本發(fā)明屬于藥物研發(fā)領域，尤其涉及細辛醚或含有細辛醚的物質(zhì)在制備促進神經(jīng)干細胞增殖藥物中的用途。

背景技術(shù)：

在哺乳動物大腦中，神經(jīng)干細胞(neural progenitor cells,NPC)的增殖和自我更新持續(xù)于整個生命過程，是神經(jīng)再生(neurogenesis)的重要環(huán)節(jié)。在衰老、長期壓力以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)生的情況下，神經(jīng)干細胞的增殖和自我更新能力下降，導致認知功能受損。促進神經(jīng)再生被認為是抵抗衰老和衰老相關神經(jīng)退行性疾病的潛在治療手段。因此，一種可能的方案是移植胚胎神經(jīng)干細胞或者體外誘導的神經(jīng)干細胞來進行細胞替換療法。但是，這種新創(chuàng)的復雜技術(shù)目前還存在一定爭議，尤其是它們的安全性問題和細胞來源等問題。另一種方案是用藥理學手段來激活內(nèi)源的神經(jīng)干細胞，以達到治療神經(jīng)退行性疾病的目的。藥理學手段操作簡便，并且可以特異性靶向神經(jīng)干細胞的特定功能，因此，激活內(nèi)源神經(jīng)干細胞不僅是一種可行的治療手段，還能作為預防手段。

神經(jīng)干細胞的增殖受到許多細胞外信號和細胞內(nèi)信號通路的調(diào)控。在生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子或其他形態(tài)建成因子的刺激下，細胞內(nèi)關鍵的信號通路，如ERK和Akt級聯(lián)反應被激活。研究表明，調(diào)控這些信號通路的化合物能夠促進神經(jīng)干細胞增殖和自我更新。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些中草藥來源的天然產(chǎn)物促進神經(jīng)干細胞的增殖，揭示了這些中藥益智作用的可能機制。中藥石菖蒲(AT)來源于植物石菖蒲(Acori tatarinowii)的根，主治老年癡呆、健忘、中風等大腦疾病，在中藥復方中作為“君”藥被沿用至今?，F(xiàn)代藥理學研究表明，石菖蒲具有神經(jīng)保護功能，改善衰老、健忘和腦缺血模型動物的學習記憶能力。但是，石菖蒲是否以及如何影響神經(jīng)干細胞的增殖和自我更新還不知道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了細辛醚或含有細辛醚的物質(zhì)在制備促進神經(jīng)干細胞增殖藥物中的用途。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的第一方面，提供了細辛醚或含有細辛醚的物質(zhì)在制備促進神經(jīng)干細胞增殖藥物中的用途。

優(yōu)選的，所述細辛醚選自α-細辛醚、β-細辛醚、γ-細辛醚中任意一種或多種的組合。

優(yōu)選的，所述細辛醚為促進神經(jīng)干細胞增殖藥物的藥效成分之一或唯一藥效成分。

進一步的，所述的細辛醚可以通過市購途徑獲得，也可以從含有細辛醚的物質(zhì)中提取獲得。

優(yōu)選的，所述含有細辛醚的物質(zhì)為石菖蒲或石菖蒲有效成分提取物。

進一步的，所述的石菖蒲來源于植物石菖蒲(Acori tatarinowii)的根。所述的石菖蒲可以通過市購途徑獲得。

本技術(shù)領域的技術(shù)人員可采用各種常規(guī)方式直接將石菖蒲或石菖蒲有效成分提取物作為用于促進神經(jīng)干細胞增殖的藥物或者生產(chǎn)該類藥物的原料。

進一步的，所述石菖蒲有效成分提取物可采用下列方法制得：將石菖蒲干燥根部用乙醇回流提取，得到的提取物合并后蒸發(fā)濃縮獲得石菖蒲有效成分提取物。

優(yōu)選的，所述乙醇為60％乙醇。所述回流提取具體為回流提取3次，每次2h。

優(yōu)選的，石菖蒲或石菖蒲有效成分提取物為所述促進神經(jīng)干細胞增殖藥物的藥效成分之一或唯一藥效成分。

優(yōu)選的，所述促進神經(jīng)干細胞增殖藥物為對抗衰老和神經(jīng)退行性疾病的藥物。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于促進神經(jīng)干細胞增殖的藥物制劑，其主要藥效成分為細辛醚、石菖蒲、或石菖蒲有效成分提取物。

進一步的，本發(fā)明的用于促進神經(jīng)干細胞增殖的藥物制劑還包括一種或多種常規(guī)的藥學上可接受的輔料。主藥藥效成分與藥學上可接受輔料的總重量比例可為1∶0.1～10。

藥學上可接受的輔料包括(但并不限于):藥物可接受的載體、稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑及其它賦形劑。本領域枝術(shù)人員已知的治療惰性的無機或有機的載體包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，諸如此類，各種防腐劑、潤滑劑、分散劑、矯味劑。保濕劑、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖液諸如此類也可加入其中，這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味。

本發(fā)明的藥物制劑可以為口服制劑，如膠囊、片劑、分散片、口含片、咀嚼片、泡騰 片、緩釋片、顆粒劑等。

本發(fā)明的藥物制劑可采用常規(guī)方法制備，如將各有效成分混勻，或者根據(jù)各種制劑的常規(guī)制法，將藥效成分與相應輔料混配后制備獲得。本發(fā)明的藥物制劑還可與其他治療劑一起使用。

本發(fā)明的藥物制劑可用于促進神經(jīng)干細胞增殖。優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物制劑可用于對抗衰老和神經(jīng)退行性疾病。

本發(fā)明的藥物制劑的有效治療劑量應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，口服石菖蒲能夠促進野生型小鼠、轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠以及年老小鼠的海馬神經(jīng)再生。在體外和體內(nèi)實驗中，石菖蒲及其活性成分細辛醚促進神經(jīng)干細胞增殖。石菖蒲和細辛醚激活ERK級聯(lián)反應而不影響Akt級聯(lián)反應。本發(fā)明的研究表明，口服石菖蒲和細辛醚不僅能夠預防，還能作為一種促進神經(jīng)再生的治療手段，來對抗衰老和神經(jīng)退行性疾病相關的認知功能下降。

附圖說明

圖1：AT促進成年小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)再生。(A)檢測神經(jīng)干細胞增殖的實驗設計圖示。(B，C)小鼠給藥(B)對照溶劑(Ctrl)或(C)AT，方案如圖(A)所示，對其海馬DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色)和DAPI(藍色)。標尺,100um。(D)BrdU+細胞的定量統(tǒng)計。每組N＝5-6。(E，F(xiàn))用免疫熒光的方法檢測(E)對照溶劑(Ctrl)給藥或(F)AT給藥的小鼠DG區(qū)的GFAP(紅色)、Nestin(綠色)和BrdU(灰色)。標尺，25um。(G)定量統(tǒng)計GFAP+Nestin+BrdU+細胞數(shù)。每組N＝5-6。(H，I)對(H)對照溶劑(Ctrl)給藥或(I)AT給藥的小鼠DG區(qū)進行Tbr2(綠色)、BrdU(紅色)和DAPI(藍色)共染。標尺，100um。(J)定量統(tǒng)計Tbr2+BrdU+細胞數(shù)。每組N＝5-6。(K，L)用免疫熒光的方法檢測(K)對照溶劑(vehicle)給藥或(L)AT給藥的小鼠DG區(qū)的Ki67(紅色)、Dcx(綠色)和DAPI(藍色)。標尺，100um。(M)定量統(tǒng)計Dcx+Ki67-細胞數(shù)。每組N＝5-6。(N)檢測神經(jīng)干細胞分化實驗設計圖示。(O，P)小鼠給藥(O)對照溶劑(vehicle)或(P)AT，方案如圖(N)所示，對其海馬DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色) 和NeuN(綠色)。標尺，100um。(Q)BrdU+NeuN+細胞的定量統(tǒng)計。每組N＝7。(R)BrdU+NeuN+細胞占BrdU+細胞的比例。每組N＝7。右下方小圖為高倍鏡下拍攝，標尺為10um。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，雙尾t檢驗。

圖2：AT對于成體海馬神經(jīng)再生的影響。(A)小鼠給藥溶劑對照(Ctrl)或AT 28天，檢測其大腦顆粒細胞層的體積。每組N＝5-6。(B)定量統(tǒng)計Ki67+細胞數(shù)。每組N＝5-6。(C-E)用免疫熒光的方法檢測(D)對照溶劑(Ctrl)給藥或(E)AT給藥的小鼠DG區(qū)的Sox2(綠色)和DAPI(藍色)；并進行定量統(tǒng)計(C)。標尺，100um。每組N＝3。(F-G)用免疫熒光的方法(F)檢測小鼠DG區(qū)的Ki67(紅色)、Dcx(綠色)和DAPI(藍色)；并定量統(tǒng)計Dcx+Ki67+細胞數(shù)。標尺，10um。(H)定量統(tǒng)計Dcx和TUNEL雙陽性細胞。每組N＝3。(I)在AT給藥的小鼠海馬DG區(qū)切片中共染c-Fos(藍色)、BrdU(紅色)和NeuN(綠色)。標尺，10um。(J)實驗方案見圖1N。小鼠DG區(qū)切片中共染GFAP、NeuN和BrdU，并定量統(tǒng)計GFAP+BrdU+細胞數(shù)。N＝4-5每組。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，雙尾t檢驗。

圖3：AT促進老年小鼠和轉(zhuǎn)基因AD小鼠的海馬神經(jīng)再生。(A，B)18-23個月大的老年小鼠口服給藥(A)溶劑對照(Ctrl)和(B)AT 28天，并在最初7天同時注射BrdU。實驗方案見圖1N。DG切片進行BrdU(紅色)和NeuN(綠色)的染色。(C)定量統(tǒng)計BrdU+NeuN+細胞數(shù)。每組N＝7。(D)BrdU+NeuN+在BrdU+細胞中的比例。每組N＝7。(E-H)野生型(WT)和APP/PS1小鼠口服給藥溶劑對照(Ctrl)和AT 17天，并在最后7天注射BrdU。對小鼠的DG切片進行BrdU(紅色)和DAPI(藍色)的染色。(I)定量統(tǒng)計BrdU+細胞數(shù)。每組N＝6-8。(J-M)在溶劑對照(Ctrl)和AT給藥的野生型和APP/PS1小鼠的DG腦片中進行Ki67(紅色)和DAPI(藍色)的染色。(N)定量統(tǒng)計Ki67+細胞數(shù)。每組N＝6-8。(O-R)在溶劑對照(Ctrl)和AT給藥的野生型和APP/PS1小鼠的DG切片中進行BrdU(紅色)和NeuN(綠色)的染色。實驗方案見圖1N。(S)定量統(tǒng)計BrdU+細胞數(shù)。每組N＝5。(T)定量統(tǒng)計BrdU+NeuN+細胞數(shù)。每組N＝5。(U)BrdU+NeuN+在BrdU+細胞中的比例。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，one-way ANOVA分析。標尺，100um。右下方小圖為高倍鏡下拍攝，標尺為10um。

圖4：體外AT促進神經(jīng)干細胞增殖。(A-C)在減生長因子(1ng/ml EGF和1ng/ml bFGF)的培液中貼壁培養(yǎng)成體海馬神經(jīng)干細胞，并用不同濃度的AT處理細胞24小時。細胞固定前2小時加入EdU。DMSO(A，Ctrl)或0.1mg/ml AT(B)處理的細胞進行EdU(紅色)和DAPI(藍色)染色。(C)定量統(tǒng)計EdU+細胞的比例。(D-F)在無生長因子的培液 中貼壁培養(yǎng)成體海馬神經(jīng)干細胞，并用不同濃度的AT處理細胞14小時。細胞固定前2小時加入EdU。DMSO(D，Ctrl)或0.1mg/ml AT(E)處理的細胞進行EdU(紅色)和DAPI(藍色)染色。(F)定量統(tǒng)計EdU+細胞的比例。(G-I)在減生長因子的培液中貼壁培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞，并用不同濃度的AT處理細胞24小時。細胞固定前2小時加入EdU。DMSO(G，Ctrl)或0.1mg/ml AT(H)處理的細胞進行EdU(紅色)和DAPI(藍色)染色。(I)定量統(tǒng)計EdU+細胞的比例。(J-L)在無生長因子的培液中貼壁培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞，并用不同濃度的AT處理細胞14小時。細胞固定前2小時加入EdU。DMSO(J，Ctrl)或0.1mg/ml AT(K)處理的細胞進行EdU(紅色)和DAPI(藍色)染色。(L)定量統(tǒng)計EdU+細胞的比例。定量結(jié)果表示為8次實驗的平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，one-way ANOVA分析。標尺，100um。

圖5：體外AT對神經(jīng)干細胞分化的影響。(A)成體神經(jīng)干細胞表達Nestin(綠色)和(Sox2)。(B)胚胎神經(jīng)干細胞表達Nestin(綠色)和(Sox2)。(C)成體海馬神經(jīng)干細胞在體外分化5天后，細胞表達Tuj 1(綠色，神經(jīng)元標志物)或GFAP(紅色，星型膠質(zhì)細胞標志物)。(D)定量統(tǒng)計AT處理的細胞在分化5天后Tuj 1+細胞的比例(左圖)和GFAP+細胞的比例(右圖)。定量結(jié)果表示為5次實驗的平均值±標準誤；one-way ANOVA分析。標尺，100um。

圖6：細辛醚是AT促進神經(jīng)干細胞增殖的主要活性成分。(A)石菖蒲成分的提取和拆分。(B)在減生長因子(1ng/ml EGF和1ng/ml bFGF)的培養(yǎng)條件下，3個組分分別處理的胚胎神經(jīng)細胞中的EdU+細胞的比例。(C)α-細辛醚、β-細辛醚和2個結(jié)構(gòu)類似物處理的胚胎神經(jīng)干細胞中的EdU+細胞比例。(D)細辛醚處理的成體海馬神經(jīng)細胞中的EdU+細胞的比例。(E)用DMSO(Ctrl)、1uMα-細辛醚和1uMβ-細辛醚處理成體海馬神經(jīng)干細胞，并對EdU(紅色)和DAPI(藍色)染色。(F)在無生長因子的培養(yǎng)條件下，細辛醚處理的成體海馬神經(jīng)細胞中的EdU+細胞的比例。(G)在無生長因子(1ng/ml EGF和1ng/ml bFGF)的培養(yǎng)條件下，細辛醚處理的成體海馬神經(jīng)細胞中的EdU+細胞的比例。定量結(jié)果表示為8次實驗的平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，one-way ANOVA分析。標尺，100um。

圖7：高效液相色譜分析AT、ATE、ATB和ATW。β-asarone，tR＝25.0min；α-asarone,tR＝27.3min。

圖8：細辛醚對神經(jīng)干細胞分化和神經(jīng)突觸生長的影響。(A)在無生長因子的培液中貼壁培養(yǎng)成體海馬神經(jīng)干細胞，并用不同濃度的3各組分處理細胞14小時。細胞固定前2 小時加入EdU。對EdU染色，并定量統(tǒng)計EdU+細胞的比例。N＝8次獨立實驗。(B)在無生長因子的培養(yǎng)條件下，α-細辛醚、β-細辛醚和2個結(jié)構(gòu)類似物處理的胚胎神經(jīng)干細胞中的EdU+細胞比例。N＝8次獨立實驗。(C)定量統(tǒng)計細辛醚處理的成體海馬神經(jīng)細胞在分化5天后Tuj 1+細胞的比例(左圖)和GFAP+細胞的比例(右圖)。(D-F)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元在培養(yǎng)的第3-7天用AT或細辛醚處理，并對MAP2進行免疫熒光染色，來檢測神經(jīng)突觸生長。(D)用DMSO(Ctrl)、10ug/ml AT、0.1uMα-細辛醚或0.1uMβ-細辛醚處理的細胞，對MAP2(紅色)和DAPI(藍色)進行染色。(E)定量統(tǒng)計MAP2+神經(jīng)元的突觸長度。N＝4次獨立實驗。(F)定量統(tǒng)計每個細胞的平均突觸數(shù)。N＝4次獨立實驗。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，one-way ANOVA分析。標尺，100um。

圖9：AT和細辛醚對成神經(jīng)細胞瘤細胞系增殖的影響。在無血清的培液中用不同藥物處理SH-SY5Y細胞2天，用MTT法分析細胞增殖。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；***P＜0.001，one-way ANOVA分析。

圖10：細辛醚促進成體海馬神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)再生。(A)檢測神經(jīng)干細胞增殖實驗設計圖示。(B-D)8周大的小鼠給藥(B)對照溶劑(Ctrl)，(C)α-細辛醚或(D)β-細辛醚，方案如圖(A)所示，對其海馬DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色)和DAPI(藍色)。(E)BrdU+細胞的定量統(tǒng)計。每組N＝5-6。(F)檢測神經(jīng)干細胞分化實驗設計圖示。(G-I)小鼠給藥(G)對照溶劑(Ctrl)，(H)α-細辛醚或(I)β-細辛醚，方案如圖(F)所示，對其海馬DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色)和NeuN(綠色)。(E)BrdU+NeuN+細胞的定量統(tǒng)計。每組N＝4-7。(K)BrdU+NeuN+細胞在BrdU+細胞中的比例。每組N＝4-7。(L-N)18-23個月大的小鼠給藥(L)對照溶劑(Ctrl)，(M)α-細辛醚或(N)β-細辛醚，方案如圖(F)所示，對其海馬DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色)和NeuN(綠色)。(O)BrdU+NeuN+細胞的定量統(tǒng)計。每組N＝5-7。(P)BrdU+NeuN+細胞在BrdU+細胞中的比例。每組N＝5-7。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，***P＜0.001，one-way ANOVA分析。標尺，100um。

圖11：細辛醚對成體海馬神經(jīng)再生的影響。(A-C)實驗方案如圖10A所示。(A)對照溶劑(Ctrl)、(B)α-細辛醚和(C)β-細辛醚給藥小鼠的DG腦片進行免疫熒光染色，檢測GFAP(紅色)、Nestin(綠色)和BrdU(灰色)。標尺，25um。(D)定量統(tǒng)計GFAP+Nestin+BrdU+細胞數(shù)。每組N＝5-6。(E-G)(E)對照溶劑(Ctrl)、(F)α-細辛醚和(G)β-細辛醚給藥小鼠的DG腦片進行免疫熒光染色，檢測BrdU(紅色)、Tbr2(綠色)和DAPI(藍色)。標尺，100um。(H)定量統(tǒng)計Tbr2+BrdU+細胞數(shù)。每組N＝5-6。(I-K)(I)對照溶劑(Ctrl)、(J) α-細辛醚和(K)β-細辛醚給藥小鼠的DG腦片進行免疫熒光染色，檢測Ki67(紅色)、Dcx(綠色)和DAPI(藍色)。標尺，100um。(L-N)定量統(tǒng)計(L)Ki67、(M)Dcx+Ki67+和(N)Dcx+Ki67-細胞數(shù)。每組N＝5-6。(O)定量統(tǒng)計溶劑對照(Ctrl)和細辛醚給藥小鼠DG區(qū)的Sox2+細胞數(shù)。每組N＝3。(P)定量統(tǒng)計溶劑對照(Ctrl)和細辛醚給藥小鼠DG區(qū)的Dcx+TUNEL+細胞數(shù)。每組N＝3。(Q)在細辛醚給藥的小鼠海馬DG區(qū)切片中共染c-Fos(藍色)、BrdU(紅色)和NeuN(綠色)。實驗方案見圖5F。標尺，10um。(R)實驗方案見圖5F。小鼠DG區(qū)中共染GFAP、NeuN和BrdU，并定量統(tǒng)計GFAP+BrdU+細胞數(shù)。N＝4-5每組。(S-T)老年小鼠新物體識別分析。(S)小鼠在訓練期的偏好指數(shù)。(T)小鼠在1天后的測試期的認知指數(shù)。每組N＝5-8。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，one-way ANOVA分析；#P＜0.05，##P＜0.01,與50％幾率水平比較的單樣品t檢驗分析。

圖12：AT和細辛醚激活ERK級聯(lián)反應來促進神經(jīng)干細胞增殖，但不影響Akt級聯(lián)反應。(A)在減生長因子的條件(1ng/ml EGF和1ng/ml bFGF)下培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞24小時，然后加入1mg/ml AT、1uM a-細辛醚或1uM b-細辛醚孵育一定時間。用免疫印跡法檢測蛋白樣品中的磷酸化ERK1/2和Akt?？侲RK和Akt的量作為上樣量的對照。4次獨立實驗得到類似的結(jié)果。(B)向胚胎神經(jīng)干細胞中加入MEK抑制劑U0126(U；0.1uM)，ERK抑制劑FR180204(F；10uM)，PI3K抑制劑LY294002(L；10uM)或Akt抑制劑MK-2206(M；10uM)。30分鐘后，再加入AT或細辛醚孵育5分鐘。用免疫印跡法檢測蛋白樣品中的磷酸化ERK1/2、總ERK、磷酸化Akt和總Akt。4次獨立實驗得到類似的結(jié)果。(C-E)在減生長因子的條件下培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞24小時，向細胞中加入MEK抑制劑U0126(U；0.1uM)，ERK抑制劑FR180204(F；10uM)，PI3K抑制劑LY294002(L；10uM)或Akt抑制劑MK-2206(M；10uM)。30分鐘后，再加入(C)AT、(D)a-細辛醚或(E)b-細辛醚孵育24小時。對最后2小時的EdU摻入進行染色和定量統(tǒng)計。(C-E)中的所有實驗組分別與該圖中的只加有AT、α-細辛醚或β-細辛醚的實驗組比較。N＝5次獨立實驗。(F-G)小鼠口服給藥溶劑對照(Ctrl)、AT或細辛醚5天。對其DG區(qū)進行免疫熒光染色，檢測磷酸化的ERK1/2(F，紅色)和Sox2(F，綠色)；并對p-ERK+Sox2+細胞定量統(tǒng)計(G)。每組N＝4-6。標尺，20um。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，one-way ANOVA分析。

圖13：AT和細辛醚短期給藥促進海馬神經(jīng)干細胞增殖。11周大的小鼠口服給藥AT或細辛醚5天，通過BrdU注射來標記增殖的細胞。用免疫熒光法檢測(A)溶劑對照(Ctrl)、 (B)AT、(C)α-細辛醚和(D)β-細辛醚給藥的小鼠DG區(qū)中的BrdU(紅色)；并定量統(tǒng)計BrdU+細胞數(shù)(E)。每組N＝5-7。定量結(jié)果表示為平均值±標準誤；*P＜0.05，**P＜0.01，one-way ANOVA分析。標尺，100um。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本技術(shù)領域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關領域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實施例1 石菖蒲提取物的制備和組分的分離

本實施例制備石菖蒲提取物(AT)，并用高效液相色譜的方法進行質(zhì)控。

19.5kg的石菖蒲干燥根部用70L的60％乙醇回流提取3次，每次2h。得到的提取物合并后蒸發(fā)濃縮獲得2.2kg的石菖蒲總提物(AT)，制備得率為11.3％(w/w)。再用10L蒸餾水溶解AT，先后用乙酸乙酯(10L,重復三次)和正丁醇(10L,重復三次)分離各組分，隨后用真空蒸發(fā)去除有機溶劑，得到的各組分為(1)溶于乙酸乙酯的組分(ATE)，346.8g，得率1.8％，(2)溶于正丁醇的組分(ATB)，127.4g，得率0.7％，和(3)剩余溶于水的組分(ATW)，1.25kg，得率6.4％。各組分中的化合物組成和含量在Waters 2695色譜儀上的UV通道進行檢測，使用Cosmosil色譜柱(C18,5μm,250X 4.6mm)，35℃,流速1.0ml/分鐘，流動相為甲醇(A相)和水(B相)，0-10分鐘(10-55％,A)，線性梯度為：10-20分鐘(55-60％,A)，20-40分鐘(60-75％,A)，40-50分鐘(75-100％,A)，50-65分鐘(100％,A)。

實施例2 實驗方法

(1)小鼠給藥和BrdU注射

α-細辛醚，β-細辛醚和AT用含0.8％吐溫-80的水溶解。在8周大小年輕小鼠的給藥實驗中，每只小鼠灌胃給藥100μl，給藥濃度分別為α-細辛醚10mg/kg小鼠體重，β-細辛醚30mg/kg小鼠體重和AT 20g/kg小鼠體重，另參照組給100μl含0.8％的吐溫-80的水，每日一次，持續(xù)給藥28天，而在5天短期給藥實驗中則給藥5天。在檢測神經(jīng)干細胞體內(nèi)增殖的實驗中，最后一次給藥后分3次腹腔注射150mg/kg小鼠體重的BrdU，每次之間間隔3h，在最后一次BrdU注射后2h，將小鼠麻醉后PFA灌流，取全腦進行下一步的實驗。在檢測神經(jīng)干細胞體內(nèi)分化的實驗中，從第1天開始給藥后腹腔注射50mg/kg小鼠體重的BrdU，每日一次，共注射7天，給藥28天后將小鼠麻醉后PFA灌流，取全腦進行下一步的實驗。在AD小鼠的給藥實驗中，參照組和AT組給藥濃度均與年輕小鼠相同，給藥時間為17天，在檢測神經(jīng)干細胞體內(nèi)增殖的實驗中，第10天開始給藥后腹腔注射50mg/kg小鼠體重的BrdU，每日一次，共注射7天，在檢測神經(jīng)干細胞體內(nèi)分化的實驗中，從第1天開始給藥后腹腔注射50mg/kg小鼠體重的 BrdU，每日一次，共注射7天，兩者均在最后一天給藥24h后將小鼠麻醉并PFA灌流，取全腦進行下一步的實驗。20個月年老小鼠給藥實驗與檢測8周大小年輕小鼠檢測神經(jīng)干細胞體內(nèi)分化的實驗步驟相同。

(2)細胞培養(yǎng)

成年小鼠海馬神經(jīng)干細胞的分離參考，并作適當修改。首先給8周大小小鼠腹腔注射10％(w/v)的水合氯醛，劑量為5ml/kg小鼠體重，麻醉后70％乙醇全身噴灑消毒，剪開顱骨，取出全腦，置于預冷的PBS中，去除小腦，再按中線將剩余部分切開，剝出左右兩側(cè)海馬。將海馬置于500μl預熱的PDD(2.5U/ml，papain；1U/ml，dispase；250U/ml，DNase)中，用眼科剪剪碎至小于1mm3的碎塊，每只小鼠再加入2ml消化液，吹勻后加入60mm細胞培養(yǎng)皿中鋪開，放入37℃細胞培養(yǎng)箱搖床上消化20分鐘，連未消化碎塊一起吸出至15ml離心管，加入2.5ml NeuroCult NSC basal培液，用剪過頭部的1ml槍頭吹打10次，自然沉降30秒后，上清加入40μm濾網(wǎng)過濾，如此重復三次，之后再用5ml培液沖洗濾網(wǎng)，合并所有過濾的細胞。取部分細胞，與臺盼藍染料1：1混合，加入血細胞計數(shù)板計數(shù)(只計臺盼藍染色陰性的活細胞)。再以1X105/ml的細胞鋪板密度種入24孔板，并加入生長因子(20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF,2μg/ml heparin)。每2天加入1/10體積的新鮮培液，6天后大部分神經(jīng)球可生長至50μm以上，此時可對細胞進行傳代，Accutase 37℃消化5分鐘，以1X105/ml的細胞鋪板密度進行傳代，由于剛分離出的細胞中有神經(jīng)細胞等污染，故傳代3代及以上的細胞才能進行實驗。多余的細胞進行凍存，10％DMSO(v/v)，30％Serum Replacement(v/v)。

胚胎神經(jīng)干細胞的從E12.5的C57BL/6小鼠胚胎分離，取出胚胎后，剝開顱骨，取小鼠胚胎的皮層，消化培養(yǎng)，具體步驟同成體海馬神經(jīng)干細胞，所使用培液為添加B27的DMEM/F12，其中補充10ng/ml bFGF和20ng/ml EGF。

(3)體外EdU摻入實驗

神經(jīng)球在用Accutase消化后，重懸于含1ng/ml bFGF和1ng/ml EGF和B27的DMEM/F12培液(胚胎神經(jīng)干細胞)中或者含1ng/ml bFGF和1ng/ml EGF的NeuroCult NSC增殖培液中，以4X104/cm2的細胞密度接種到預先包被好的96孔板中(PDL包被過夜，用水洗一遍后，再用laminin包被過夜)，培養(yǎng)24小時后，加入AT，α-細辛醚和β-細辛醚，在有抑制劑的實驗中，加入AT，α-細辛醚，β-細辛醚之前30分鐘用ERK和Akt信號通路抑制劑(U0126，0.1μM；LY294002，1μM；MK-2206，10μM；FR180204，10μM)預處理，加藥后共孵育24小時，在第22小時加入10μM的EdU，孵育2小時后收細胞染色。

(4)EdU染色和分析

細胞用4％PFA固定15分鐘，PBS洗一遍后，再用含0.1％TritonX-100的PBS打孔處理15分鐘，PBS洗一遍，含4％BSA的PBS封閉30分鐘，Nestin(1:100，含4％BSA的PBS)一抗4℃孵育過夜，PBS洗一遍后，二抗(1:1000，含4％BSA的PBS)室溫孵育1小時，PBS洗一遍后，加入配好的EdU染色液染色30分鐘，配方下表1所示。

表1

EdU染色完畢后，PBS洗一遍，DAPI(1:5000，PBS)染色5分鐘，PBS洗兩遍，在operetta上進行檢測和分析。

(5)神經(jīng)干細胞體外分化

神經(jīng)球在用Accutase消化后，重懸于含10ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的NeuroCult NSC增殖培液中，以2.5X104/cm2的細胞密度接種到預先包被好的96孔板中(PDL包被過夜，用水洗一遍后，再用laminin包被過夜)，培養(yǎng)24小時后，將培液換成NeuroCult NSC分化培液，同時加入AT，α-細辛醚，β-細辛醚，之后每隔一天更換培液，在培液換成NeuroCult NSC分化培液5天后，對各個譜系的分化標記分子進行染色分析。

(6)免疫印跡實驗

神經(jīng)球在用Accutase消化后，重懸于含1ng/ml bFGF和1ng/ml EGF和B27的DMEM/F12培液，再以3X106/ml的細胞密度接種到預先包被好的12孔板中,培養(yǎng)24小時后，加入AT，α-細辛醚，β-細辛醚，在有抑制劑的實驗中，加入AT，α-細辛醚，β-細辛醚之前30分鐘用ERK和Akt信號通路抑制劑(U0126，0.1M；LY294002，1M；MK-2206，10M；FR180204，10M)預處理，加藥后5分鐘將細胞放至冰上，用預冷的PBS洗兩次，加入1XLB，95℃處理5分鐘，跑SDS/PAGE膠，轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上，與phospho-ERK，ERK，phospho-Akt，Akt一抗和IRDye800CW標記二抗孵育，用Odyssey遠紅外圖像系統(tǒng)檢測并在其自帶軟件上分析。

(7)免疫熒光實驗

PFA灌流過的小鼠大腦繼續(xù)在4％PFA中固定24小時，再在30％蔗糖固定液中靜置72小時。 處理完畢后，去除小腦部分，將大腦嗅球朝上直立置于濾紙上，-80℃凍存至少24小時。以30μm厚度垂直縱向冰凍切片，按小鼠大腦圖譜取DG部分，共切8X 9X＝72張，共2.16mm，按切片順序排列，每8片取1張，合并后編為一組腦片，進行染色。切好的腦片置于組織保護液中(30％蔗糖，30％乙二醇，0.1M PB)，可在-20℃保存半年以上。染色時取一組腦片，在封閉液(10％驢血清，0.3％TritonX-100，PBS)中室溫封閉45分鐘，之后加入一抗4℃孵育過夜(一抗稀釋比例為：大鼠抗BrdU，1：2000；兔抗Ki67，1：1000；羊抗Dcx，1：200；鼠抗NeuN，1：200；羊抗Sox2，1：60)，再與合適的熒光二抗室溫孵育1小時。DAPI對細胞核染色。之后用Olympus FV100i或Leica SP-8對染色的腦片進行拍照。陽性或雙染細胞的數(shù)量通過Image Pro Plus軟件分析。對于和BrdU共染，需要進行抗原修復的腦片，于血清封閉之前，在抗原修復液(10mM檸檬酸鈉，pH 6.5)中95℃處理20分鐘。BrdU染色，腦片在血清封閉之前，用2M的鹽酸在37℃處理30分鐘，再用0.1M的硼酸緩沖液(pH 8.5)清洗。

(8)MTT實驗

將SH-SY5Y消化成單細胞狀態(tài)，以4000個/孔的密度加入96孔板，每孔體積為200μl。細胞貼壁后加藥，每種處理條件5個副孔。在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時，每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，置于搖床上低速震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。實驗中需同時設置調(diào)零孔(沒有細胞，僅有培液，MTT和DMSO)，對照孔(沒有藥物，僅有細胞，相同濃度的藥物溶解介質(zhì)，培液，MTT和DMSO)。

(9)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。不同處理組之間采用t檢驗進行比較。多組結(jié)果之間采用one-way ANOVA進行分析，并用Fisher’s protected least significant difference test或Bonferroni t test進行事后檢驗，或者采用two-way ANOVA進行分析，并用Tukey post hoc test進行事后檢驗。P<0.05時認為組間有顯著性差異。

實施例3 石菖蒲促進成年小鼠神經(jīng)干細胞增殖

我們給8周大的C57BL/6小鼠按照200mg原藥材/20g體重的劑量口服AT；對照組小鼠則口服相應體積溶劑(vehicle,水中溶解0.8％Tween-80)，灌胃給藥，每天1次，共28天。在最后一天，注射3次溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)來標記增殖的細胞。免疫組化分析結(jié)果表明，大部分BrdU陽性細胞位于神經(jīng)干細胞集中的顆粒下區(qū)(subgranular zone， SGZ)。與對照組小鼠相比，口服AT使BrdU陽性細胞的數(shù)量增加31％(如圖1B-D所示)。對另一增殖標志分子Ki67的染色也得到相似的結(jié)果(如圖1K,L,圖2B所示)。而AT并沒有明顯改變顆粒細胞層的體積(如圖2A所示)。之前的研究表明，SGZ區(qū)存在兩種類型的成體神經(jīng)干細胞，分別是放射狀膠質(zhì)樣細胞(radial glia-like cells)和非放射狀神經(jīng)干細胞(nonradial neural progenitor cells)。我們進一步檢測這兩種細胞的變化，發(fā)現(xiàn)口服AT促進Tbr2和BrdU雙陽性的增殖的非放射狀神經(jīng)干細胞的數(shù)量(如圖1H-J所示)，而GFAP、Nestin和BrdU三陽性的增殖的放射狀膠質(zhì)樣細胞數(shù)量沒有明顯改變。此外，SGZ區(qū)的Sox2陽性細胞數(shù)目也沒有明顯變化，表明口服AT不影響神經(jīng)干細胞庫的大小(如圖2C-E所示)。我們進一步通過Dcx的染色，檢測海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)區(qū)成神經(jīng)細胞(neuroblast)和非成熟神經(jīng)元?？诜嗀T后，Dcx和Ki67雙陽性的成神經(jīng)細胞和Dcx陽性、Ki67陰性的非成熟神經(jīng)元都顯著增加(如圖1K-M,圖2-F所示)。TUNEL實驗表明，Dcx陽性細胞的存活率沒有受到AT的影響(如圖2H所示)。這些結(jié)果表明，口服AT促進成體海馬神經(jīng)干細胞增殖。

為了進一步檢測由神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的新生神經(jīng)元，我們在小鼠給藥的最初7天，每日1次注射BrdU來標記增殖的細胞，距第一次注射BrdU的28天后，對小鼠大腦進行檢測(如圖1N所示)。我們在BrdU陽性細胞中檢測了成熟神經(jīng)元標志物NeuN，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，口服AT的小鼠大腦中存在更多BrdU和NeuN雙陽性的神經(jīng)元(如圖1O-Q所示)。其中一部分神經(jīng)元同時還表達c-Fos，表明這些神經(jīng)元處于激活狀態(tài)(如圖2I所示)。然而，口服AT后，BrdU陽性細胞中BrdU和NeuN雙陽性細胞的比例沒有明顯改變(如圖1R所示)，表明AT并不影響神經(jīng)干細胞像神經(jīng)元方向的譜系分化(lineage commitment)。進一步地，我們發(fā)現(xiàn)口服AT后，GFAP和BrdU雙陽性細胞的數(shù)量也沒有明顯變化，表明膠質(zhì)再生(gliogenesis)沒有受到影響。

實施例4 石菖蒲促進衰老小鼠和轉(zhuǎn)基因AD小鼠的神經(jīng)再生

首先，我們連續(xù)7天給18-23個月大的老年小鼠注射BrdU，并口服給藥AT或?qū)φ杖軇?8天。與8周大的小鼠相比，這些老年小鼠大腦中的BrdU和NeuN雙陽性細胞的數(shù)量明顯減少(如圖3A所示；對比如圖1O所示)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)口服AT顯著增加BrdU和NeuN雙陽性細胞的數(shù)量(～90％,如圖2A-C所示)，而BrdU陽性細胞中的BrdU和NeuN雙陽性細胞的比例沒有變化(如圖3D所示)。這些結(jié)果表明，口服AT能夠促進老年小鼠的神經(jīng)再生。

接著，給8-12個月大的中年APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠及其野生型同窩對照小鼠口服AT或?qū)φ?溶劑，然后對其注射BrdU。與8周大的小鼠相比，8-12個月的野生型小鼠大腦中BrdU陽性細胞數(shù)明顯減少(如圖3E,G,I所示)，表明AD轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細胞增殖存在缺陷。我們發(fā)現(xiàn)，口服AT使野生型小鼠大腦中的神經(jīng)干細胞增殖增加36％(如圖3E,F,I所示)，而在APP/PS1小鼠大腦中，增幅更是達到了98％(如圖3G,H,I所示)。對Ki67的染色也顯示類似的結(jié)果(如圖3J-N所示)。我們也檢測了口服AT的APP/PS1小鼠的神經(jīng)再生。為此，我們給APP/PS1小鼠和他們的野生型同窩對照小鼠注射BrdU，并口服給藥AT 28天。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠DG區(qū)中的BrdU陽性細胞的數(shù)量以及其中BrdU和NeuN雙陽性細胞的比例都顯著下降(如圖3O,Q,S-U所示)。APP/PS1小鼠口服AT后，BrdU陽性細胞的數(shù)量以及其中BrdU和NeuN雙陽性細胞的比例都明顯上升(如圖3O-U所示)，表明口服AT促進新生細胞的存活以及增加新生神經(jīng)元的數(shù)量。這些結(jié)果表明，口服AT減少了AD模型小鼠神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)再生的缺陷。

實施例5 在體外，石菖蒲促進神經(jīng)干細胞增殖

為了探究AT是否直接作用于神經(jīng)干細胞，我們從成體小鼠海馬中分離培養(yǎng)了神經(jīng)干細胞。細胞中約90％是Nestin和Sox2陽性的神經(jīng)干細胞(如圖5A所示)。這些貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在含有20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF的培液中迅速擴增。有研究表明，在衰老或者神經(jīng)退行的大腦中，生長因子水平的下降以及靜息調(diào)控因子水平的上升可能是導致神經(jīng)再生減少的原因。因此，我們減少了神經(jīng)干細胞培液中的EGF和bFGF濃度，來模擬這種生理或病理條件，并在這種細胞培養(yǎng)體系中，通過EdU摻入來檢測AT對神經(jīng)干細胞增殖的影響。如圖4A所示，在含有1ng/ml EGF和1ng/ml bFGF的減生長因子的培液中，約有20％的細胞呈現(xiàn)EdU陽性，在不含EGF和bFGF的無生長因子培液中，這一比例下降到1％(如圖4A,D)。在這兩種細胞培養(yǎng)體系中，AT使EdU摻入呈劑量依賴性增加(如圖4A-F)(在減少生長因子的條件下增加～30％，在無生長因子的條件下增加～65％)。同樣地，AT也能促進從胎鼠大腦皮層中分離的神經(jīng)干細胞的增殖(如圖5B,圖4G-L)。

另一方面，在分化的條件下，AT沒有改變Tuj 1陽性或者GFAP陽性細胞的比例(如圖5C,D)，表明在體外AT不影響神經(jīng)干細胞的譜系分化。這與我們在體內(nèi)實驗中觀察到的現(xiàn)象一致(如圖1R)。

實施例6 細辛醚是石菖蒲中調(diào)控神經(jīng)干細胞的主要活性成分

為了進一步找到石菖蒲中的活性成分，我們把AT分成3各組分(圖6A)。我們檢測胚胎神經(jīng)干細胞在減生長因子和無生長因子兩種條件下的EdU摻入(圖6B和圖7A)。我們將每種組分的濃度根據(jù)得率折算成初始原藥材的濃度。如圖6B和圖7A所示，乙酸乙酯溶組分(ATE)加藥和AT加藥類似，能夠呈劑量依賴性地提高EdU陽性細胞的比例。與對照組相比，正丁醇和水溶組分，即ATB和ATW則對EdU摻入水平?jīng)]有明顯影響。因此，ATE是AT中促進神經(jīng)干細胞增殖的主要組分。

為了進一步找到ATE中的主要活性成分，我們進行了高效液相色譜分析(圖7A-D)。ATE中主要有2個化學成分富集，約占ATE總質(zhì)量的20％，分別是β-細辛醚和α-細辛醚(圖7B)。在AT中，含有3％的細辛醚(圖7A)。在ATB和ATW中，只檢測到微量的細辛醚(圖7C,D)。

我們檢測了細辛醚對神經(jīng)干細胞增殖的影響。如圖6C和圖7B所示，α-細辛醚和β-細辛醚能夠呈劑量依賴性地增加EdU摻入水平。相反地，用ATE中細辛醚的2個結(jié)構(gòu)類似物cis-methylisoeugenol或asarylaldehyde處理細胞則對神經(jīng)干細胞增殖沒有明顯影響。進一步地，細辛醚對成體海馬神經(jīng)干細胞也有呈劑量依賴性的促進增殖的作用(圖6D-G)。為了進一步檢測細辛醚是否對其它細胞，尤其是癌細胞也有類似的促增殖的作用，我們在無血清的條件下培養(yǎng)了成神經(jīng)細胞瘤細胞SH-SY5Y，并用細辛醚處理。MTT實驗結(jié)果表明，細辛醚與EGF和bFGF的作用不同，對SH-SY5Y的增殖沒有明顯影響(圖9)，表明細辛醚可能選擇性地促進神經(jīng)干細胞增殖。進一步地，與對照組相比，細辛醚處理后的神經(jīng)干細胞所產(chǎn)生的Tuj 1陽性和GFAP陽性的細胞比例不變，表明與AT類似，細辛醚對神經(jīng)干細胞的譜系分化沒有明顯影響(圖8C)。在新生小鼠大腦皮層和海馬來源的原代神經(jīng)元中，AT和細辛醚呈劑量依賴性地增加神經(jīng)突觸的長度，但對它們的數(shù)量沒有明顯影響(圖8D-F)。有趣的是，細辛醚促進神經(jīng)突觸生長的最佳濃度是0.1-0.3μM，比它們促進成體神經(jīng)干細胞增殖的最佳劑量(0.3-3μM)低，暗示可能存在不同的作用機制。這些結(jié)果表明，α-細辛醚和β-細辛醚是AT在體外促進神經(jīng)干細胞增殖的主要活性成分。

實施例7 在體內(nèi)細辛醚促進海馬神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)再生

為了進一步檢測細辛醚是否像AT一樣能夠在體內(nèi)促進成體海馬神經(jīng)再生，我們給8周大的C57BL/6小鼠口服α-細辛醚和β-細辛醚28天，并注射BrdU標記增殖的細胞(圖10A)。與 對照組小鼠相比，α-細辛醚和β-細辛醚給藥的小鼠大腦SGZ區(qū)BrdU陽性的增殖的神經(jīng)干細胞數(shù)量增多(圖10B-E)。Ki67的染色分析也呈現(xiàn)相似的結(jié)果(圖11I-L)。與AT給藥類似，細辛醚給藥主要促進Tbr2陽性的非放射狀神經(jīng)干細胞的增殖(圖11E-H)，而對GFAP和Nestin雙陽性的放射狀膠質(zhì)樣細胞的增殖沒有明顯影響(圖11A-D)。Sox2陽性細胞組成的神經(jīng)干細胞庫的大小也沒有明顯改變(圖11O)。細辛醚給藥增加了Dcx和Ki67雙陽性成神經(jīng)細胞和Dcx陽性、Ki67陰性的非成熟神經(jīng)元的數(shù)量(圖11I-K,M,N)，而對這兩群細胞的存活沒有明顯影響(圖11P)。為了進一步檢測由神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的新生神經(jīng)元，我們在細辛醚給藥的前7天給小鼠注射BrdU，28天后取腦分析(圖10F)。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，細辛醚給藥的小鼠腦中有更多的BrdU和NeuN雙陽性新生神經(jīng)元(圖10G-J)。其中部分新生神經(jīng)元同時表達c-Fos，表明其處于功能性激活狀態(tài)(圖11Q)。然而，細辛醚給藥后，NeuN和BrdU雙陽性的細胞在BrdU陽性細胞中的比例沒有改變(圖10K)，表明細辛醚與AT類似，不影響神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的譜系分化。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)GFAP和BrdU雙陽性的細胞數(shù)也增加了，表明細辛醚也能促進膠質(zhì)再生(圖11R)。這些結(jié)果表明細辛醚和AT促進成年小鼠海馬中的神經(jīng)干細胞增殖，并進一步增強了神經(jīng)再生。

我們還檢測了細辛醚給藥的老年小鼠的神經(jīng)再生。為此，我們給18-23個月大的小鼠注射了7天BrdU來標記增殖細胞，并給藥細辛醚或?qū)φ杖軇?8天。與AT的結(jié)果相似，細辛醚使BrdU和NeuN雙陽性細胞的數(shù)量增加了約70％(圖10L-O)，但是神經(jīng)元譜系分化沒有變化(圖10P)。這些數(shù)據(jù)表明細辛醚促進老年小鼠的神經(jīng)再生。

隨著年齡的增加，認知功能和神經(jīng)再生衰退。為進一步探究AT和細辛醚給藥是否能夠改善行為學表現(xiàn)，我們用了新物體識別實驗來檢測老年小鼠中與海馬相關的認知記憶。在小鼠訓練過程中，對照組、AT給藥組和細辛醚給藥組的小鼠對兩個相同物體表現(xiàn)出相等的偏好指數(shù)(圖11S)。24小時后，對照組小鼠對新物體的探索沒有超出50％的幾率水平，表明其無法區(qū)分出新物體(圖11T)。相反地，AT和細辛醚給藥的小鼠對新物體表現(xiàn)出比熟悉物體更多的偏好性，表明它們還保留著對物體的記憶(圖11T)。這些結(jié)果表明，AT和細辛醚減少了老年小鼠的認知記憶缺陷。

實施例8 石菖蒲和細辛醚激活ERK級聯(lián)反應，但不影響Akt級聯(lián)反應

研究表明，ERK和/或Akt級聯(lián)反應的激活對于神經(jīng)干細胞增殖和自我更新非常關鍵。因此，我們通過免疫印跡的方法來檢測這些級聯(lián)反應的激活。如圖12A所示，AT和細辛醚加 藥后，細胞內(nèi)ERK磷酸化水平增加，在2-10分鐘到達峰值，然后在30分鐘內(nèi)緩慢下降到基礎水平。然而，Akt磷酸化水平則沒有明顯變化(圖11A)。進一步地，AT和細辛醚對ERK的激活可以被MEK抑制劑U0126和ERK抑制劑FR180204阻斷而不能被PI3K抑制劑LY294002或者Akt抑制劑MK-2206阻斷(圖11B)。為了進一步檢測AT和細辛醚對神經(jīng)干細胞增殖的促進作用是否依賴于ERK級聯(lián)反應的激活，我們用U0126，F(xiàn)R180204，LY294002或MK-2206處理神經(jīng)干細胞。如圖11C-E所示，用U0126和FR180204處理細胞能夠阻斷AT和細辛醚促進神經(jīng)干細胞增殖的作用，但是LY294002或MK-2206則不能，表明MEK/ERK級聯(lián)反應，而非PI3K/Akt級聯(lián)反應是AT和細辛醚促進神經(jīng)干細胞增殖所必需的。為了進一步確定體內(nèi)ERK信號通路在細辛醚促進神經(jīng)干細胞增殖中起到的作用，我們給11周大的小鼠口服給藥AT或者細辛醚5天。與對照組小鼠相比，AT和細辛醚給藥的小鼠SGZ區(qū)BrdU陽性的增殖細胞的數(shù)目增加了25％，表明AT和細辛醚對神經(jīng)干細胞增殖有直接和快速的促進作用(圖13A-E)。同時，我們在SGZ區(qū)對磷酸化ERK和Sox2進行了共染，發(fā)現(xiàn)AT和細辛醚給藥小鼠的磷酸化ERK陽性的神經(jīng)干細胞數(shù)量也明顯增加(圖12F-G)。

實施例9 實驗小結(jié)

我們發(fā)現(xiàn)AT在AD和年老小鼠體內(nèi)促進神經(jīng)干細胞增殖的效果，好于其在年輕小鼠中的作用，這可能是由多種因素造成的：首先AD和年老小鼠大腦內(nèi)的生長因子如EGF，F(xiàn)GF和BDNF等低于年輕小鼠，因此AT給藥的效果容易在更低的本底增殖背景上顯示出來，同時AT通過生長因子信號通路產(chǎn)生的促進增殖作用也能得以體現(xiàn)；其次AD和年老小鼠大腦內(nèi)存在Aβ，tau和損傷神經(jīng)元等造成的慢性炎癥環(huán)境，而這種環(huán)境對于神經(jīng)干細胞增殖起到了抑制性的作用，之前報道AT有一定的抑制炎性反應的作用，因此這種抑炎作用于AT本身促進神經(jīng)干細胞增殖的作用相協(xié)同，在AD和年老小鼠上發(fā)揮出更好的促進神經(jīng)再生的效果。

我們的結(jié)果表明，AT和細辛醚的功能是多重性的，這種特性在治療包括AD的多致病因子疾病中具有其獨特的優(yōu)勢。

MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞功能上有非常關鍵的作用。激活MEK/ERK信號通路能促進神經(jīng)干細胞的增殖，而PI3K/Akt信號通路不止對神經(jīng)干細胞的增殖很重要，同時它也能調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的分化和存活。我們的結(jié)果表明，AT和細辛醚的作用是通過激活MEK/ERK信號通路而不是PI3K/Akt信號通路。和此結(jié)果吻合，抑制MEK或ERK的活化，可以抑制AT和細辛醚對于神經(jīng)干細胞增殖的作用。而另一方面，AT和細辛醚處理對于神經(jīng)干細胞的分化沒有影響，也印證了AT和細辛醚不激活PI3K/Akt信號通路的現(xiàn) 象。說明細辛醚對增殖的促進作用是有細胞特異性的。

我們發(fā)現(xiàn)AT和細辛醚處理能夠在微量生長因子存在的體外培養(yǎng)環(huán)境下，促進神經(jīng)干細胞的增殖。而在常用的加入過量生長因子培養(yǎng)環(huán)境中，AT和細辛醚卻沒有促進增殖的作用。這個發(fā)現(xiàn)暗示AT和細辛醚可能在缺乏生長因子的生理和病理條件下，發(fā)揮其促進神經(jīng)再生的功能。與這些體外結(jié)果相吻合，我們觀察到在中年小鼠(8個月大)中AT促進神經(jīng)再生的效果也優(yōu)于年輕小鼠(8周大)。

綜上所述，我們不僅發(fā)現(xiàn)了AT和和其中的活性成分細辛醚可以促進神經(jīng)干細胞的增殖，同時我們也建立了添加微量生長因子的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)體系，可以用于模擬體內(nèi)的生理和病理環(huán)境，給篩選治療神經(jīng)退行性疾病的藥物提供了新的方法。

以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應當理解，本發(fā)明不應僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。