本發(fā)明涉及具有對稱或不對稱結(jié)構(gòu)的羥基取代的二苯甲酮及其類似物在制備預(yù)防和治療病毒性感染和腫瘤藥物中的應(yīng)用。該類藥物可用于預(yù)防和治療艾滋病毒、皰疹病毒和人乳頭瘤病毒病毒性疾病和腫瘤，如口唇皰疹、生殖器皰疹、帶狀皰疹、扁平疣、尋常疣、尖銳濕疣、慢性宮頸炎、陰道炎、口腔癌、食道癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、皮膚癌、和肺癌。

背景技術(shù)：

羥基取代的二苯甲酮及其類似物是指二苯甲酮的兩個(gè)苯環(huán)上被一個(gè)以上羥基取代的衍生物，如2，2′-二羥基二苯甲酮、2，2′3′-三羥基二苯甲酮、2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，3，4-三羥基二苯甲酮、2，2′，3′-三羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮、2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮等。目前，這些羥基取代二苯甲酮及其類似物很多被用作紫外線吸收劑，也有個(gè)別用于心腦血管用藥，如依昔苯酮(Exifone；化學(xué)名2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮)是由法國Pharmascience開發(fā)并于1988年上市的智能改善藥，具有增加腦血流量，降低腦毛細(xì)血管通透性和提高學(xué)習(xí)記憶的功能。

艾滋病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、皰疹病毒(HSV)都具有整合進(jìn)入人體細(xì)胞、長期滯留的特征，但各自又有不同的遺傳和代謝特性。

HIV-1是導(dǎo)致艾滋病的病毒，它編碼三種酶：逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT，)、蛋白酶(Protease，PR)和整合酶(Integrase，IN)。這三種酶是HIV復(fù)制和感染所必需的基本酶。具有新穎作用機(jī)制的整合酶抑制劑可提高療效，并能與已有的抗艾滋病藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，組成新的有效的聯(lián)合療法。HIV-1整合酶(IN)是病毒復(fù)制所必需的三大基本酶之一，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA在整合酶的催化下插入宿主染色體內(nèi)，使之與人類染色體連成一體后，病毒便可以復(fù)制，整合酶控制 HIV侵入染色體，整合酶抑制劑能夠阻止HIV侵入正常細(xì)胞的染色體?，F(xiàn)在認(rèn)為，這是抗艾滋病藥物研制領(lǐng)域的一大突破。而且HIV-1整合酶以單一的活性部位與病毒和宿主兩種不同構(gòu)象的DNA底物作用，有可能限制HIV對整合酶抑制劑藥物產(chǎn)生抗藥性；加之整合酶只存在于病毒中，哺乳動物均無此類酶，因此HIV-1整合酶成為大有前景的抗HIV藥物設(shè)計(jì)的新型靶蛋白(Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.2001，4，402-410)。許多HIV-1整合酶抑制劑被鑒定出來，其中一些化合物顯示選擇性的抑制HIV-1整合酶和阻斷病毒復(fù)制的活性，而最有影響的兩類抑制劑是含鄰苯二酚的多羥基芳環(huán)化合物和最近報(bào)道的芳基β-二酮酸類化合物。但其結(jié)構(gòu)與羥基二苯甲酮有明顯區(qū)別。

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)能引起人類多種疾病，如齦口炎(gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感染宿主后，常在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳播鏈，周而復(fù)始的循環(huán)。目前缺乏有效治療皰疹病毒感染的藥物。

阿爾茲海默氏癥是最常見的老年癡呆癥疾病，病因仍然沒有定論，缺乏有效藥物。近些年來對阿爾茲海默氏癥的很多研究都揭示了1型單純皰疹病毒的感染和個(gè)體患阿爾茲海默氏癥之間的關(guān)系。大部分人在其機(jī)體都會攜帶有單純皰疹病毒，在機(jī)體感染初期病毒會異?；钴S引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生口腔潰瘍或口唇皰疹，皰疹病毒是嗜神經(jīng)病毒，感染后可進(jìn)入神經(jīng)組織，長期存在，現(xiàn)認(rèn)為貝它糊蛋白(Beta Amyloid Protein)斑塊堆積，是造成阿茲海默癥的主要原因，而1型單純皰疹病毒可能在這種斑塊形成時(shí)扮演重要角色。利用“原位聚合-連鎖反應(yīng)”(IS-PCR)的精密基因分析技術(shù)，研究人員在蛋白斑塊中偵測到1型單純皰疹病毒的DNA，顯示這種病毒有可能導(dǎo)致蛋白斑塊形成。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 時(shí)，1型單純皰疹病毒能助長貝它糊蛋白斑塊的形成。研究人員利用“原位聚合酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增”(IS-PCR)的基因分析技術(shù)，在蛋白斑塊中偵測到1型單純皰疹病毒的DNA，顯示這種病毒有可能導(dǎo)致蛋白斑塊形成。2014年10月22日，刊登在國際雜志Alzheimer′s&Dementia上的兩篇研究報(bào)道中，瑞典于默奧大學(xué)(Umea University)的研究人員通過研究發(fā)現(xiàn)，單純皰疹病毒的感染或可增加個(gè)體患阿爾茲海默氏癥的風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果清楚地解析了單純皰疹病毒感染和阿爾茲海默氏癥患病之間的關(guān)聯(lián)；在第一項(xiàng)研究中，研究者揭示，皰疹病毒的再度活化可以加倍個(gè)體患阿爾茲海默氏癥的風(fēng)險(xiǎn)，該研究對3432名個(gè)體平均進(jìn)行了長達(dá)11.3年的跟蹤研究；在第二項(xiàng)研究中，研究者對來自于默奧大學(xué)醫(yī)學(xué)生物庫中捐獻(xiàn)的360份阿爾茲海默氏癥患者的機(jī)體樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，如果個(gè)體攜帶有皰疹病毒，那么其患阿爾茲海默氏癥的風(fēng)險(xiǎn)會加倍。研究者表示，如我們利用抗病毒藥物來治療皰疹病毒的感染，有希望通過抗病毒的藥物來抑制并且治療個(gè)體的阿爾茲海默氏癥，可以開發(fā)治療阿爾茲海默氏癥的新型療法。

人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus；HPV)與誘發(fā)多種皮膚黏膜的炎癥和癌有密切關(guān)系，如尖銳濕疣、扁平疣、尋常疣、宮頸炎、宮頸糜爛、口腔癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、皮膚癌、肺癌和宮頸癌。尖銳濕疣、扁平疣和尋常疣，是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的皮膚黏膜良性新生物，為目前最常見的傳播病之一。人乳頭瘤病毒(HPV)有100多種亞型，已經(jīng)證明，其中一些高危亞型如16、18、33、52、58型的病毒可以整合進(jìn)入宮頸黏膜細(xì)胞的DNA中，其可誘發(fā)宮頸癌、口腔癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌和皮膚癌，現(xiàn)有的藥物不能將病毒殺滅，研究證明，高危型人乳頭瘤病毒與吸煙一樣是誘生肺癌的重要誘因。

HPV可經(jīng)胎盤和分娩過程導(dǎo)致母嬰垂直傳播，使下一代生下來就帶病毒，使預(yù)防性疫苗無法發(fā)揮作用。

近年研究結(jié)果表明(陳富強(qiáng)等，腫瘤防治雜志，2001，8(4)342-344；徐成康，中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19(3)：223-226)，29.3％的宮頸糜爛患者呈現(xiàn)HPV陽性，而正常宮頸陽性率只為11.1％。據(jù)報(bào)道(Ahn ws et al，J Cell Biochem Suppl，1997；28-29：133-139)，慢性宮頸炎中高危HPV(人乳頭瘤病毒)16、18型表達(dá)率為69％，高危型HPV16、18檢出率隨宮頸糜爛程度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢，顆粒型或乳突型糜爛HPV16、18檢出率與正常宮頸比較差異顯著。用PCR可測得宮頸癌中HPV16、18陽性率達(dá)83.33％，高危型HPV DNA整合到宿主細(xì)胞染色體，可產(chǎn)生E6、E7腫瘤蛋白，它們分別抑制抑癌基因p53和Rb，使細(xì)胞逃脫p53和Rb的控制，導(dǎo)致細(xì)胞周期控制失常，使通常處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞增生活躍、腫瘤生長。若HPV16、18型持續(xù)存在，就可使宮頸病變進(jìn)展。宮頸HPV感染與外陰感染不同，宮中以HPV16/18型為主，常不發(fā)生濕疣改變，而是以隱性感染長期存在，先引起不典型增生，當(dāng)有其他因子參與時(shí)而導(dǎo)致癌變。目前，較缺乏治療尖銳濕疣、宮頸糜爛的有效藥物，一些藥物如鬼臼毒素d，優(yōu)點(diǎn)是療程短，但存在刺激性、毒副作用大的問題。具體表現(xiàn)是疼痛、水腫、糜爛等。外用藥治療尖銳濕疣的重組人干擾素α-2β凝膠是目前公認(rèn)有效果的藥物。但由于這些藥物不能根除整合進(jìn)入人體細(xì)胞的病毒，使感染經(jīng)久不愈，轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤。

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康和生命。目前臨床應(yīng)用的化療藥物毒性較大，對實(shí)體瘤效果較差，接受化療的病人絕大多數(shù)最終都死于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，尋找低毒性而能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物是腫瘤化療研究的重要任務(wù)。

人們一直在研究開發(fā)抗HIV、HSV和HPV病毒感染以及抗腫瘤的新藥。

3，4，5-三羥基苯甲酸及其葡萄糖生成的衍生物具有抑制HIV-1整合酶的作用(Kane CJ等Planta Med 2002 May；68(5)：457-9)，但活性不高。

CN1234353C公開了3，4，5-三羥基苯甲酸用于抗腫瘤的用途，具體來說是抗肝癌和宮頸癌方面的用途。但已知3，4，5-三羥基苯甲酸在人體環(huán)境條件下不穩(wěn)定。

沒食子酸與烷基醇生成的酯比沒食子酸穩(wěn)定，但在體內(nèi)外弱堿性環(huán)境下，仍然容易被氧化破壞，由無色變至黃色，最后變成墨綠色.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供羥基取代的二苯甲酮及其類似物在制備預(yù)防和治療病毒性感染和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，尤其是用于制備預(yù)防和治療艾滋病毒(HIV)、皰疹病毒(Herpes simplex virus；HSV)、人乳頭瘤病毒(HPV)病毒性疾病藥物和腫瘤藥物的用途。

本發(fā)明中羥基取代的二苯甲酮及其類似物選自下述通式(1)所表示的化合物中的一種或幾種，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R’₁、R’₂、R’₃、R’₄、R’₅各獨(dú)立地選自O(shè)H或H并其中一個(gè)苯環(huán)上至少含一個(gè)OH；優(yōu)選R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R’₁、R’₂、R’₃、R’₄、R’₅中包括二個(gè)以上的OH；更優(yōu)選包括四個(gè)以上的OH；所述通式化合物選自以下化合物之一：2，2′-二羥基二苯甲酮、2，2′3′-三羥基二苯甲酮、2，3，4-三羥基二苯甲酮、2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮、2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮；更優(yōu)選自以下化合物之一：2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮、2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮；最優(yōu)選自以下化合物之一：2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮、 2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮。

通式(1)的羥基取代的二苯甲酮類化合物可在市場上購買或通過據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的合成反應(yīng)制備，二苯甲酮的合成方法有(1)氯化芐法；(2)苯與四氯化碳法；(3)苯與苯甲酰氯法，；(4)乙酸鉛法；(5)光氣法等。

例如，以水楊酸和間苯二酚為原料，無水氯化鋅為催化劑，氯苯為溶劑，通過Friedel-Crafts反應(yīng)可制備2，2’，4-三羥基二苯甲酮。

間苯二酚水溶液與三氯甲苯反應(yīng)可制備2，4-二羥基二苯甲酮。

以對羥基苯甲酸和苯酚為原料，氯化鋅、三氯氧磷為催化劑，通過FriedelCrafts反應(yīng)可制備4，4′-二羥基二苯甲酮。

以焦性沒食子酸和對羥基苯甲酸為原料可制備2，3，4，4’四羥基二苯甲酮。

各種羥基取代的二苯甲酮及其類似物及對照物均由DMSO助溶，再溶于適量蒸餾水，供測試抑制HIV整合酶、抑制HSV、HPV病毒活性用。

本發(fā)明設(shè)計(jì)抗艾滋病毒是基于HIV-1整合酶與其抑制劑相互作用的晶體結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系，由于HIV-1整合酶表現(xiàn)出以二聚或四聚體形式起催化作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，13040-13043)，但低聚體的精確性質(zhì)仍未知，因此，我們從具有抗病毒活性的羥基苯甲酸類化合物出發(fā)，通過縮合生成羥基取代二苯甲酮類化合物，以獲取高活性的抗病毒劑。本發(fā)明測定了各個(gè)化合物的HIV-1整合酶抑制活性以及抗HSV、HPV和抑制多種腫瘤細(xì)胞生長的 活性。

HIV-1整合酶抑制試驗(yàn)

藥理數(shù)據(jù)顯示，這類羥基取代的二苯甲酮類化合物具有非常高的HIV-1整合酶抑制活性，對于底物的3’端切斷和鏈轉(zhuǎn)移的半抑制濃度IC₅₀均在88.92-10.20μg/ml范圍內(nèi)，其中最好的化合物的抑制活性高于羥基苯甲酸的單體化合物。HIV-1整合酶的作用機(jī)制是兩步反應(yīng)：1)3’端加工(3′Processing)：整合酶結(jié)合前病毒DNA的長末端重復(fù)區(qū)域(LTR)的特定序列形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后進(jìn)行核苷3’端的內(nèi)切核苷酸解加工，特異性地切掉序列...CAGT-3’末端的GT二核苷酸，露出凹進(jìn)的3’位羥基；2)鏈轉(zhuǎn)移(Strand Transfer)：加工過的DNA/整合酶預(yù)整合復(fù)合物穿過核膜進(jìn)入核子中心，與宿主的DNA結(jié)合，然后整合酶催化病毒DNA凹進(jìn)的3’位羥基通過酯交換反應(yīng)嵌入宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)，成為成熟的前病毒。因此，整合酶抑制劑的活性表現(xiàn)在對病毒DNA的3’端切除的抑制或鏈轉(zhuǎn)移的抑制，以半抑制濃度IC₅₀來表征。

體外整合酶測試使用合成的30個(gè)寡核苷酸作供體底物，用合成的20個(gè)寡核苷酸作為靶底物，在96孔板包被供體底物加入純化的HIV-1整合酶，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，檢測靶DNA的鏈轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，酶標(biāo)儀測定OD值。

首先，在反應(yīng)體系中加入樣品可用于篩選該酶的抑制劑。樣品臨用前用DMSO配成適當(dāng)濃度，再作5倍稀釋，4個(gè)稀釋度。樣品稀釋后加入供體底物包被96孔板中，并加入含有基因工程整合酶靶酶和biotin-靶底物的反應(yīng)Buffer中，在最佳反應(yīng)條件下孵育，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，測定405nm吸收值OD值。

抗皰疹病毒I、II型(HSV-I、II)抑制實(shí)驗(yàn)

以Vero(非洲綠猴腎)細(xì)胞為病毒宿主，測定樣品抑制皰疹病毒I、II型引起Vero細(xì)胞病變程度。

病毒HPV的抑制試驗(yàn)

上述化合物和/或含有上述化合物的組合物能有效地殺滅和抑制HPV6/11、16/18型，可用于制備預(yù)防和治療HPV的病毒感染和的藥物，預(yù)防和治療尖銳濕疣、扁平疣、尋常疣、陰道、宮頸炎及宮頸糜爛、宮頸癌、食道癌和其它由HPV引起的癌癥。本發(fā)明通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HPV病毒的量的改變來觀察活性成分和產(chǎn)品效果，該方法已在數(shù)篇公開發(fā)表的文獻(xiàn)中應(yīng)用(蔡有齡等，中國性病艾滋病防治，2002，8：2，108；吳元勝、范瑞強(qiáng)等，實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2003，3：2，1)。

上述化合物和/或含有上述化合物的組合物作為活性成分的有效劑量，可用于制備治療人和動物病毒性疾病藥物，特別是用于治療人和動物皰疹病毒(HSV)、艾滋病(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)等病毒性疾病，包括但不限于艾滋病、尖銳濕疣、扁平疣、尋常疣、單純皰疹、帶狀皰疹、陰道、宮頸炎、宮頸糜爛、宮頸癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌和以及由皰疹病毒誘生的帶狀皰疹、口唇皰疹、口腔潰瘍、生殖器皰疹和老年性癡呆。以及通過減少高危型人乳頭瘤病毒載量、減少由高危人乳頭瘤病毒誘生的宮頸癌、口腔癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、皮膚癌和肺癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，起到化學(xué)預(yù)防癌癥(Chemoprevention of Cancer)的作用。

腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)

藥理數(shù)據(jù)顯示，上述化合物和/或含有上述化合物的組合物作為活性成分的有效劑量，可用于制備治療人和動物腫瘤的藥物，這類羥基取代的二苯甲酮化合物具有非常高的腫瘤細(xì)胞抑制活性。

上述化合物和/或含有上述化合物的組合物作為活性成分的有效劑量，具有抑制腫瘤細(xì)胞作用。本發(fā)明利用藍(lán)四唑法，檢測羥基取代的二苯甲酮類化合物對體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

噻唑鹽(MTT)比色法

該方法是一種細(xì)胞活力的檢測方法，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可使外源的MTT(2.5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱噻唑鹽)，還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉淀于細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，可用二甲基亞砜(DMSO)異丙醇或10％酸化SDS(十二烷基硫酸鈉)將顆粒溶解，用酶標(biāo)儀在A570波長處測OD值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，該法用于細(xì)胞因子生物活性檢測，抗腫瘤藥物及腫瘤放射敏感性及細(xì)胞毒試驗(yàn)的測定，特點(diǎn)是簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，無需采用放射性核素。目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選及新鮮腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性檢測。方法如下：

(1)用0.25％胰蛋白酶消化法制備的腫瘤細(xì)胞懸液，用10％小牛血清的RPMI1640整細(xì)胞濃度為10⁵/ml，于96孔板中每孔加100ul，培養(yǎng)24小時(shí)后加不同劑量藥物100ul/孔，設(shè)陰性對照組，陽性對照組和調(diào)零孔，每組4個(gè)平行孔。

(2)37℃5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)終止前，每孔加入MTT溶液(5g/L)，方法同第九章第5節(jié)。用酶標(biāo)儀檢測A570nm的OD值，以不加藥的陰性對照組A570的OD值均數(shù)作為對照，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率及藥物對細(xì)胞的抑制率：

細(xì)胞抑制率(％)＝(1-試驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100％

用細(xì)胞存活率對劑量對數(shù)作圖，并按作圖法求出IC₅₀值。

以下將以實(shí)例進(jìn)行說明，但保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)例。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所采用的主要材料(含量均大于99％)及其來源：

材料來源

沒食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸)南京龍?jiān)刺烊欢喾雍铣蓮S

沒食子酸丙酯(3，4，5-三羥基苯甲酸丙酯)南京龍?jiān)刺烊欢喾雍铣蓮S

2，3-二羥基苯甲酸 臺州市中大化工有限公司

3，4-二羥基苯甲酸 臺州市中大化工有限公司

2，2′-二羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，2′3′-三羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，3，4-三羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮 上海立誠化工有限公司

實(shí)施例1羥基取代的二苯甲酮及其類似物溶液的制備

分別取2，3-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、3，4，5-三羥基苯甲酸、沒食 子酸丙酯、2，2′-二羥基二苯甲酮、2，2′3′-三羥基二苯甲酮、2，3，4-三羥基二苯甲酮、2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，4′，5-六羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮、2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮各5g，各加20ml DMSO、50ml滅菌蒸餾水，混合，調(diào)節(jié)pH至5.5，各加蒸餾水總體積為100ml，得各種5％羥基取代的二苯甲酮及其類似物溶液.

實(shí)施例2抗HPV病毒外用制劑

取2，3，3′，4，4′，5′六羥基二苯甲酮3g，加20ml聚乙二醇400、50ml滅菌蒸餾水，混合，調(diào)節(jié)pH至5.5，加滅菌蒸餾水至總體積為100ml，得3％抗HPV病毒外用制劑。

實(shí)施例3復(fù)方2，3，4，2′，3’，4′-六羥基二苯甲酮泡騰片的制備

取2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮0.25g、酒石酸0.45g分別過80目篩，以無水乙醇制成軟材，過12目篩制濕粒，于50℃干燥，備用。另取碳酸氫鈉0.65g、糊精0.02g加無菌蒸餾水制軟材，過12目篩制濕粒，于50℃干燥，然后與上述干?；旌?，整粒，加適量滅菌蒸餾水，烘片刻，加0.01g PEG6000?；靹颍瑝浩?，即得。

實(shí)施例4樣品抑制HIV-1整合酶報(bào)告

一、測試原理：

用合成的30個(gè)寡核苷酸作供體底物，用合成的20個(gè)寡核苷酸作為靶底物，在96孔板包被供體底物加入純化的HIV-1整合酶，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，檢測靶DNA的鏈轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，酶標(biāo)儀測定OD值。在反應(yīng)體系中加入樣品可用于篩選該酶的抑制劑。

二、測試材料和方法：

1.HIV-1 IN：中國國家新藥篩選中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提取并保存。

2.樣品處理：樣品A1-A10共10個(gè)樣品，臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，再作5倍稀釋，4個(gè)稀釋度。供體底物和靶底物：上海生工合成。

3.測試方法：樣品稀釋后加入供體底物包被96孔板中，并加入含有基因工程靶酶和biotin-靶底物的反應(yīng)Buffer中，在最佳反應(yīng)條件下孵育，以生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，測定405nm吸收值OD值。

二、測試結(jié)果：

表1抑制HIV-1 IN實(shí)驗(yàn)初篩報(bào)告

注：表中“-”表示樣品在初始濃度抑制HIV-1 IN活性的百分率小于50％。

結(jié)論：體外藥物抑制HIV-1 IN實(shí)驗(yàn)初篩結(jié)果顯示：樣品2，2′-二羥基二苯甲酮、2，2′3′-三羥基二苯甲酮、2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，3，4-三羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮和2，3，3’，4，4′，5-六羥基二苯甲酮抑制HIV-1IN的半數(shù)有效濃度(IC₅₀)分別為15.32μg/ml、10.46μg/ml、11.23μg/ml、12.11μg/ml、9.12μg/ml和10.51μg/ml。其它樣品抑制HIV-1 IN活性的IC₅₀＞109μg/ml。

實(shí)施例5熒光定量PCR檢測HPV病毒篩選藥物實(shí)驗(yàn)

分別按取實(shí)施例1中所得的溶液為供試樣品，生理鹽水空白對照。

HPV病毒來源：

來自多位病人臨床標(biāo)準(zhǔn)的尖銳濕疣標(biāo)本，切取后，用生理鹽水洗去血液， 在無菌條件下，將標(biāo)本剪碎，加入3倍體積生理鹽水混勻、研磨成勻漿放置-40℃?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)方法：

取每種供試藥品DMSO液及生理鹽水各50μl，分別加入尖銳濕疣組織勻漿50μl，37℃溫育24小時(shí)，然后按達(dá)安基因診斷中心提供的HPV6，11和16，18型FQ-PCR診斷試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行檢測，采用常規(guī)堿裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反應(yīng)管中，同時(shí)加入一定濃度的引物、F-PROBE、DNTP、DNA聚合酶及緩沖液等，用ABI PRISM^TM 7700熒光定量PCR擴(kuò)增儀，93℃2min予變性后，按93℃45s，55℃120s，反復(fù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，定量結(jié)果由電腦軟件自動分析計(jì)算出初始拷貝數(shù)的定量結(jié)果。數(shù)據(jù)見表1。

表2熒光定量PCR檢測HPV病毒篩選藥物實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示：尖銳濕疣的組織勻漿在加入受試化合物后24小時(shí)后，2，2′-二羥基二苯甲酮、2，2′3′-三羥基二苯甲酮、2，4，2′，4′四羥基二苯甲酮、2，3，4-三羥基二苯甲酮、2，3，4，2′，3′，4′-六羥基二苯甲酮和2，3，3’4，4′，5-六羥基二苯甲酮與3，4，5-三羥基苯甲酸及沒食子酸丙酯不能再檢出HPV 6/11和HPV16/18病毒；3，4-二羥基苯甲酸和 2，3-二羥基苯甲酸組卻具有較高濃度的HPV6/11和HPV16/18病毒量，空白組有很高的HPV6/11和HPV16/18病毒量，說明本發(fā)明的化合物在體外具有能快速有效地殺滅HPV病毒的能力。

實(shí)施例6抗皰疹病毒I、II型(HSV-I、II)抑制實(shí)驗(yàn)

一、測試原理：以Vero(非洲綠猴腎)細(xì)胞為病毒宿主，測定樣品抑制皰疹病毒I、II型引起Vero細(xì)胞病變程度。

二、測試材料和方法：

1.病毒株：HSV-I，VR733株；HSV-II，SAV株；均由ATCC提供。

2.樣品處理：樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，檢測時(shí)用培養(yǎng)液作3倍稀釋，共8個(gè)稀釋度。

3.陽性對照藥：無環(huán)鳥苷(ACV)，由湖北科益制藥廠生產(chǎn)。

4.測試方法：Vero細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后分別感染皰疹病毒I型10^-3(50倍TCID₅₀感染量)、皰疹病毒II型10^-4(10倍TCID₅₀感染量)，吸附2小時(shí)，棄病毒液，按以上稀釋度加入樣品及陽性對照藥，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照孔和病毒對照孔，48小時(shí)觀察細(xì)胞病變程度(CPE)，用Reed-Muench法分別計(jì)算樣品對皰疹病毒I、II型的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

三、測試結(jié)果：

表3抗皰疹病毒I、II型(HSV-I、II)活性篩選報(bào)告

汪：(1)表中“-”表示樣品在最大無毒劑量無抗皰疹病毒活性。

(2)TC₅₀：半數(shù)有毒濃度；IC₅₀：對病毒半數(shù)抑制濃度；SI：選擇指數(shù)，SI＝TC₅₀/IC₅₀。

結(jié)果顯示：在加入受試化合物后后，上述各種羥基取代的二苯甲酮對HSVI和HSV-II都有不同的抑制率。

實(shí)例7化合物體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

一、測試材料

1、腫瘤細(xì)胞株：人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251)，人結(jié)腸癌細(xì)胞株(LOVO)，人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，人肺癌細(xì)胞株(PC84045)，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(JEC)，人腎癌細(xì)胞株(GRC)，人胃癌細(xì)胞株(MCG804)，人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)，人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)均購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

2、測試主要儀器和試劑：CO₂濕化孵箱：Sheldon公司；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備廠；酶標(biāo)儀：Biored公司；胰蛋白酶(Trypsin)：Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：Gibco公司；96孔培養(yǎng)板，Corning公司；新生牛血清：杭州四季清公司；

二、測試方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)：腫瘤細(xì)胞系按常規(guī)方法培養(yǎng)于含15％新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37℃含5％CO₂濕化孵箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察生長情況。約3-5天傳代一次，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25％胰酶消化，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力，細(xì)胞活力＞95％用于正式實(shí)驗(yàn)。

2、MTT法

配液：配液：將化合物分別用代號進(jìn)行標(biāo)記，DMSO溶解每種化合物，細(xì)菌過濾器除去細(xì)菌，每種化合物配成10^-4g/ml，10^-5g/ml，10^-6g/ml，保存在4℃待用。

MTT法：取培養(yǎng)4-5天，處于指數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)一瓶，加入適量Trypsin-EDTA液，使貼壁細(xì)胞脫落，用10ml含15％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成懸液；用臺盼藍(lán)染色后再血球計(jì)數(shù)板上做細(xì)胞計(jì)數(shù)，使活細(xì)胞在97％以上；用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液配成每100ml含5000～400000個(gè)細(xì)胞；用96孔平板，每孔加細(xì)胞懸液200ul。將96孔板置于37℃，5％CO₂溫箱24小時(shí)；受試化合物作3個(gè)稀釋度，每種濃度平行五個(gè)孔；同時(shí)設(shè)無血清RPMI1640為對照組。將96孔板在37℃，5％CO2及100％濕度的溫箱中孵育3天；MTT用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配成1mg/ml溶液，每孔加50ul，37℃溫育4小時(shí)，使MTT還原成甲鐟；吸出上清液，加入200ulDMSO使甲鐟溶解，用平板搖床振蕩5分鐘搖勻；用酶標(biāo)儀計(jì)測量吸光值，測量波長570nm，參比波長630nm處測定每個(gè)小孔的吸光度值，所獲數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算細(xì)胞的抑制率。

抑制率％＝(1-樣品組吸光度平均值/溶劑組吸光度平均值)×100％

3、結(jié)果判斷

抑制率＞50％為敏感；

30％～50％為中度敏感；

＜30％為不敏感

三、測試結(jié)果與分析

表4化合物體外對腫瘤細(xì)胞抑制報(bào)告

結(jié)果顯示：在加入受試化合物后3天后，上述各種羥基取代二苯甲酮對各種腫瘤細(xì)胞都有不同的抑制率，人肺癌細(xì)胞株(PC84045)，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(JEC)，人腎癌細(xì)胞株(GRC)，人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)，人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)的較明顯抑制。說明本發(fā)明羥基取代的二苯甲酮化合物及其類似物抑制腫瘤細(xì)胞的效果較好。

實(shí)施例8羥基取代的二苯甲酮穩(wěn)定性觀察

分別配置pH7.4，濃度為0.5％的沒食子酸、沒食子酸丙酯、2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮和2，3，3’，4，，4′，5-六羥基二苯甲酮溶液，放置12小時(shí)，沒食子酸、沒食子酸丙酯溶液分別由淡黃色變?yōu)楹诩熬G色，而2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮和2，3，3’，4，，4′，5-六羥基二苯甲酮溶液保持淡黃色不變，說明2，2’，3，4，4’-五羥基二苯甲酮和2，3，3’，4，，4′，5-六羥基二苯甲酮更穩(wěn)定。