本發(fā)明涉及：用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的組合物，該組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽；用于預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病的藥物組合物；用于預(yù)防或緩解與肌無力有關(guān)的疾病的食品組合物；用于強(qiáng)化肌肉的組合物；以及用于強(qiáng)化肌肉的飼料或飼料添加劑。

此外，本發(fā)明涉及：使用丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的方法；用于制備分化的成肌細(xì)胞的方法；以及用于治療與肌無力有關(guān)的疾病的方法。

背景技術(shù)：

引起肌無力的疾病包括：隨著老齡化而發(fā)展的少肌癥；由蛋白質(zhì)代謝失衡和肌肉使用減少引起的肌肉萎縮癥；和隨著饑餓、衰竭性疾病(癌癥等)和老齡化而發(fā)展的心萎縮癥。

少肌癥是指隨著老齡化過程中由于骨骼肌質(zhì)量下降而引起的肌肉強(qiáng)度的下降。作為少肌癥的最重要特性的骨骼肌質(zhì)量下降會與另外在肌纖維類型方面的變化同時(shí)被觀察到。1型和2型肌纖維的直徑隨著老齡化的進(jìn)行以相似速率減少，而在少肌癥下，2型肌纖維的直徑不會明顯改變，但1型肌纖維的直徑顯著減小。據(jù)報(bào)道，少肌癥引起在老年人當(dāng)中出現(xiàn)的衰老和功能障礙。

少肌癥是由多種因素造成的，但關(guān)于每個(gè)因素的研究仍在進(jìn)展中。少肌癥是由生長激素水平的降低或神經(jīng)變化、生理活性變化、代謝變化、性激素或脂肪和分解代謝的細(xì)胞因子的量增加以及蛋白質(zhì)合成和降解的平衡變化誘導(dǎo)的。已知骨骼肌質(zhì)量下降(其為少肌癥的最顯著特征)的最重要原因是衛(wèi)星細(xì)胞活化的降低。衛(wèi)星細(xì)胞是位于肌纖維的肌纖維膜和基底膜之間的小單核細(xì)胞。這些衛(wèi)星細(xì)胞通過刺激(例如損傷或鍛煉)被活化并增殖作為成肌細(xì)胞，而隨著分化的發(fā)展，它們與其他細(xì)胞融合以形成多核肌纖維。因此，當(dāng)使衛(wèi)星細(xì)胞活化降低時(shí)，使受損的肌肉再生的能力或?qū)Ψ只盘柕捻憫?yīng)能力降低，從而導(dǎo)致肌肉形成減少。

肌肉萎縮癥是由營養(yǎng)缺乏或長時(shí)間的身體不活動造成的，并且其通過由于蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡破壞而發(fā)生的蛋白質(zhì)降解來指示。

另一方面，心萎縮是由饑餓、衰竭性疾病(癌癥等)以及衰老引起的，心肌纖維變得更薄，并且細(xì)胞核變濃并表現(xiàn)出紅細(xì)胞大小不均。因此，肌束的體積減小，心臟總體變小，心外膜脂肪組織的尺寸明顯下降，且冠狀動脈變彎?？上牡纳?脂褐質(zhì))作為棕色色素出現(xiàn)在心肌纖維的細(xì)胞核的兩端，且隨著脂肪組織的減少，整個(gè)心臟顯示褐色。

針對少肌癥的治療方法包括三種方法。第一種方法是鍛煉。鍛煉會在短期內(nèi)改善骨骼肌肉的蛋白質(zhì)合成能力，且據(jù)報(bào)道會提高老年人的肌肉強(qiáng)度和移動性。然而，鍛煉不適合作為長期治療方法。第二種方法作為藥物治療，是給藥睪酮或合成代謝類固醇，但這引起女性的男性化，和對男性的副作用例如可能發(fā)生前列腺癥狀。對于其它經(jīng)批準(zhǔn)的方法，可用脫氫表雄酮(DHEA)和生長激素，且研究報(bào)道可以在包括選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑(SARM)的區(qū)域?qū)⑦@些用作治療方法(D.D.Thompson,J.Musculoskelet Neuronal Interact 7,344-345,2007)。具體地，盡管已知節(jié)食作為一種治療方法，但根據(jù)營養(yǎng)評定，營養(yǎng)不良和現(xiàn)代的飲食習(xí)慣對于保持適當(dāng)?shù)目傮w重是不恰當(dāng)?shù)摹?/p>

近來，干細(xì)胞治療(其中衛(wèi)星細(xì)胞在體外被分離并分化使得將它們引入體內(nèi))以及用于直接在體內(nèi)活化衛(wèi)星細(xì)胞以促進(jìn)肌生成從而維持或強(qiáng)化肌肉的方法，正被強(qiáng)調(diào)作為用于治療肌無力例如少肌癥的可能治療方法(Shihuan Kuang和Michael A.Rudnicki,Trends in Molecular Medicine 14,82-31,2008)。

因此，為了治療與肌無力有關(guān)的疾病，作為沒有副作用的更加根本性的方法，需要用于分化成肌細(xì)胞的方法，因此，能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的物質(zhì)的開發(fā)是高度必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明人致力于開發(fā)一種用于治療與肌無力有關(guān)的疾病的藥物，該藥物增加骨骼肌肉質(zhì)量并有效地恢復(fù)肌肉功能，因此，通過驗(yàn)證包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化從而預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病而完成本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于制備分化的成肌細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病的藥物組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或緩解與肌無力有關(guān)的疾病的食品組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于強(qiáng)化肌肉的組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于強(qiáng)化肌肉的飼料或飼料添加劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療與肌無力有關(guān)的疾病的方法。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽促進(jìn)成肌細(xì)胞分化并能夠形成肌管從而預(yù)防肌無力，并能夠有效地改善肌肉功能。因此，包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物能夠有效地用于預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病。

附圖說明

圖1示出了在相差顯微鏡下驗(yàn)證用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物處理過的C2C12成肌細(xì)胞系的分化的結(jié)果。

圖2示出了通過免疫細(xì)胞化學(xué)法驗(yàn)證用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物處理過的C2C12成肌細(xì)胞系的分化的結(jié)果。

圖3示出了通過Western印跡法驗(yàn)證在用乙基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物處理過的C2C12成肌細(xì)胞系中的肌球蛋白重鏈3(MYH3)的表達(dá)的結(jié)果。

圖4示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的握力改善效果的對比。

圖5示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的平衡能力改善效果的對比。

圖6示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的耐力改善效果的對比。

圖7示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的握力改善效果的對比。

圖8示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的平衡能力改善效果的對比。

圖9示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的處理引起的小鼠的耐力改善效果的對比。

具體實(shí)施方式

作為實(shí)現(xiàn)上述目的的一個(gè)方面，本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式涉及一種用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的組合物，該組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，且丁基吡啶鎓如下面的式1中所示。

[式1]

如在本文中所使用的，術(shù)語“衍生物”是指通過向丁基吡啶鎓引入官能團(tuán)或取代、氧化或還原丁基吡啶鎓的官能團(tuán)等而在使得母體化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不會明顯改變的程度上改變的化合物。例如，鍵合到丁基吡啶鎓的含有4個(gè)碳原子的烷基可以被含有4個(gè)或更多個(gè)碳原子的烷基的官能團(tuán)取代。具體地，它可以被含有4至16個(gè)碳原子的官能團(tuán)、更具體地含有4、12或16個(gè)碳原子的官能團(tuán)取代，但不限于此。

具體地，該衍生物可以是被具有12個(gè)碳原子的烷基取代的十二烷基吡啶鎓，如下面的式2中所示。

[式2]

此外，該衍生物可以是被具有16個(gè)碳原子的烷基取代的十六烷基吡啶鎓，如下面的式3中所示。

[式3]

十六烷基吡啶鎓的國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)名稱是1-十六烷基吡啶鎓，且它可以與鹽酸、溴等反應(yīng)而以鹽的形式存在，例如十六烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓溴化物等，但不限于此。

在本發(fā)明中，作為丁基吡啶鎓的衍生物的“十六烷基吡啶鎓”是以十六烷基吡啶鎓氯化物的形式，且已知其通過殺滅口腔內(nèi)的有害細(xì)菌而表現(xiàn)出優(yōu)秀的對抗牙周疾病的作用，但是尚未知曉它與成肌細(xì)胞分化有關(guān)。此外，尚未知曉丁基吡啶鎓、十二烷基吡啶鎓等與成肌細(xì)胞的分化有關(guān)。因此，本發(fā)明人首次研究了丁基吡啶鎓、其衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽具有使成肌細(xì)胞分化的作用，從而完成了本發(fā)明。

如在本文中所使用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指當(dāng)給藥給有機(jī)體時(shí)不會引起嚴(yán)重刺激且不會損害化合物的生物活性和性質(zhì)的化合物制劑。藥物鹽可以包括形成包含藥學(xué)上可接受的陰離子的無毒酸加成鹽的酸，例如，通過由無機(jī)酸，例如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫溴酸、氫碘酸等；由有機(jī)羧酸，例如酒石酸、甲酸、檸檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富馬酸、馬來酸、水楊酸等；通過由磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等形成的酸加成鹽。例如，藥學(xué)上可接受的羧酸鹽可以包括由鋰、鈉、鉀、鈣或鎂等形成的金屬鹽或堿土金屬鹽；氨基酸鹽，例如賴氨酸、精氨酸或胍等；和有機(jī)鹽，例如二環(huán)己基胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羥甲基)甲胺、二乙醇胺、膽堿和三乙胺等。

作為本發(fā)明的具體的示例性實(shí)施方式，鹽可以是丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓溴化物、十二烷基吡啶鎓溴化物或十六烷基吡啶鎓溴化物，但不限于此。

如在本文中所使用，術(shù)語“成肌細(xì)胞分化”是單核的成肌細(xì)胞通過融合形成多核肌管的過程。與肌肉前體細(xì)胞對應(yīng)的成肌細(xì)胞在自我更新的情況下表達(dá)Pax7⁺標(biāo)記物，而在增殖的情況下表達(dá)Pax7⁺/MyoD⁺標(biāo)記物。處于形成肌管的分化階段的細(xì)胞可以通過使用Pax7^-MyoD⁺MyoG⁺標(biāo)記物來進(jìn)行區(qū)分。處于形成肌管的分化初始階段的細(xì)胞表現(xiàn)出肌原性轉(zhuǎn)錄因子例如MyoD的表達(dá)增加，而在中間階段，肌細(xì)胞生成素表達(dá)增加。在當(dāng)分化幾乎完成的后期階段，肌球蛋白重鏈(MyHC)表達(dá)增加。

具體地，本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式涉及一種用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的組合物，該組合物包括濃度在0.001μM到5.0μM范圍內(nèi)的丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。該組合物可以是包括馬血清的用于分化的DMEM培養(yǎng)基，但可包括培養(yǎng)基或能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的組合物，而沒有限制。更具體地，該組合物可包括濃度在0.005μM到2.5μM、最具體地0.01μM到0.5μM范圍內(nèi)的丁基吡啶鎓、其衍生物或藥學(xué)上可接受的鹽。此外，該組合物還可以括細(xì)胞培養(yǎng)或分化所需的另外的材料。

當(dāng)所包括的丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的濃度低于0.001μM時(shí)，可能由于低濃度而使分化促進(jìn)效果下降，而當(dāng)其濃度超過5.0μM時(shí)，可能引起毒性。

本發(fā)明的另一示例性實(shí)施方式是用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的方法，所述方法包括用丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽來處理成肌細(xì)胞。丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽如上所述。具體地，用于促進(jìn)成肌細(xì)胞分化的方法可以通過用十六烷基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在體外或體內(nèi)處理成肌細(xì)胞來促進(jìn)分化。

本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式提供了用于制備分化的成肌細(xì)胞的方法，所述方法包括用丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽來處理成肌細(xì)胞以使成肌細(xì)胞分化。

丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽如上所述。本發(fā)明的方法的特征在于，通過用丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在體外或體內(nèi)處理成肌細(xì)胞來制備分化的成肌細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在用濃度為0.2μM的十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物的每一個(gè)處理成肌細(xì)胞后，在相差顯微鏡下觀察分化的程度，驗(yàn)證了與負(fù)對照組(DMSO)相比，促進(jìn)了分化，從而形成了很多肌管(圖1)，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western印跡法驗(yàn)證了促進(jìn)肌細(xì)胞分化的效果非常高(圖2和圖3)。

因此，本發(fā)明能夠形成肌管并制備在體外或體內(nèi)表達(dá)MYH3蛋白的分化的成肌細(xì)胞。

本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式涉及用于預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的濃度如上所述。

如在本文中所使用，術(shù)語“肌無力”是指一種或多種肌肉的強(qiáng)度降低的情況。肌無力可限于任何一種肌肉、身體的一側(cè)、上肢或下肢等，或其可能表現(xiàn)在整個(gè)身體中。此外，肌無力的自覺癥狀例如肌肉疲勞或肌肉疼痛可以通過經(jīng)體檢的客觀方法來量化。

與在本發(fā)明中的肌無力有關(guān)的疾病是指由肌無力引起的任何疾病，并且可以是，例如，少肌癥、肌肉萎縮癥、肌肉營養(yǎng)不良癥或心萎縮癥，但不限于此。

因此，本發(fā)明的組合物可以用于通過促進(jìn)成肌細(xì)胞分化來預(yù)防或治療少肌癥、肌肉萎縮癥、肌肉營養(yǎng)不良癥或心萎縮癥。

具體地，本發(fā)明的少肌癥是指直接導(dǎo)致肌肉強(qiáng)度降低的骨骼肌質(zhì)量的逐漸減少，因此，它是指可能發(fā)生各種身體功能下降或紊亂的狀況。

此外，肌肉萎縮癥是指肢體的肌肉幾乎對稱地持續(xù)收縮從而使脊髓中的運(yùn)動神經(jīng)纖維和細(xì)胞的逐漸劣化，并由此引起肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)和脊髓性進(jìn)行性肌萎縮(SPMA)的狀況。

肌肉營養(yǎng)不良癥是表現(xiàn)出進(jìn)行性肌肉萎縮和肌無力的疾病，在病理上，它是指由肌纖維壞死為特征的退行性肌病。在經(jīng)歷了由于對肌細(xì)胞膜的損傷引起的肌纖維壞死和退化的過程之后發(fā)生肌無力和肌肉萎縮癥。

本發(fā)明的心萎縮癥是指由于外部因素或內(nèi)部因素、以及由于饑餓、衰竭性疾病或衰老、心肌纖維變得更瘦和更薄引起的心臟萎縮，且它可能導(dǎo)致脂肪組織減少并引起顯現(xiàn)褐色的心臟萎縮的癥狀。

如在本文中使用，術(shù)語“預(yù)防”是指通過給藥組合物來抑制與肌無力有關(guān)的疾病或延遲發(fā)病的任何行為。

如在本文中使用，術(shù)語“治療”是指通過給藥組合物來改善或緩解與肌無力有關(guān)的癥狀的任何行為。

用于給藥的本發(fā)明的藥物組合物包含丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具體為丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓溴化物、十二烷基吡啶鎓溴化物或十六烷基吡啶鎓溴化物，或藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。載體、賦形劑和稀釋劑可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶無定形纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。

本發(fā)明的藥物組合物可以使用本領(lǐng)域中公知的方法來制備為藥物制劑，以提供丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的快速釋放、持續(xù)釋放或延遲釋放。在制劑的制備中，期望將活性成分用載體混合或稀釋，或?qū)⒒钚猿煞忠匀萜鞯男螤畎谳d體中。

此外，本發(fā)明的藥物組合物可用作任何制劑，但期望將其制備用于腸胃外使用。腸胃外制劑可以是以用于注射、外用的形式或以噴霧形式例如氣溶膠。

用于腸胃外給藥的制劑包括無菌水溶液、非水溶液、懸浮劑、乳劑、凍干藥物和栓劑。對于作為懸浮劑的非水溶劑，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油，以及可注射的酯例如油酸乙酯。

為了配制成注射制劑，可以將丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽與在水中的緩沖液或穩(wěn)定劑混合以制備成為溶液或懸浮劑，且也可以將其制備成作為安瓿或小瓶中的單位劑量使用。

包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的本發(fā)明的藥物組合物，可以被直接給藥至具有與肌無力有關(guān)的疾病的受試者或處于該疾病的發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的部位；或在通過將該組合物施用至體外或體內(nèi)的成肌細(xì)胞而制備了分化的成肌細(xì)胞之后，可將分化的成肌細(xì)胞給藥至具有與肌無力有關(guān)的疾病的受試者或處于該疾病的發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的需要強(qiáng)化肌肉的部位。

此外，該組合物可以包括附加成分，例如已知作為治療與肌無力有關(guān)的疾病的藥物的化合物，其中丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽不會干擾對與肌無力有關(guān)的疾病的預(yù)防或治療。

具體地，本發(fā)明的藥物組合物的特征在于促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在用濃度為0.2μM的十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物的每一個(gè)處理成肌細(xì)胞后，在相差顯微鏡下觀察分化程度，并驗(yàn)證了與負(fù)對照組(DMSO)相比，促進(jìn)了分化，從而形成了很多肌管(圖1)，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western印跡法證實(shí)了對肌肉細(xì)胞的分化的促進(jìn)效果非常高(圖2和圖3)。此外，將脛骨前肌肌肉固定3天(肌肉固定)，從而誘導(dǎo)肌肉損傷。之后，將肌肉從固定化釋放并使其再生。七天后，通過在給藥了十六烷基吡啶鎓氯化物的實(shí)驗(yàn)組中進(jìn)行同樣的運(yùn)動能力改善實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了與對照組相比，握力的下降范圍降低(圖4)，保持平衡感的運(yùn)動能力得以改善(圖5)，且耐力得以改善(圖6)。

通過這些結(jié)果，顯示丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽有效促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，并且它對于預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病是有用的。

本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式涉及一種用于預(yù)防或緩解與肌無力有關(guān)的疾病的食品組合物，該食品組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或營養(yǎng)學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的組合物可以與治療該疾病的另一種藥物在相同的時(shí)間或間隔開的時(shí)間下用于預(yù)防或緩解與肌無力有關(guān)的疾病(在該疾病的發(fā)展之前或在該疾病發(fā)作后)。丁基吡啶鎓、其衍生物或其營養(yǎng)學(xué)上可接受的鹽的濃度如上所述。

與肌無力有關(guān)的疾病是指可由肌無力引起的所有疾病，例如，少肌癥、肌肉萎縮癥、肌肉營養(yǎng)不良癥或心萎縮癥，但不限于此。優(yōu)選地，該食品組合物的特征是促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。

如在本文中所使用，術(shù)語“緩解”是指例如至少降低了與被治療的病癥有關(guān)的參數(shù)，例如降低了癥狀的嚴(yán)重程度的所有行為。

而且，當(dāng)將本發(fā)明的食品組合物用作食品添加劑時(shí)，可以將該組合物直接加入或與其它食品或食品成分一起使用，并且可以根據(jù)傳統(tǒng)方法適當(dāng)使用。通常，在食品或飲料的制造過程中，可以相對于原料以小于15重量％、優(yōu)選地小于10重量％的量加入本發(fā)明的組合物。然而，出于健康和衛(wèi)生目的，或者在長期攝取用于控制健康目的的情況下，所述量可以小于該范圍，并且由于在安全性方面不存在問題，因此活性成分可以以超過該范圍的量被使用。

對食品的類型沒有任何特別限制。可以包括該組合物的食品的例子包括肉類、香腸、面包、巧克力、糖果、零食、糖食、比薩餅、拉面、其它面條、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各種湯、飲料、茶、飲品、酒精飲料和維生素復(fù)合物等，包括所有傳統(tǒng)意義上的健康食品。

本發(fā)明的健康飲料組合物可以包括另外的成分，例如各種香料或天然糖類。上述天然糖類可以是單糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如麥芽糖和蔗糖，和天然甜味劑例如糊精和環(huán)糊精；和合成的甜味劑例如糖精，阿斯巴甜等。天然糖類的比例可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)確定。

除上述之外，本發(fā)明的組合物可以包括各種營養(yǎng)增補(bǔ)劑、維生素、電解質(zhì)、調(diào)味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)膠體增稠劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇類、在碳酸飲料中使用的充二氧化碳劑等。本發(fā)明的其它組合物可以包括用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的水果塊。這些成分可以單獨(dú)使用或組合使用。這些添加劑的比例也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定。

本發(fā)明的另一示例性實(shí)施方式涉及一種用于強(qiáng)化肌肉的組合物，該組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

此外，本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方式涉及一種用于強(qiáng)化肌肉的組合物，該組合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物、或其營養(yǎng)學(xué)上可接受的鹽。

如在本文中所使用，術(shù)語“肌肉強(qiáng)化”意指增強(qiáng)身體性能、增強(qiáng)最大耐力、增加骨骼肌質(zhì)量、增強(qiáng)肌肉恢復(fù)、降低肌肉疲勞、改善能量平衡或它們的任意組合效果。

本發(fā)明的用于強(qiáng)化肌肉的組合物包括能夠通過其將成肌細(xì)胞分化為肌細(xì)胞的能力增加總的骨骼肌肉質(zhì)量的丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上或營養(yǎng)學(xué)上可接受的鹽，該組合物增加了骨骼肌肉質(zhì)量并能夠增強(qiáng)最大耐力，從而增強(qiáng)人體性能并降低肌肉疲勞。此外，由于肌細(xì)胞可以被迅速更換，所以肌肉損傷可以很快痊愈。

為了給藥本發(fā)明的用于強(qiáng)化肌肉的組合物，除了丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上或其營養(yǎng)學(xué)上可接受的鹽以外，用于強(qiáng)化肌肉的組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑如上所述。

另外，本發(fā)明的用于強(qiáng)化肌肉的組合物可以以食品組合物或食品添加劑的形式來制備，特別是以健康食品組合物的形式。因此，本發(fā)明的用于強(qiáng)化肌肉的組合物，不僅可以用于由于老齡化造成的肌肉減少，而且可以以用于肌肉形成和肌肉強(qiáng)化的增補(bǔ)劑的形式用于正常個(gè)體等。

在本發(fā)明的一個(gè)示例中，通過用十六烷基吡啶鎓氯化物和丁基吡啶鎓氯化物來處理小鼠，然后進(jìn)行握力試驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和跑步機(jī)試驗(yàn)，通過證實(shí)改善肌肉強(qiáng)度而驗(yàn)證了組合物能夠用于強(qiáng)化肌肉。

本發(fā)明的另一示例性實(shí)施方式涉及一種用于強(qiáng)化肌肉的飼料或飼料添加劑，其包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

如在本文中所用，術(shù)語“飼料”是指供應(yīng)維持動物生命所必需的有機(jī)或無機(jī)營養(yǎng)素的物質(zhì)。飼料可以供應(yīng)動物例如家畜所必需的能量和營養(yǎng)素，例如蛋白質(zhì)、脂類、維生素、礦物質(zhì)等；并可以是植物類飼料，例如谷物、堅(jiān)果、食品副產(chǎn)品、藻類、纖維、脂肪和油、淀粉、粗粉、谷物副產(chǎn)品等；或可以是動物類飼料，例如蛋白質(zhì)、無機(jī)物質(zhì)、脂肪和油、礦物質(zhì)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)等，但并不限于此。

如在本文中所使用的，術(shù)語“飼料添加劑”是指添加到飼料中以改善生產(chǎn)率和動物健康的物質(zhì)，具體地，盡管不限于此，但其可以另外包括氨基酸、維生素、酶、調(diào)味劑、硅酸鹽劑、緩沖劑、萃取劑、寡糖等。

在用于強(qiáng)化肌肉的飼料或飼料添加劑中包括的丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的含量可以是在0.001％(w/w)到1％(w/w)、具體地0.005％(w/w)到0.9％(w/w)、且更具體地0.01％(w/w)到0.5％(w/w)的范圍內(nèi)，但并不特別地限于此。

本發(fā)明的另一示例性實(shí)施方式涉及一種用于治療與肌無力有關(guān)的疾病的方法，該方法包括將丁基吡啶鎓、其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽給藥至需要其的受試者。

與肌無力有關(guān)的疾病是指可能由肌無力引起的所有疾病，且可以是例如少肌癥、肌肉萎縮癥、肌肉營養(yǎng)不良癥或心萎縮癥，但不限于此。

實(shí)施例

在下文中，將根據(jù)示例性實(shí)施方式來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，在本文中公開的示例性實(shí)施方式僅用于說明的目的，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.C2C12成肌細(xì)胞系的培養(yǎng)

C2C12是從C3H品種活老鼠中獲得的成肌細(xì)胞的細(xì)胞系，它廣泛用于成肌細(xì)胞的分化研究中。

將上述C2C12細(xì)胞在用于細(xì)胞生長的一般培養(yǎng)基和用于分化的培養(yǎng)基中的每個(gè)中培養(yǎng)。在正常細(xì)胞生長培養(yǎng)基(GM)中，使用補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM；而在分化培養(yǎng)基(DM)中，使用包含2％馬血清的DMEM。

實(shí)施例2.成肌細(xì)胞的分化

在將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中分裝并培養(yǎng)24小時(shí)后，將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞分別用DMSO、十六烷基吡啶鎓氯化物(0.2μM)、丁基吡啶鎓氯化物(0.2μM)和十二烷基吡啶鎓氯化物(0.2μM)在各個(gè)分化培養(yǎng)基中處理，然后誘導(dǎo)分化3天。在實(shí)驗(yàn)中使用的DMSO、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物均購自Sigma-Aldrich。

實(shí)施例3.通過丁基吡啶鎓氯化物或其衍生物促進(jìn)成肌細(xì)胞分化(體外)

3-1.相差顯微鏡

為了通過用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物(即，十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物)中的每個(gè)處理成肌細(xì)胞來驗(yàn)證許多肌管的形成，將在涂有0.1％明膠的蓋玻片上的C2C12細(xì)胞分化3天，同時(shí)用濃度為0.2μM的DMSO(一種藥物載體)、丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每個(gè)處理，并在相差顯微鏡下進(jìn)行觀察。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與作為對照組的DMSO相比，當(dāng)用丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每個(gè)處理時(shí)，形成更多的肌管，從而驗(yàn)證了分化促進(jìn)效果(×100)(圖1)。

3-2.免疫細(xì)胞化學(xué)法

將在涂有0.1％明膠的蓋玻片上的C2C12細(xì)胞分化為3天。將細(xì)胞用1X PBS洗滌后，在室溫下用3.7％多聚甲醛固定15分鐘，并用1X PBS洗滌3次，加入透化緩沖液，并使細(xì)胞在室溫下反應(yīng)15分鐘。將細(xì)胞用1X PBS再次洗滌三次后，使細(xì)胞與含有1％BSA的PBST(封閉緩沖液，含有0.5％吐溫20的PBS)反應(yīng)30分鐘以阻止抗體的任何非特異性結(jié)合。將針對MYH3(SC-20641,Santa Cruz Biotechnology)的一級抗體通過以1:500的比例稀釋而加入到封閉緩沖液中，并使其在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在將細(xì)胞用1X PBS洗滌三次后，將在封閉緩沖液中以1:5000的比例稀釋的二級抗體(山羊抗兔IgG-HRP)加入其中并使其在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，并且將細(xì)胞用1X PBS洗滌三次。將蓋玻片放在載玻片上，用熒光顯微鏡拍照，并分析結(jié)果。

在本發(fā)明中，在用DMSO(負(fù)對照組)、丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每個(gè)處理以誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞系的分化后，在第三天，為了比較成肌細(xì)胞的分化程度，用針對MYH3的抗體染色后，驗(yàn)證了蛋白的表達(dá)。其結(jié)果是，驗(yàn)證了在用濃度為0.2μM的丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每個(gè)處理后MYH3的表達(dá)非常高。

3-3.Western印跡法

在將C2C12細(xì)胞分裝在培養(yǎng)基中并培養(yǎng)24小時(shí)后，每天將濃度為0.2μM的DMSO(對照組)、乙基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物施加到每個(gè)培養(yǎng)基，并誘導(dǎo)分化。在分化第三天收集細(xì)胞并將其在1200rpm下離心分離3分鐘。在向細(xì)胞中加入100μL裂解緩沖液后，將細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，并在3000rpm下離心分離10分鐘，得到水溶性蛋白質(zhì)，并且在加入4X樣品緩沖液后，使細(xì)胞在沸水中反應(yīng)5分鐘。

將10μg蛋白質(zhì)裝載到12％SDS-PAGE凝膠上并顯影，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將硝酸纖維素膜在5％的脫脂乳中封閉1小時(shí)，并用TTBS(0.03％吐溫20、Tris 2.42g、NaCl 9g，pH值7.4，1L)洗滌5次，每次5分鐘。將一級抗體在含有5％脫脂乳的TTBS中以1:500的比例稀釋并將其加入到硝酸纖維素膜中，并且在室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，將硝酸纖維素膜再次用TTBS洗滌5次，每次5分鐘。再將二級抗體在含有5％脫脂乳的TTBS中以1:5000的比例稀釋并將其加入，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用TTBS洗滌5次，每次5分鐘，并加入ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液，Pierce)。然后，將該膜暴露于X-射線膜，并測定蛋白的量。

作為上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，驗(yàn)證了在用十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每個(gè)處理過的組中，在相同量的蛋白中所含的MYH3蛋白的量顯著增加。由于DMSO處理，在對照組中的MYH3表達(dá)不明顯，但通過十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物使MYH3表達(dá)增加。此外，當(dāng)用十六烷基吡啶鎓溴化物處理時(shí)，驗(yàn)證了使MYH3表達(dá)增加(圖3)。

這表明通過十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物使在相同量的蛋白中所含的肌球蛋白的量快速增加，且發(fā)現(xiàn)丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物對成肌細(xì)胞的分化的促進(jìn)效果非常高。

然而，不同于其它衍生物，在乙基吡啶鎓氯化物(作為丁基吡啶鎓氯化物的衍生物之一并且具有兩個(gè)碳骨架)的情況下，MYH3的蛋白沒有增加。從這個(gè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在丁基吡啶鎓的衍生物中，只有具有四個(gè)或更多個(gè)碳骨架的衍生物是有效的。

實(shí)施例4.在給藥丁基吡啶鎓氯化物后通過肌肉再生來驗(yàn)證動物運(yùn)動能力的改善

作為實(shí)驗(yàn)動物，使用20只6周齡的C57BL/6雄性小鼠。將實(shí)驗(yàn)動物分為兩組：對照組，被分配有具有相似重量的10只小鼠，不給藥；和實(shí)驗(yàn)組，被分配有具有相似重量的10只小鼠，給藥丁基吡啶鎓氯化物。

將丁基吡啶鎓氯化物溶解在蒸餾水中以制備成15mg/kg的濃度，并將其口服給藥至實(shí)驗(yàn)組中的小鼠。在以下所述的肌肉固定時(shí)段也連續(xù)給藥。

在該實(shí)驗(yàn)中，作為用于在小鼠中誘導(dǎo)肌肉再生的方法，使用脛骨前肌肌肉固定化方案。在該方法中，使用醫(yī)用釘將小鼠的一條腿的大腿和小腿固定使得將腿固定化，在將固定化的小鼠單獨(dú)放置3天后，將被固定的腿松開。在此方法中使用的原理是，當(dāng)將腿放置在固定用敷料中并將腿的肌肉固定化(即，不頻繁使用)時(shí)，肌肉損失。它是用于誘導(dǎo)肌肉再生的方法，其中，在由于將脛骨肌肉固定化而造成肌肉損失后，通過將固定化的肌肉松開使得肌肉可再次運(yùn)動來使肌肉再生。在該實(shí)驗(yàn)中，通過將脛骨前肌肌肉固定化3天(肌肉固定化)來誘導(dǎo)肌肉損傷，并通過將肌肉再次松開而使得肌肉得以再生，且在7天后，進(jìn)行了同樣的運(yùn)動能力改善試驗(yàn)。

4-1.握力試驗(yàn)

使用BIOSEB公司制造的握力測量儀器來測量握力。將小鼠放置在與儀器面板(能夠監(jiān)測力的強(qiáng)度)附接的金屬絲網(wǎng)上，在將尾巴向下夾緊的同時(shí)測量小鼠握住金屬絲網(wǎng)的力。使用在連續(xù)重復(fù)試驗(yàn)五次后得到的平均值。

作為握力的測量結(jié)果，驗(yàn)證了與對照組相比，在給藥了丁基吡啶鎓氯化物的實(shí)驗(yàn)組中，使肌肉固定化后的握力下降的范圍減小(圖4)。

4-2.轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)

使用包括6個(gè)分區(qū)(直徑為7cm，以15cm的間隔)的轉(zhuǎn)棒裝置和可旋轉(zhuǎn)圓柱棒(高度為60cm)來實(shí)施鍛煉。以10rpm的旋轉(zhuǎn)速度開始并歷時(shí)5分鐘加速到至多40rpm的速度，測定小鼠沒有從轉(zhuǎn)棒跌落并保持在轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間。在將使小鼠休息15分鐘并使小鼠鍛煉的過程重復(fù)3次后測量所顯示的平均值。

作為轉(zhuǎn)棒測量的結(jié)果，驗(yàn)證了與對照組相比，在肌肉固定化后給藥了丁基吡啶鎓氯化物的實(shí)驗(yàn)組中用以保持平衡感的運(yùn)動能力得以改善(圖5)。

4-3.跑步機(jī)試驗(yàn)

對于在本試驗(yàn)中使用的跑步機(jī)，使用了自制造裝置。在將每只小鼠放置在單獨(dú)的跑道中并使其跑動后，記錄從起點(diǎn)到小鼠筋疲力盡(即，判斷為不想跑動)的點(diǎn)的時(shí)間。如果小鼠沒有跑而停留在跑道外的時(shí)間為10秒以上，則判斷小鼠筋疲力盡，并且記錄該時(shí)間。在該實(shí)驗(yàn)中，不能對同一小鼠進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。將小鼠放置在裝置上并使得其以8rpm的速度跑動，每10分鐘加速2rpm直到18rpm的速度，并從沒有傾角開始，每30分鐘將傾角增加5度。

作為跑步機(jī)測量的結(jié)果，與對照組相比，在給藥了丁基吡啶鎓氯化物的實(shí)驗(yàn)組中，肌肉固定化后耐力顯然得到改善(圖6)。

在對照組中，驗(yàn)證了與肌肉固定化之前相比，肌肉固定化之后在握力試驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和跑步機(jī)試驗(yàn)中的運(yùn)動能力降低。然而，在給藥了丁基吡啶鎓氯化物的實(shí)驗(yàn)組中，驗(yàn)證了運(yùn)動能力沒有降低；而是與對照組相比其得以維持或改善。

實(shí)施例5.在給藥十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物衍生物后通過肌肉再生的動物運(yùn)動能力的改善

為了驗(yàn)證與丁基吡啶鎓氯化物具有結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)性的衍生物顯示出相同的效果，將十六烷基吡啶鎓氯化物以50mg/kg的濃度口服給藥于20只C57BL/6雄性小鼠2周，并驗(yàn)證在肌肉固定化之前和之后的運(yùn)動能力的改善。

5-1.握力試驗(yàn)

以與上述實(shí)施例4-1相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)，并且在給藥十六烷基吡啶鎓氯化物后，驗(yàn)證了與對照組相比，使肌肉固定化后的握力下降的范圍減小(圖7)。

5-2.轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)

以與上述實(shí)施例4-2相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)，并且在給藥十六烷基吡啶鎓氯化物后，驗(yàn)證了與對照組相比，用以保持平衡感的運(yùn)動能力得以改善(圖8)。

5-3.跑步機(jī)試驗(yàn)

以與上述實(shí)施例4-3相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)，并且在給藥十六烷基吡啶鎓氯化物后，驗(yàn)證了與對照組相比，耐力得以改善(圖9)。

這些結(jié)果支持了不僅丁基吡啶鎓氯化物而且其衍生物對于肌肉細(xì)胞具有相同的分化作用，而且此外其衍生物具有預(yù)防或治療與肌無力有關(guān)的疾病的作用。

從上可知，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠理解，在不修改本發(fā)明的技術(shù)概念或必要特征下可以將本發(fā)明以其它具體方式來實(shí)施。在這方面，本文中公開的示例性實(shí)施方式僅用于說明目的而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反，本發(fā)明旨在不僅涵蓋所述示例性實(shí)施方式，而且涵蓋可以包括在由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多個(gè)替代方案、修改、等同方案和其它實(shí)施方式。