本發(fā)明涉及包含糖鏈-多肽復合物的止血用藥物組合物。
背景技術：
：生物凝膠例如水凝膠和血纖蛋白膠被用作用于三維培養(yǎng)等的研究基質(zhì)、外科基質(zhì)例如手術期間/手術后止血劑或傷口愈合片材、藥物遞送系統(tǒng)(DDS)等。然而，因為這些生物凝膠中許多使用生物來源的材料，隨其使用而存在風險，例如來自微生物例如病毒的感染、免疫原性和疾病傳播。例如，盡管血纖蛋白膠作為手術期間的止血劑而具有高的效用價值，但因為來源材料源自于人血，在實際使用時在患者手術期間已存在被已污染了血纖蛋白膠的肝炎病毒感染的多個病例，從而引起重大的社會問題。還存在用生物來源的生物凝膠不能總是提供均質(zhì)品質(zhì)的凝膠的問題。與生物來源的生物凝膠相比，通過化學合成生產(chǎn)的生物凝膠已知沒有感染風險和能夠提供均質(zhì)品質(zhì)的凝膠(專利文獻1)。然而，迄今為止已知的生物凝膠要求例如當形成凝膠時緩沖液交換或置換和混合多種試劑等程序，操作復雜。此外，不僅因為根據(jù)pH范圍導致溶解度低，組合使用的試劑或溶劑受到限制，而且還存在問題，例如可施用部位(受累部位)受限和在使用時注射器或管阻塞。此外，低溶解度(即，不透明的)，特別是在接近于生物pH的中性范圍內(nèi)，在要求可見的情況(例如手術視野)下會使利用復雜化。引用文獻列表[專利文獻1]美國專利號5670483。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的是提供止血用藥物組合物，其與利用常規(guī)生物凝膠的止血劑相比具有更高的可用性，并可在寬pH內(nèi)形成透明的和均質(zhì)的水凝膠。解決問題的手段作為本發(fā)明人為解決所述問題而廣泛研究的結果，不僅令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過結合糖鏈與包含極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列的多肽生產(chǎn)的糖鏈-多肽復合物顯示高的水溶性，并在寬pH范圍內(nèi)，特別是在中性范圍內(nèi)形成透明的和均質(zhì)的水凝膠，而且還發(fā)現(xiàn)，該水凝膠作為止血劑極為有用，從而導致本發(fā)明的完成。換句話說，本發(fā)明提供包含糖鏈-多肽復合物的止血用藥物組合物，其特征在于，所述糖鏈-多肽復合物中的所述多肽是包含極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列的多肽，且一條或多條糖鏈與所述多肽結合。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，所述糖鏈-多肽復合物中的所述多肽是包含由8-34個氨基酸殘基組成的極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列的多肽。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，所述糖鏈-多肽復合物可通過在具有大約中性pH的水性溶液中自組裝而形成包含β片結構的水凝膠。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，在所述止血用藥物組合物中包含的所述糖鏈-多肽復合物的濃度是0.1%重量-20%重量。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，在與所述多肽結合的一條或多條糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量是5以上。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，與所述多肽結合的糖鏈數(shù)是1、2或3。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，糖鏈與自位于所述多肽的N末端的氨基酸殘基計數(shù)直至x位的每個氨基酸和自位于C末端的氨基酸殘基計數(shù)直至y位的每個氨基酸結合(其中x和y是整數(shù)，x≥0，y≥0，且x+y是與多肽結合的糖鏈的總數(shù)量)。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，所述糖鏈是具有支鏈的糖鏈。此外，本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，所述藥物組合物呈水凝膠狀態(tài)。本領域技術人員應認識到，上述本發(fā)明的一個或多個特征的任何組合的發(fā)明也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。發(fā)明效果因為本發(fā)明的止血用藥物組合物在寬pH范圍(包括中性范圍)內(nèi)具有高的水溶性和形成均勻的和透明的水凝膠，因此較少限制組合使用的試劑或溶劑，和可用作具有高的可用性的止血劑。此外，因為其可在寬pH范圍內(nèi)使用，因此較少限制可施用的部位(受累部位)。此外，因為本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物在寬pH范圍內(nèi)(包括中性范圍)具有高的水溶性和形成均勻的和透明的水凝膠，溶膠和凝膠狀態(tài)可以在中性pH下可逆存在。換句話說，糖鏈-多肽復合物可一度形成凝膠狀態(tài)，然后通過機械攪拌呈溶膠狀態(tài)，并且再次仍呈凝膠狀態(tài)。因此，其可以凝膠狀態(tài)分配(即，即用型狀態(tài))和不需要如其它肽凝膠那樣的復雜操作，例如在適合于膠凝的pH(例如酸性pH)下形成凝膠后進行緩沖液交換(或置換)以實現(xiàn)中性pH。換句話說，本發(fā)明的糖鏈-多肽復合物在操作性方面非常優(yōu)于其它肽凝膠。此外，因為本發(fā)明的止血用藥物組合物可使用的pH范圍寬，所以較少發(fā)生在使用時注射器和管的阻塞等問題。此外，因為本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物被動物體內(nèi)存在的糖鏈修飾，所以與沒有任何修飾的肽相比抗原性降低。此外，本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物幾乎沒有產(chǎn)生毒性的風險，例如用例如聚乙二醇(PEG)修飾的化合物所見到的風險。因此，本發(fā)明的止血用藥物組合物對于生物應用具有高安全性。此外，因為本發(fā)明的止血用藥物組合物在生理條件下(中性范圍)形成均勻的和透明的水凝膠和具有低的抗原性，所以作為用于體內(nèi)動物應用的水凝膠是優(yōu)選的。附圖說明圖1顯示對溶于超純水、鹽水或磷酸鹽緩沖液的C(DiGlcNAc)-(RADA)4的各組合物進行圓二色性(CD)測量的結果。圖2顯示對溶于超純水、鹽水或磷酸鹽緩沖液的(RADA)4的各組合物進行圓二色性(CD)測量的結果。圖3是C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4形成纖維結構的能力的比較。圖4顯示C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4在水性溶液狀態(tài)中的貯存彈性模量。圖5顯示加入鹽之后C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4的貯存彈性模量。圖6顯示當C(DiGlcNAc)-(RADA)4或(RADA)4施用于大鼠肝穿刺模型時，在施用后3分鐘時止血效果評分的分布。具體實施方式本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物可具有生物來源或可通過化學合成產(chǎn)生，但在安全穩(wěn)定性或糖鏈的品質(zhì)和均勻性方面優(yōu)選地通過化學合成產(chǎn)生。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物可例如在水性溶液中通過相互作用(例如肽分子之間的靜電相互作用、氫鍵合和疏水相互作用)而自裝配。本文使用的糖鏈-多肽復合物在水性溶液中"自裝配"意指多肽彼此通過某種相互作用(例如靜電相互作用、氫鍵合、范德華力和疏水相互作用)在水性溶液中自發(fā)裝配，不應解釋為具有限制性含義。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物可在水性溶液中自裝配和形成β片結構。此外，水凝膠可通過所述β片結構多次成層而形成。用于證實糖鏈-多肽復合物在水性溶液中形成β片結構的方法不特別受到限制，其可通過例如測量包含糖鏈-多肽復合物的水性溶液的圓二色性(CD)得到證實。因為一般而言作為具有β片結構的分子的特征，在197nm附近波長見到最大值，和在216nm附近波長見到最小值，所以β片結構形成可通過圓二色性測量驗證在這些波長附近的峰而得到證實。因為本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物包含極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列，因此當在水性溶液中形成β片結構時，僅極性氨基酸殘基可排列在β片結構的一側上，而僅非極性氨基酸殘基可排列在另一側上。因此，所述β片結構可以將疏水側(僅具有非極性氨基酸殘基排列的一側)隱藏的方式裝配，以形成雙層結構。隨后，該β片層化結構將隨分子自組裝進行而延伸，因此可形成三維構象(例如，水凝膠)。本文使用的"大約中性的pH"意指pH在7.0附近，更特別是pH在5.0-9.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選地pH在6.0-8.0的范圍內(nèi)。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物的濃度可由本領域技術人員根據(jù)可適用的癥狀或可施用的部位而適當?shù)卣{(diào)整，例如可以是0.1%重量-20%重量，優(yōu)選地0.2%重量-15%重量，和進一步優(yōu)選地是0.5%重量-10%重量。當止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物的濃度是0.1%重量以下時，存在將不適當?shù)匦纬伤z的可能性。注意，本文的水凝膠廣義上是指分散介質(zhì)主要是水的凝膠或溶膠組合物，不應解釋為具有限制性含義。本發(fā)明的止血用藥物組合物可以水性溶液狀態(tài)或水凝膠狀態(tài)使用。用于制備所述水性溶液或所述水凝膠的方法不受到限制。例如，呈水性溶液狀態(tài)的止血用藥物組合物可通過將糖鏈-多肽復合物溶于超純水而獲得，或呈水凝膠狀態(tài)的止血用藥物組合物可通過進一步加入包含鹽的溶劑(例如生理鹽水、PBS等)至溶于超純水的糖鏈-多肽復合物的水性溶液中而獲得。此外，止血用藥物組合物不限于僅包含糖鏈-多肽復合物和溶劑(水、PBS、生理鹽水等)的那些，可包含各種其它組分。例如，通過包含具有消毒/滅菌組分的試劑，不僅可停止自傷口出血，而且還可同時進行傷口的消毒/滅菌。如本說明書的實施例中所示，本發(fā)明的止血用藥物組合物在水性溶液狀態(tài)下具有低的貯存彈性模量和在水凝膠狀態(tài)下具有高的貯存彈性模量。此外，本發(fā)明的止血用藥物組合物在包括中性范圍的寬pH范圍內(nèi)形成具有均勻的纖維結構的澄清的水凝膠。本發(fā)明的止血用藥物組合物的可適用的癥狀或可施用的部位不特別受到限制，根據(jù)上述性質(zhì)，可優(yōu)選地特別用于當目視確認例如手術期間受累部位的狀態(tài)有必要時的止血、盲點的出血部位的止血、寬出血部位的止血、立體或復雜形狀的出血部位的止血等。本發(fā)明的一個實施方案的特征在于，止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物可在具有大約中性的pH的水性溶液中自裝配以形成包含β片結構的水凝膠。甚至在具有并非大約中性的pH的水性溶液中可自裝配以形成包含β片結構的水凝膠的那些并未排除在外，只要它們具有所述特征。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物包含含有極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列的多肽。所述氨基酸序列的長度不受限制，優(yōu)選地其可為由8-34個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，更優(yōu)選地為由12-25個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，和進一步優(yōu)選地為由16-21個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物包含含有極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列的多肽。本文使用的"氨基酸"以其最廣泛的含義使用，不僅包含構成蛋白質(zhì)的氨基酸，而且包含非構成蛋白質(zhì)的氨基酸，例如氨基酸變體和衍生物。本領域技術人員應認識到，根據(jù)該廣泛的定義，本文的氨基酸的實例包括構成蛋白質(zhì)的L-氨基酸；D-氨基酸；化學修飾的氨基酸，例如氨基酸變體和衍生物；非構成蛋白質(zhì)的氨基酸，例如正亮氨酸、β-丙氨酸和鳥氨酸；以及化學合成的具有本領域眾所周知的氨基酸特有的性質(zhì)的化合物。非構成蛋白質(zhì)的氨基酸的實例包括α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸(例如2-氨基組氨酸、β-羥基組氨酸、同型組氨酸、α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸)、在側鏈上具有過量亞甲基的氨基酸("同型"氨基酸)和在側鏈上羧酸官能團氨基酸被磺酸基團取代的氨基酸(例如磺基丙氨酸)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，本文使用的氨基酸可以是構成蛋白質(zhì)的氨基酸。本文使用的極性氨基酸殘基不特別受到限制，只要它是側鏈可具有極性的氨基酸殘基，其實例包括酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基。本文使用的酸性氨基酸殘基的實例包括天冬氨酸(Asp:D)殘基和谷氨酸(Glu:E)，和堿性氨基酸的實例包括精氨酸(Arg:R)、賴氨酸(Lys:K)和組氨酸(His:H)。注意，例如本文使用的描述例如"天冬氨酸(Asp:D)"意指，三字母描述"Asp"和單字母描述"D"可用作天冬氨酸的縮寫。此外，在本說明書中，在中性氨基酸殘基中，包含羥基、酰胺基、硫醇基等的氨基酸殘基包括在極性氨基酸殘基內(nèi)，因為它們具有極性。例如，在本說明書中，酪氨酸(Tyr:Y)、絲氨酸(Ser:S)、蘇氨酸(Thr:T)、天冬酰胺(Asn:N)、谷氨酰胺(Gln:Q)和半胱氨酸(Cys:C)包括在極性氨基酸殘基內(nèi)。本文使用的非極性氨基酸殘基不特別受到限制，只要它是側鏈不具有極性的氨基酸，其實例包括丙氨酸(Ala:A)、纈氨酸(Val:V)、亮氨酸(Leu:L)、異亮氨酸(Ile:I)、甲硫氨酸(Met:M)、苯丙氨酸(Phe:F)、色氨酸(Trp:W)、甘氨酸(Gly:G)和脯氨酸(Pro:P)。本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物中，"極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列"優(yōu)選地為其中所述氨基酸序列可以是重復序列"RADA"(2-8個重復，優(yōu)選地3-6個重復)的那些序列，和更優(yōu)選地其中所述氨基酸序列可為RADARADARADARADA(SEQIDNO.1)或RADARADARADARADARADA(SEQIDNO.2)的那些序列。本文使用的"糖鏈"是指由一個或多個單位糖(單糖和/或其衍生物)的串構成的化合物。當其是二個單位糖的串時，各單位糖通過脫水縮合經(jīng)由糖苷鍵彼此結合。這樣的糖鏈的實例包括但不限于一個寬范圍，例如體內(nèi)包含的單糖和多糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和其復合物和衍生物)以及從復雜生物分子(例如降解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖和糖脂)降解或誘導的糖鏈。糖鏈可以是線性的或支鏈的。本文使用的"糖鏈"還包括糖鏈衍生物。糖鏈衍生物的實例包括但不限于構成糖鏈的糖是例如下述糖的糖鏈：具有羧基的糖(例如，醛糖酸，其中C-1位置被氧化以變成羧酸(例如D-葡糖酸，其為氧化的D-葡萄糖)和糖醛酸，其中末端C原子變成羧酸(D-葡糖醛酸，其是氧化的D-葡萄糖))、具有氨基或氨基衍生物的糖(例如D-葡糖胺和D-半乳糖胺)、具有氨基和羧基兩者的糖(例如N-糖基神經(jīng)氨酸和N-乙酰基胞壁酸)、脫氧化的糖(例如2-脫氧-D-核糖)、包含硫酸基團的硫酸化糖和包含磷酸基團的磷酸化糖。在本發(fā)明的糖鏈-多肽復合物中，與多肽結合的糖鏈不特別受到限制，但關于生物相容性，優(yōu)選地是作為糖綴合物(例如糖肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖和糖脂)體內(nèi)存在的糖鏈。這樣的糖鏈包括N-連接的糖鏈、O-連接的糖鏈等，其是體內(nèi)與肽(或蛋白質(zhì))結合為糖肽(或糖蛋白)的糖鏈。在本發(fā)明的糖鏈-多肽復合物中，例如二唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、diGlcNAc糖鏈、二甘露糖(DiMan)糖鏈、GlcNAc糖鏈、麥芽三糖糖鏈、麥芽糖糖鏈、麥芽四糖糖鏈、麥芽七糖糖鏈、β-環(huán)糊精糖鏈和γ-環(huán)糊精糖鏈可用于與多肽結合的糖鏈。更特別的是，用于本發(fā)明的糖鏈可以是下式(1)所示的二唾液酸糖鏈、下式(2)所示的去唾液酸糖鏈、下式(3)所示的diGlcNAc糖鏈、下式(4)所示的二甘露糖糖鏈、下式(5)所示的GlcNAc糖鏈、下式(6)所示的麥芽三糖糖鏈、下式(7)所示的麥芽糖糖鏈、下式(8)所示的麥芽四糖糖鏈、下式(9)所示的麥芽七糖糖鏈、下式(10)所示的β-環(huán)糊精糖鏈或下式(11)所示的γ-環(huán)糊精糖鏈。[化學式1]式(1)二唾液酸糖鏈[化學式2]式(2)去唾液酸糖鏈[化學式3]式(3)diGlcNAc糖鏈[化學式4]式(4)二甘露糖糖鏈[化學式5]式(5)GlcNAc糖鏈[化學式6]式(6)麥芽三糖糖鏈[化學式7]式(7)麥芽糖糖鏈[化學式8]式(8)麥芽四糖糖鏈[化學式9]式(9)麥芽七糖糖鏈[化學式10]式(10)β-環(huán)糊精糖鏈[化學式11]式(11)γ-環(huán)糊精糖鏈。在本發(fā)明中，也可使用一個或多個糖從上述二唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、diGlcNAc糖鏈、二甘露糖糖鏈或麥芽七糖糖鏈的非還原端丟失的糖鏈。在本發(fā)明中，與糖鏈結合的氨基酸殘基不特別受到限制。例如，糖鏈可與半胱氨酸(Cys:C)或天冬酰胺(Asn:N)結合，優(yōu)選地與半胱氨酸(Cys:C)結合。在本發(fā)明中，用于結合糖鏈至氨基酸的方法不特別受到限制。例如，糖鏈可直接結合至氨基酸殘基，或糖鏈可經(jīng)過接頭結合至氨基酸殘基。此外，在本發(fā)明中，與糖鏈結合的氨基酸殘基可直接結合至"極性和非極性氨基酸殘基交替排列的氨基酸序列"，或可通過例如接頭結合。這樣的接頭的實例可包括在兩端具有氨基和羧基的烷基鏈或PEG鏈，使得其可與氨基酸形成肽鍵。這樣的接頭的實例可包括-NH-(CH2)n-CO-(其中n是整數(shù)和不受到限制，只要其不抑制目的接頭功能，優(yōu)選地1–15的整數(shù))或-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(其中m是整數(shù)和不受到限制，只要其不抑制目的接頭功能，優(yōu)選地1–7的整數(shù))，更特別是-NH-(CH2)11-CO-(C12接頭)或-NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG接頭)等。用于本發(fā)明的糖鏈-多肽復合物可通過將糖基化步驟整合至本領域技術人員眾所周知的多肽合成方法中來制備。盡管利用由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶代表的酶的方法可用于糖基化，但在該情況下存在問題，例如需要加入大量的糖鏈，最后步驟后純化的復雜化，和對可加入的糖基化蛋白質(zhì)和糖鏈的限制。因此，盡管有可能在小規(guī)模合成中使用該方法(例如用于分析)，但不能認為其是用于大規(guī)模生產(chǎn)的實用方法。作為用于本發(fā)明的糖鏈-多肽復合物的容易生產(chǎn)方法的具體實例，將在下文說明：通過使用與糖鏈結合的Asn(糖基化Asn)和應用眾所周知的肽合成方法例如固相和液相合成而用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法(方法A)，和根據(jù)眾所周知的肽合成方法通過生產(chǎn)任意氨基酸殘基是Cys的多肽和然后通過化學合成將Cys糖基化而用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法(方法B)。參考這些生產(chǎn)方法，本領域技術人員將能夠通過各種方法生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物。這些方法A和B也可以兩種以上種組合進行。在用于分析等的小規(guī)模合成的情況下，上述方法可進一步與通過轉(zhuǎn)移酶的糖鏈延伸反應組合使用。方法A描述于國際公開號2004/005330(US2005222382(A1))和方法B描述于國際公開號2005/010053(US2007060543(A1))，其公開內(nèi)容通過引用以其整體結合到本文中。此外，在方法A和B中使用的具有均勻的糖鏈結構的糖鏈的生產(chǎn)見述于例如國際公開號03/008431(US2004181054(A1))、國際公開號2004/058984(US2006228784(A1))、國際公開號2004/058824(US2006009421(A1))、國際公開號2004/070046(US2006205039(A1))和國際公開號2007/011055，其公開內(nèi)容通過引用以其整體結合到本文中。用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法(方法A)如下文所示，糖鏈-多肽復合物可通過例如使用與糖鏈結合的Asn的固相合成生產(chǎn)。(1)氨基氮被親脂保護基保護的氨基酸的羧基與樹脂結合。在該情況下，因為氨基酸的氨基氮被親脂保護基保護，所以防止氨基酸彼此的自縮合，樹脂和氨基酸反應形成鍵。(2)得到的反應物的親脂保護基經(jīng)分離以形成游離的氨基。(3)該游離的氨基和氨基氮受親脂保護基保護的任何氨基酸的羧基進行酰胺化反應。(4)上述親脂保護基經(jīng)分離以形成游離的氨基。(5)上述步驟(3)和(4)重復一次或多次，以得到連接在一起的任何數(shù)量的任何氨基酸的肽，其一端結合了樹脂，另一端具有游離的氨基。(6)當在上述(5)中合成的肽的游離的氨基欲用乙酰基保護時，其也優(yōu)選用乙酸酐、乙酸等乙酰化。(7)最后，用酸切割樹脂，可獲得具有所需氨基酸序列的肽。此處，通過使用氨基氮用親脂保護基保護的糖基化Asn代替氨基氮用親脂保護基保護的氨基酸，和使所述天冬酰胺部分的羧基與(1)中的樹脂的羥基反應，可獲得在C末端具有糖基化Asn的肽。此外，在(2)之后，或在重復(3)和(4)任何次數(shù)(一次或多次)之后，在(3)中通過使用氨基氮用親脂保護基保護的糖基化Asn代替氨基氮用親脂保護基保護的氨基酸，可在多肽的任何位置結合糖鏈。以這種方式，在步驟(1)和(3)的任一者中通過使用氨基氮用親脂保護基保護的糖基化Asn代替氨基氮用親脂保護基保護的氨基酸兩次以上，可在多肽的任何兩個以上位置結合糖鏈。如果在結合糖基化Asn后，親脂保護基經(jīng)分離和形成游離的氨基，和步驟(7)緊接其后進行，則可獲得在N末端具有糖基化Asn的多肽。提供C末端為酰胺基的樹脂可以是通常用于固相合成的樹脂。例如，優(yōu)選使用Rink-Amide-樹脂(獲自Merck&Co.,Inc.)、Rink-Amide-PEGA樹脂(獲自Merck&Co.,Inc.)或NH-SAL-樹脂(獲自WatanabeChemicalIndustries,Ltd.)，其用氨基官能化。此外，F(xiàn)moc-NH-SAL-樹脂-接頭(獲自WatanabeChemicalIndustries,Ltd.)等可結合用氨基官能化的氨基-PEGA-樹脂(獲自Merck&Co.,Inc.)等。肽的C末端氨基酸可通過用酸切割該樹脂和肽而酰胺化。此外，可使用的使C末端為羧酸的樹脂的實例為用氯官能化的2-氯三甲苯基氯化物樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)、用氨基官能化的氨基-PEGA樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)、具有羥基的NovaSynTGT醇樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)、Wang樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)、HMPA-PEGA樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)等。此外，接頭可存在于氨基-PEGA樹脂和氨基酸之間，這樣的接頭的實例可包括4-羥基甲基苯氧乙酸(HMPA)、4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。也可使用C末端氨基酸與樹脂提前結合的H-Cys(Trt)-TritylNovaPEG樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)等。關于樹脂和氨基氮用親脂保護基保護的氨基酸之間的結合，例如為了使用具有羥基的樹脂或用氯官能化的樹脂，氨基酸的羧基與樹脂進行酯結合。此外，當使用用氨基官能化的樹脂時，氨基酸的羧基通過酰胺鍵與樹脂結合。注意，2-氯三苯甲基氯化物樹脂是優(yōu)選的，因為當在固相合成中延伸肽鏈時其可防止末端Cys的外消旋作用。用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法-2(方法A)如下所示，糖鏈-多肽復合物可通過例如使用與糖鏈結合的Asn的液相合成來生產(chǎn)。(1)氨基氮用親脂保護基保護的氨基酸的羧基與具有游離的氨基和經(jīng)保護或酰胺化的羧基的氨基酸結合。(2)獲得的反應物的親脂保護基經(jīng)分離以形成游離的氨基。(3)該游離的氨基和氨基氮用親脂保護基保護的任何氨基酸的羧基在溶液中進行酰胺化反應。在該情況下，因為氨基酸在N末端側上的氨基氮用親脂保護基保護，和在C末端側上的羧基被保護或酰胺化，因此防止了氨基酸彼此的自縮合，游離的氨基和羧基反應形成鍵。(4)上述親脂保護基經(jīng)分離以形成游離的氨基。(5)上述步驟(3)和(4)重復一次或多次，以得到連接在一起的任何數(shù)量的任何氨基酸的肽，其具有被保護或酰胺化的C末端羧基和在N末端具有游離的氨基。(6)當在上述(5)中合成的肽的游離的氨基欲用乙酰基保護時，也優(yōu)選用乙酸酐、乙酸等乙?；?7)最后，側鏈親脂保護基用酸切下，可獲得具有所需氨基酸序列的肽。用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法-3(方法A)如下所示，糖鏈-多肽復合物可通過例如使用與糖鏈結合的Asn的片段合成方法生產(chǎn)。(1)氨基氮用乙?；蛴H脂保護基保護的多肽或糖鏈-多肽復合物在樹脂上通過用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的上述方法(方法A)的(1)-(6)合成。(2)在不使側鏈保護基脫保護的條件下將多肽或糖鏈-多肽復合物從樹脂上切下，以獲得在C末端具有游離的羧基和在N末端具有用乙酰基或親脂保護基保護的氨基氮的多肽或糖鏈-多肽復合物。(3)獲得的氨基氮用乙?；蛴H脂保護基保護的多肽或糖鏈-多肽復合物通過固相或液相合成與樹脂或多肽連接。(4)上述親脂保護基經(jīng)分離以形成游離的氨基。(5)上述步驟(3)和(4)重復一次或多次，以得到連接在一起的任何數(shù)量的任何氨基酸的肽。(6)最后，樹脂用酸切下，可獲得具有所需氨基酸序列的肽。親脂保護基的實例可包括基于碳酸酯或酰胺的保護基等，例如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐基、烯丙基、烯丙基氧基羰基和乙?；?。為了引入親脂保護基至氨基酸，例如引入Fmoc基團，可通過加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯和碳酸氫鈉并允許反應而進行引入。反應可在0-50℃下、優(yōu)選地室溫下進行大約1–5小時。市售可得的那些也可用作用親脂保護基保護的氨基酸，其實例可包括Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH和Fmoc-Pro-OH。此外，具有保護基引入至側鏈的用親脂保護基保護的氨基酸的實例可包括Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH。此外，當需要加入接頭至糖鏈-多肽綴合物的氨基酸序列時，在固相合成過程中接頭可使用用親脂保護基保護的接頭代替上述用親脂保護基保護的氨基酸在優(yōu)選的位置上插入。當使用2-氯三甲苯基氯化物樹脂時，酯化可通過使用堿例如二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶和2,4,6-三甲基吡啶進行。此外，當使用具有羥基的樹脂時，例如，眾所周知的脫水縮合劑例如1-均三甲苯磺?；?3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二異丙基碳二亞胺(DIC)可用作酯化催化劑。氨基酸和脫水縮合劑之間的使用比例是1當量的前者與通常1–10當量、優(yōu)選地2–5當量的后者。酯化反應優(yōu)選地通過例如下述方法進行：將樹脂置于固相柱中，用溶劑洗滌該樹脂和然后加入氨基酸溶液。洗滌溶劑的實例可包括二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。用于溶解氨基酸的溶劑的實例可包括二甲基亞砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應可在0-50℃、優(yōu)選地在室溫下進行約10分鐘-30小時，優(yōu)選地15分鐘-24小時。此時還優(yōu)選通過用乙酸酐等乙?；瘉硌诒喂滔嗌系奈捶磻鶊F。親脂保護基的分離可通過例如用堿處理進行。堿的實例可包括哌啶、嗎啉等。優(yōu)選在溶劑的存在下進行。溶劑的實例可包括DMSO、DMF、甲醇等。游離氨基和氨基氮用親脂保護基保護的任何氨基酸的羧基之間的酰胺化反應優(yōu)選地在活化劑和溶劑的存在下進行?；罨瘎┑膶嵗砂ǘh(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC/HCl)、二苯基磷?；B氮化物(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰基膦酸酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀酰亞胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、羥基鄰苯二甲酰亞胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟膦酸鹽(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-氫二-4-氧雜-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物n-水合物(DMT-MM)等。優(yōu)選的是，對氨基氮用親脂保護基保護的任何氨基酸，使用的活化劑的量是1–20當量，優(yōu)選地1–10當量和進一步優(yōu)選地1–5當量。溶劑的實例可包括DMSO、DMF、二氯甲烷等。反應可在0-50℃、優(yōu)選地室溫下進行約10分鐘-30小時，優(yōu)選地15分鐘-24小時。親脂保護基的分離可類似于上述進行。當引入C末端氨基酸至用氨基官能化的Rink-Amide-樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)、Rink-Amide-PEGA樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)或NH-SAL-樹脂(來自WatanabeChemicalIndustries,Ltd.)或者與NH-SAL-樹脂-接頭結合的氨基-PEGA-樹脂(來自Merck&Co.,Inc.)等時，引入可通過使用上述酰胺化反應進行。優(yōu)選用酸處理以從樹脂切下肽鏈。酸的實例可包括三氟乙酸(TFA)、氟化氫(HF)等。以該方式，可獲得在需要的位置上具有糖基化Asn的糖鏈-多肽復合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，當在用于固相合成的糖基化Asn中糖鏈的非還原端包含唾液酸時，優(yōu)選所述唾液酸的羧基被保護基保護以防止唾液酸被酸處理切下。保護基的實例可包括芐基、烯丙基、二苯甲基、苯甲酰甲基等。用于引入保護基和分離保護基的方法可通過眾所周知的方法進行。用于生產(chǎn)糖鏈-多肽復合物的方法(方法B)糖鏈-多肽復合物也可通過首先合成多肽和然后隨后將合成的多肽糖基化的方法生產(chǎn)。具體而言，通過下述方法生產(chǎn)在欲糖基化的位置上包含Cys的多肽：固相或液相合成方法、通過細胞合成的方法、分離和提取天然存在的那些多肽的方法等。當多肽通過固相或液相合成方法合成時，可按一次一個殘基連接氨基酸，或可連接多肽。不欲糖基化的Cys例如在預定形成二硫鍵的位置上的Cys此時用例如乙酰胺基甲基(Acm)保護。此外，當引入不欲糖基化和不用于形成二硫鍵的Cys至糖鏈-多肽復合物時，可通過在糖基化步驟和二硫鍵形成步驟期間用保護基保護該Cys，和然后將其去保護來引入。這樣的保護基的實例可包括叔丁基(tBu)或4-甲氧基芐基等。此外，當在一個多肽中添加不同的糖鏈至Cys時，不同的糖鏈可如下引入：使用于首先引入糖鏈的Cys未保護，和通過StBu等保護用于接著引入不同糖鏈的Cys。具體而言，當通過固相合成等合成多肽時，使用于引入第一糖鏈的Cys未保護，和用于引入第二糖鏈的Cys為具有Fmoc-Cys(StBu)-OH等保護基的Cys。然后，將糖鏈引入至未保護的Cys，而保護基例如StBu仍保留。通過將StBu基團等去保護，不同的糖鏈然后可引入至未保護的Cys。用于引入第一糖鏈的Cys和用于引入第二糖鏈的Cys可以是一個或多個。StBu基團的去保護可通過與還原劑例如三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)和三丁基膦反應進行。上述反應可通常在0-80℃、優(yōu)選地5-60℃和還優(yōu)選地10-35℃進行。優(yōu)選地，反應時間通常為約30分鐘-5小時。在反應完成時，合適時，這可用眾所周知的方法純化(例如高效液相柱色譜(HPLC))。當引入不同的糖鏈時，優(yōu)選用對在Cys的去保護步驟中的還原條件或在純化步驟例如HPLC中的酸性條件更穩(wěn)定的糖鏈開始引入。具體而言，當引入包含唾液酸的糖鏈時，優(yōu)選首先引入不具有唾液酸的糖鏈或具有較少唾液酸殘基的糖鏈。此外，當需要添加接頭至糖鏈-多肽復合物的氨基酸序列中時，接頭可在固相合成過程中在合成多肽的優(yōu)選位置上插入，例如通過使用用親脂保護基保護的接頭代替用親脂保護基保護的氨基酸。接著，通過使鹵代乙酰化的糖鏈衍生物與包含上述獲得的未保護的Cys反應，糖鏈與未保護的Cys的硫醇基反應和結合至肽。上述反應可在磷酸鹽緩沖液、tris-鹽酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或其混合溶液中通常在0-80℃、優(yōu)選地10-60℃和進一步優(yōu)選地15-35℃進行。反應時間通常為10分鐘-24小時，和優(yōu)選地通常大約30分鐘-5小時。在反應完成時，合適時，這可用眾所周知的方法純化(例如HPLC)。鹵代乙?；奶擎溠苌锏膶嵗秊榕c天冬酰胺連接的糖鏈的1位的碳結合的羥基被-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X置換的化合物(其中X是鹵素原子，和a是整數(shù)并不受到限制，只要其不抑制目的接頭功能，優(yōu)選地為0–4的整數(shù))。具體而言，將鹵代乙?；膹秃衔锾擎溠苌锖桶珻ys的多肽在磷酸鹽緩沖液中在室溫下反應。在反應完成時，具有與糖鏈結合的Cys的糖鏈-多肽復合物可通過用HPLC純化而獲得。反應也可在有機溶劑(例如DMSO、DMF、甲醇和乙腈)與上述緩沖液的混合溶液中進行。在該情況下，有機溶劑可按范圍0-99%(v/v)的比例添加至上述緩沖液。對于對所述緩沖液具有低溶解度的包含未保護的Cys的肽，這是優(yōu)選的，因為加入這樣的有機溶劑可提高針對反應溶液的溶解度。反應也可在有機溶劑例如DMSO、DMF、甲醇和乙腈或其混合溶液中進行。優(yōu)選在堿的存在下進行。堿的實例可包括DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。反應也可在鹽酸胍或尿素添加至所述緩沖液溶液的混合溶液中進行。鹽酸胍或尿素可添加至上述緩沖液，使得終濃度為1M-8M。這是優(yōu)選的，因為添加鹽酸胍或尿素也可提高對所述緩沖液具有低溶解度的肽的溶解度。此外，反應還可通過加入三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)至緩沖液中進行，以防止包含未保護的Cys的多肽通過二硫鍵形成二聚體。TCEP或DTT可添加至緩沖液中，使得終濃度為10μM-10mM。此外，當生產(chǎn)在肽序列中具有多個包含唾液酸的糖鏈(例如二唾液酸或單唾液酸糖鏈)的糖鏈-多肽復合物時，可使用在欲引入的糖鏈上唾液酸的羧基被芐基(Bn)、烯丙基、二苯甲基、苯甲酰甲基等保護的包含唾液酸的糖鏈。當引入唾液酸羧基保護的糖鏈時，將唾液酸保護基去保護的步驟可在下文描述的糖鏈-多肽復合物形成二硫鍵的步驟后進行。以此方式，通過用芐基等保護唾液酸的羧基，將利于在生產(chǎn)步驟中通過HPLC等的分離/純化步驟。保護唾液酸的羧基還將能夠防止對酸敏感的唾液酸的分離。在糖鏈上唾液酸的羧基的保護反應可通過本領域技術人員眾所周知的方法進行。此外，在糖鏈-多肽復合物中，唾液酸的羧基的保護基可通過在堿性條件下水解來去保護。上述反應可通常在0-50℃、優(yōu)選地0-40℃和進一步優(yōu)選地0-30℃進行。優(yōu)選地，反應時間通常為大約5分鐘-5小時。在反應完成時，合適時，在用弱酸例如磷酸或乙酸中和后，這可用眾所周知的方法純化(例如HPLC)。此外，在方法B中，與鹵代乙?；膹秃衔锾擎溠苌锓磻陌被岵惶貏e受到限制，只要它是含硫醇基的氨基酸，和例如D-半胱氨酸(D-Cys)、同型半胱氨酸、去甲半胱氨酸、青霉胺等也可類似于Cys使用。與本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈的類型不特別受到限制，但優(yōu)選的是，與糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量是5以上。例如，可加入一個或多個五糖以上的糖鏈，或可加入多個五糖以下的糖鏈，使得添加至一個糖鏈-多肽復合物的糖鏈上存在的糖殘基的數(shù)量為5以上。當加入多個糖鏈時，與一個肽結合的糖鏈的類型可以是相同的，或可組合結合不同類型的糖鏈，但優(yōu)選它們是相同的。例如，當與糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量是5時，可結合具有兩個糖殘基的麥芽糖糖鏈和具有三個糖殘基的麥芽三糖糖鏈的各一個。此外，當與糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量為6時，可結合三個麥芽糖糖鏈，或可結合兩個麥芽三糖糖鏈。此外，當與糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量為7時，可結合兩個麥芽糖糖鏈和一個麥芽三糖糖鏈，或可結合具有七個糖殘基的一個diGlcNAc糖鏈。類似地，對于其中與糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈中存在的糖殘基的總數(shù)量為8以上的情況，可結合各種糖鏈的組合。與本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物結合的糖鏈數(shù)不受到限制，只要糖鏈-多肽復合物未丟失通過在具有大約中性的pH的水性溶液中自組裝形成β片結構的特征。例如，其可以是1、2、3、4、5或6條鏈，優(yōu)選地1、2或3條鏈。在本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物中，糖鏈結合的氨基酸殘基的位置不受到限制，只要糖鏈-多肽復合物未丟失通過在具有大約中性的pH的水性溶液中自組裝形成β片結構的特征。例如，糖鏈結合的氨基酸殘基的位置可以是多肽的N和/或C末端側，或其可以是并非N和C末端側的位置。優(yōu)選地，糖鏈可與從位于多肽的N末端的氨基酸殘基計數(shù)直至x位的每個氨基酸和從位于C末端的氨基酸殘基計數(shù)直至y位的每個氨基酸結合(其中x和y是整數(shù)，x≥0，y≥0，和x+y是與多肽結合的糖鏈的總數(shù)量)。更具體而言，當與多肽結合的糖鏈數(shù)為1時，所述一條糖鏈可結合至位于所述多肽的N末端的氨基酸殘基或位于C末端的氨基酸殘基。此外，當與多肽結合的糖鏈數(shù)為2時，所述兩條糖鏈可結合至選自下文(1)-(3)的氨基酸殘基：(1)從位于多肽的N末端的氨基酸殘基計數(shù)的第一個和第二個氨基酸殘基(2)從位于多肽的C末端的氨基酸殘基計數(shù)的第一個和第二個氨基酸殘基，和(3)位于多肽的N末端的氨基酸殘基和位于所述多肽的C末端的氨基酸殘基。此外，當與多肽結合的糖鏈數(shù)為3時，所述三條糖鏈可結合至選自下文(1)-(4)的任何氨基酸殘基：(1)從位于多肽的N末端的氨基酸殘基計數(shù)的第一個、第二個和第三個氨基酸殘基(2)從位于多肽的C末端的氨基酸殘基計數(shù)的第一個、第二個和第三個氨基酸殘基(3)從位于多肽的N末端的氨基酸殘基計數(shù)的第一個和第二個氨基酸殘基，和位于多肽的C末端的氨基酸殘基，和(4)位于多肽的N末端的氨基酸殘基，和從多肽的C末端計數(shù)的1位和2位的氨基酸殘基。優(yōu)選的是，添加至本發(fā)明的止血用藥物組合物中包含的糖鏈-多肽復合物的糖鏈是支鏈的。此處，本文使用的與多肽結合的糖鏈是"具有支鏈的糖鏈"不限于例如在一條糖鏈中具有支鏈的那些糖鏈，例如二唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈或diGlcNAc糖鏈，而且還包括例如多個線性糖鏈添加至一個多肽以產(chǎn)生糖鏈在肽中作為整體是支鏈的狀態(tài)的那些糖鏈。例如，與一個多肽結合的具有兩條以上條線性糖鏈(例如麥芽糖糖鏈或麥芽三糖糖鏈)的那些，也包括在本文的"具有支鏈的糖鏈"中。在本發(fā)明中，用于評價水凝膠的強度或性質(zhì)的方法不特別受到限制，例如可通過鋼球負荷試驗或動態(tài)粘度測量進行評價。在鋼球負荷試驗中，例如水凝膠的強度可如下評價：將給定重量的鋼球負載到在Durham氏管內(nèi)側形成的水凝膠的表面上，并觀察鋼球是停留在水凝膠的表面上或下沉。此外，在鋼球負荷試驗中，可目視確認水凝膠的透明度或不溶物質(zhì)或沉淀的存在或不存在。在水凝膠的動態(tài)粘度測量中，水凝膠的強度隨時間的變化可通過用流變儀測量受試水凝膠的動態(tài)粘度進行測量。本文使用的術語用于描述具體實施方案，和不旨在限制本發(fā)明。此外，本文使用的術語"包含"，除非上下文清楚表明不同地理解，否則意指所述項(例如組分、步驟、要素和數(shù)量)的存在，和不排除其它項(例如組分、步驟、要素和數(shù)量)的存在。除非另外定義，否則本文使用的所有術語(包括技術和科學術語)具有與本發(fā)明所屬
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的技術人員廣泛理解的相同含義。本文使用的術語，除非明確另外定義，否則應解釋為具有與本文和相關
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中的含義一致的含義，而不應解釋為具有理想化或過度形式化的含義。術語例如第一和第二有時用于表示各種要素，應認識到，這些要素不受這些術語的限制。這些術語僅用于區(qū)分一個要素與另一個要素的目的，例如在未脫離本發(fā)明的范圍的情況下，有可能描述第一個要素為第二個要素，和同樣地，描述第二個要素為第一個要素?，F(xiàn)在將通過實施例更具體地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可通過各種實施方案具體化，不應解釋為受限于本文所述的實施例。例如，本文所示的DiGlcNAc-BrAc表示溴代乙酰化的diGlcNAc糖鏈。此外，例如本文所示的C(DiGlcNAc)-(RADA)4表示與diGlcNAc糖鏈結合的半胱氨酸殘基結合至具有氨基酸序列RADARADARADARADA的多肽的N末端。實施例(合成實施例1)C(DiGlcNAc)-(RADA)4的合成(合成實施例1-1)DiGlcNAc-BrAc的合成用類似于描述于WO2005/010053的方法進行合成，以獲得由下式(12)表示的DiGlcNAc-BrAc。[化學式12]式(12)(合成實施例1-2)Ac-C(RADA)4-NH2的合成將RinkamidePEGA樹脂(100μmol)吸收至用于固相合成的柱中，用DMF和二氯甲烷洗滌，接著加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg,400μmol)、1-雙二甲基氨基亞甲基-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)(157.2mg,380μmol)和二異丙基乙胺(DIPEA)(104.5μL,600μmol)在DMF(2.5mL)中的溶液，和將其搖振15分鐘。用二氯甲烷和DMF洗滌后，通過用20%哌啶/DMF處理除去Fmoc保護基。用DMF洗滌后，用PreludeTM肽合成儀合成：用基于Fmoc方法的肽固相合成方法保護的由下式(13)(SEQIDNO.3)表示的樹脂-結合的多肽。在DMF中使用HCTU作為縮合劑進行縮合反應。[化學式13]式(13)Fmoc保護基通過用20%哌啶/DMF處理而除去。用DMF和二氯甲烷洗滌后，加入乙酸酐和吡啶，搖振1小時。用DMF和二氯甲烷洗滌后，加入三氟乙酸(TFA):水:三異丙基甲硅烷:乙烷二硫醇(=90:2.5:5:2.5)，和將其在室溫下?lián)u振4小時。濾除樹脂，加入冷乙醚至濾液，作為沉淀物獲得粗肽。一部分粗肽用HPLC純化[柱：SHISEIDOCAPCELLPAKC18UG-120(5μm),φ20x250mm，流速：7.0mL/min，展開溶劑A：0.1%aq.TFA，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A:B=88:12->78:22，11min。線性濃度梯度洗脫]，以獲得由下式(14)(SEQIDNO.4)表示的多肽(32.7mg)。[化學式14]式(14)(合成實施例1-3)C(DiGlcNAc)-(RADA)4的合成在合成實施例1-2中合成的多肽(SEQIDNO.4)(25.3mg,13.9μmol)和在合成實施例1-1中合成的DiGlcNAc-BrAc(30.0mg,20.9μmol,對肽1為1.5當量)溶于包含33μMTCEP和8M鹽酸胍的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.3,4.7mL)，和在室溫下反應3小時。反應溶液用HPLC純化[柱：SHISEIDOCAPCELLPAKC18UG-120(5μm),φ20x250mm,流速:7.0mL/min,展開溶劑A:0.1%aq.TFA,B:0.09%TFA/10%水/90%乙腈,梯度A:B=88:12->81:19,10min。線性濃度梯度洗脫]，以獲得由下式(15)(SEQIDNO.5)表示的糖鏈-多肽復合物(23.9mg,7.53μmol,收率54%)。[化學式15]式(15)(實施例1)圓二色性(CD)的測量和分析已知自裝配的肽例如(RADA)4由于分子間相互作用而形成β片結構，此外該結構在離子的存在下分層為許多層，形成水凝膠。CD測量已知為證實該β片結構的有效工具。一般而言，當β片結構存在時CD譜在大約197nm顯示正最大和在大約216nm顯示負最大。因此，通過進行CD測量，證實了本發(fā)明的組合物是否在寬pH內(nèi)形成β片結構。在合成實施例1中合成的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和作為對照的(RADA)4(產(chǎn)品名：PuraMatrix，來自3DMatrix，產(chǎn)品號：354250)各自溶于超純水，以制備1%重量的水性溶液。向這些水性溶液中加入等量的超純水、1.8%鹽水或0.3M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，以分別產(chǎn)生水性溶液和0.5%重量的水凝膠。然后用超純水將這些稀釋，使得各溶液的肽濃度為100mM。將這些溶液轉(zhuǎn)移至具有0.1cm的光路長度的石英池。然后用圓二色性分光計(J-805,Jasco)以190-260nm的波長測量CD譜。平均殘基橢圓率θ用下式計算：[θ]=(θobs/10?l?c)/r其中θobs表示單位毫度的橢圓率，l表示池長度(cm)，c表示濃度(M)，和r表示氨基酸殘基數(shù)。對于包含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的組合物的測量結果顯示于圖1，和對于包含(RADA)4的組合物的測量結果顯示于圖2。在水性溶液和生理鹽水中，C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4兩者均在大約197nm顯示正最大和在大約216nm顯示負最大，因此證實了兩種肽均形成β片結構。另一方面，在磷酸鹽緩沖液中，β片結構的形成僅對C(DiGlcNAc)-(RADA)4得到證實。(實施例2)纖維結構的形成的證實在合成實施例1中合成的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和作為對照的(RADA)4各自溶于超純水，以制備1%重量的水性溶液。制備的各水性溶液各自用超純水、1.8%鹽水或磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋，以獲得0.5%重量。1微升的稀釋溶液各自滴加到劈開的云母襯底(產(chǎn)品名：MICAGradeV-4，來自SPIsupplies)。然后用100μL的雙蒸水洗去在所述云母襯底上的過量化合物。然后將襯底在室溫下(25℃)空氣干燥。干燥后，用原子力顯微鏡(產(chǎn)品名：NanoscaleHybridMicroscopeVN-8000，來自Keyence)觀察云母襯底上的肽。結果顯示于圖1。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)C(DiGlcNAc)-(RADA)4在任一條件下自裝配和形成纖維結構。另一方面，對于(RADA)4，發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽緩沖液中觀察到聚集物樣物質(zhì)，和未形成纖維結構。(實施例3)動態(tài)粘度的測量和分析配備有縫隙高度0.3mm和40mm直徑的不銹鋼平行板的流變儀(DiscoveryHR-2，來自TAInstruments)用于測量動態(tài)粘度。C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于超純水，以制備0.5-5%重量的水性肽溶液。作為對照的(RADA)4也溶于超純水，以制備0.5-1%重量的水性肽溶液。這些水性溶液然后在25℃轉(zhuǎn)移至流變儀裝置。以轉(zhuǎn)速100S-1施加預剪切30秒，之后隨時間監(jiān)測各種物理性質(zhì)數(shù)據(jù)(頻率=1Hz，變形=10%)。該測量結果顯示于圖4。在將C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于超純水后，加入等量的磷酸鹽緩沖液(300mM,pH7.4)以產(chǎn)生0.5-5%重量的水凝膠。此外，在將(RADA)4溶于超純水后，加入等量的1.8%鹽水以產(chǎn)生0.5-1%重量的水凝膠。注意，(RADA)4在2%重量以上的濃度時不完全溶解，導致處理困難，由此試驗未能進行。這些水凝膠的動態(tài)粘度在類似于上述的條件下測量。該測量結果顯示于圖5。圖4顯示C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4在水性溶液狀態(tài)下的貯存彈性模量。比較1%重量的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和1%重量的(RADA)4在水性溶液狀態(tài)下的貯存彈性模量，C(DiGlcNAc)-(RADA)4顯示更低的值。另一方面，類似地比較如圖5所示的在添加鹽后各自在水凝膠狀態(tài)下的貯存彈性模量，C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4顯示相當?shù)闹怠８鶕?jù)這些結果，發(fā)現(xiàn)C(DiGlcNAc)-(RADA)4具有下述特征：在水性溶液狀態(tài)下具有低貯存彈性模量和容易處理，同時在加入鹽時立即膠凝。此外，因為C(DiGlcNAc)-(RADA)4具有高的水溶性，所以甚至當肽濃度增加時不會產(chǎn)生聚集體，和可提供具有高貯存彈性模量的水凝膠。(實施例4)止血作用的評價為了證實本發(fā)明的水凝膠是否具有體內(nèi)止血作用，在通過大鼠肝穿刺的出血模型中進行了評價試驗。9周齡的Crlj:SD大鼠用異氟烷麻醉，和自尾靜脈給予肝素鈉注射液(200U/大鼠，來自AjinomotoPharmaceuticalsCo.,Ltd.)。將大鼠腹部剖開，和將可塑石蠟膜置于肝的側左葉和中右葉下以暴露肝表面。肝葉的相同位點用針裝置穿刺三次(針束約7mm直徑，以進行穿刺至3-4mm的深度)，以得到肝穿刺模型。出血直至穿刺后10秒，用吸收棉除去，和然后立即局部逐滴給予100μL的各測試物(C(DiGlcNAc)-(RADA)4、(RADA)4)和溶媒(純化水、PBS)至穿刺位點。在給予后1.5和3分鐘，通過下文的評分標準證實止血和出血狀態(tài)，以評價測試物的止血效果。C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于PBS(pH7.4,磷酸鹽緩沖鹽水)至0.5%重量，并用于評價。(RADA)4溶于純化水至0.5%重量，并用于評價。[表1]表1：止血和出血狀態(tài)的驗證評分評估評分穿刺位點的狀態(tài)○：止血2其中未觀察到出血的狀態(tài)△：大部分止血1其中見到稍微出血的狀態(tài)，即使僅間斷性的×：出血0其中見到間斷性出血的狀態(tài)止血效果的評價結果顯示于表2。此外，3分鐘后止血效果的評分分布顯示于圖6。直至3分鐘后仍觀察到持續(xù)出血的個體數(shù)對于PBS施用組為12/16個病例(75%)，和對于純化水施用組為13/15個病例(87%)。另一方面，直至3分鐘后仍觀察到持續(xù)出血的個體數(shù)對于C(DiGlcNAc)-(RADA)4施用組為4/15個病例(27%)，而直到3分鐘后仍觀察到持續(xù)出血的個體數(shù)對于(RADA)4施用組為3/15個病例(20%)。到穿刺后3分鐘，余下的個體形成凝膠樣固體或涂膜等，從出血位點的血流停止，或流量減少。因為在該試驗系統(tǒng)中在給予測試物之前給予肝素至大鼠，以在內(nèi)源性血液凝固系統(tǒng)受到抑制的條件下進行檢查，所以上述結果表明測試物具有的止血效果。[表2]表2處理C(DiGlcNAc)-(RADA)4PBS(RADA)4純化水1.5分鐘持續(xù)出血(評分0)9/15(60%)16/16(100%)11/15(73%)14/15(93%)大部分止血(評分1)4/15(27%)0/16(0%)3/15(20%)0/15(0%)止血(評分2)2/15(13%)0/16(0%)1/15(7%)1/15(7%)3分鐘持續(xù)出血(評分0)4/15(27%)12/16(75%)3/15(20%)13/15(87%)大部分止血(評分1)1/15(7%)1/16(6%)2/15(13%)0/15(0%)止血(評分2)10/15(67%)3/16(19%)10/15(67%)2/15(13%)根據(jù)以上結果，發(fā)現(xiàn)(C(DiGlcNAc)-(RADA)4與(RADA)4相比具有較高的可用性，同時顯示等同于(RADA)4的止血效果。換句話說，顯示本發(fā)明的水凝膠作為止血用藥物組合物具有特別高的效用價值。當前第1頁1 2 3