí)例是游離的硒代甲硫氨酸。在一些情況下，硒有機(jī)化合物還包括硒代謝物。

術(shù)語"患者"或"受試者"可互換使用和是指動(dòng)物界的任何成員。優(yōu)選受試者是哺乳動(dòng)物，例如人、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或家畜哺乳動(dòng)物。

短語"藥學(xué)上可接受的"是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與人和動(dòng)物的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥、與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。

短語"藥學(xué)上可接受的載體"是指藥學(xué)上可接受的材料、組合物或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包膠材料，其參與從身體的一個(gè)器官或部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸所述包含硒的化合物或類似物或衍生物至身體的另一個(gè)器官或部分。在與制劑的其它成分相容和對患者無害的意義上，各種載體必須是"可接受的"?？捎米魉帉W(xué)上可接受載體的材料的一些實(shí)例包括：(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3) 纖維素和其衍生物，例如羧基甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4) 西黃蓍膠粉；(5) 麥芽；(6) 明膠；(7) 滑石粉；(8) 賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9) 油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 瓊脂；(14) 緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15) 藻酸；(16) 無熱原水；(17) 等滲鹽水；(18) 林格溶液；(19) 乙醇；(20) 磷酸鹽緩沖溶液；和(21) 藥物制劑中使用的其它無毒相容物質(zhì)。

術(shù)語“前藥”是指通過代謝轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變成藥理學(xué)活性劑的藥理學(xué)活性或更通常是無活性化合物。任何上式的化合物的前藥通過修飾任何上式化合物中存在的官能團(tuán)制備，其方式為所述修飾可在體內(nèi)裂解以釋放母體化合物。在體內(nèi)，前藥容易地在生理?xiàng)l件下經(jīng)歷化學(xué)變化(例如水解或受到天然存在的酶作用)，導(dǎo)致釋放藥理學(xué)活性劑。前藥包括任何上式的化合物，其中羥基、氨基或羧基與可在體內(nèi)裂解以分別再生游離羥基、氨基或羧基的任何基團(tuán)鍵合。前藥的實(shí)例包括但不限于任何上式化合物的酯(例如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)或在處于生理pH或通過酶作用時(shí)轉(zhuǎn)變成活性母體藥物的任何其它衍生物。在本領(lǐng)域中描述了用于選擇和制備合適的前藥衍生物的常規(guī)程序(見例如Bundgaard. Design of Prodrugs. Elsevier，1985)。

術(shù)語"純化的"或"純化"或“基本上純化的”是指從組合物除去組分例如無活性、抑制性組分、未反應(yīng)化合物或在合成中產(chǎn)生的代替化合物(例如污染物)至組合物的10%或更少(例如10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少)不是活性化合物或藥學(xué)上可接受的載體的程度。

術(shù)語“鹽”可包括酸加成鹽或游離堿的加成鹽。優(yōu)選鹽是藥學(xué)上可接受的?？捎糜谛纬伤帉W(xué)上可接受的酸加成鹽的酸的實(shí)例包括但不限于源自無毒無機(jī)酸例如硝酸、磷酸、硫酸或氫溴酸、氫碘酸、氫氟酸、亞磷酸的鹽，以及源自無毒有機(jī)酸例如脂肪族一和二羧酸、苯基-取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、鏈烷二酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸和乙酸、馬來酸、琥珀酸或檸檬酸的鹽。這樣的鹽的非限制性實(shí)例包括萘二磺酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、辛酸鹽、異丁酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、苯基乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。還預(yù)期氨基酸的鹽例如精氨酸鹽等和葡萄糖酸鹽、半乳糖醛酸鹽(見例如Berge,等“Pharmaceutical Salts,” J. Pharma. Sci. 1977;66:1)。

術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的鹽，例如本發(fā)明的化合物的一鹽(例如，堿金屬和銨鹽)和多鹽(例如，二-或三-鹽)。本公開內(nèi)容的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽是其中例如，可交換基團(tuán)例如--OH、--NH--或--P(=O)(OH)—中的氫被替換為藥學(xué)上可接受的陽離子(例如，鈉、鉀或銨離子)，和可從本文公開的相應(yīng)的化合物通過例如與合適的堿反應(yīng)合適地制備。在化合物是足夠堿性或酸性以形成穩(wěn)定的無毒酸或堿鹽的情況下，化合物作為鹽給予可能是合適的。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例是與形成生理學(xué)可接受的陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸鹽。也可形成合適的無機(jī)鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽。藥學(xué)上可接受的鹽可使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序獲得，例如通過使足夠堿性的化合物例如胺與提供生理上可接受的陰離子的合適酸反應(yīng)。也可制備羧酸的堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(例如鈣)鹽。

術(shù)語"富硒酵母"和"硒化酵母"是指在含有無機(jī)硒鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的任何酵母(例如釀酒酵母)。本申請不受限于使用的硒鹽。事實(shí)上，預(yù)期各種硒鹽可用于本申請，包括但不限于亞硒酸鈉、硒酸鈉、亞硒酸鈷或硒酸鈷。這樣的酵母制備物中的含硒化合物是硒代甲硫氨酸，其以摻入至多肽/蛋白的形式存在。在這樣的制備物中以硒代甲硫氨酸的形式存在的總細(xì)胞硒的量將不同，但可在10和100%之間、20-60%、50-75%和在60和75%之間。硒化酵母制備物中剩余部分的有機(jī)硒主要由硒代甲硫氨酸生物合成途徑中的中間體構(gòu)成。這些包括但不限于硒代半胱氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和硒代腺苷硒代甲硫氨酸。最終產(chǎn)物中殘余的無機(jī)硒鹽的量通常非常低(例如< 2%)。

關(guān)于部分(moiety)的術(shù)語"取代的"是指另外的取代基，其與所述部分在所述部分的任何可接受的位置上連接。除非另外說明，部分可通過碳、氮、氧、硫或任何其它可接受的原子鍵合。取代基的實(shí)例包括但不限于胺、醇、硫醇、醚、烯、炔、環(huán)氧化物、氮丙啶、環(huán)氧乙烷、氮雜環(huán)丁烷、二氫呋喃、吡咯烷、吡喃、哌啶、醛、酮、酯、羧酸、羧酸酯、亞胺、酰亞胺、疊氮化物、偶氮基、烯胺、烷基鹵化物、烯基鹵化物、炔基鹵化物、芳基鹵化物、膦、氧化膦、次膦酸酯、亞膦酸酯、亞磷酸酯、膦酸酯、磷酸酯、硫酸酯、硫氧化物、磺酰基、次硫酰基(sulfoxyl)、磺酸酯、硝酸酯、亞硝酸酯、腈、硝基、亞硝基、氰酸酯、硫代氰酸酯、異硫代氰酸酯、碳酸酯、酰基鹵化物、過氧化物、氫過氧化物、半縮醛、半縮酮、縮醛、縮酮、原酸酯、原碳酸酯、硫化物、二硫化物、磺酸、磺酸、硫酮、硫醛、磷酸二酯、硼酸、硼酸酯、硼酸和硼酸酯。

術(shù)語“治療(treating, treat或treatment)”是指治療性處理，其中目的是減慢(例如減輕或延遲發(fā)生)不需要的生理學(xué)病況、病癥或疾病，或獲得有益或需要的結(jié)果，例如已經(jīng)或?qū)⒆兊卯惓５膮?shù)、值、功能或結(jié)果的下降的部分或全部恢復(fù)或抑制。有益或需要的結(jié)果包括但不限于癥狀減輕；病況、病癥或疾病的發(fā)展的程度或活力或速率的降低；病況、病癥或疾病的狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)；病況、病癥或疾病的發(fā)作延遲或進(jìn)展減慢；病況、病癥或疾病狀態(tài)的改善；和實(shí)際臨床癥狀的減輕(無論部分或全部) (無論其是否轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際臨床癥狀的直接減輕)或病況、病癥或疾病的提高或改善。

術(shù)語"能夠特異性檢測基因表達(dá)的試劑"是指能夠或足以檢測本文詳細(xì)描述的各種基因的表達(dá)的試劑。合適試劑的實(shí)例包括但不限于能夠與mRNA或cDNA特異性雜交的核酸探針，和抗體(例如單克隆或多克隆抗體)。

術(shù)語"毒性的"是指與給予毒性劑之前的相同細(xì)胞或組織相比，對受試者、細(xì)胞或組織的任何有損或有害作用。

化合物和組合物

本申請的一個(gè)方面涉及5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)、Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物D”)、γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸(“化合物E”)和其類似物。一些實(shí)施方案包括包含式I、式II和/或式III的化合物和其組合的組合物。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(I)化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，

其中R₁是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₄是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₇是H、烷基、烯基、炔基、酮、氨基醇、氨基酸、OR’、Se-R’、S-R’，其中R’選自H、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；和

R₈是氫、疊氮基、烷基、烯基、炔基。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些式(I)化合物中的一個(gè)或多個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁、R₃、R₄和R₈各自為H；R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆各自不存在；和R₇是烷基或氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁、R₃、R₄和R₈各自是H；R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆ 各自不存在；和R₇是烷基或氨基酸；條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜可各自從組合物中排除。

在特定的方面，提供包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，所述化合物是5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥，條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜可各自從組合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(II)化合物的組合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥，

其中R₁是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₄是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₈是氫、疊氮基、烷基、烯基、炔基；

R₉是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₉與R₁₀一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₁₀是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₉與R₁₀一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；和

R₁₁是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些式(II)化合物中的一個(gè)或多個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁、R₃、R₄、R₈和R₉各自是H；R₂是H、?；⑼榛?、羧基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆不存在；R₁₀是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；和R₁₁是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀如上文所定義和其中R₁₁是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。

在特定的方面，提供包含式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，所述化合物是5'-硒代腺苷高半胱氨酸(化合物“D”)或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸和硒代羥基腺苷高半胱氨酸可各自從組合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(III)化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中

R₁是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₄是H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；和

R₇是H、烷基、烯基、炔基、酮、OR’、Se-R’、S-R’，其中R’選自H、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中

R₁和R₂各自是H；

R₃是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₄是H或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₅和R₆不存在；和

R₇是烷基、烯基或炔基。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化這些式(III)化合物中的一個(gè)或多個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁和R₂各自是H；R₃是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；R₄是H；R₅和R₆各自不存在；和R₇是烷基，其是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。

在一些實(shí)施方案中，提供包含式III化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，其中R₁和R₂各自是H；R₃是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；R₄是H；R₅和R₆ 不存在；和R₇是甲基。

在特定的方面，提供包含式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥的組合物，所述化合物是γ-谷氨酰基-甲基硒代-半胱氨酸(“化合物E”)或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥，條件是γ-谷氨?；腚装彼? γ -谷氨?；腚装彼?、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸,γ-谷氨?；腚装彼?γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨?；腚装彼岷臀入赘孰?γ-谷氨?；腚装彼峥筛髯詮慕M合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供包含根據(jù)式(I)、(II)和/或(III)的一個(gè)或多個(gè)的一種或多種化合物的組合物，其中以下化合物的每一個(gè)從組合物中排除以使硒毒性最小、除去無活性或抑制性化合物、和/或使組合物的治療指數(shù)最大，其中所排除的化合物是γ -谷氨?；腚装彼?γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨?；腚装彼帷ⅵ?-谷氨?；腚装彼?γ-谷氨?；腚装彼帷ⅵ?谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨?；腚装彼帷⑽入赘孰?γ-谷氨?；腚装彼?、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜。

在實(shí)施方案中，本文所述的任何化合物可用前藥修飾以延長半壽期，保護(hù)化合物免于氧化，使化合物靶向組織，和/或允許化合物通過血腦屏障。

在實(shí)施方案中，前藥包含硒代糖苷。糖苷包括單糖、二糖和寡糖。糖可包括核糖、葡萄糖、半乳糖或甘露糖。例如與硒部分綴合的半乳糖可使化合物靶向肝。

在其它實(shí)施方案中，前藥包含selenazolidine。這些化合物提供化合物的緩慢釋放。

在仍其它的實(shí)施方案中，前藥包含本文所述的硒有機(jī)化合物與維生素例如C或E的綴合。這些前藥綴合物具有改進(jìn)的保護(hù)作用。

在仍其它的實(shí)施方案中，前藥是細(xì)胞色素P450活化的前藥。例如，環(huán)狀的磷酸酯或膦酸酯。具體而言，核苷被這些分子修飾，和提供分子靶向至肝。示例性的前藥包括HepDirect前藥。細(xì)胞色素P450活化的前藥的其它實(shí)施方案改進(jìn)生物利用度和描述于Huttunen等Current Medicinal Chemistry 2008 15:2346。

在實(shí)施方案中，式(I)、式(II)、式(III)化合物中的任一個(gè)可被修飾以減少硒的氧化。在實(shí)施方案中，化合物可通過硒原子之間的連鍵形成二聚體。

在實(shí)施方案中，式(I)、式(II)、式(III)化合物中的任一個(gè)可通過連接組織靶向劑或用于增加化合物的半壽期的其它試劑而被修飾。在實(shí)施方案中，組織靶向劑包括特異性結(jié)合組織特異性抗原的抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或如本文所述的前藥。

在其它實(shí)施方案中，化合物可連接聚合物載體或納米粒載體或與其組合，以遞送組合物至腦和提供其它組織靶向。這樣的聚合物載體包括但不限于聚乙二醇、聚丙交酯、聚乙交酯、聚原酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。微球和脂質(zhì)體包括聚二乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)微球。其它納米粒包括磷脂、殼聚糖、乳酸和葡聚糖。

脂質(zhì)前藥也可適用于本發(fā)明的化合物。通過非限制性實(shí)例，某些脂質(zhì)前藥描述于Hostetler等(1997 Biochem. Pharm. 53:1815-1822)和Hostetler等1996 Antiviral Research 31:59-67)，這兩者通過引用以其整體結(jié)合到本文中。合適的前藥技術(shù)的其它實(shí)例描述于WO 90/00555; WO 96/39831; WO 03/095665A2; 美國專利號5,411,947; 5,463,092; 6,312,662; 6,716,825;和美國專利申請公開號2003/0229225和2003/0225277，其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中。這樣的前藥也可具有使藥物化合物靶向患者內(nèi)的特定組織例如肝的能力，如描述于Erion等(2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion等Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004); WO 01/18013 A1; 美國專利號6,752,981)，其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中。通過非限制性實(shí)例的方式，適合用于本發(fā)明的化合物的其它前藥描述于WO 03/090690; 美國專利號6,903,081; 美國專利申請?zhí)?005/0171060A1; 美國專利申請?zhí)?002/0004594A1;和Harris等(2002 Antiviral Chem & Chemo. 12: 293-300; Knaggs等2000 Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 2075-2078)，其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

在一些實(shí)施方案中，提供包含各自根據(jù)式(I)的一種或多種化合物的組合物。在一些方面，包含各自根據(jù)式(I)的一種或多種化合物的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，提供包含各自根據(jù)式(I)和式(III)的一種或多種化合物的組合物。在一些方面，包含各自根據(jù)式(I)和式(III)的一種或多種化合物的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，包含各自根據(jù)式(I)和式(III)的一種或多種化合物的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨酰基-甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，提供包含各自根據(jù)式(II)和式(III)的一種或多種化合物的組合物。在一些方面，包含各自根據(jù)式(II)和式(III)的一種或多種化合物的組合物包含5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含治療有效量的一種或多種本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或前藥，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。

藥學(xué)上可接受的載體包括：(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3) 纖維素和其衍生物，例如羧基甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4) 西黃蓍膠粉；(5) 麥芽；(6) 明膠；(7) 滑石粉；(8) 賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9) 油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 瓊脂；(14) 緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15) 藻酸；(16) 無熱原水；(17) 等滲鹽水；(18) 林格溶液；(19) 乙醇；(20) 磷酸鹽緩沖溶液；和(21) 藥物制劑中使用的其它無毒相容物質(zhì)。

組合物可配制用于任何給藥途徑，具體而言用于口服、直腸、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。組合物可以任何常規(guī)形式配制，例如作為片劑、膠囊劑、錠劑、溶液、混懸劑、分散劑、糖漿劑、噴霧劑、凝膠、栓劑、貼劑和乳劑。

如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，對任何一個(gè)受試者的劑量可取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給藥次數(shù)和途徑、一般健康和與同時(shí)給予的其它藥物的相互作用。根據(jù)通過治療所尋求的欲改變的靶標(biāo)，藥物組合物可配制和系統(tǒng)或局部給予。用于制劑和給藥的技術(shù)可見于最新版本的"Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co，Easton Pa.)。合適的途徑可例如包括口服或經(jīng)粘膜給藥；以及胃腸外遞送，包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。

適用于本申請的藥物組合物包括這樣的組合物，其中活性成分(例如5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合)以有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量包含在內(nèi)。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有效量的藥物組合物包含一定量的選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物。有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容。

包含2%或更少無機(jī)硒的硒化酵母通常包含許多含硒組分。硒化酵母的典型水提取物的主要的硒組分是硒代蛋白和硒代甲硫氨酸。已經(jīng)鑒定、分離和純化了具有小于1000千道爾頓("Kda")的分子量的其它小分子量組分。硒化酵母或其水提取物中存在的一些組分和化合物當(dāng)自這樣的硒化酵母分離時(shí)，具有較不需要的生物活性或甚至對線粒體功能具有抑制性生物活性?；衔锢绻劝滨；腚装彼岷秃蚧衔锢?’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸是無活性的，或在一些情況下是抑制性的，如本文所述和顯示的。

一些含硒化合物已經(jīng)合成制備，純化和在生物活性測定法中篩選。篩選的濃度范圍包括約15-約500 ppb。對于本文所述的組合物甚至可在15 ppb時(shí)檢出生物活性。在實(shí)施方案中，生物活性測定法是線粒體電位測定法。當(dāng)獲自硒化酵母時(shí)，并非所述酵母或其水提取物中存在的所有的組分和化合物具有生物活性，并且一些組分和化合物抑制需要的生物活性。

在實(shí)施方案中，合成產(chǎn)生的含硒化合物以不同于水提取物中存在的比率在組合物中配制。例如，典型的水提取物具有7：1比率的γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸與5’-甲基硒代腺苷或Se-腺苷-L-高半胱氨酸。在實(shí)施方案中，含有合成產(chǎn)生的化合物的組合物可包含相等量的各含硒化合物，例如比率至少1:1:1的γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸與5’-甲基硒代腺苷與Se-腺苷-L-高半胱氨酸。在其它實(shí)施方案中，組合物可包含比率為5:1至1:1的至少2種組分。

包含一種或多種化合物(包括5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合)的組合物，可在藥學(xué)上可接受的載體例如生理鹽水中經(jīng)靜脈內(nèi)給予受試者(例如患者)?？墒褂冒麅?nèi)遞送化合物的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如通過脂質(zhì)體遞送)。這樣的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。

包含硒的組合物可用于靜脈內(nèi)給藥以及胃腸外給藥，例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)。對于注射，本申請的包含硒的組合物(例如藥物組合物)可在水溶液中配制，優(yōu)選在生理學(xué)相容的緩沖液中例如Hanks溶液、林格溶液或生理緩沖鹽水。對于組織或細(xì)胞給藥，可在制劑中使用適合于待滲透的特定屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。

包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的組合物可添加至營養(yǎng)飲料或食物(例如ENSURE、POWERBAR等)、多重維生素、營養(yǎng)產(chǎn)品、食品等中，用于每日消耗。

在其它實(shí)施方案中，本申請的組合物可使用本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體，以適合于口服給藥的劑量配制。這樣的載體使藥物組合物能夠配制為片劑、丸劑、膠囊劑、液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，用于由待治療的患者口服或經(jīng)鼻攝取。

在本申請的一些實(shí)施方案中，包含硒的組合物和/或制劑可單獨(dú)或與其它形式的硒、藥物、小分子組合或在其中它與賦形劑或其它藥學(xué)上可接受的載體混合的藥物組合物中給予受試者。在實(shí)施方案中，組合物可包括一種或多種氨基酸或硒代氨基酸，例如甲硫氨酸、半胱氨酸或硒代半胱氨酸，以使毒性最小。在本申請的一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是藥學(xué)上惰性的。在本申請的另一實(shí)施方案中，包含硒的組合物可單獨(dú)給予至易患、有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生或患有與線粒體功能障礙有關(guān)的疾病或病況的個(gè)體。

使用化合物和組合物的方法

如本文所述，化合物和其組合可以組織特異性和組織合適性的方式用于增強(qiáng)線粒體功能、治療線粒體功能障礙、治療阿爾茨海默病和調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。

A. 線粒體功能和功能障礙

線粒體是高等生物的細(xì)胞中的主要能量產(chǎn)生細(xì)胞器。線粒體對各種細(xì)胞呼吸、氧化和代謝過程提供直接和間接的生物化學(xué)調(diào)節(jié)。這些包括電子傳遞鏈(ETC)活性，其驅(qū)動(dòng)氧化磷酸化以產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)形式的代謝能量，和其還是胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中重要的線粒體功能的基礎(chǔ).。

除了它們在成長的細(xì)胞的能量產(chǎn)生中的作用以外，線粒體(或者至少線粒體組分)參與程序化細(xì)胞死亡(PCD)，亦稱為細(xì)胞凋亡(參見例如，Newmeyer等Cell 1994，79:353-364; Liu等Cell 1996，86:147-157)。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和免疫系統(tǒng)正確發(fā)揮功能所必需的。此外，一些疾病狀態(tài)被認(rèn)為與不足或過度的細(xì)胞凋亡水平有關(guān)(例如癌癥和自身免疫疾病，和在后一情況下分別為中風(fēng)損害和阿爾茨海默病中的神經(jīng)變性)。已經(jīng)證明了線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用(參見例如，Green和Reed，Science，1998，281:1309-1312; Green，Cell，1998，94:695-698;和Kromer，Nature Medicine，1997,3:614-620)。

線粒體相關(guān)的疾病(例如由線粒體功能障礙引起)也可與通過并非自由基氧化的機(jī)制導(dǎo)致的線粒體膜電化學(xué)電位的損失有關(guān)，和滲透性轉(zhuǎn)變可由于線粒體基因、基因產(chǎn)物或相關(guān)的下游介質(zhì)分子和/或線粒體外基因、基因產(chǎn)物或相關(guān)的下游介質(zhì)的直接或間接影響，或其它已知或未知的原因?qū)е隆Ｒ虼?，線粒體電位的損失可能是在與線粒體功能改變有關(guān)的疾病的進(jìn)展中的重要的事件，所述疾病包括變性疾病以及與衰老有關(guān)的疾病/病況(例如癌癥、心血管疾病和心力衰竭、2型糖尿病、阿爾茨海默病和帕金森病、脂肪肝病、白內(nèi)障、骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、睡眠障礙和炎性疾病例如銀屑病、關(guān)節(jié)炎和結(jié)腸炎)。如本文所述的方法可用于增強(qiáng)線粒體功能，無論在受試者中的細(xì)胞是否處于應(yīng)激或疾病情況下。

本文公開的化合物和組合物關(guān)于它們對線粒體功能的影響，顯示組織特異性。

實(shí)施方案包括在一種或多種腎細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的方法或用途，包括：給予有效量的組合物至細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式I的化合物和其混合物的化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增強(qiáng)線粒體功能。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，組合物可排除Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、谷氨酰基硒代半胱氨酸、式III的化合物、5’-甲基硫代腺苷或S-腺苷-L-高半胱氨酸中的一種或多種。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┌x自5’-甲基硒代腺苷、式I的化合物和其混合物的化合物的組合物的用途，其中所述有效量在腎細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷和/或式I的化合物的化合物。在實(shí)施方案中，用于在腎細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物可不包括Se-腺苷-L-高半胱氨酸、甲基硫代腺苷或S-腺苷-L-高半胱氨酸中的一種或多種。

本申請的實(shí)施方案包括在一種或多種細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的方法或用途，所述細(xì)胞選自骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和其組合，所述方法包括：給予有效量的組合物至細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增強(qiáng)線粒體功能。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┌x自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物的組合物的用途，其中所述有效量在一種或多種細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能，所述細(xì)胞選自骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和其組合。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物和其組合的化合物。在實(shí)施方案中，用于在肌細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物可不包括甲基硫代腺苷或S-腺苷-L-高半胱氨酸中的一種或多種。盡管不意欲限制本申請的范圍，甲基硫代腺苷或S-腺苷-L-高半胱氨酸顯示在骨骼肌細(xì)胞中對線粒體功能的毒性作用。

在常用的硒補(bǔ)充劑(例如富硒酵母)中某些含硫分子的存在，在一些情況下可抑制線粒體活性和隨時(shí)間導(dǎo)致前-糖尿病狀態(tài)。文獻(xiàn)中充分證明了成年發(fā)作型糖尿病與在數(shù)年的時(shí)間中線粒體活性的逐漸降低有關(guān)。這在骨骼肌的情況下是特別重要的，估計(jì)骨骼肌使用75-80%的每日攝取的葡萄糖。甚至肌肉線粒體有效消耗葡萄糖的能力的適度降低(例如，20%抑制)可隨時(shí)間導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題。例如，在響應(yīng)化合物Se-腺苷-L-高半胱氨酸時(shí)在骨骼肌細(xì)胞中注意到的線粒體活性的2倍刺激，可代表在前驅(qū)糖尿病或糖尿病受試者的肌肉組織中避免或延遲線粒體減少的方式。

在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物可不包括硒代甲硫氨酸或谷氨酰基硒代半胱氨酸中的一種或多種。

在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物包含選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸和/或式II的化合物的化合物和選自5’-甲基硒代腺苷、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式III的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。

在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物包含包含選自5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基-半胱氨酸和其組合的化合物的組合物。在實(shí)施方案中，靶向神經(jīng)元細(xì)胞的組合物可包含提高神經(jīng)元細(xì)胞中的線粒體活性的一種或多種硫類似物。

其它實(shí)施方案包括在一種或多種肝細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的方法或用途，包括：給予有效量的組合物至細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物和式III的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增強(qiáng)線粒體功能。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在肝細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物和式III的化合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種肝細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的至少三種化合物，以在肝細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能。在實(shí)施方案中，組合物可排除選自5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸、谷氨?；?甲基-半胱氨酸和其組合的一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，與未用化合物處理的相同類型的細(xì)胞相比，提高線粒體功能范圍從增加大約50%至增加500%。響應(yīng)的幅度取決于細(xì)胞類型、特定的化合物和與細(xì)胞接觸的時(shí)間。在實(shí)施方案中，與用硒化合物的一種或多種硫類似物處理的相同類型的細(xì)胞相比，對線粒體功能的影響是約-66%至+200%。在一些細(xì)胞類型的情況下，硫類似物對線粒體活性沒有可測量的影響，在其它細(xì)胞類型的情況下，它們是抑制性的，和在仍其它細(xì)胞類型的情況下，它們是刺激性的。

在實(shí)施方案中，一種或多種化合物對解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)具有組織特異性作用。線粒體(MT)中的解偶聯(lián)蛋白(UCP)對線粒體電位或完整性的維持和熱產(chǎn)生是重要的。已經(jīng)證明UCP2的損失導(dǎo)致壽命縮短和MT中活性氧物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生提高(參見例如，Andrews等 Am J Physiol Endocrinol Metab，2009. 296(4): p. E621-7；Andrews等Curr Aging Sci，2010. 3(2): p. 102-12)。然而，因?yàn)閁CP將線粒體中的電子傳遞解偶聯(lián)，它們具有在細(xì)胞中降低從葡萄糖產(chǎn)生ATP的凈效果。眾所周知的，線粒體ATP的產(chǎn)生對通過胰腺β-細(xì)胞的葡萄糖-刺激的胰島素分泌(GSIS)是關(guān)鍵的。事實(shí)上，已經(jīng)表明一種UCP (具體而言是UCP2)的抑制通過正面影響胰島素分泌和作用兩者逆轉(zhuǎn)膳食-誘導(dǎo)的糖尿病(De Souza等FASEB J，2007，21(4): 1153-1163。

在實(shí)施方案中，在神經(jīng)元細(xì)胞中下調(diào)Ucp2和/或Ucp3基因表達(dá)的方法或用途包括：給予有效量的組合物至細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中下調(diào)Ucp2和/或Ucp3的表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在神經(jīng)元細(xì)胞中下調(diào)Ucp2和/或Ucp3基因表達(dá)的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物。

在其它實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞中下調(diào)Ucp2基因表達(dá)的方法或用途包括：給予有效量的組合物至細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的至少三種化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量在肝細(xì)胞中下調(diào)Ucp2表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在肝細(xì)胞中下調(diào)Ucp2和/或Ucp3基因表達(dá)的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物和式III的化合物的至少三種不同的化合物。

在細(xì)胞中測定基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，和包括與探針雜交(例如在陣列上)，或通過PCR方法。用于測定基因表達(dá)的陣列和/或引物是市售可得的。使用對于Ucp1、Ucp2和/或Ucp3的示例性的序列，可容易地設(shè)計(jì)引物。Ucp1的示例性的序列見于NM_021833/gI194733736，Ucp2見于NM_003355/gI13259540和Ucp3見于NM_003356/gI 215273349。

在實(shí)施方案中，如本文所述的化合物和組合物的有效量是有效增強(qiáng)線粒體功能而對細(xì)胞沒有毒性的量。增強(qiáng)線粒體功能可在獲自按照本文所述的組合物處理的受試者的樣品上使用多種測定法確定。選擇的有效量不對任何示例的細(xì)胞包括腎細(xì)胞、小鼠骨骼細(xì)胞、人神經(jīng)元細(xì)胞或小鼠肝細(xì)胞顯示毒性。

如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，對任何一個(gè)受試者的劑量可取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給藥次數(shù)和途徑、一般健康和與同時(shí)給予的其它藥物的相互作用。

在實(shí)施方案中，給予受試者以在一種或多種腎、神經(jīng)元、肝或骨骼肌細(xì)胞中增強(qiáng)線粒體功能的組合物的有效量是每天約至少5 ug或更多，或800 ug或更少的單一需要的生物活性的含硒化合物或多種需要的生物活性的含硒化合物。當(dāng)多種需要的生物活性的含硒化合物存在時(shí)，組合物的有效量是組合物中所有需要的生物活性的含硒化合物的總計(jì)。

在實(shí)施方案中，給予受試者的有效量是約5ug至約800 ug和其中的每個(gè)數(shù)值，5 ug至約700 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約600 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約500 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約400 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約300 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約200 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約100 ug和其中的每個(gè)數(shù)值或5 ug至50 ug和其中的每個(gè)數(shù)值。

在包含如本文所述的需要的生物活性的含硒化合物的組合物的實(shí)施方案中，給予受試者的有效量優(yōu)選是200 ug或更少/天或50 ug或更少/天。在實(shí)施方案中，劑量可根據(jù)功效或是否在受試者中觀察到硒中毒的任何明顯跡象例如蒜味呼吸、掉發(fā)或?qū)蛹锥{(diào)整。

在實(shí)施方案中，在包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少兩種或更多種化合物的組合物中，化合物以相等的比例存在于組合物中。在其它實(shí)施方案中，一種需要的生物活性的含硒化合物與另一種的比率可以是約4:1至1:1。

在實(shí)施方案中，每天至少一次給予劑量，持續(xù)一段時(shí)間，以在血液中實(shí)現(xiàn)元素硒的穩(wěn)定狀態(tài)。在實(shí)施方案中，每天給予劑量，持續(xù)至少60或90天。在實(shí)施方案中，在受試者正經(jīng)歷疾病或病癥的癥狀時(shí)給予劑量。在實(shí)施方案中，受試者處于線粒體相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加的年齡，例如至少40歲。

本申請的方法可用于治療(例如預(yù)防性地或治療性地)受試者(例如具有與線粒體功能障礙有關(guān)的病況的受試者)。盡管不意欲限制本公開內(nèi)容的范圍，已經(jīng)提供了證據(jù)表明三種合成的有機(jī)硒化合物單獨(dú)或以各種組合在不同的細(xì)胞類型中具有顯著地增加線粒體活性的能力，所述細(xì)胞類型即腎細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和肝細(xì)胞。在機(jī)制上，UCP的調(diào)節(jié)可為這種增加提供一種解釋，并且我們在下文提供了證據(jù)表明，對線粒體功能和生物發(fā)生是關(guān)鍵的其它蛋白的表達(dá)也可受這些化合物有利地影響。然而不管作用機(jī)制如何，這些化合物可以跨組織的方式刺激線粒體活性的事實(shí)意味著它們可能在改善表面上不同疾病例如阿爾茨海默病(AD)和2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生和進(jìn)展中特別有價(jià)值。

包含一種或多種化合物(包括5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合)的組合物可以如本文所述的任一種方式給予受試者(例如患者)。

在遞送至骨骼肌的實(shí)施方案中，如本文所述的組合物可以凝膠、貼劑或霜?jiǎng)┑男问骄植渴┯谩?/p>

在其它實(shí)施方案中，遞送至腦可通過使用具有抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或前藥作為靶向劑的脂質(zhì)體或PLGA球靶向。

在其它實(shí)施方案中，遞送至肝可通過使用使用如本文所述的靶向前藥，包括HepDirect或硒代糖苷靶向。

因此，在本申請的一些實(shí)施方案中，包含硒的組合物和/或制劑可單獨(dú)或與其它形式的硒、藥物、小分子組合或在其中它與賦形劑或其它藥學(xué)上可接受的載體混合的藥物組合物中給予受試者。

在本申請的另一實(shí)施方案中，包含本文所述的硒有機(jī)化合物的組合物可單獨(dú)給予至易患、有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生或患有與線粒體功能障礙有關(guān)的疾病或病況的個(gè)體。這樣的疾病包括糖尿病腎病、阿爾茨海默病和II型糖尿病。

A.阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(“AD”)是美國(“USA”)的第6大死亡原因，并且是最常見的癡呆形式。目前估計(jì)該疾病影響USA的510萬年齡在65歲和以上的人。AD在組織病理學(xué)上的特征為兩種標(biāo)志性損傷Aβ斑塊(見Kumar等2000)和由高-磷酸化形式的微管相關(guān)蛋白tau構(gòu)成的NFT (見Dunckley等，2005年在線公開，2005年10月19日和公開的專利申請201110038889 AI的段落155-163)。文獻(xiàn)中存在許多證據(jù)表明Aβ和NFT兩者在阿爾茨海默病的發(fā)病中是重要的伴侶，并且在受影響的個(gè)體中它們各自和一致起作用以使認(rèn)知損害和神經(jīng)元損失最大化。淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的突變導(dǎo)致具有100%滲透的AD，并且APP、早老素-I (PSEN)和早老素-2 (PSEN-2)的家族性AD (FAD)-相關(guān)突變導(dǎo)致淀粉樣蛋白β產(chǎn)生的水平增加和Aβ聚集。

此外，APP-過表達(dá)的小鼠(APP-Tg)顯示Aβ沉積和記憶損害，未形成NFT或遭受神經(jīng)元損失。當(dāng)?shù)矸蹣拥鞍浊绑w蛋白(APP)被稱為β分泌酶和y-分泌酶的兩種酶異常加工，導(dǎo)致形成β淀粉樣蛋白的39-42個(gè)氨基酸肽時(shí)，形成斑塊。γ-分泌酶事實(shí)上是多酶復(fù)合物，其包括早老素-I (PSEN)和早老素-2 (PSEN-2)作為兩種關(guān)鍵組分。

Aβ聚集與AD模型的記憶損失有關(guān)，和APP表達(dá)降低逆轉(zhuǎn)該損失(見Kumar等Peptides 21:1769 2000)。因此，APP表達(dá)降低(在基因或蛋白水平上)被技術(shù)人員理解為用來對抗涉及記憶損失的年齡依賴性或神經(jīng)變性病癥例如AD的方法。

PSEN、PSEN-2、Nicastrin (其控制在γ-分泌酶復(fù)合物中的蛋白運(yùn)輸)的調(diào)節(jié)或抑制是AD治療研究的重要目標(biāo)，和已經(jīng)公布了一些顯著的成功。例如，在人神經(jīng)元中調(diào)節(jié)PSEN活性的高度特異性的抑制劑不僅影響Aβ產(chǎn)生，而且影響Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(見Seiffert等J Biol. Chem. 275:34086 2000)。這伴隨有神經(jīng)突形態(tài)的變化，和表明γ分泌酶PSEN-1活性的調(diào)節(jié)對AD的神經(jīng)突病理學(xué)具有臨床有益作用(見Figueroa等Neurobiology Dis. 9:49 2002)。此外，PSEN的下調(diào)表明降低Aβ蛋白的分泌(見Luo等Acta Pharmacol.Sin.25:1613 2004)，和發(fā)現(xiàn)在SAMP8小鼠中PSEN的抑制顯著地改善記憶(見Kumar等J.Exp. Biol. 212:494 2009)。

因此，Aβ對神經(jīng)元具有毒性，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，和在腦中Aβ水平可通過調(diào)節(jié)其前體APP或加工APP的酶復(fù)合物的水平/活性而改變。技術(shù)人員容易理解和意識到，能夠抑制APP表達(dá)和/或APP加成成Aβ (例如B或γ分泌酶)的試劑是AD療法的治療靶標(biāo)。

本文公開的含硒化合物和組合物影響參與B淀粉樣蛋白加工和tau磷酸化的基因的基因表達(dá)。此外，這樣的化合物和組合物顯示關(guān)于涉及轉(zhuǎn)錄激活物的基因的基因表達(dá)的組織特異性。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其混合物的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制B淀粉樣蛋白積聚的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物的化合物或選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物5’-甲基硒代腺苷、式I的化合物和其混合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其混合物的化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制早老素1 (PSEN)和Nicastrin的表達(dá)。在實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞是IMR 32細(xì)胞。IMR 32細(xì)胞是作為阿爾茨海默病的模型的人神經(jīng)元細(xì)胞。(Neill等J. Neuroscience Res. 1994 39:482)。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的組合物可不包括Se-腺苷-L-高半胱氨酸或甲基硫代腺苷中的一種或多種。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制早老素1和nicastrin的表達(dá)的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物的化合物或選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸,γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物5’-甲基硒代腺苷、式I的化合物和其混合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物，以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制nicastrin和早老素1的基因表達(dá)。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的組合物可不包括硒代甲硫氨酸或谷氨酰基硒代半胱氨酸的一種或多種。

在實(shí)施方案中，組合物包括5’-甲基硒代腺苷和/或式(I)的化合物和選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物，以抑制神經(jīng)元細(xì)胞中的基因表達(dá)。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其混合物的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的神經(jīng)元細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物的化合物或選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸,γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、和式(III)的化合物5’-甲基硒代腺苷、式I的化合物和其混合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷和/或式I的化合物的化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制Gsk3B的表達(dá)。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制Gsk3B基因表達(dá)的組合物可不包括Se-腺苷-L-高半胱氨酸或甲基硫代腺苷的一種或多種。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化的組合物可不包括甲硫氨酸或其它含硫化合物的一種或多種。

在實(shí)施方案中，組合物包括5’-甲基硒代腺苷和/或式(I)的化合物和選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式III的化合物和其組合的至少兩種化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制tau磷酸化。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸和/或式(III)的化合物的化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制全部tau。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制全部tau的組合物可不包括Se-腺苷-L-高半胱氨酸或甲基硫代腺苷的一種或多種。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO磷酸化的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量抑制FOXO磷酸化。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO磷酸化的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物。

在實(shí)施方案中，用于在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO磷酸化同時(shí)在一種或多種肝細(xì)胞中提高FOXO磷酸化的方法或用途包括：給予有效量的組合物至肝和神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量在神經(jīng)元細(xì)胞中降低FOXO磷酸化和在肝細(xì)胞中增加FOXO磷酸化。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO3和/或FOXO 4的磷酸化。在實(shí)施方案中，用于在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO 3和/或FOXO4磷酸化的組合物可不包括甲硫氨酸或硒代甲硫氨酸。在實(shí)施方案中，組合物包括5’-甲基硒代腺苷和/或式(I)的化合物和選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物以在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制FOXO 3和FOXO 4的磷酸化。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物以提高PGC1a在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)。在實(shí)施方案中，用于提高PGC 1a在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)的組合物可不包括甲硫氨酸或硒代甲硫氨酸。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物用于提高PGC1a在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物。

在實(shí)施方案中，增加PGC1a在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)的方法或用途包括：給予有效量的組合物至一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增加PGC1a表達(dá)。

在實(shí)施方案中，用于增加PGC1a在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)和不影響PGC1a在一種或多種肝細(xì)胞中的表達(dá)的方法或用途包括：給予有效量的組合物至肝和神經(jīng)元細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物，其中與未用組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量增加PGC1a在一種或多種神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)和不影響PGC1a在一種或多種肝細(xì)胞中的表達(dá)。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷和/或式I的化合物的化合物和選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式II的化合物、式III的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物以提高PGC1 a在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)。

在實(shí)施方案中，與未用化合物處理的相同類型的細(xì)胞相比，PGC1a表達(dá)提高、FOXO磷酸化降低、PSEN1降低、nicastrin降低、Gsk3b降低的范圍分別為大約增加或降低50%至增加或降低500%。響應(yīng)的幅度取決于細(xì)胞類型、特定的化合物和與細(xì)胞接觸的時(shí)間。

本申請的化合物和組合物對FOXO 3和FOXO 4的磷酸化和對PGC1a的表達(dá)的作用顯示組織特異性。盡管不意圖限制本申請，但在神經(jīng)元細(xì)胞中FOXO3和FOXO4的磷酸化的抑制允許FOXO進(jìn)入細(xì)胞核和活化轉(zhuǎn)錄。PGC1a也是調(diào)節(jié)細(xì)胞中能量代謝(包括糖原異生)的轉(zhuǎn)錄激活物。FOXO和PGC1a促進(jìn)基因例如葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)的轉(zhuǎn)錄活化。糖原異生的提高使神經(jīng)元細(xì)胞具有產(chǎn)生葡萄糖和保持能量貯存的能力。

如上文所述，Aβ和磷酸化tau的產(chǎn)生顯著地促進(jìn)阿爾茨海默病的病狀。本文提供的結(jié)果提供了證據(jù)表明，本文所述的化合物和組合物影響早老素1和nicastrin的基因表達(dá)。這兩種酶已經(jīng)表明參與Aβ的產(chǎn)生。此外，tau和/或全部tau的磷酸化的抑制證明了如本文所述的化合物和組合物還影響NFT的產(chǎn)生。此外，化合物對增強(qiáng)線粒體功能、提高FOXO活化和增加PGC1a基因表達(dá)的作用使神經(jīng)元細(xì)胞具有提高的線粒體功能，這還可通過使氧化應(yīng)激最小用于治療阿爾茨海默病。之前的研究表明，飼喂富硒酵母而非正常膳食或缺硒膳食的App轉(zhuǎn)基因小鼠減少B淀粉樣蛋白斑塊的產(chǎn)生(Lovell等Free Rad. Biol. Med.46:1527 2009)。

在細(xì)胞中測定基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，和包括與探針雜交(例如在陣列上)或通過PCR方法。用于檢測基因表達(dá)的陣列和/或引物是市售可得的。使用對PSEN 1、PSEN2、Nicastrin和 Gsk3b的示例性的序列，可容易地設(shè)計(jì)引物。PSEN 1的示例性的序列見于NM_000021/ NM_007318，PSEN2見于NM_000447/NM_012486，Nicastrin見于NM_015331，和Ucp3見于NM_002093。

在實(shí)施方案中，治療阿爾茨海默病的方法或用途包括：給予受試者有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其組合的化合物。在實(shí)施方案中，用于治療阿爾茨海默病的組合物可不包括甲基硫代腺苷或S-腺苷-L-高半胱氨酸的一種或多種。

在實(shí)施方案中，治療阿爾茨海默病的方法或用途包括：給予選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的化合物。在實(shí)施方案中，用于治療阿爾茨海默病的組合物可不包括甲硫氨酸或硒代甲硫氨酸。

在實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┙M合物治療阿爾茨海默病的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的化合物。

在實(shí)施方案中，組合物包括5’-甲基硒代腺苷和/或式(I)的化合物和選自Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少一種其它硒化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種化合物。

在實(shí)施方案中，治療阿爾茨海默病的方法或用途還包括選擇治療阿爾茨海默病的癥狀而不對肝中的葡萄糖代謝產(chǎn)生副作用的組合物。在實(shí)施方案中，組合物包含5’-甲基硒代腺苷和/或式(I)的化合物。在實(shí)施方案中，組合物可排除Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(II)的化合物或式(III)的化合物的一種或多種。在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物。在實(shí)施方案中，組合物排除H(5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)或J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)的一種或多種。

在實(shí)施方案中，組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的至少三種化合物，其用于治療阿爾茨海默病。

在實(shí)施方案中，如本文所述的化合物和組合物的有效量是有效治療阿爾茨海默病而對細(xì)胞無毒性的量。選擇的有效量不對任何示例的細(xì)胞包括腎細(xì)胞、小鼠骨骼細(xì)胞、人神經(jīng)元細(xì)胞或小鼠肝細(xì)胞顯示毒性。

在實(shí)施方案中，如本文所述的化合物和組合物的有效量是有效改善阿爾茨海默病的癥狀和/或調(diào)節(jié)如本文所述的基因表達(dá)而對細(xì)胞無毒性的量。在神經(jīng)元細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)可如本文所述的使用多種測定法在獲自按照本文所述的組合物治療的受試者的樣品上確定。

如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，對任何一個(gè)受試者的劑量可取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給藥次數(shù)和途徑、一般健康和與同時(shí)給予的其它藥物的相互作用。

在實(shí)施方案中，用于治療阿爾茨海默病、抑制B淀粉樣蛋白加工和/或神經(jīng)元細(xì)胞中的tau磷酸化的組合物的有效量是每天約5 ug或更多或800 ug或更少的單一需要的生物活性的含硒化合物或多種需要的生物活性的含硒化合物。當(dāng)多種需要的生物活性的含硒化合物存在時(shí)，組合物的有效量是給予受試者的組合物中所有化合物的總計(jì)。

在實(shí)施方案中，一天內(nèi)給予受試者的有效量是約5ug至約800 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約700 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約600 ug和其中的每個(gè)數(shù)值 、5 ug至約500 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約400 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約300 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約200 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約100 ug和其中的每個(gè)數(shù)值和5 ug至50 ug和其中的每個(gè)數(shù)值。

在實(shí)施方案中，給予受試者的包含如本文所述的需要的生物活性的含硒化合物的組合物的有效量優(yōu)選是200 ug或更少/天或50 ug或更少/天。在實(shí)施方案中，劑量可根據(jù)功效或是否在受試者中觀察到任何明顯的硒中毒跡象例如蒜味呼吸、掉發(fā)或?qū)蛹渍{(diào)整。

在實(shí)施方案中，在包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的兩種或更多種化合物的組合物中，化合物以相同的比例存在于組合物中。在其它實(shí)施方案中，一種化合物與另一種的比率可以是約4:1至1:1。

在實(shí)施方案中，至少一天一次給予劑量，持續(xù)一段時(shí)間以在血液中實(shí)現(xiàn)元素硒的穩(wěn)定狀態(tài)。在實(shí)施方案中，每日給予劑量持續(xù)至少60或90天。在實(shí)施方案中，在受試者正經(jīng)歷疾病或病癥的癥狀時(shí)給予劑量。在實(shí)施方案中，受試者處于其中線粒體相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加的年齡，例如，至少40歲。

本申請的方法可用于治療(例如預(yù)防性地或治療性地)受試者(例如具有與阿爾茨海默病、B淀粉樣蛋白加工、tau磷酸化和早老素1基因表達(dá)、nicastrin、PGC1a和tau和FOXO3和FOXO 4磷酸化相關(guān)的病況的受試者)。包含一種或多種化合物(包括5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合)的組合物可在藥學(xué)上可接受的載體例如生理鹽水中經(jīng)靜脈內(nèi)給予受試者(例如患者)。可使用用于胞內(nèi)遞送化合物的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如通過脂質(zhì)體遞送)。這樣的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。包含硒的組合物可用于靜脈內(nèi)給藥以及胃腸外給藥，例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和腹膜內(nèi)。

在實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物經(jīng)配制以跨過血腦屏障。本發(fā)明的組合物可與適合于遞送至腦的植入材料組合，例如聚合的生物可降解的植入物，例如乙烯乙酸乙烯酯。其它類型的靶向可包括受體介導(dǎo)的運(yùn)輸，例如胰島素受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。這些受體可整合至還包括如本文所述的組合物的脂質(zhì)體或微球。在其它實(shí)施方案中，遞送至腦可通過使用具有抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或前藥作為靶向劑的脂質(zhì)體或PLGA球來靶向。

因此，在本申請的一些實(shí)施方案中，包含硒的組合物和/或制劑可單獨(dú)或與其它形式的硒、藥物、小分子組合或在其中它與賦形劑或其它藥學(xué)上可接受的載體混合的藥物組合物中給予受試者。在本申請的一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是藥學(xué)上惰性的。在本申請的另一實(shí)施方案，包含硒的組合物可單獨(dú)給予至易患、有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生或患有與B淀粉樣蛋白加工或tau磷酸化有關(guān)的疾病或病況的個(gè)體。包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的組合物可添加至營養(yǎng)飲料或食物(例如ENSURE、POWERBAR等)、多種維生素、營養(yǎng)產(chǎn)品、食品等，用于每日消耗。

葡萄糖代謝

非胰島素依賴性(II型)糖尿病(DM)是特征為在骨骼肌、肝和脂肪中胰島素抵抗以及由于胰腺β-細(xì)胞功能導(dǎo)致的胰島素分泌缺乏的疾病。胰島素抵抗是II型糖尿病的重要特征。例如，已知極大多數(shù)II型糖尿病是胰島素抵抗的。同樣，在II型糖尿病的后代中的胰島素抵抗是后期發(fā)生該疾病的最好的預(yù)測物(參見例如，Warram等Ann Intern Med. 113:909 1990)。減少胰島素抵抗的干預(yù)也防止糖尿病發(fā)生。最佳線粒體功能是自胰腺β細(xì)胞分泌正常葡萄糖-刺激的胰島素所需要的。

在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中，骨骼肌和肝是兩個(gè)重要的胰島素-響應(yīng)器官。這些器官轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素-抵抗?fàn)顟B(tài)解釋了在II型糖尿病患者中見到的大多數(shù)葡萄糖代謝變化(參見例如，Lowell和Shulman，Science 21:307 2005)。在這兩個(gè)器官中，在自胰島素抵抗發(fā)生獲得的后果方面，骨骼肌是更重要的。這是因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)骨骼肌處理或代謝80-90%的每日攝取葡萄糖(參見例如，DeFronzo等1985)。

通過基因組范圍內(nèi)的表達(dá)分析已經(jīng)證明，線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)基因顯示與健康對照相比，在前驅(qū)糖尿病和糖尿病個(gè)體中表達(dá)降低，和在許多情況下這些基因是轉(zhuǎn)錄共活化劑增殖子-活化受體γ共活化劑1-α的靶標(biāo)(PGC1-α，參見例如，Mootha等2003)。在這些研究中，典型的OXPHOS基因表達(dá)降低是適度的(大約20%)，但非常一致，其中相對于具有正常葡萄糖耐量的個(gè)體，在具有葡萄糖耐量受損或II型糖尿病的個(gè)體中，研究的基因的89%顯示較低的表達(dá)。

本領(lǐng)域中通常應(yīng)理解和意識到，在肌肉中增加OXPHOS活性的藥物或試劑作為2型糖尿病的有價(jià)值的療法存在。為支持該假設(shè)，很久就知道有氧運(yùn)動(dòng)是用于治療糖尿病的最佳非-藥理學(xué)干預(yù)，因?yàn)槠湓黾泳€粒體活性和數(shù)量以及促進(jìn)OXPHOS基因表達(dá)。

在肝中，呈活化或非磷酸化狀態(tài)的FOXO位于細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中它結(jié)合葡萄糖6-磷酸酶的啟動(dòng)子區(qū)以及其它因子例如PGC-1a，增加葡萄糖-6-磷酸酶的轉(zhuǎn)錄，從而增加葡萄糖產(chǎn)生速率。葡萄糖6-磷酸酶催化糖原異生和糖原分解的最后一步，導(dǎo)致從肝釋放葡萄糖。因此，在控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)中，特別是在糖尿病受試者中，其是重要的。

正常地，F(xiàn)OXO磷酸化的加工受到稱為AKT (蛋白激酶B)的另一種激酶直接控制。AKT將FOXO磷酸化和驅(qū)動(dòng)其離開細(xì)胞核，從而通過降低葡萄糖6-磷酸酶的轉(zhuǎn)錄速率，減少葡萄糖產(chǎn)生。AKT本身在通過小分子級聯(lián)反應(yīng)的下游控制下，所述級聯(lián)反應(yīng)以在細(xì)胞表面上胰島素與其受體結(jié)合開始。這起始一系列事件，包括兩種其它激酶，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸肌醇-依賴性蛋白激酶1 (PDK1)。全部途徑稱為胰島素/PI3K/PDK1/Akt途徑，其具有通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用。在FOXO控制的情況下，PDK1使Akt磷酸化和活化，其進(jìn)而使FOXO磷酸化和失活。

在實(shí)施方案中，提供用于在一種或多種肝細(xì)胞中增加FOXO 3和FOXO 4磷酸化的方法或用途，包括給予包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的至少三種化合物的組合物。

在實(shí)施方案中，在選自肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和其組合的一種或多種細(xì)胞中調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法包括：給予有效量的組合物至所述一種或多種細(xì)胞，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量在肝細(xì)胞或肌細(xì)胞中改變葡萄糖代謝。在實(shí)施方案中，組合物可排除H(5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)和/或J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)中的一種或多種。

在本申請的實(shí)施方案中，提供組合物用于在肝細(xì)胞或肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，治療II型糖尿病的方法包括：給予受試者有效量的組合物，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物，其中與未用所述組合物處理的細(xì)胞相比，所述有效量在肝細(xì)胞或肌細(xì)胞中改變葡萄糖代謝。在實(shí)施方案中，組合物可排除H(5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)和/或J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)的一種或多種。

在本申請的實(shí)施方案中，提供組合物用于在受試者中治療糖尿病的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，提供用于在一種或多種肝細(xì)胞中抑制G6pc的表達(dá)的方法或用途，包括：給予包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式I的化合物、式II的化合物、式III的化合物和其組合的至少三種化合物的組合物。在實(shí)施方案中，組合物可排除H(5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)和/或J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)中的一種或多種。

在本申請的實(shí)施方案中，提供組合物用于抑制葡萄糖-6-磷酸酶的用途，所述組合物包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物和式(III)的化合物的至少三種不同的化合物。

在實(shí)施方案中，與未用化合物處理的相同類型的細(xì)胞相比，F(xiàn)OXO磷酸化增加或G6pc降低的范圍分別為增加或降低大約50%至增加或降低500%。響應(yīng)的幅度取決于細(xì)胞類型、特定的化合物和與細(xì)胞接觸的時(shí)間。

含硒化合物在肝細(xì)胞中不同地影響基因表達(dá)。與化合物和組合物對如本文所述的肝細(xì)胞具有的影響相反，相同或類似的組合物可以相反的方式影響神經(jīng)元細(xì)胞。例如，如本文所述組合物在神經(jīng)元細(xì)胞中降低FOXO3和/或FOXO4的磷酸化。PGC1a的表達(dá)增加，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞中糖原異生增加。相比之下，相同的化合物或組合物在肝細(xì)胞中增加FOXO3和/或FOXO4的磷酸化，和PGC1a的表達(dá)未改變。

如在神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞的情況下所述的，PGC1a是MT生物發(fā)生和糖代謝的關(guān)鍵基因。在肝細(xì)胞中，與FOXO一致，其也用于驅(qū)動(dòng)參與糖原異生的基因轉(zhuǎn)錄，但不能在FOXO的核缺乏的情況下進(jìn)行該驅(qū)動(dòng)。我們檢查了PGC1a蛋白表達(dá)和在CDE組合處理后通過定量分析未觀察到肝細(xì)胞中PGC蛋白水平的顯著改變。然而，由于響應(yīng)CDE時(shí)對FOXO磷酸化觀察到的穩(wěn)健作用，幾乎肯定的是，其從細(xì)胞核中排出，因此PGC1a的水平變得較不重要，因?yàn)樗枰狥OXO以起始糖原異生過程。總之，這些結(jié)果表明，CDE的組合不影響PI3k/PDK1/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和幾種其它AKT直接或間接下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，除了上述重要的FOXO之外。換句話說，CDE的組合在肝細(xì)胞中選擇性失活FOXO和該作用顯得不依賴于PI3K/PDK1/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在實(shí)施方案中，如本文所述的化合物和組合物的有效量是在肝細(xì)胞中有效抑制G6pc的表達(dá)、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝或增加FOXO磷酸化而對細(xì)胞無毒性的量。肝細(xì)胞中的基因表達(dá)可使用許多測定法在獲自按照本文所述的組合物處理的受試者的樣品上測定。選擇的有效量不對任何示例的細(xì)胞包括腎細(xì)胞、小鼠骨骼細(xì)胞、人神經(jīng)元細(xì)胞或小鼠肝細(xì)胞顯示毒性。

如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，對于任何一個(gè)受試者的劑量可取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給藥次數(shù)和途徑、一般健康和與同時(shí)給予的其它藥物的相互作用。

在實(shí)施方案中，給予受試者以抑制G6pc表達(dá)、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、治療II型糖尿病或在肝或骨骼肌細(xì)胞中增加FOXO磷酸化的本發(fā)明的含硒組合物的有效量是每天約5 ug或更大或800 ug或更少的單一需要的本發(fā)明的生物活性含硒化合物或多種需要的本發(fā)明的生物活性含硒化合物。當(dāng)多種需要的生物活性含硒化合物存在時(shí)，給予受試者的組合物的有效量是組合物中所有需要的生物活性含硒化合物的總量。

在實(shí)施方案中，給予受試者的需要的本發(fā)明的生物活性含硒化合物的有效量是約5ug至約800 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約700 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約600 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約500 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約400 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約300 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約200 ug和其中的每個(gè)數(shù)值、5 ug至約100 ug和其中的每個(gè)數(shù)值和5 ug至50 ug。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含本文所述的化合物的組合物優(yōu)選以200ug或更少/天或50 ug或更少/天給予。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，劑量可根據(jù)功效或是否在受試者中觀察到任何明顯的硒中毒跡象例如蒜味呼吸、掉發(fā)或?qū)蛹渍{(diào)整。

在實(shí)施方案中，在包含選自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其組合的兩種或更多種化合物的組合物中，化合物以相等的比例存在于組合物中。在其它實(shí)施方案中一種化合物與另一種的比率可以是約4:1至1:1。

在實(shí)施方案中，至少每日一次給予劑量，持續(xù)一段時(shí)間以在血液中實(shí)現(xiàn)元素硒的穩(wěn)定狀態(tài)。在實(shí)施方案中，每日給予劑量，持續(xù)至少60或90天。在實(shí)施方案中，在受試者正經(jīng)歷疾病或病癥的癥狀時(shí)給予劑量。在實(shí)施方案中，受試者處于其中線粒體相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加的年齡，例如至少40歲。

在其它實(shí)施方案中，遞送至肝可通過使用具有抗體的脂質(zhì)體或PLGA球，通過制備硒代糖苷或靶向肝的前藥而靶向。

本申請的其它實(shí)施方案

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物：

其中R₁是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₄是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基;或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán);

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₇是H、烷基、烯基、炔基、酮、氨基醇、氨基酸、OR’、Se-R’、S-R’，其中R’選自H、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；和

R₈是氫、疊氮基、烷基、烯基、炔基。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種這些式(I)化合物。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁、R₃、R₄和R₈各自為H；R₂是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆ 各自不存在；和R₇是烷基或氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁、R₃、R₄和R₈ 各自為H；R₂是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆ 各自不存在；和R₇是烷基或氨基酸；條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜可各自從組合物中排除。

在特定的方面，提供基本上由式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，所述化合物是5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)。

在一些實(shí)施方案中，組合物基本上由式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成，條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜可各自從組合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物：

，

其中R₁是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₄是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、環(huán)烷基、羧基或C-酰胺基；或R₃與R₄和它們所連接的原子一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₈是氫、疊氮基、烷基、烯基、炔基；

R₉是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₉與R₁₀一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₁₀是H、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₉與R₁₀一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；和

R₁₁是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種這些式(II)化合物。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁、R₃、R₄、R₈和R₉各自是H；R₂是H、?；⑼榛?、羧基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；R₅和R₆ 不存在；R₁₀是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；和R₁₁是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀如上文所定義和其中R₁₁是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。

在特定的方面，提供基本上由式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，所述化合物是5'-硒代腺苷高半胱氨酸(化合物“D”)或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，組合物基本上由式(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成；條件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸和硒代羥基腺苷高半胱氨酸可各自從組合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物：

其中

R₁是H、?；?、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₂是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、環(huán)烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基；或R₁與R₂一起形成具有4-8個(gè)環(huán)成員以及選自氧或氮的至少一個(gè)雜原子的雜環(huán)；

R₃是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₄是H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₅是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；

R₆是氧代、羥基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基；和

R₇是H、烷基、烯基、炔基、酮、OR’、Se-R’、S-R’，其中R’選自H、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中

R₁和R₂各自是H；

R₃是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R選自烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)基或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₄是H或藥學(xué)上可接受的鹽或內(nèi)鹽；

R₅和R₆不存在；和

R₇是烷基、烯基或炔基。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可分離和/或純化一種或多種這些式(III)化合物。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁和R₂各自是H；R₃是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；R₄是H；R₅和R₆不存在；和R₇是烷基，其是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由式III化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，其中R₁和R₂各自是H；R₃是OH或OR，其中R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；R₄是H；R₅和R₆不存在；和R₇是甲基。

在特定的方面，提供基本上由式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成的組合物，所述化合物是γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸(“化合物E”)或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，組合物基本上由式(III)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥組成或由其組成，條件是γ-谷氨?；腚装彼?γ -谷氨?；腚装彼?、γ-谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨?；腚装彼?、γ-谷氨?；腚装彼?γ-谷氨?；腚装彼?、γ-谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨?；腚装彼岷臀入赘孰?γ-谷氨?；腚装彼峥筛髯詮慕M合物中排除。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由根據(jù)式(I)、(II)和/或(III)的一個(gè)或多個(gè)的一種或多種化合物組成或由其組成的組合物，其中以下化合物各自從組合物中排除以使硒毒性最小、除去無活性或抑制性化合物、和/或使組合物的治療指數(shù)最大，其中所排除的化合物是γ -谷氨?；腚装彼?γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨?；腚装彼?2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨?；腚装彼?、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨?；腚装彼?、γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨?；腚装彼?、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨?；腚装彼帷⑽入赘孰?γ-谷氨?；腚装彼?、脫羥基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羥基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜、腺苷-羥基硒亞砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羥基)-硒代苯基-(3'-脫氧基-腺苷)、腺苷-羥基硒亞砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亞砜。

在實(shí)施方案中，本文所述的任何化合物可經(jīng)修飾以延長半壽期、保護(hù)化合物免于氧化、使化合物靶向組織、允許化合物通過血腦屏障，如本文所述的。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由各自按照式(I)的一種或多種化合物組成或由其組成的組合物。在一些方面，包含各自按照式(I)的一種或多種化合物的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由各自按照式(I)和式(III)的一種或多種化合物組成或由其組成的組合物。在一些方面，包含各自按照式(I)和式(III)的一種或多種化合物的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，基本上由各自按照式(I)和式(III)的一種或多種化合物組成或由其組成的組合物包含5'-甲基硒代腺苷或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

在一些實(shí)施方案中，提供基本上由各自按照式(II)和式(III)的一種或多種化合物組成或由其組成的組合物。在一些方面，包含各自按照式(II)和式(III)的一種或多種化合物的組合物包含5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥；和γ-谷氨?；?甲基硒代-半胱氨酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其基本上由治療有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或前藥以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體組成或由其組成。藥學(xué)上可接受的載體包括：(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3) 纖維素和其衍生物，例如羧基甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4) 西黃蓍膠粉；(5) 麥芽；(6) 明膠；(7) 滑石粉；(8) 賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9) 油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 瓊脂；(14) 緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15) 藻酸；(16) 無熱原水；(17) 等滲鹽水；(18) 林格溶液；(19) 乙醇；(20) 磷酸鹽緩沖溶液；和(21) 藥物制劑中使用的其它無毒相容物質(zhì)。

組合物可經(jīng)配制用于本文所述的任何給藥途徑。

實(shí)施例I

5’-甲基硒代腺苷(“C”)的合成和表征

合成方案和方法如下：

將硼氫化鈉(227mg，6.0mM，在Ar^o下)置于裝配在磁力攪拌器上和位于冰冷卻浴中的含有20mL的無水乙醇的200mL圓底燒瓶中。在冷卻、攪拌和在Ar流下，從注射器添加二甲基二硒化物(190uL，376mg，2.0mM)。在淺黃色溶液變色后，加入固體5’-氯-5’-脫氧基腺苷(1,143g、4.0mM)。5-Cl-Ade極難溶于乙醇。再加入100mL乙醇以溶解沉淀物。在室溫下繼續(xù)攪拌混合物，持續(xù)之后四天。MS用于監(jiān)測轉(zhuǎn)化率。在5天后達(dá)到~75%轉(zhuǎn)化率。蒸發(fā)溶劑和收集產(chǎn)物3.22g (含~ 20%的SM)和通過反相(C-8)制備型色譜純化，得到1.1g的純產(chǎn)物，其分子量通過質(zhì)譜證實(shí)。

實(shí)施例2

Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“D”)的合成和表征

合成方案和方法如下：

5’-氯-5’-脫氧基腺苷(639-62)

將89G (0.366摩爾，1eq.)腺苷、59.3ML (58G，1.833摩爾，2eq.)無水吡啶和1L無水乙腈置于烤箱干燥的2L 4頸燒瓶中，其配備有滴液漏斗、攪拌器、氣體入口/出口和溫度計(jì)。將反應(yīng)裝置置于冰/鹽浴中。開始攪拌，和當(dāng)溶液溫度下降低于3^oC時(shí)，開始極緩慢加入亞硫酰氯(強(qiáng)放熱！)。在亞硫酰氯加入期間反應(yīng)混合物溫度需要保持在低于5^oC和持續(xù)超過4h (此時(shí)溶液是黃色，在底部具有白-黃色沉淀)。然后反應(yīng)在環(huán)境溫度下放置過夜。第二天早上，大部分沉淀使用燒結(jié)玻璃濾器濾出，和在濾器上用3次100ML體積的無水乙腈洗滌，期間沉淀顏色變成白色。然后將濕的沉淀轉(zhuǎn)移回含有800ML甲醇和160ML水的混合物的2L反應(yīng)燒瓶，向其中逐滴添加80ML的濃氫氧化銨溶液，同時(shí)機(jī)械攪拌和用水浴冷卻?；旌衔镌诃h(huán)境溫度下攪拌45min和通過真空過濾將形成的白色沉淀與液體分離。使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液濃縮至干，同時(shí)沉淀從~560ML熱水結(jié)晶，在冰水浴中冷卻和濾出第一批晶體，并經(jīng)冷凍干燥。然后該濾液在自第一濾液的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生的固體結(jié)晶中用作溶劑，得到第二批產(chǎn)物，其也經(jīng)冷凍干燥(2天)。兩批晶體最終經(jīng)五氧化磷在真空干燥器中干燥2天。獲得84G的白色晶體，80.5%收率。MS (286-M+H)，mp. 187^oC。

硒代腺苷高半胱氨酸(655-40)

將9.806G (50mM，1eq.)的L-硒代甲硫氨酸加入配備有溫度計(jì)、大的冷卻指針(在出口具有氣泡檢查儀)、氨氣入口(到達(dá)燒瓶底部)和磁力攪拌棒的2L三頸燒瓶和置于含有CO₂-丙酮冷卻浴的2.5L雙層容器中。Ar^o通過燒瓶，然后加入固體CO₂至丙酮浴和冷卻指針。當(dāng)燒瓶內(nèi)部的溫度下降低于-35^oC時(shí)，開始無水氨(氣體)流和當(dāng)液氨水平達(dá)到800ML體積時(shí)，氣流停止。此時(shí)加入小塊的金屬鈉至充分?jǐn)嚢璧娜芤褐?，直到溶液的藍(lán)紫色保持約30秒。在45min內(nèi)總共加入2.645G (115mM，2.3 eq.)的鈉。保持?jǐn)嚢韬屠鋮s另外30min。此時(shí)所有組分在溶液中。單次加入14.856G (52mM，1.04 eq.)的無水5’-氯-5’-脫氧基腺苷和放置反應(yīng)混合物過夜，伴隨攪拌和極慢Ar^o流。第二天早上(如果所有氨消失)加入350ML的無水甲醇至燒瓶中存在的白色固體。將燒瓶置于油浴中，安裝回流冷凝器，保持Ar^o氣流和將油浴加熱至50^oC持續(xù)隨后24h。此時(shí)用幾滴0.1N HCl將1ML的溶液酸化至pH 3.5和使用質(zhì)譜法分析樣品中底物的存在。如果它們低于5%，則可用1N HCl將混合物酸化至pH 3.5，從鹽過濾，使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干和可通過自水-乙醇混合物結(jié)晶將粗產(chǎn)物純化。15.98G (74%收率)的第一批硒代腺苷高半胱氨酸晶體是~95%純凈的，可用于生物學(xué)研究無需進(jìn)一步純化。

實(shí)施例3

γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸的合成和表征

合成方案和方法如下：

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(655-90)的合成

將N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OH (303mg，1.0Mmol)、N-羥基琥珀酰亞胺(121mg，1.05Mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(227mg，1.1Mmol)懸浮/溶于15mL的無水乙醚中，和自注射器加入10uL的二甲基乙基芐基胺至反應(yīng)混合物。在環(huán)境溫度下(22^oC)保持?jǐn)嚢?8h。將混合物過濾，和沉淀用10mL乙醚洗滌10次。濾液在高真空下濃縮和干燥，得到白色結(jié)晶產(chǎn)物(570mg，~90%收率)。MS (M+Na⁺) = 423.17。

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH (655-90)的合成

將N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(570mg，0.9Mmol)、甲基硒代半胱氨酸(175mg，0.8Mmol)、三乙基胺(152mg，209μL，1.5Mmol)加入6mL的1,4-二噁烷和2mL水的混合物。磁力攪拌反應(yīng)混合物，保持100h。之后加入1.21N HCl (1.65mL)，反應(yīng)后混合物用3x 20mL乙醚萃取，使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將萃取物濃縮至干，得到649mg的蠟狀產(chǎn)物，對其進(jìn)行制備型HPLC。收集283mg的產(chǎn)物(75.6%收率)。質(zhì)譜證實(shí)產(chǎn)物的分子量和其中存在單個(gè)Se原子。理論Ms C₁₈H₃₂N₂O₇Se =468.42；實(shí)測469.24 m/e (M+H⁺)和491.24 m/e (M+Na⁺)。

γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸 (655-92)的合成

將283mg (0.6Mmol)的N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH、2mL硫代苯甲醚和5mL三氟乙酸的混合物用磁力攪拌在油浴中在63^oC加熱6h和在環(huán)境溫度下(22^oC)放置過夜。之后將反應(yīng)混合物加入(逐滴)至劇烈攪拌的乙醚(20mL)。形成的沉淀用2x 20mL的乙醚洗滌，得到138.3mg的膏狀沉淀，其然后通過制備型HPLC純化。

實(shí)施例4

在細(xì)胞培養(yǎng)中單獨(dú)或組合測試三種合成的硒有機(jī)化合物對線粒體功能、細(xì)胞存活和基因表達(dá)的作用。測試的細(xì)胞包括肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和骨骼肌。

材料和方法

細(xì)胞系和AT化合物

人胚腎HEK293T細(xì)胞由Qiutang Li博士(University of Louisville)慷慨提供。小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞系由Xiao博士(University of Kentucky)饋贈(zèng)。人成神經(jīng)細(xì)胞IMR-32細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia)。所有這些細(xì)胞在ATCC建議的培養(yǎng)基中擴(kuò)增。

化合物C(5’-甲基硒代腺苷)、D(Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E(γ-谷氨?；?甲基硒代半胱氨酸)和它們的硫類似物H(5’-甲基硫代腺苷)、I(S-腺苷-L-高半胱氨酸)和J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)鑒定為具有低于2%無機(jī)硒的硒化酵母的單獨(dú)化合物，并且經(jīng)合成或自商業(yè)來源獲得(在合適時(shí))。所有測試的化合物的純度經(jīng)驗(yàn)證為≥ 99%，如通過質(zhì)譜法所測定的。

在HEK293T細(xì)胞中線粒體電位的熒光分析

HEK293T細(xì)胞在8-室玻璃載玻片上培養(yǎng)(1X10⁴細(xì)胞/室) 24小時(shí)，然后用各種濃度的化合物或其相應(yīng)的硫類似物處理(溶于無菌水) 4.5 hr。根據(jù)制造商的方案，這些化合物處理的細(xì)胞用PBS漂洗兩次，和用Mitotracker橙色熒光染料(Invitrogen)在37°C孵育30 min，然后替換為新鮮的PBS。然后使用Zeiss Axio Vert.A1熒光顯微鏡(Thornwood，NY)記錄這些活細(xì)胞的熒光信號(線粒體電位)。在熒光顯微鏡下分析至少三個(gè)樣品/處理組。

在C2C12、IMR-32和AML-12細(xì)胞中線粒體電位的定量分析

對于C2C12細(xì)胞，將相等數(shù)量的細(xì)胞(1X10⁴)接種于Corning 96-孔透明底和黑壁細(xì)胞培養(yǎng)板(VWR)，在10%FBS DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 hr，然后用溶媒(無菌水)、化合物C和D和它們的硫類似物處理24和48 hr。這些溶媒-或化合物-處理的細(xì)胞用PBS漂洗兩次，用Mitotracker橙色熒光染料在37°C孵育30 min，然后替換為PBS。這些活細(xì)胞中的Mitotracker橙色熒光強(qiáng)度(線粒體電位)通過Bio-TeK Synergy HT Multi-Mode熒光微板閱讀器(Winooski，VT)測定。對于上述分析檢查8個(gè)樣品/各處理，和數(shù)據(jù)表示為8個(gè)樣品的平均值 ± SEM。

對于AML-12肝細(xì)胞，細(xì)胞在補(bǔ)充1X胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒(ITS，Sigma)的10% FBS Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和Ham's F12培養(yǎng)基(1:1) (DMEM/F12)培養(yǎng)基中擴(kuò)增。然后將相同數(shù)量的細(xì)胞(1X10⁴細(xì)胞/孔)接種于Corning 96-孔透明底和黑壁細(xì)胞培養(yǎng)板(VWR，Radnor，PA)，在無ITS 10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 hr，然后進(jìn)行各種化合物或化合物的組合處理6、24和48 hr?；罴?xì)胞中的線粒體電位使用上述的Mitotracker橙色染料通過熒光強(qiáng)度的定量分析測定。此外，根據(jù)制造商的方案，上述處理的細(xì)胞還用Hoechst 33342染料(Invitrogen，Grand Island，NY)孵育以對細(xì)胞核染色。通過Hoechst 33342染料染色的細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度也通過熒光微板閱讀器測定。在活細(xì)胞中的線粒體電位/細(xì)胞通過在各孔中標(biāo)準(zhǔn)化Mitotracker橙色染料的熒光強(qiáng)度至Hoechst 33342染料的熒光強(qiáng)度獲得。對于上述分析檢查8個(gè)樣品/各處理，和數(shù)據(jù)表示為8個(gè)樣品的平均值 ± SEM。

類似于對AML-12細(xì)胞的上述研究，在活的IMR-32細(xì)胞中的線粒體電位/細(xì)胞使用Bio-TeK Synergy HT Multi-Mode熒光微板閱讀器測定，具有以下修改。為改進(jìn)IMR-32細(xì)胞附著至培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)板用0.1%明膠(Sigma，St. Louis，MO)預(yù)包被。將2X10⁴細(xì)胞/96-孔接種于明膠化的96-孔板用于上述研究。為減少細(xì)胞移動(dòng)，在溶媒-或化合物-處理后將Mitotracker橙色和Hoechst 33342熒光染料(稀釋于培養(yǎng)基)直接添加至各孔。在染料孵育后，將細(xì)胞培養(yǎng)基小心置換為1X PBS用于在微板閱讀器上定量分析熒光。對于上述分析檢查8個(gè)樣品/各處理，和實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少5次。數(shù)據(jù)表示為8個(gè)樣品的平均值 ± SEM。

細(xì)胞成活力測定法

培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞成活力使用Promega的CellTiter96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒，根據(jù)制造商的方案測定。簡言之，將相等量的C2C12 (1X10⁴細(xì)胞/孔)、AML-12 (1X10⁴細(xì)胞/孔)和IMR-32 (2X10⁴細(xì)胞/孔)接種于96-孔澄清的板(VWR)和用溶媒或化合物處理24、28和/或72 hr。然后，培養(yǎng)細(xì)胞用AQueous One solution (100 ul/孔)在37°C孵育1 hr，和各樣品中OD490 nm的吸光度通過Bio-Tek微板閱讀器測定。培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞成活力通過培養(yǎng)細(xì)胞的OD490 nm減去單純培養(yǎng)基(未接種細(xì)胞)的OD490 nm來確定。對于上述分析檢查8個(gè)樣品/各處理。數(shù)據(jù)表示為8個(gè)樣品的平均值 ± SEM。

RNA分離和實(shí)時(shí)PCR分析

將人IMR-32細(xì)胞接種于明膠化的6-孔(6.5 X 10⁵細(xì)胞/孔)或24-孔(1.3 X 10⁵細(xì)胞/孔)板，而小鼠肝AML-12細(xì)胞在未包被的6-孔(3.33 X 10⁵細(xì)胞/孔)或24-孔(6.7 X10⁴細(xì)胞/孔)板上培養(yǎng)。細(xì)胞用溶媒(對照)或各種化合物處理6、24或48 hr。使用Trizol (Invitrogen)，根據(jù)制造商的方案自這些細(xì)胞分離總RNA，然后用DNase I孵育以除去任何可能污染的基因組DNA。然后使用Applied-Bioscience的RT試劑盒和預(yù)設(shè)計(jì)的Taqman探針(Invitrogen)，將RNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，如之前所述(Lan等EMBO J 2003)。在各處理組中分析3-6個(gè)樣品。數(shù)據(jù)通過各樣品中的肌動(dòng)蛋白B (Actb)或甘油醛磷酸脫氫酶(Gapdh)水平標(biāo)準(zhǔn)化，和表示為3-6個(gè)樣品的平均值 ± SEM。

蛋白制備和蛋白質(zhì)印跡分析

將IMR-32和AML12細(xì)胞接種于6-孔板，然后用溶媒和各種化合物處理6和24 hr，如上文所述。在處理后，細(xì)胞用冰冷的PBS漂洗和在含有完全蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Themo-Fisher Scientific，Waltham，MA)的冰冷的RIPA緩沖液中在冰上裂解30 min。使用細(xì)胞刮刀和移液管收集細(xì)胞裂解物，然后以12000 g在4°C離心30 min以除去DNA沉淀，和得到蛋白提取物。這些細(xì)胞裂解物的上清液中的蛋白水平使用Pierce Micro-BCA蛋白測定試劑盒(Themo Scientific-Piece Biotechnology，Rockford，IL)，根據(jù)制造商的方案測定。

對于蛋白質(zhì)印跡分析，將來自溶媒-和化合物-處理的細(xì)胞的5微克總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，如之前所述(Reddy，Liu等 2008 Science)。將膜在含有5% (w/v)的牛血清白蛋白(Sigma，St. Louis，MO)的磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)中封閉和用特異性第一抗體孵育，接著用HRP-綴合的抗-小鼠或抗-兔第二抗體(1:5000稀釋，Cell Signaling Inc.)孵育。除了G6PC (Santa Cruz)、Actb (Li-COR，Lincoln，Nebraska)、Elf2bε和pElf2bε (Abcam，Cambridge，MA)之外，所有第一抗體購自Cell Signaling Inc。膜印跡上的陽性信號使用Amersham的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡最佳檢測試劑(Prime Detection reagents)(GE healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)檢測。在膜印跡上的這些發(fā)光信號的圖像使用LI-COR Odyssey Fc Image系統(tǒng)(Lincoln，Nebraska)捕獲。將相同的膜印跡切成條狀和按GE WB ECL-最佳檢測方案所述(GE healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)，用另一抗體再次印跡。蛋白質(zhì)印跡上的蛋白條帶密度使用Li-COR Image studio軟件或NIH ImageJ軟件測定，然后通過各樣品中的Actb水平標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)樣品/各組的平均值 ± SEM。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

如適用，進(jìn)行Student’s t-檢驗(yàn)以確定兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低于0.05的P值被認(rèn)為是顯著的。

結(jié)果和討論：線粒體功能

為測試在培養(yǎng)的人腎細(xì)胞中化合物C或D是否可提高線粒體(“MT”)電位，將HEK293T細(xì)胞用37.5和75 ppb的化合物C或D處理。這些量基于用SeaHorse測定法的研究，其中發(fā)現(xiàn)有效劑量為100-150ppb?；衔顲以及其硫類似物H用HEK293T細(xì)胞孵育4.5小時(shí)和在顯微鏡下進(jìn)行熒光分析。如圖1所示，較低劑量(37.5 ppb)的化合物C提高M(jìn)T電位，而在用較高劑量(75ppb)的化合物C處理4.5 hr的腎細(xì)胞中對MT電位具有較少影響。相比之下，所有測試劑量的化合物D不影響MT電位(圖1)。

我們的結(jié)果清楚地證實(shí)，化合物C提高腎細(xì)胞中的MT電位，而化合物D沒有效果?？紤]到硒存在于化合物C和D兩者中，和它們各自的硫類似物H和J證明不能刺激線粒體活性，得出結(jié)論，在腎細(xì)胞中化合物C的刺激作用歸因于硒和在該有機(jī)硒化合物中圍繞硒的分子結(jié)構(gòu)的組合作用。刺激活性不歸因于單獨(dú)的硒作用。

能夠增加腎細(xì)胞中的線粒體活性的重要性可具有非常顯著的健康益處，尤其是在糖尿病受試者中。最近的研究(Sharma等J AM Soc Nephrol，2013: 1901-12)從來自糖尿病群體的尿液的代謝分析得出結(jié)論，糖尿病腎病明顯與線粒體功能降低有關(guān)。糖尿病腎病(DKD)是末期腎病的主要原因，作者得出結(jié)論，恢復(fù)或增加線粒體功能的治療性方法能夠改善或甚至阻止DKD。額外的興趣在于作者將在這些病例中的線粒體功能障礙與稱為PGC1a的轉(zhuǎn)錄輔激活因子聯(lián)系起來的事實(shí)。如后面所討論的，PGC1a是本申請中所述的合成的硒化合物的靶標(biāo)。

在小鼠C2C12細(xì)胞中化合物C和D提高線粒體電位

為了測試化合物C和D是否在骨骼肌細(xì)胞中影響MT電位，將C2C12細(xì)胞用溶媒(水，對照)或各種濃度的硒和硫化合物處理，然后進(jìn)行MT電位的定量分析。如圖2所示，在C2C12細(xì)胞中在用硫類似物處理24 hr后MT電位降低(與對照相比)，表明硫化合物在骨骼肌細(xì)胞中顯示一定的MT毒性。相比之下，硒化合物C和D顯著地提高M(jìn)T電位(圖2)。

該結(jié)果的兩個(gè)方面是特別出人意料和不可預(yù)期的。首先，化合物D，盡管在腎細(xì)胞中失活，但在肌細(xì)胞中在刺激線粒體活性時(shí)高度有效(在其最有效劑量下是對照水平的大約2倍)。此外，在較低劑量(37.5和75 ppb，圖2)下，其證明了比化合物C更有效，化合物C(如上文所示)是在腎細(xì)胞中唯一有效的測試化合物。

第二，C和D的硫類似物，并非僅相對于溶媒-處理的對照細(xì)胞沒有作用，而是對線粒體活性具有抑制性(在一些情況下降低了2/3)。該作用在過去并未報(bào)道，但可有助于解釋使用富硒酵母制備物的一些研究已經(jīng)報(bào)道了在接受這些補(bǔ)劑的受試者中的前-糖尿病作用的原因。盡管在硒富集過程中硒替換在酵母的正常的含硫分子中的硫，但在最終制備物中總是存在一定優(yōu)勢的含硫分子(硫是大量元素，不可能從任何生長或發(fā)酵過程中完全除去)。因此，在一些情況下富硒酵母中某些含硫分子的存在可抑制線粒體活性和隨時(shí)間導(dǎo)致前-糖尿病狀態(tài)。文獻(xiàn)中充分證明了成人發(fā)作型糖尿病與在數(shù)年的時(shí)間內(nèi)線粒體活性逐漸降低有關(guān)。在骨骼肌的情況下這特別重要，估計(jì)骨骼肌利用每日攝取的葡萄糖的75-80%。甚至肌肉線粒體有效利用葡萄糖的能力的適度降低可隨時(shí)間導(dǎo)致嚴(yán)重健康問題。例如，響應(yīng)化合物D時(shí)在C2C12肌細(xì)胞中注意到線粒體活性的2倍刺激，可代表在前驅(qū)-糖尿病或糖尿病受試者的肌肉組織中避免或延遲線粒體降低的一種方式。

為研究觀察到的化合物C和D導(dǎo)致的MT電位增加是否僅歸因于活細(xì)胞數(shù)的增加，我們進(jìn)行了細(xì)胞成活力測定法。發(fā)現(xiàn)在用相同劑量的這些化合物處理24 hr和48 hr后，化合物C和D不影響C2C12細(xì)胞的細(xì)胞成活力(數(shù)據(jù)未顯示)。總之，我們的結(jié)果表明，化合物C和D對細(xì)胞存活不具有負(fù)面影響，但是可在C2C12細(xì)胞中短暫提高M(jìn)T電位。

在IMR-32細(xì)胞中化合物C、D和E短暫提高M(jìn)T電位

為研究在神經(jīng)元細(xì)胞中硒化合物是否可調(diào)節(jié)MT功能，將人IMR32細(xì)胞用各種化合物處理6、24和48 hr，然后進(jìn)行線粒體電位測定法。如圖3所示(上圖)，與對照正常細(xì)胞(用水溶媒處理)相比，化合物D或E或兩者的組合處理6 hr顯著地提高M(jìn)T電位，而在化合物C處理的IMR-32細(xì)胞中也觀察到MT電位升高的趨勢。在用化合物H或I和J處理的細(xì)胞中也觀察到MT電位增加(與對照相比，圖3上圖)。然而，在用化合物D或E或DE組合處理的細(xì)胞中比它們相應(yīng)的硫類似物，MT電位提高更加顯著(圖3上圖)。

在化合物處理后24小時(shí)，在所有硒化合物-處理的細(xì)胞中觀察到MT電位顯著增加(與對照相比)。一般而言，在用硒化合物C、D、E或CDE的組合處理的細(xì)胞中與它們的硫類似物H、I、J或HIJ的組合相比，MT電位提高更加顯著。應(yīng)注意，在一種情況下，在24 hr時(shí)間點(diǎn)，I和J的組合產(chǎn)生最高的線粒體反應(yīng)。然而在48 hr，在所有測試組中MT電位沒有顯著變化?？傊?，這些結(jié)果表明，硒化合物C、D、E或這些化合物的組合可在IMR-32細(xì)胞中短暫提高M(jìn)T電位和這些硒化合物的作用比它們的硫類似物更明顯。

再次，在本實(shí)驗(yàn)中明顯存在顯著的細(xì)胞特異性和化合物特異性反應(yīng)，這強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞類型對這些特異性硒化合物和它們的組合的不同反應(yīng)。此外，不是如肌細(xì)胞的情況下對線粒體活性具有抑制性，硫化合物在IMR-32細(xì)胞中刺激線粒體活性 – 雖然通常程度低于硒化合物。在該情況下觀察到的瞬時(shí)或暫時(shí)作用表明這些化合物或它們的組合必須重復(fù)給予所治療的受試者，以保持對線粒體活性的作用；基本上可能需要每日劑量。

在IMR-32細(xì)胞中通過重復(fù)D或E處理總共48小時(shí)提高M(jìn)T電位

上文觀察到的化合物C、D和E對MT電位的短暫作用提示我們測試重復(fù)處理是否可提高M(jìn)T電位。 因此，IMR-32細(xì)胞首先用化合物C、D或E處理24 hr，然后用新制備的化合物C、D或E再次處理另外24 hr。作為陰性對照，IMR-32細(xì)胞用化合物C、D或E僅處理一次48 hr。然后，對這些細(xì)胞進(jìn)行MT電位測定。如所預(yù)期的，化合物C、D或E延長單次處理48 hr (繼續(xù)48 hr單次處理)在IMR-32中不影響MT電位(圖4上圖)。然而，化合物D (15和150 ppb兩者)或E (劑量150 ppb)的重復(fù)處理顯著地提高M(jìn)T電位(與對照或硫類似物I或J相比)。

化合物C、D、E對IMR-32細(xì)胞的細(xì)胞存活無毒性作用

為測試硒化合物對IMR-32細(xì)胞的存活是否存在任何毒性作用，在用各種化合物處理24、48和72小時(shí)后對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞成活力測定。如圖5所示，對于測試的時(shí)間點(diǎn)，所有化合物的處理在IMR-32中不導(dǎo)致活細(xì)胞顯著降低。事實(shí)上，在硒化合物處理48和72小時(shí)后在細(xì)胞中存在少但明顯的細(xì)胞成活力增加(圖5中圖和下圖)。這些數(shù)據(jù)表明，硒化合物對IMR-32細(xì)胞的存活不具有毒性作用，而是對神經(jīng)元細(xì)胞的存活具有小但顯著的有益作用。然而應(yīng)注意，在本實(shí)驗(yàn)中任何觀察到的細(xì)胞成活力增加太微小，而不能解釋在響應(yīng)某些硒化合物或它們的類似物時(shí)在IMR-32細(xì)胞系中觀察到的MT電位的增加。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)選擇的合成硒化合物在自大鼠腦分離的線粒體中增加或降低線粒體活性的能力

水溶性提取物獲自硒化酵母。水溶性提取物占制備物中存在的總硒的至多25%。我們推論這些硒物質(zhì)在硒化酵母通過腸道時(shí)首次自硒化酵母釋放/消化。在通過質(zhì)譜法鑒定提取物中的含硒化合物后，我們合成了許多含硒化合物和肽。因此，該輪合成和純化產(chǎn)生一組9種含硒物質(zhì)，用于進(jìn)一步測試。鑒于由此產(chǎn)生的物質(zhì)的量很少(低毫克量)，認(rèn)為在活動(dòng)物中進(jìn)行飼喂研究是不實(shí)際的。因?yàn)槲覀冎饕P(guān)注這些硒物質(zhì)對線粒體生物能量的可能作用，所以決定直接使用線粒體測試這些硒分子。

開始測試濃度范圍低(50ppb)、中(500 ppb)和高(1ppm)的硒作為化合物的可能范圍。根據(jù)在中-范圍內(nèi)未觀察到對線粒體的毒性，我們選擇500ppb (5uM)濃度用于進(jìn)行我們的化合物篩選，使用線粒體生物能量作為主要的結(jié)果度量。成年大鼠腦ficoll純化的線粒體用9種化合物在37°C孵育30分鐘，然后一式三份加載至Seahorse Biosciences流量分析儀。我們測量了在三個(gè)呼吸階段下的OCR (氧消耗速率)參數(shù)，所述階段包括ATP合成(階段III)、復(fù)合物I依賴性(NADH-驅(qū)動(dòng)的)最大呼吸能力(階段V _FCCP)和復(fù)合物II (FADH-驅(qū)動(dòng)的)依賴性最大呼吸能力(階段V_succ)。

結(jié)果表明源自水提取物的不同的硒化合物在能夠增加線粒體電位方面具有不同的活性。

化合物5：纈氨酸-硒代甲硫氨酸-精氨酸

化合物6：亮氨酸-纈氨酸-硒代甲硫氨酸-精氨酸

化合物7：亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-硒代甲硫氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸

化合物8：硒代谷胱甘肽二聚體

化合物9：甲基硒代腺苷

化合物10：谷氨?；腚装彼?/p>

化合物25：酵母的總水提取物，pH 6.0

化合物28：氧化的谷胱甘肽

化合物30：谷氨酰基半胱氨酸

表1

具體而言，化合物6和9增加線粒體電位，而化合物7、10和25抑制線粒體電位。這些結(jié)果表明源自硒化酵母的水提取物的化合物對線粒體電位具有非常不同的作用，這使我們分離、篩選和合成候選化合物，目的在于僅選擇對生物過程產(chǎn)生陽性反應(yīng)的那些化合物。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)合成的硒化合物在自大鼠腦分離的線粒體中恢復(fù)應(yīng)激的線粒體至正?；钚缘哪芰?/p>

以下實(shí)施例描述了在SeaHorse外部流量分析儀上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)；所述分析儀為用于測量表示為氧消耗速率或OCR的線粒體呼吸速率的儀器。所述實(shí)驗(yàn)使用來自用正常實(shí)驗(yàn)飼料維持的正常大鼠的腦皮層的線粒體，所述飼料未用任何額外的硒來源強(qiáng)化。圖6顯示正常線粒體的呼吸圖(上線)，其中最終的OCR為在圖線末端與X-軸之間的測量的距離。

相同線粒體制備物的相同樣品以與對照樣品完全相同的方式處理，除了加入鈣(10微摩爾終濃度)以通過使它們除極化而應(yīng)激或損害線粒體。如所示的(下線)，OCR從值1,677下降至1,066皮摩爾/min O₂。

再次，相同的大鼠腦皮層線粒體樣品按上所述孵育，除了它們包含鈣(10μM)和分別150 ppb的化合物D和E之外。C未測試。明顯的是，在化合物D的情況下，化合物處理的鈣應(yīng)激的線粒體的OCR恢復(fù)至接近對照水平，即1,564皮摩爾/min O2，和在化合物E的情況下為1,531皮摩爾/min O2。

根據(jù)該結(jié)果和使用大鼠腦線粒體重復(fù)實(shí)驗(yàn)的那些結(jié)果，我們得出結(jié)論，合成的硒化合物不僅具有增加正常線粒體的線粒體活性的能力(參見使用各種類型的未應(yīng)激細(xì)胞的實(shí)施例)，而且可恢復(fù)應(yīng)激或損害的線粒體的呼吸能力。

在小鼠肝AML-12細(xì)胞中通過C、D和E的組合而非通過單獨(dú)的化合物提高M(jìn)T電位

為了研究硒化合物是否可在肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)MT功能，小鼠AML-12細(xì)胞用各種化合物處理6和24 hr，然后進(jìn)行線粒體電位測定。如圖7所示，與對照正常細(xì)胞(用水溶媒處理)相比，用150 ppb的化合物C、D或E或相同濃度的其相應(yīng)硫類似物單獨(dú)處理不顯著地影響MT電位。然而，與溶媒-或HIJ-處理組兩者相比，C、D和E的組合導(dǎo)致MT電位高度顯著增加(圖7)。因此，在肝細(xì)胞中，化合物C、D和E的特定組合是引起MT電位增加所需要的，而單獨(dú)的化合物和它們的硫類似物沒有影響。該作用完全不同于在神經(jīng)元細(xì)胞中觀察到的，并且之前從未在文獻(xiàn)中證明。

在AML-12細(xì)胞中通過化合物C、D和E的組合，UCP2表達(dá)下調(diào)

具有增加或降低線粒體活性的能力的一個(gè)候選的基因家族是所謂的解偶聯(lián)蛋白基因或UCP。在響應(yīng)用CDE組合處理時(shí)觀察到的MT電位升高使我們測試這些基因在溶媒-、HIJ-和CDE-處理的AML-12細(xì)胞中是否存在不同調(diào)節(jié)。在正常的AML-12細(xì)胞中，Ucp2 mRNA表達(dá)水平是Ucp1的416倍，而Ucp3 mRNA通過實(shí)時(shí)RT-PCR未檢出(圖8A，Ucp3數(shù)據(jù)未顯示)。用CDE化合物處理AML-12細(xì)胞不影響Ucp1表達(dá)(圖8B)。然而，用CDE而非HIJ處理后在AML-12細(xì)胞中存在Ucp2 mRNA表達(dá)顯著降低(圖8C)。因?yàn)閁cp2可抑制MT電位，Ucp2表達(dá)降低可至少是在AML-12細(xì)胞中通過CDE化合物引起的MT電位提高的一部分原因。因?yàn)榉逝只颊咄ǔＴ诟沃芯哂懈咚降腢cp2，通過CDE降低Ucp2表達(dá)表明CDE化合物可能對于治療肥胖是有益的。

CDE化合物對AML-12細(xì)胞的存活無毒性作用

為了測試硒化合物對AML-12細(xì)胞的存活是否存在任何毒性作用，在用各種化合物處理48 hr后對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞成活力測定。我們發(fā)現(xiàn)無處理(單一化合物和它們的組合兩者)導(dǎo)致在AML-12細(xì)胞中細(xì)胞成活力顯著降低(圖9)，這證實(shí)了硒化合物對AML-12細(xì)胞的存活不具有毒性作用。

在IMR-32細(xì)胞中化合物C、D和E的組合下調(diào)UCP2/3

如先前所述，UCP例如Ucp1、2和3是調(diào)節(jié)MT電位的關(guān)鍵基因。響應(yīng)CDE時(shí)在IMR-32細(xì)胞中觀察到的MT電位升高(圖3，上兩個(gè)圖)提示我們測試在響應(yīng)組合處理時(shí)這三個(gè)基因是否存在差異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在正常IMR-32細(xì)胞中通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析，Ucpl mRNA不可檢出(數(shù)據(jù)未顯示)。用CDE化合物而非HIJ處理IMR-32細(xì)胞6小時(shí)，導(dǎo)致Ucp2和Ucp3兩者的表達(dá)顯著降低(圖10A-B)。在24小時(shí)處理時(shí)，在HIJ-和CDE-處理組兩者中Ucp2表達(dá)顯著降低(圖10A)，而在CDE-處理的IMR-32細(xì)胞中還觀察到Ucp3表達(dá)的顯著降低(圖10B)。這些結(jié)果表明，Ucp2/3下調(diào)可能是在響應(yīng)CDE化合物時(shí)在IMR-32細(xì)胞中觀察到的MT電位提高的至少一個(gè)原因。

討論

因此，我們已經(jīng)提供了證據(jù)表明，三種合成的有機(jī)硒化合物單獨(dú)或以各種組合具有在不同細(xì)胞類型中顯著地增加線粒體活性的能力；所述細(xì)胞即腎細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和肝細(xì)胞。在機(jī)制上，我們注意到UCP的調(diào)節(jié)可對該增加提供一種解釋，并且在下文提供證據(jù)表明，對線粒體功能和生物發(fā)生是重要的其它蛋白的表達(dá)也可受這些化合物有利地影響。然而無論作用機(jī)制如何，這些化合物可以跨組織的方式刺激線粒體活性的事實(shí)意味著它們在改善表面不同的疾病的發(fā)生和進(jìn)展中可能特別有價(jià)值，所述疾病例如阿爾茨海默病(AD)和2型糖尿病(T2DM)。

在阿爾茨海默病的情況下，快速增加的文獻(xiàn)支持AD起源于在腦中的葡萄糖輸入受損、能量代謝缺乏、線粒體功能障礙、慢性氧化應(yīng)激和DNA損傷的觀點(diǎn)(綜述于de la Monte和Wands，2008)。例如，許多研究已得出結(jié)論，胰島素缺乏和胰島素抵抗可介導(dǎo)在AD-變性中觀察到的許多影響。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T2DM導(dǎo)致腦胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和認(rèn)知損害。腦胰島素和胰島素-樣生長因子(IGF)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的廣泛紊亂可解釋AD中見到的許多分子、生物化學(xué)和組織病理學(xué)影響。

美國阿爾茨海默病學(xué)會(huì)公布的眾所周知的統(tǒng)計(jì)數(shù)值說明，大約80%的AD患者同時(shí)具有T2DM。這些和其它原因使許多研究者使用術(shù)語“3型糖尿病”來反映AD代表選擇性累及腦和具有與1型和2型糖尿病兩者重疊的分子和生物化學(xué)特征的一種糖尿病形式的事實(shí)。

AD和2型糖尿病之間的聯(lián)系在科學(xué)文獻(xiàn)中正變得非?？煽?，但是什么才是這些疾病和線粒體功能障礙之間的聯(lián)系？正是T2DM，其兼有通過胰腺的胰島素分泌缺乏和在外周組織，特別是肝和骨骼肌中的胰島素抵抗，這由在長期時(shí)間內(nèi)線粒體呼吸功能的適度和逐漸損失引起(Lowell和Shulman，2005)。因此，可在不同組織中增加線粒體功能的任何試劑作為追蹤來源至線粒體降低的病況的干預(yù)，可能是非常有價(jià)值的。

阿爾茨海默病發(fā)病的結(jié)果和討論

在IMR-32細(xì)胞中化合物C、D和E的組合下調(diào)PSEN

已經(jīng)報(bào)道IMR-32細(xì)胞是用于研究阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的合適的體外模型系統(tǒng)(Neill等J. Neuroscience Res. 1994 39:482)。AD的重要病理學(xué)特征之一是淀粉樣蛋白斑塊，其在神經(jīng)元之間出現(xiàn)，并且其促進(jìn)腦萎縮和細(xì)胞死亡。涉及淀粉樣蛋白斑塊產(chǎn)生的機(jī)制是復(fù)雜的，但主要依賴于稱為β-分泌酶(BACE)的酶的作用，其與稱為γ-分泌酶的多酶復(fù)合物一致起作用。總之，在AD中這些酶起作用以異常加工稱為淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的腦蛋白。得到的產(chǎn)物是異常的淀粉樣蛋白β肽，其凝集在一起形成斑塊。

如所述的，γ-分泌酶實(shí)際上是由四個(gè)已知成員構(gòu)成的多元復(fù)合物：早老素-1 (PSEN1或PSEN)、Nicastrin、APH-1(Anterior Pharynx Defective 1)和PEN2 (早老素增強(qiáng)劑2)。PSEN的其它橫向同源物是早老素2或PSEN2。盡管所有四個(gè)組分對γ-分泌酶正確發(fā)揮功能是重要的，但特別的是，兩個(gè)組分已經(jīng)成為pipeline治療藥物的焦點(diǎn)。這些組分是早老素1和Nicastrin。這是因?yàn)樵缋纤?是γ-分泌酶的實(shí)際催化組分 – 該組分在物理上切割淀粉樣蛋白前體蛋白。此外，早老素1的基因是在家族性AD中最頻繁突變的基因。相對于PSEN2，PSEN1更加豐富，在功能上更好確定。對Nicastrin具有興趣，不是因?yàn)樗谴呋缘模且驗(yàn)樗Y(jié)合和定向APP以致早老素可將其切割。因此，對于聚焦于γ-分泌酶的AD干預(yù)，PSEN 1和Nicastrin是具有最大興趣的靶標(biāo)。

還應(yīng)注意，數(shù)個(gè)研究組認(rèn)為AD源于隨人變老而線粒體功能逐漸下降。在這一點(diǎn)上，還有興趣的是注意到，在AD疾病過程中可測量的優(yōu)先生理學(xué)變化之一是腦細(xì)胞攝取和利用葡萄糖不足；明顯的是，這兩種現(xiàn)象可能是有關(guān)聯(lián)的。因此，我們檢查了在用化合物C、D和E的組合(CDE)以及它們的硫類似物的組合(HIJ)處理的IMR32細(xì)胞中編碼PSEN的基因的表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)在正常的IMR32細(xì)胞中PSEN的表達(dá)幾乎是PSEN2的8倍(圖10C)。更重要的是，與對照或HIJ組相比在CDE-處理的細(xì)胞中PSEN1表達(dá)顯著地降低(圖10D)。相比之下，在對照、HIJ和CDE組之間PSEN2表達(dá)沒有明顯變化(圖10E)。這些結(jié)果表明，硒化合物可在IMR-32細(xì)胞中選擇性地下調(diào)PSEN而不是PSEN2表達(dá)，和在CDE化合物中可存在針對淀粉樣蛋白斑塊形成的前導(dǎo)物。

化合物C，一種在IMR-32細(xì)胞中通過靶向γ-分泌酶復(fù)合物基因PSEN和Nicastrin用于在AD中防止切割用于形成斑塊的APP的前導(dǎo)化合物

如上文所述(圖10D)，化合物CDE混合物抑制PSEN表達(dá)，表明在這三種化合物中存在針對用于產(chǎn)生淀粉樣蛋白β肽的γ-分泌酶組分的生物前導(dǎo)物。該研究限于PSEN表達(dá)，但因?yàn)棣梅置诿甘嵌嗝笍?fù)合物，另一重要的組分蛋白Nicastrin包括在該特定實(shí)施例中。為了鑒定前導(dǎo)化合物，IMR-32細(xì)胞用單獨(dú)的化合物處理和進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR分析。

如圖11A所示，在通過化合物C處理24 hr后，PSEN和Nicastrin而非PEN2和β-分泌酶BACE蛋白在IMR-32細(xì)胞中削弱。定量分析表明，僅C導(dǎo)致PSEN和Nicastrin蛋白水平兩者的顯著降低，而D和E化合物也引起Nicastrin蛋白表達(dá)降低的趨勢(圖11B-C)。與PSEN表達(dá)削弱一致，不僅在處理6 hr而且在24 hr時(shí)，化合物C顯著地降低PSEN mRNA表達(dá)(圖11D-E)。類似地，在IMR-32細(xì)胞中在處理6 hr后，化合物C處理還導(dǎo)致Nicastrin mRNA表達(dá)降低的趨勢(圖11F)，和更重要的是，在24 hr處理后在IMR-32細(xì)胞中Nicastrin mRNA表達(dá)顯著降低(圖11G)。相比之下，在IMR-32細(xì)胞中化合物D和E處理不抑制，而是刺激PSEN和Nicastrin mRNA表達(dá)(圖11E和11G)。

總之，我們的數(shù)據(jù)表明化合物C可在mRNA和蛋白水平兩個(gè)水平上抑制PSEN和Nicastrin兩者的表達(dá)。這些結(jié)果表明化合物C是三種候選物中的抗-AD化合物，并且通過靶向已知在AD中導(dǎo)致斑塊形成的γ-分泌酶復(fù)合物組分，更特別是PSEN和Nicastrin而實(shí)現(xiàn)。

化合物C，一種在IMR-32細(xì)胞中針對Tau蛋白高磷酸化的細(xì)胞特異性GSK3b下調(diào)劑

除了淀粉樣蛋白斑塊之外，AD中第二主要的病理學(xué)被稱為神經(jīng)原纖維纏結(jié)、NFT或簡稱纏結(jié)。已經(jīng)充分表征了AD中纏結(jié)形成由稱為Tau蛋白的高磷酸化引起和該磷酸化由激酶例如DYRK1A (雙特異性酪氨酸-磷酸化-調(diào)節(jié)激酶1A)和主要是Gsk3b (糖原合酶激酶3β)引起。為了研究硒化合物C、D或E是否有可能促進(jìn)AD中纏結(jié)形成減少，我們首先研究了兩種AD標(biāo)志物pTau S396和pTauS400/T403/S404的磷酸化狀態(tài)，以及在IMR32細(xì)胞中的總Tau蛋白濃度。在指定的位點(diǎn)上Tau的磷酸化與Tau蛋白的失穩(wěn)和最終形成纏結(jié)有關(guān)。為此目的，細(xì)胞用化合物C、D和E處理6和24 hr，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

如圖12A所示，所有測試的Tau蛋白物質(zhì)的蛋白水平在6 hr處理時(shí)不受影響。然而在24 hr處理后，IMR-32細(xì)胞中的pTauS396、pTauS400/T403/S404和/或總Tau的蛋白水平被化合物C和/或E顯著地下調(diào)。定量分析表明化合物C不影響總Tau蛋白水平，但顯著地抑制在S400/T403/S404上而非在S396上的Tau的磷酸化(圖12B-C)?；衔顳對在所有測試的絲氨酸/蘇氨酸殘基上的Tau磷酸化或?qū)俆au蛋白水平?jīng)]有影響，而在S396和S400/T403/S404上的Tau磷酸化和總Tau蛋白被E化合物顯著地下調(diào)(圖12B-C)。

總pTauS396和pTauS400/T403/S404與總Tau蛋白的比率的分析表明，僅化合物C而非D或E在IMR-32中顯著地削弱Tau蛋白的總磷酸化，即使存在化合物E導(dǎo)致的在所有測試的絲氨酸/蘇氨酸殘基上Tau磷酸化降低的趨勢(圖12E)。

總之，我們的數(shù)據(jù)顯示，在IMR32細(xì)胞中化合物C可顯著抑制Tau磷酸化，但不影響總Tau蛋白，而化合物D在該過程中不具有任何作用?；衔顴也可具有調(diào)節(jié)Tau磷酸化的作用，但該化合物的作用可能通過下調(diào)IMR-32細(xì)胞中總Tau蛋白進(jìn)行。鑒于Tau的高磷酸化是AD中纏結(jié)形成的原因，我們的數(shù)據(jù)表明C抑制了促進(jìn)Ad中纏結(jié)形成的Tau高磷酸化。

為了研究化合物C下調(diào)Tau磷酸化是否歸因于Gsk3和DYRK1A (對于AD中的Tau磷酸化的兩種關(guān)鍵激酶)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以檢查它們的蛋白水平。如圖12A所示，在IMR-32細(xì)胞中，Gsk3b的磷酸化、總Gsk3a和DYRK1A蛋白不受三種化合物的任一種的影響。然而，在IMR-32細(xì)胞中在用化合物C而非D或E處理24 hr而非6 hr后，Gsk3b蛋白水平顯著降低(圖12A)。定量分析表明，在化合物C而非D或E處理的IMR-32細(xì)胞中，Gsk3b蛋白水平統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低(與對照細(xì)胞相比) (圖12F)。

為了進(jìn)一步證實(shí)Gsk3b表達(dá)被化合物C抑制，進(jìn)行定量RT-PCR以檢查其mRNA水平。如圖12G中所示，在IMR32細(xì)胞中在用化合物C處理6 hr后Gsk3b mRNA水平顯著地降低。在用化合物C處理24 hr后還在IMR-32細(xì)胞中觀察到Gsk3b mRNA表達(dá)降低的趨勢(圖12H)。相比之下，在IMR-32細(xì)胞中化合物D和E處理6 hr不顯著地抑制Gsk3b mRNA表達(dá)(圖12G)。而是，在IMR-32細(xì)胞中在用化合物D或E處理24 hr后存在Gsk3b mRNA表達(dá)顯著增加(圖12H)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明化合物C可在mRNA和蛋白兩個(gè)水平上抑制Gsk3b表達(dá)，化合物C下調(diào)GSK3b可能是上文所述的Tau磷酸化降低的原因。

為了研究化合物C對Gsk3b表達(dá)的抑制作用是否是神經(jīng)元細(xì)胞-特異性的，我們在小鼠肝細(xì)胞中檢查了其蛋白水平。蛋白提取物自肝細(xì)胞與上述IMR-32細(xì)胞同時(shí)和在相同的實(shí)驗(yàn)條件下制備。發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中的Gsk3b蛋白水平不受化合物C影響(圖16)。因此，Gsk3b表達(dá)的下調(diào)是神經(jīng)元細(xì)胞-特異性的。從治療前景來看，肝細(xì)胞中GSK3b對化合物C的反應(yīng)的缺少可能具有重要的價(jià)值。這意味著化合物C可在神經(jīng)元組織中用作治療劑而不需要冒嚴(yán)重干擾肝糖代謝的風(fēng)險(xiǎn)。

總之，我們的結(jié)果表明，化合物C是神經(jīng)元細(xì)胞-特異性的Gsk3b下調(diào)劑，并且可在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制Tau磷酸化，這針對AD中的纏結(jié)形成將是有益的。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步提供體外證據(jù)表明，化合物C可能是在AD領(lǐng)域中有價(jià)值的治療劑。

在IMR32細(xì)胞中CDE致使FOXO磷酸化的神經(jīng)元特異性下調(diào)和PGC1a蛋白上調(diào)

鑒于在IMR-32細(xì)胞中觀察到的CDE化合物對線粒體活性的作用，我們希望檢查這些化合物是否可調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)細(xì)胞生長和代謝、線粒體功能和能量的重要因子。FOXO (Forkhead box)蛋白是重要的核轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞增殖、分化和存活中具有不同的作用。它們部分地控制細(xì)胞的關(guān)鍵功能，例如糖原異生(自非-糖底物產(chǎn)生葡萄糖)。它們進(jìn)入細(xì)胞核受磷酸化控制，磷酸化的FOXO從核排除，而去磷酸化的FOXO可進(jìn)入。

PGC1a (過氧化物酶體增殖子-活化受體γ共激活劑1-α)是調(diào)節(jié)參與能量代謝的基因的有效的轉(zhuǎn)錄激活物，并且還是線粒體生物發(fā)生和生長的主要調(diào)節(jié)劑。它提供外部刺激(例如運(yùn)動(dòng))和線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)之間的直接關(guān)聯(lián)。通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合以共活化基因，它執(zhí)行不同的功能。在神經(jīng)元特異性線粒體活性和AD進(jìn)展的情況下，有興趣地注意到，在阿爾茨海默病的腦中PGC1a表達(dá)隨癡呆進(jìn)展而降低(Qin等2009. Arch Neurol; 66:352-361)。

因此，我們感興趣研究CDE化合物的任一種是否可影響這些有效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達(dá)。如圖13所示，在IMR-32細(xì)胞中在CDE處理6和24 hr后FOXO4和FOXO3的磷酸化下調(diào)，而在IMR-32細(xì)胞中在24 hr處理后PGC1a蛋白增加。對其它測試的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的蛋白表達(dá)存在很少或沒有作用。PGC1a蛋白提高可促進(jìn)MT生物發(fā)生，其可提供在IMR-32細(xì)胞中MT電位被CDE組合提高的原因的另一種解釋(圖3，上圖和中圖)。充分表征了FOXO例如FOXO 4在T28和S193去磷酸化導(dǎo)致FOXO蛋白的核定位。該結(jié)果強(qiáng)烈表明，CDE化合物的組合很可能提高核FOXO作用?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，在神經(jīng)元細(xì)胞中CDE包含一種或多種FOXO激活劑和正PGC1a調(diào)節(jié)劑。

從在神經(jīng)元細(xì)胞例如腦中的治療前景上，該結(jié)果可能是非常有意義的。充分確立了某些FOXO蛋白和PGC1a在核中共定位可導(dǎo)致糖原異生(葡萄糖產(chǎn)生)的有效活化。盡管這樣的情況在糖尿病受試者的肝中可能是不需要的，但在早期AD受試者(其中葡萄糖輸入至神經(jīng)元受損，因此腦細(xì)胞缺乏其主要能量來源)的情況下可認(rèn)為是非常有利的。在這樣的情況下，從其它分子的碳骨架產(chǎn)生葡萄糖的能力提高將是非常有利的。

為了測試觀察到的FOXO和PGC1a活化(上述)是否是神經(jīng)元細(xì)胞-特異性的，我們還檢查了在小鼠肝AML-12細(xì)胞中它們的蛋白水平。蛋白提取物從肝細(xì)胞與IMR-32細(xì)胞同時(shí)和在相同的實(shí)驗(yàn)條件下制備。然而，在后面部分中描述的在肝細(xì)胞中觀察到的作用(圖15)與對IMR-32細(xì)胞所獲得的作用完全相反，確定地表明CDE導(dǎo)致的FOXO去磷酸化和PGC1a上調(diào)不是組織范圍內(nèi)的現(xiàn)象，可能限于神經(jīng)元細(xì)胞。

化合物C，一種神經(jīng)元特異性FOXO激活劑和PGC1a上調(diào)劑

如上文所述，CDE化合物一起導(dǎo)致FOXO去磷酸化和刺激PGC1a蛋白表達(dá)(圖13)。為鑒定CDE混合物中的哪一種化合物具有這些作用，我們檢查了在C-、D-和E-處理的IMR32細(xì)胞中前述蛋白的表達(dá)。如圖14A所示，在IMR32細(xì)胞中在所有三種化合物6 hr處理后pFOXO4水平顯著降低。在24 hr處理后，在C-和E-而非D-處理的IMR-32細(xì)胞中還觀察到pFOXO4 T28水平降低。定量分析表明C、D和E處理6 hr以及C和E處理24 hr導(dǎo)致的IMR-32細(xì)胞中pFOXO4水平降低是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(圖14B-C)。

重要的是注意到，CDE組合和單獨(dú)的C、D或E處理都不導(dǎo)致總FOXO水平的任何變化(圖13和14)，而是通過將其去磷酸化僅改變FOXO作用的控制。FOXO磷酸化降低不大可能歸因于AKT磷酸化的下調(diào)，因?yàn)閜AKT蛋白水平在C-、D-或E-處理的細(xì)胞中未明顯降低(圖14A)。此外，pElf2beS539蛋白水平也未受C、D或E的影響，表明這些化合物很可能在神經(jīng)元細(xì)胞中不影響蛋白翻譯(圖14A)。相比之下，PGC1a蛋白水平在所有三種化合物24 hr處理后顯著提高(圖14A、14D)，這可解釋在IMR-32細(xì)胞中MT電位被這些化合物上調(diào)的原因(圖3，上圖和中圖)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，化合物C和E是FOXO激活劑和PGC1a上調(diào)劑，而化合物D是PGC1a上調(diào)劑并且在FOXO磷酸化調(diào)節(jié)中具有混合作用。

討論

當(dāng)總體考慮時(shí)，我們在神經(jīng)元細(xì)胞中的結(jié)果將化合物C作為用于在這些細(xì)胞中引發(fā)有益作用的有利試劑。盡管上文直接描述的結(jié)果表明所有三種化合物都能夠?qū)е翭OXO去磷酸化和PGC1a上調(diào) –從神經(jīng)元細(xì)胞的能量觀點(diǎn)來看非常需要的作用，但應(yīng)記得，化合物C是引發(fā)這些FOXO/PGC1作用和同時(shí)顯著地降低PSEN和Nicastrin水平(圖11)的唯一候選物。此外，在降低IMR-32細(xì)胞中的磷酸-Tau水平和GSK3b水平方面(圖12)，正是該化合物顯示出有利的反應(yīng)。

因此，化合物C似乎是用于在神經(jīng)元細(xì)胞中引發(fā)如下三聯(lián)有益作用的精選化合物：1) 通過刺激總體線粒體電位、增加PGC1水平和降低FOXO磷酸化– 從而允許其核進(jìn)入，導(dǎo)致對線粒體活性和功能的有益影響；2) 通過降低PSEN1和Nicastrin的表達(dá)，在降低淀粉樣蛋白積聚中的隱含作用；和3) 通過降低磷酸化Tau和被認(rèn)為負(fù)責(zé)Tau磷酸化的酶(GSK3b)的水平，降低Tau纏結(jié)形成的隱含作用。

再次，為了測試這些作用的細(xì)胞特異性，來自CDE組合處理的肝AML-12細(xì)胞的蛋白提取物用相同的抗體探查，以檢測FOXO磷酸化和PGC1a水平的差異。如圖15和16所示，和在后面部分中更詳細(xì)論述的，用這三種相應(yīng)的化合物所見到的作用證實(shí)了IMR-32細(xì)胞作用確定在肝中未觀察到。事實(shí)上，可以認(rèn)為觀察到直接相反作用，即FOXO磷酸化(核排出)增加、PGC1a水平未改變和GSK3b水平未改變。然而，顯然，這些是希望見到的發(fā)生在肝中的作用類型，特別是在糖尿病受試者的情況下，其中肝葡萄糖輸出需要受到控制。最重要的是，發(fā)現(xiàn)完全不同于神經(jīng)元細(xì)胞，肝AML-12細(xì)胞對用單獨(dú)化合物處理無響應(yīng)，而是，僅對CDE混合物有響應(yīng)。再次，關(guān)于這些化合物的作用模式，這指向非常明確的細(xì)胞特異性和不可預(yù)期的細(xì)胞響應(yīng)。

結(jié)果和討論：肝細(xì)胞

通過化合物CDE組合而非通過單獨(dú)的化合物或它們的硫類似物導(dǎo)致的FOXO磷酸化的肝細(xì)胞-特異性和PDK1/AKT-非依賴性上調(diào)

正如IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞的情況，硒化合物(在該情況下為CDE組合)提高M(jìn)T活性和調(diào)節(jié)在細(xì)胞能量中控制的關(guān)鍵基因的表達(dá)(UCP2)的觀察結(jié)果提示我們研究該硒化合物的組合對參與肝能量代謝、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖的其它關(guān)鍵基因可能具有的作用。因此，對CDE-處理的AML-12細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

如之前所述，F(xiàn)OXO是在肝中糖原異生和胰島素敏感性的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。已經(jīng)論述了FOXO蛋白的功能受它們的磷酸化狀態(tài)支配。FOXO磷酸化將它們從核中排除，從而基本上失活它們。去磷酸化允許FOXO蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而它們可參與涉及能量代謝的幾種關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。如圖15A所示，發(fā)現(xiàn)在AML-12細(xì)胞中在CDE而非HIJ處理6hr后，F(xiàn)OXO3和4 (pFOXO3和pFOXO4蛋白水平)的磷酸化形式顯著地升高。定量分析表明在CDE-處理的AML-12細(xì)胞中，pFOXO3增加約2.5倍和pFOXO4增加約3.2倍(圖15B-C)。因?yàn)镕OXO磷酸化導(dǎo)致核排除，以在細(xì)胞核中失活FOXO，我們的結(jié)果表明CDE將在肝細(xì)胞中起到FOXO失活劑的作用。因?yàn)樵谕瑫r(shí)和相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的分析中FOXO磷酸化增加未在CDE-處理的IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中觀察到(見上圖13)，我們可得出結(jié)論，CDE使FOXO失活是肝細(xì)胞特異性的。

總之，我們的結(jié)果表明，CDE組合將起到新的肝細(xì)胞特異性FOXO失活劑的作用。事實(shí)上，在IMR-32神經(jīng)元細(xì)胞中，F(xiàn)OXO蛋白的顯著和高度顯著的活化(去磷酸化)在響應(yīng)單一硒化合物C、D和E或其組合時(shí)發(fā)生。因此，在這些特定化合物的情況下我們能夠在神經(jīng)元細(xì)胞中選擇性活化FOXO蛋白和在肝細(xì)胞中將它們失活。當(dāng)在2型糖尿病和阿爾茨海默病的葡萄糖處理的情況下考慮它時(shí)，這一發(fā)現(xiàn)的總體重要性和新穎性變得顯而易見。

作為簡單的背景，在其活化或非磷酸化狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)OXO位于細(xì)胞核中，其中它結(jié)合葡萄糖6-磷酸酶的啟動(dòng)子區(qū)，F(xiàn)OXO連同其它因子例如PGC-1a，增加葡萄糖-6-磷酸酶的轉(zhuǎn)錄，從而增加葡萄糖產(chǎn)生速率。葡萄糖6-磷酸酶催化糖原異生和糖原分解中的最后一步，導(dǎo)致從肝釋放葡萄糖。因此，在控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)中，特別是在糖尿病受試者中，這是至關(guān)重要的。正常地，F(xiàn)OXO磷酸化的過程受稱為AKT (蛋白激酶B)的另一種激酶直接控制。AKT將FOXO磷酸化和驅(qū)動(dòng)它離開細(xì)胞核，從而通過降低葡萄糖6-磷酸酶轉(zhuǎn)錄速率來降低葡萄糖產(chǎn)生。AKT本身在通過小分子級聯(lián)反應(yīng)的下游控制下，其始于胰島素結(jié)合其在細(xì)胞表面的受體。這起始一系列事件，包括兩種其它激酶，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸肌醇-依賴性蛋白激酶1 (PDK1)。整個(gè)途徑被稱為胰島素/PI3K/PDK1/Akt途徑，其具有通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用。在FOXO控制的情況下，PDK1使Akt磷酸化和活化，其進(jìn)而使FOXO磷酸化和失活。

因?yàn)閷τ诟沃幸葝u素介導(dǎo)的葡萄糖產(chǎn)生控制，PI3K/PDK1/AKT是FOXO上游的主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，我們質(zhì)疑通過CDE提高的FOXO磷酸化是否歸因于肝細(xì)胞中PI3K/Pdk/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化。為測試這一點(diǎn)，我們檢查了在CDE-處理的肝細(xì)胞中pPDK1、pAKT T308和S473和總AKT的蛋白水平。令人驚訝的是，CDE不影響PDK1、AKT的磷酸化或總AKT水平(圖15A)。我們還檢查了兩種其它下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子pGSk3a和pGSK3b的水平，它們直接受AKT控制，并且未觀察到它們蛋白水平的任何變化(圖15A)，這與在CDE-處理的細(xì)胞中pAKT未變化一致。對于胰島素驅(qū)動(dòng)的蛋白合成或翻譯是關(guān)鍵的p4Ebp (AKT/mTor信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游分子靶標(biāo))和pElf2be S539 (Gsk3的下游分子靶標(biāo))的水平也未受到影響(圖15A)。這提供了另外的直接分子證據(jù)，即CDE在影響肝細(xì)胞增殖/存活方面不具有毒性作用，如先前所述。

如在神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞的情況下所述的，PGC1a是MT生物發(fā)生和糖代謝的重要基因。在肝細(xì)胞中，其還與FOXO一致起作用以驅(qū)動(dòng)參與糖原異生的基因的轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞核缺少FOXO時(shí)不能如此。在CDE組合處理后通過定量分析，我們檢查了PGC1a蛋白表達(dá)和未觀察到肝細(xì)胞中PGC蛋白水平的顯著變化(圖15A和D)。然而，由于在響應(yīng)CDE時(shí)對FOXO磷酸化觀察到的穩(wěn)健作用，幾乎確定的是，它將從細(xì)胞核中排除，因此PGC1a的水平變得不太重要，這是因?yàn)樾枰狥OXO以起始糖原異生過程?？傊@些結(jié)果表明，CDE不影響PI3k/PDK1/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和幾種其它AKT直接或間接下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，除了上述關(guān)鍵FOXO之外。換句話說，在肝細(xì)胞中CDE可選擇性失活FOXO，并且該作用顯示不依賴于PI3K/PDK1/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

因此，在本質(zhì)上，CDE在肝細(xì)胞中的作用模式可完全不依賴于胰島素-驅(qū)動(dòng)的PI3k/PDK1/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即它可以是胰島素-非依賴性的。其重要性對代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的領(lǐng)域的技術(shù)人員直接變得顯而易見，因?yàn)樵诳刂聘纹咸烟禽敵龅那闆r下它減少了肝細(xì)胞變成具有胰島素-抵抗的生理學(xué)后果。通過FOXO調(diào)節(jié)，繞過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)仍能夠控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)，大體上開啟了對于治療糖尿病的許多治療可能性；使得其較不依賴于外源胰島素的給予。

此外，從更寬泛的健康前景來看，找到在肝中潛在的AKT-非依賴性FOXO抑制劑的重要性不應(yīng)被低估。充分確定了PI3k/PDK1/AKT途徑是促進(jìn)細(xì)胞生長的原型途徑和在許多癌癥中具有組成型活性。AKT當(dāng)活化時(shí)，通過FOXO失活，在不同的細(xì)胞過程中 – 不僅是葡萄糖穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這些其它途徑中癌癥進(jìn)展是主要的。在這方面，有興趣的是注意到，在轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒AKT8中AKT初始被鑒定為癌基因。因此，可發(fā)揮AKT關(guān)鍵作用但以AKT-非依賴性方式如此的任何化合物，是非常新穎和有價(jià)值的。

再次，為了完成我們對化合物特異性的研究，我們希望確定CDE中的單一化合物是否具有在肝細(xì)胞中失活FOXO的能力，AML-12細(xì)胞用單獨(dú)的化合物在相同的實(shí)驗(yàn)條件下處理。蛋白質(zhì)印跡分析表明，在單獨(dú)的化合物-處理的肝細(xì)胞中在6或24 hr處理后未觀察到FOXO的失活(通過pFOXO增加指示)(圖16)。我們還檢查了許多其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，未發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中在用C、D或E處理6或24 hr后AKT、Gsk3a/b和Elf2be的磷酸化增加(圖16)。觀察到的唯一作用涉及到化合物E，其顯示在AML-12細(xì)胞中在6 hr處理后略微降低pAKT和pElf2bε S539的水平(圖16)。然而，化合物E對AKT的作用必定是不重要的，因?yàn)檫@并未通過化合物E-介導(dǎo)的FOXO(AKT的直接下游靶標(biāo))磷酸化降低反映。因此，這未表明E-處理的細(xì)胞中潛在的糖原異生的顯著改變。EIF2bε的去磷酸化可指示mRNA/蛋白翻譯水平增加，但這尚未充分研究。然而，清楚的是，通過這三種硒化合物的任一種，這些蛋白質(zhì)印跡中測試的種類的蛋白表達(dá)未改變(圖16)。無論如何，我們的結(jié)果表明，單獨(dú)的硒化合物C、D或E不增加肝細(xì)胞中的FOXO磷酸化。因此，在C、D和E化合物之間存在協(xié)同作用以在肝細(xì)胞中失活FOXO。

總之，我們的結(jié)果表明CDE而非單獨(dú)的化合物將起肝細(xì)胞特異性和PI3K/PDK/AKT-非依賴性FOXO失活劑的作用。

在AML-12細(xì)胞中在用化合物CDE硒化合物處理后下調(diào)G6pc (一種葡萄糖產(chǎn)生的FOXO下游靶標(biāo))的表達(dá)

如上述的，葡萄糖6-磷酸酶催化亞基(G6PC)是FOXO的直接下游靶標(biāo)，其提高葡萄糖產(chǎn)生，特別是在肝中。在CDE-處理的肝細(xì)胞中pFOXO (失活)水平提高表明CDE可在肝細(xì)胞中起控制葡萄糖產(chǎn)生和提高胰島素敏感性的作用。硒化合物組合CDE可通過FOXO磷酸化調(diào)節(jié)糖原異生或糖原分解的真實(shí)證據(jù)，是觀察到在肝環(huán)境中G6PC表達(dá)降低。為測試該假設(shè)，我們通過定量RT-PCR分析，檢查了肝細(xì)胞中的G6pc表達(dá)。

如圖17所示，用CDE組合而非HIJ硫類似物組合處理AML-12肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞中G6pc表達(dá)的非常顯著的45%降低。此外，我們還檢查了在用所有單獨(dú)的化合物處理后AML-12細(xì)胞中的G6pc表達(dá)和未觀察到G6pc表達(dá)的任何顯著改變(增加或降低) (圖17)；該發(fā)現(xiàn)與在化合物C-、D-或E-處理的肝細(xì)胞中觀察到的未改變的FOXO磷酸化水平一致，如通過蛋白質(zhì)印跡分析測定的(圖16)。在使用不同批次的細(xì)胞的三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中觀察到在響應(yīng)CDE組合時(shí)G6pc表達(dá)降低的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

總之，我們的結(jié)果證實(shí)CDE而非單獨(dú)的化合物可顯著地削弱G6pc表達(dá)，從而代表了一種降低肝葡萄糖輸出的新方式。我們的總體發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步指向這些化合物通過FOXO磷酸化的AKT-非依賴性增加介導(dǎo)的作用方式。這些數(shù)據(jù)提供強(qiáng)的體外證據(jù)，即在肥胖和2型糖尿病受試者中在控制肝葡萄糖輸出的治療能力上CDE具有顯著潛力。

總體概述和討論

我們已經(jīng)確定了化合物C而非D提高腎細(xì)胞中的MT電位，并且化合物C和D兩者提高小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞中的MT電位。這些結(jié)果表明化合物C可用于對抗進(jìn)行性腎衰竭，和C和D可用于對抗在腎或骨骼肌中MT功能的進(jìn)行性喪失導(dǎo)致的肌肉減少癥(sarcopenia)。在骨骼肌的情況下，鑒于骨骼肌利用每日攝取的葡萄糖的75-80%和骨骼肌中的線粒體功能障礙被認(rèn)為是T2DM的關(guān)鍵引發(fā)劑，我們還預(yù)期C和D可能用于T2DM研究和控制領(lǐng)域。

此外，我們使用人神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，這些化合物之一(特別是化合物C)可獨(dú)特地對抗AD發(fā)病。該結(jié)論基于以下重要發(fā)現(xiàn)：

(1) C短暫提高M(jìn)T電位(圖3)

(2) 化合物C提高神經(jīng)元細(xì)胞存活(圖5)

(3) 神經(jīng)元細(xì)胞-特異性下調(diào)FOXO磷酸化(對細(xì)胞代謝重要)和上調(diào)PGC1a (對MT生物發(fā)生重要) (圖14與圖16的肝細(xì)胞數(shù)據(jù))；

(4) 對于APP切割，選擇性靶向γ-分泌酶復(fù)合物基因PSEN和Nicastrin以抑制它們的表達(dá)(圖11)；

(5) 抑制Tau磷酸化可能對抗AD中的纏結(jié)形成(圖12)；和

(6) 神經(jīng)元細(xì)胞-特異性GSK3b下調(diào)，其再次表明在AD情況下降低Tau磷酸化可能性和減少纏結(jié)形成(圖12與圖16的肝細(xì)胞數(shù)據(jù))。

我們已經(jīng)鑒定了新的肝細(xì)胞特異性和PI3K/PDK1/AKT-非依賴性FOXO失活化合物組合(CDE) (即，CDE的組合，而非單獨(dú)的化合物)。該化合物組合在肝細(xì)胞中通過核排除FOXO蛋白而顯著下調(diào)G6pc表達(dá)。我們預(yù)期該組合可特別用于研究和改善自代謝綜合征、肥胖和T2DM產(chǎn)生的癥狀和病理。我們的理由基于以下發(fā)現(xiàn)：

(1) 在肝細(xì)胞中通過僅CDE組合，而非任何其它化合物或它們的組合顯著地提高M(jìn)T電位(圖7)；

(2) 對肝細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞的存活沒有毒性作用(圖5、圖9)

(3) 通過CDE特異性地和顯著地下調(diào)解偶聯(lián)蛋白2 (Ucp2)基因(圖8)；在這一點(diǎn)上特別注意的是從最新研究中的發(fā)現(xiàn)，即UCP2表達(dá)的抑制通過影響胰島素分泌和作用兩者逆轉(zhuǎn)膳食-誘導(dǎo)的糖尿病。

(4) 通過CDE導(dǎo)致肝細(xì)胞特異性FOXO被失活(磷酸化) (圖15與圖13的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)據(jù))；

(5) 注意到通過單獨(dú)的化合物對FOXO失活沒有作用(圖16)

(6) 注意到通過CDE對PI3K/PDK/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化沒有作用(圖15)。這表明CDE代表了新的AKT-非依賴性FOXO失活劑。

(7) 通過CDE(圖17)而非通過任何單獨(dú)的化合物(圖17)顯著下調(diào)關(guān)鍵的FOXO靶基因G6pc。之前論述了肝葡萄糖輸出受FOXO-介導(dǎo)的G6pc轉(zhuǎn)錄活化的控制。

基于以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為CDE組合可特異性用作在肝細(xì)胞中的有效的FOXO失活劑以降低G6pc表達(dá)和降低肝葡萄糖輸出。此外，我們證明該作用不依賴于PI3K/PDK/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。該過程可如何起作用的描述顯示在圖18中。盡管，正常地，F(xiàn)OXO磷酸化和其隨后進(jìn)入細(xì)胞核或從細(xì)胞核排除受胰島素/PI3K/PDK1/AKT途徑控制，我們證明了化合物C、D和E的特定組合通過仍未鑒定的激酶導(dǎo)致FOXO磷酸化。從細(xì)胞核排除的磷酸化FOXO不能在轉(zhuǎn)錄上活化G6PC，其進(jìn)而導(dǎo)致從肝的葡萄糖輸出降低。肝葡萄糖輸出降低和血糖濃度相關(guān)降低將導(dǎo)致胰島素-節(jié)約作用，即在響應(yīng)高血糖時(shí)對胰腺分泌胰島素的需求減少。

還非常合理的預(yù)期，較低水平的血糖可導(dǎo)致外周組織中胰島素敏感性提高和更受控制的通過胰腺β-細(xì)胞的胰島素釋放兩者。這就是說，通過胰腺的胰島素輸出將不大可能被過載，這是由于總體上較低的循環(huán)葡萄糖水平。從本申請進(jìn)行和提供的實(shí)驗(yàn)，我們不能鑒定對測試的所有細(xì)胞類型的生長或途徑活化(可發(fā)信號啟動(dòng)不受控制的增殖和生長，即導(dǎo)致癌癥)的任何負(fù)面作用。事實(shí)上，從毒性潛力降低的觀點(diǎn)來看，這些化合物繞過AKT-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(至少在肝中)的能力使得它們特別引人關(guān)注。

基于上文提供的發(fā)現(xiàn)，我們還認(rèn)為，我們可假設(shè)對于特別是化合物C對改善AD病理(淀粉樣蛋白斑塊和Tau纏結(jié))的影響的作用的可信模型。如圖19A–C所示，在IMR-32細(xì)胞中表達(dá)降低或改變的關(guān)鍵AD相關(guān)基因，在它們的基因啟動(dòng)子區(qū)具有FOXO 1、3或4的結(jié)合基序(位點(diǎn))。對于Gsk3b (圖19A)、Psen1(圖19B)和Nicastrin (圖19C)，這是真實(shí)的。這意味著核定位的FOXO蛋白可結(jié)合這些基因啟動(dòng)子和負(fù)調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。認(rèn)識到這一點(diǎn)后，因此非常容易地想象這樣的情況(圖19D)，其中化合物C使FOXO蛋白去磷酸化和允許它們進(jìn)入細(xì)胞核。此處，有活性的FOXO蛋白結(jié)合上述基因的啟動(dòng)子區(qū)和抑制它們的轉(zhuǎn)錄。IMR細(xì)胞中較低水平的GSK3b (圖12)將導(dǎo)致Tau磷酸化降低，接著作為直接結(jié)果，降低微管穩(wěn)定性和降低纏結(jié)形成。

同樣，F(xiàn)OXO蛋白結(jié)合PSEN和Nicastrin的啟動(dòng)子區(qū)抑制從這些基因的轉(zhuǎn)錄，這導(dǎo)致在神經(jīng)元細(xì)胞中產(chǎn)生較低量的這些關(guān)鍵的γ-分泌酶組分。這自然暗指較低水平的異常APP加工、較低的淀粉樣蛋白-β肽濃度和降低的淀粉樣蛋白斑塊負(fù)荷，作為結(jié)果。

本申請中提及的所有出版物和專利通過引用結(jié)合到本文中。在沒有脫離本申請的范圍和精神的情況下，本申請的所述方法和組合物的各種修改和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管已經(jīng)結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本申請，但應(yīng)理解，要求保護(hù)的本申請不應(yīng)過度限于這樣的特定實(shí)施方案。事實(shí)上，對相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的所述實(shí)施本申請的方式的各種修改意欲包括在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。