本發(fā)明屬于GPR35受體激動(dòng)劑領(lǐng)域，涉及茜草科蒽醌類化合物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，具體地說(shuō)是蒽醌類化合物中羥基茜草素作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。所述蒽醌類化合物為羥基茜草素和它藥學(xué)上可接受成鹽的化合物；所述靶點(diǎn)為GPR35受體；所述應(yīng)用為治療哮喘、心力衰竭、高血壓、炎癥、冠狀動(dòng)脈性心臟病、代謝綜合癥和疼痛等疾病的預(yù)防和治療。

背景技術(shù)：

茜草科植物(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根莖中含大量的蒽醌類化合物(Anthraquinone compounds)，種類繁多，結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，具有行血、止血、通筋活絡(luò)和止咳祛痰等功效，且表現(xiàn)出多種的藥理活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝、解熱鎮(zhèn)痛、抗凝血和抗腫瘤等，但是目前對(duì)于此類化合物研究大多集中在細(xì)胞水平，對(duì)于純化合物作用靶點(diǎn)研究甚少(Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(2010).[S].Vol 1.2010:218–219；許蘭芝,趙世琴,胡慶偉,冷萍,高爾.茜草總蒽醌抗炎抗風(fēng)濕作用及機(jī)制.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,24(1):11-13；Li X,Liu Z,Chen Y,et al.Rubiacordone A:a new anthraquinone glycoside from the roots of Rubia cordifolia.Molecules,2009,14(1):566-572；Tsang P W,Wong A P,Yang H P,et al.Purpurin triggers caspase-independent apoptosis in Candida dubliniensis biofilms.PloS one,2013,8(12):e86032；Itokawa H,Takeya K,Mihara K,et al.Studies on the Anti-Tumor Cyclic Hexapeptides Obtained from Rubiae Radix.Chem Pharm Bull,1983,31(4):1424-1427；Itokawa H,Ibraheim Z Z,Qiao Y F,et al.Anthraquinones,Naphthohydroquinones and Naphthohydroquinone Dimers from Rubia-Cordifolia and Their Cytotoxic Activity.Chem Pharm Bull,1993,41(10):1869-1872；Rao G M,Rao C V,Pushpangadan P,et al.Hepatoprotective effects of rubiadin,a major constituent of Rubia cordifolia Linn.Journal of ethnopharmacology,2006,103(3):484-490；KastureS B,KastureV S,Chopde C T.Anti-inflammatory activity of Rubia cordifolia roots,1998,1(2):135-153)。

GPR35受體是一個(gè)含有309個(gè)氨基酸的孤兒受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。GPR35受體在包括免疫細(xì)胞、結(jié)腸、胰腺、小腸和脾臟等各種組織中表達(dá)，其中在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞中表達(dá)水平較高。目前研究表明GPR35受體與哮喘、心力衰竭、高血壓、炎癥、冠狀動(dòng)脈性心臟病、代謝綜合癥、疼痛和癌癥等疾病相關(guān)。GPR35受體的新配體的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)，對(duì)于闡明其藥理學(xué)和生物學(xué)功能有非常大的意義，這將為疾病的靶向治療提供新的方向(O’Dowd B F,Nguyen T,Marchese A,Cheng R,Lynch K R,Heng H H Q,Kolakowski L F,George S R.Genomics 47(1998)310-313；Taniguchi Y,Tonai-Kachi H,Shijo K. FEBS Lett 580(2006)5003-5008；Wang J,Simonavicius N,Wu X,Swaminath G,Reagan J,Tian H,Ling L.J Biol Chem 281(2006)22021-22028；Y Yang,J Y L Lu,X Wu,S Summer,J Whoriskey,C Saris,J D Reagan.Pharmacology 86(2010)1-5；H Deng,Y Fang.Pharmacology 89(2012)211-219；Huayun Deng,Ye Fang.Med Chem Commun 3(2012)1270-1274)。

目前關(guān)于茜草科蒽醌類化合物中羥基茜草素作用于GPR35受體的內(nèi)容尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及蒽醌類化合物中羥基茜草素及其衍生物的作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及此類化合物的應(yīng)用，目的之一是提供羥基茜草素及其衍生物的作用靶點(diǎn)為GPR35受體；目的之二是提供此類化合物在臨床上的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

所述GPR35受體激動(dòng)劑為羥基茜草素和/或羥基茜草素對(duì)應(yīng)藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或兩種以上為活性成分。

羥基茜草素及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

所述的對(duì)應(yīng)藥學(xué)上可接受的鹽是指對(duì)活生物體基本無(wú)毒的本發(fā)明化合物的鹽，優(yōu)選的可接受的鹽為鹽酸鹽、鈉鹽、硫酸鹽、鉀鹽、磷酸鹽、鈣鹽、枸櫞酸鹽中的一種或兩種以上，最佳的可接受的鹽為鹽酸鹽、鈉鹽中的一種或兩種以上。

一種藥物組合物，包括所述的GPR35受體激動(dòng)劑，其中還可添加藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，對(duì)載體或賦形劑的選擇不做限制，如：淀粉、氯化鈉、微晶纖維素、山梨酸和/或甘露醇等。該組合物的給藥方式可以是但不限于經(jīng)靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表面、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限于是注射液、凍干粉針劑、注射微球、脂質(zhì)體、片劑、雙層/多層片、口含片、舌下片、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優(yōu)選注射液、凍干粉針劑、片劑和膠囊劑。

本發(fā)明所述的蒽醌類化合物在制備預(yù)防和/或治療哮喘、心力衰竭、高血壓、炎癥、冠狀動(dòng)脈性心臟病、代謝綜合癥和疼痛等疾病藥物中的應(yīng)用，其中，蒽醌類化合物為羥基茜草素以及羥基茜草素對(duì)應(yīng)的藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或兩種以上。

所述藥物是以羥基茜草素和/或羥基茜草素對(duì)應(yīng)的藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或兩種以上為活性成分，其中還可添加有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

所述GPR35受體激動(dòng)劑是以羥基茜草素以及羥基茜草素藥學(xué)上可接受的鹽中的一種或兩種以上為活性成分，其中還可添加藥學(xué)上可接受的載體或賦形 劑。

本發(fā)明的有益效果：

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中的羥基茜草素及其衍生物作用于GPR35受體，此受體為G蛋白偶聯(lián)受體，GPR35受體與哮喘、心力衰竭、高血壓、炎癥、冠狀動(dòng)脈性心臟病、代謝綜合癥、疼痛和癌癥等疾病相關(guān)，根據(jù)靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性，可以拓寬此化合物的臨床應(yīng)用范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1在HT-29細(xì)胞上的DMR響應(yīng)；

其中，圖1a為10μM羥基茜草素(Purpurin)、1μM敏喘寧(Zaprinast)、10μM羥基茜草素預(yù)處理后1μM敏喘寧在HT-29細(xì)胞上的50min內(nèi)最大DMR響應(yīng)；

圖1b為不同濃度的羥基茜草素在HT-29細(xì)胞上的DMR響應(yīng)曲線。

圖2為實(shí)施例2中羥基茜草素在HT-29細(xì)胞上的DMR劑量響應(yīng)曲線；

其中，圖2a為羥基茜草素(Purpurin)、羥基茜草素預(yù)處理1h后1μM的敏喘寧(Zaprinast)在HT-29細(xì)胞上的劑量響應(yīng)曲線；圖2b為不同濃度的ML145預(yù)處理10min后羥基茜草素在HT-29細(xì)胞上的DMR劑量響應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)例(羥基茜草素)，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1：蒽醌類化合物羥基茜草素作用于GPR35受體的發(fā)現(xiàn)

HT-29細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；敏喘寧購(gòu)于Sigma公司；ML145購(gòu)于Tocris公司。檢測(cè)平臺(tái)為康寧第三代成像儀，檢測(cè)的信號(hào)為細(xì)胞動(dòng)態(tài)質(zhì)量重置(DMR)引起的波長(zhǎng)位移。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞接種到384孔生物感應(yīng)器微型板中，每孔接種細(xì)胞懸液的體積為40μL，每孔接種的細(xì)胞數(shù)目為3.2×10⁴個(gè)，然后將384孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5％的CO₂、37℃)中培養(yǎng)22-24h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)95％左右時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

首先，分別實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)10μM的羥基茜草素和1μM的敏喘寧在HT-29細(xì)胞上引起的DMR響應(yīng)信號(hào)，然后選擇部分前述的10μM羥基茜草素，向其中加入1μM的敏喘寧繼續(xù)監(jiān)測(cè)，以50min內(nèi)檢測(cè)到的最大DMR響應(yīng)信號(hào)為縱坐標(biāo)作圖，如圖1a。敏喘寧是一個(gè)已知的GPR35受體激動(dòng)劑，以其作為陽(yáng)性對(duì)照比較羥基茜草素的激動(dòng)活性。結(jié)果表明，10μM的羥基茜草素在HT-29細(xì)胞上引起的DMR響應(yīng)信號(hào)為敏喘寧(1μM)的86％，而HT-29細(xì)胞經(jīng)10μM的羥基茜草素處理后，再用1μM的敏喘寧處理時(shí)引起的DMR響應(yīng)信號(hào)只有敏喘寧單獨(dú)作用時(shí)的9％。這說(shuō)明羥基茜草素與敏喘寧可能作用于同一受體——GPR35受 體，因此我們對(duì)其激動(dòng)活性進(jìn)行了量效關(guān)系考察。

激動(dòng)分析：將羥基茜草素(最高工作濃度100草素，2倍稀釋，9個(gè)濃度梯度)加入已接種HT-29細(xì)胞的384孔生物感應(yīng)器微型板中，在系統(tǒng)上監(jiān)測(cè)1h，得羥基茜草素的DMR響應(yīng)曲線(圖1b)。結(jié)果表明羥基茜草素引起的DMR響應(yīng)信號(hào)呈劑量依賴性，其EC50值為6.142量依賴性，其起的能作，且響應(yīng)曲線類型與GPR35受體激動(dòng)劑敏喘寧一致。

實(shí)施例2：蒽醌類化合物羥基茜草素作用于GPR35受體的驗(yàn)證

我們通過(guò)脫敏分析和拮抗分析驗(yàn)證了羥基茜草素對(duì)GPR35受體的激動(dòng)活性。

脫敏分析：將羥基茜草素(最高工作濃度100草素，2倍稀釋，14個(gè)濃度梯度)加入已接種HT-29細(xì)胞的384孔生物感應(yīng)器微型板中，在系統(tǒng)上監(jiān)測(cè)1h，再加入敏喘寧(工作濃度1μM)繼續(xù)監(jiān)測(cè)1h，以羥基茜草素的對(duì)數(shù)劑量對(duì)1μM敏喘寧的DMR響應(yīng)作圖，如圖2a。從圖中可以看出，用羥基茜草素單獨(dú)處理時(shí)引起劑量依賴性DMR響應(yīng)信號(hào)，繼續(xù)加入固定濃度的敏喘寧處理，GPR35受體對(duì)激動(dòng)劑敏喘寧的敏感性下降而顯示出脫敏現(xiàn)象，且羥基茜草素濃度越高脫敏越明顯，呈劑量依賴性，其IC50值為3.668±0.189μM。這說(shuō)明羥基茜草素與敏喘寧作用于同一靶點(diǎn)，GPR35受體。

拮抗分析：以ML145(最高工作濃度32μM，2倍稀釋，14個(gè)濃度梯度)預(yù)處理HT-29細(xì)胞10min，然后加入羥基茜草素(200μM)繼續(xù)監(jiān)測(cè)1h，結(jié)果如圖2b所示。ML145為GPR35受體的拮抗劑，以ML145處理后，ML145呈劑量依賴性地拮抗羥基茜草的激動(dòng)活性，其IC50值為3.931±0.267μM。這進(jìn)一步說(shuō)明羥基茜草素的作用靶點(diǎn)為GPR35受體。

通過(guò)激動(dòng)、脫敏和拮抗分析三個(gè)實(shí)驗(yàn)表明GPR35受體是羥基茜草素的作用靶點(diǎn)。目前研究表明GPR35受體與疼痛、高血壓、糖尿病、早發(fā)性炎癥性疾病、炎癥、哮喘以及癌癥等疾病相關(guān)，根據(jù)靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性，可以拓寬此化合物的臨床應(yīng)用范圍。