本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及特異性肝臟損傷模型，具體涉及一種可誘導(dǎo)的特異性肝臟損傷模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

有統(tǒng)計(jì)顯示，肝臟疾病是對(duì)人類威脅最大的疾病之一，除病毒性肝炎外，肝臟疾病中肝硬化、肝癌等的危害也相當(dāng)嚴(yán)重；目前，中國每年用于肝炎和肝病的直接醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)1000多億元人民幣。臨床治療中，肝臟移植手術(shù)是解決肝臟系統(tǒng)疾病和肝臟代謝紊亂的一種非常重要的手段之一，但是肝臟移植手術(shù)仍然面臨很多尚未解決的問題，需要更多的相關(guān)研究提高移植后肝臟細(xì)胞的再生和增殖水平；而與肝組織的移植相比，肝臟細(xì)胞的移植更具可行性，所需費(fèi)用也較小。

本領(lǐng)域知悉，一些特殊品系動(dòng)物的出現(xiàn)以及依托其構(gòu)建的人類重大疾病動(dòng)物模型，是感染性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的必需工具；而建立肝臟損傷動(dòng)物模型是研究肝細(xì)胞移植和再生的關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)；然而，缺乏合適小動(dòng)物模型在很大程度上限制了肝移植技術(shù)相關(guān)的臨床前研究。就小鼠而言，移植的外源肝細(xì)胞要在小鼠體內(nèi)嵌合、再生成功，其先決條件之一是要求肝臟本身有損傷，外源植入的肝細(xì)胞才有機(jī)會(huì)克服生存競(jìng)爭(zhēng)而“殖民”成功。現(xiàn)有的動(dòng)物模型，例如Alb-uPA小鼠模型曾被應(yīng)用于肝細(xì)胞移植研究中，但是由于uPA小鼠繁殖困難，死亡率高，移植手術(shù)需要在小鼠出生2周內(nèi)完成且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較大等一系列問題而限制了其廣泛應(yīng)用。

因此，現(xiàn)有肝臟損傷的小鼠模型有待進(jìn)一步優(yōu)化，現(xiàn)在迫切需要一種可誘導(dǎo)型肝損傷小鼠模型，該小鼠模型將為肝細(xì)胞的移植研究提供更適合的新型動(dòng)物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，提供一種可誘導(dǎo)的特異性肝臟損傷模型的構(gòu)建方法，為后續(xù)的肝臟疾病相關(guān)研究提供新的肝損模型技術(shù)平臺(tái)。

本發(fā)明所述的構(gòu)建方法獲得了一種可誘導(dǎo)的特異性肝臟損傷Alb-cre/DTR（Alb-cre：肝臟特異性表達(dá)Cre酶；DTR：條件性轉(zhuǎn)入人白喉毒素受體基因，其表達(dá)受Cre/LoxP系統(tǒng)控制）小鼠模型；該小鼠可在肝臟特異性表達(dá)人白喉毒素受體（DTR）。

本發(fā)明所述的構(gòu)建方法采用轉(zhuǎn)入白喉毒素到Alb-cre/DTR小鼠體內(nèi)，白喉毒素可特異性誘導(dǎo)Alb-cre/DTR小鼠產(chǎn)生肝臟損傷，獲得可誘導(dǎo)的特異性肝臟損傷模型；

具體而言，本發(fā)明的特異性肝臟損傷小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，基于Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠，采用轉(zhuǎn)入白喉毒素的方法，構(gòu)建特異性肝臟損傷小鼠模型，其包括步驟：

（1）繁育和鑒定Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠

將Alb-cre與DTR小鼠雜交后，獲得Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過PCR的方法對(duì)雜交產(chǎn)生的子代進(jìn)行基因定型，以確定同時(shí)含有Alb-cre和DTR基因；

（2）轉(zhuǎn)入白喉毒素

取SPF級(jí)Alb-cre/DTR小鼠，將0.3~1.25ng/g小鼠體重劑量的白喉毒素溶于200μl的PBS溶液中，通過轉(zhuǎn)入方式造模，得到；以同周齡C57BL/6小鼠作為對(duì)照；

（3）檢測(cè)肝損相關(guān)生化指標(biāo)的變化，以評(píng)價(jià)肝損造模是否成功。

本發(fā)明所述方法中，采用Alb-cre/DTR小鼠作為造模實(shí)驗(yàn)鼠；

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用經(jīng)腹腔注射途徑將含有白喉毒素的PBS溶液至造模實(shí)驗(yàn)鼠；

本發(fā)明所述方法中，造模所用白喉毒素劑量為0.3~1.25ng/g小鼠體重；

本發(fā)明所述方法中，在轉(zhuǎn)入白喉毒素造模前，小鼠稱重，用以計(jì)算白喉毒素的用量，同時(shí)采小鼠血分離血清，檢測(cè)血清中ALT和AST指標(biāo)，確定注射之前的本底值；轉(zhuǎn)入白喉毒素后，采小鼠血分離血清，檢測(cè)ALT和AST值是否升高，以確定是否發(fā)生肝損；

本發(fā)明所述方法中，在轉(zhuǎn)入白喉毒素后每天對(duì)小鼠的體重進(jìn)行持續(xù)觀測(cè)，并采血分離血清檢測(cè)ALT和AST值，ALT和AST值與C57BL/6小鼠相比顯著升高者，確定為肝損成功模型。

采用本發(fā)明所述構(gòu)建方法獲得的特異性肝損小鼠將為肝移植研究提供一種可行的動(dòng)物模型支撐，對(duì)于深入探討肝細(xì)胞移植和肝臟再生等研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，還可作為其他肝病研究的人源化動(dòng)物模型平臺(tái)。

附圖說明

圖1是對(duì)Alb-cre/DTR小鼠的基因定型結(jié)果

其中顯示，Alb-cre/DTR小鼠既含有Alb-cre轉(zhuǎn)基因，又含有DTR轉(zhuǎn)基因

圖2是Alb-cre/DTR和C57BL/6小鼠體重變化曲線

其中顯示在注射白喉毒素后Alb-cre/DTR小鼠的體重出現(xiàn)了顯著的降低，而C57BL/6的體重沒有顯著的變化（*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001）。

圖3是Alb-cre/DTR和C57BL/6小鼠ALT變化曲線

其中顯示在注射白喉毒素后Alb-cre/DTR小鼠的ALT值出現(xiàn)了 顯著的上升，隨后又逐漸下降，而C57BL/6的ALT值與注射白喉毒素之前相比沒有顯著的變化（*代表P<0.05；***代表P<0.001）。

圖4是Alb-cre/DTR和C57BL/6小鼠AST變化曲線

其中顯示在注射白喉毒素后Alb-cre/DTR小鼠的AST值出現(xiàn)了顯著的上升，隨后又逐漸下降，而C57BL/6的AST值與注射白喉毒素之前相比沒有顯著的變化（**代表P<0.01；***代表P<0.001）。

圖5是Alb-cre/DTR小鼠肝臟損傷后的肝臟組織

其中顯示Alb-cre/DTR小鼠的肝臟組織出現(xiàn)了明顯的病變，組織變白，有出血點(diǎn)，而C57BL/6小鼠的肝臟組織沒有出現(xiàn)異常。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1. 繁育和鑒定Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠

將Alb-cre與DTR小鼠雜交后，獲得Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過PCR的方法對(duì)雜交所得小鼠進(jìn)行基因定型，以確定含有Alb-cre和DTR基因；

2.腹腔注射白喉毒素

取SPF級(jí)Alb-cre/DTR小鼠，將0.3~1.25ng/g小鼠體重劑量的白喉毒素溶于200μl的PBS溶液中，通過腹腔注射的方式造模，得到可誘導(dǎo)的特異性肝臟損傷模型；以同周齡C57BL/6小鼠作為對(duì)照；

腹腔注射白喉毒素后，采小鼠血分離血清，檢測(cè)ALT和AST值是否升高，以確定是否發(fā)生肝損；

3.檢測(cè)肝損相關(guān)生化指標(biāo)的變化，以評(píng)價(jià)肝損造模是否成功。

結(jié)果表明，采用本發(fā)明所述構(gòu)建方法獲得的特異性肝損小鼠將為肝移植研究提供一種可行的動(dòng)物模型支撐，對(duì)于深入探討肝細(xì)胞移植和肝臟再生等研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，還可作為其他肝病研究的人源化動(dòng)物模型平臺(tái)。