本發(fā)明屬于藥物組合物領(lǐng)域，涉及治療乳腺癌的藥物組合物，尤其涉及一種含有辛伐他汀與組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幬锝M合物，以及在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查報(bào)告顯示，全球腫瘤癥狀況日益嚴(yán)重，未來(lái)20年新患者的人數(shù)將由目前的每年1410萬(wàn)增加到2170萬(wàn)，因腫瘤癥而死亡的人數(shù)也將由目前的每年820萬(wàn)增加至1300萬(wàn)。目前已上市的抗腫瘤藥物較多，如烷化劑藥物、抗代謝藥物、抗腫瘤抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑等，但是大多藥物由于毒性較大，導(dǎo)致病人不耐受。隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要的作用。然而，研究顯示，大部分腫瘤的生物學(xué)行為并非由單一信號(hào)傳導(dǎo)通路所支配，而是多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路共同起作用的，因此合理的將多藥制成藥物組合進(jìn)行聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示具有單用藥物不可比擬的優(yōu)越性，所述藥物組合進(jìn)行聯(lián)合用藥針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療將不僅旨在減少或延緩耐藥性的出現(xiàn)、降低毒性，而且通過(guò)多種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用取得更好的療效，因此，采用藥物組合進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物治療已成為腫瘤藥物干預(yù)領(lǐng)域發(fā)展的新方向。

已知腫瘤的種類繁多,各種腫瘤癥的特性不盡相同，重要信號(hào)分子及信號(hào)途徑也不同，如其中的腫瘤癥中Cyclin D1、CDK4、AKT或MYC等表達(dá)失控，這些重要分子可能成為治療靶標(biāo)；有些分子，如ZAP-70、p-AKT、Cyclin D1的短小變體、cyclin D2、cyclin D3等，它們的表達(dá)和腫瘤癥的惡化有很強(qiáng)的相關(guān)性，這樣的分子或幾個(gè)分子的組合同樣可以成為治療靶標(biāo)；但是，該些分子本身的活性、穩(wěn)定性及它們的下游信號(hào)均依賴于Hsp90的分子伴侶功能。

研究顯示，所述Hsp90是高度保守的、以二聚體存在的ATP依賴型的分子伴侶，在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，其主要功能是幫助細(xì)胞里蛋白質(zhì)的折疊,保持蛋白有正確的空間結(jié)構(gòu)而發(fā)揮正常的生理活性,需要Hsp90維持功能的蛋白分子通常 被稱為Hsp90的Client protein(或稱分子伴侶底物)；一旦Hsp90不能發(fā)揮正常的分子伴侶功能,這些分子伴侶底物的穩(wěn)定性將被破壞并很快通過(guò)蛋白酶體途徑被降解。

研究顯示，腫瘤中被誘導(dǎo)的Hsp90對(duì)維持腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)及活性是不可或缺的，如腫瘤蛋白激酶、核內(nèi)激素轉(zhuǎn)錄因子的組裝和拆分等；含Hsp90的分子伴侶復(fù)合物，經(jīng)過(guò)多步驟的ATP結(jié)合、水解循環(huán)，Hsp90α在ATP和ADP之間實(shí)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)換，完成hsp90與分子伴侶底物的結(jié)合與分離，最終導(dǎo)致分子伴侶底物以高活性狀態(tài)存在；ATP結(jié)合部位在Hsp90的N-端疏水區(qū)域，ATP和N-端的結(jié)合引起Hsp90空間結(jié)構(gòu)的變化，影響Hsp90和輔助伴侶分子如p23和p50p50cdc37(如果底物是信號(hào)蛋白激酶的話)形成伴侶機(jī)器(chaperone machine)，直接影響與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)分子的活性和穩(wěn)定性；Hsp90本身具有ATPase的功能，ATP與Hsp90結(jié)合的復(fù)合物在這種ATPase作用下，水解成ADP結(jié)合的Hsp90復(fù)合物，該種復(fù)合物沒(méi)有分子伴侶的功能，底物分子在泛素化E3連結(jié)酶的幫助下被26S蛋白酶體降解，對(duì)腫瘤細(xì)胞而言，維持腫瘤細(xì)胞生存的重要蛋白及蛋白激酶多數(shù)需要Hsp90分子伴侶功能的幫助，所以，Hsp90對(duì)腫瘤細(xì)胞至關(guān)重要。

正因?yàn)镠sp90的N-端含有ATP的結(jié)合部位，影響ATP與Hsp90結(jié)合的小分子化合物可以抑制Hsp90的分子伴侶功能，ATP的結(jié)合部位是目前篩選Hsp90抑制劑的主要靶標(biāo)；中間段是分子伴侶底物和Hsp90相互作用的部位，許多腫瘤相關(guān)蛋白激酶,如AKT、c-Raf、c-Src等都和Hsp90的中端部位作用；C-端的末尾含有一個(gè)MEEVD片段，這一片段對(duì)Hsp90和含有TPR結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用至關(guān)重要，除去這一片段會(huì)抑制Hsp90的ATPase活性；研究顯示，Hsp90結(jié)構(gòu)的任何變化都可能影響Hsp90的功能，更可能干擾Hsp90和分子伴侶底物的結(jié)合，最終引起分子伴侶底物的降解。在腫瘤細(xì)胞中,越來(lái)越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)是Hsp90的分子伴侶底物，尤其是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)分子，如c-Raf、AKT、ZAP-70、IKKα；ER(endoplasmic reticulum)的轉(zhuǎn)膜激酶，如IRE1(inositol requiring enzyme 1)和PERK(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase)；cell cycle調(diào)控蛋白，如cdk4、cyclin D、p21、chk1及wee1等。這些腫瘤相關(guān)蛋白都是Hsp90的分子伴侶底物,它們和許多腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有直接的關(guān)系，因此，腫瘤中Hsp90和許多腫瘤相關(guān)蛋白形成復(fù)合物，主導(dǎo)它們的 功能，已成為抗腫瘤研究的熱門(mén)靶標(biāo)分子。此外，有研究報(bào)道，正常生理?xiàng)l件下的腫瘤細(xì)胞Hsp90表達(dá)水平高達(dá)總蛋白的4％,明顯地比正常細(xì)胞的1-2％高得多,這種表達(dá)水平的差異使Hsp90成為一個(gè)很好的抗腫瘤藥物的篩選靶標(biāo)。

已知格爾德霉素(Geldanamycin，GAA)是一種天然的Hsp90抑制劑，特異性地干擾糖皮質(zhì)激素受體(GR)/HSP復(fù)合物的形成，GAA的衍生物17-AAG和17-DMAG與hsp90有很強(qiáng)的親和力，它們和hsp90的ATP/ADP結(jié)合部位結(jié)合，從而阻止hsp90和底物相結(jié)合，使底物被蛋白酶體降解，Hsp90的ATP結(jié)合部位理所當(dāng)然地成為篩選Hsp90抑制劑的模型；

以Hsp90的ATP結(jié)合部位為篩選模型,Novartis、Merck等制藥公司已篩選到一些Hsp90抑制劑,如17-AAG、17-DMAG和AUY922都促使腫瘤蛋白迅速被蛋白酶體途徑降解,達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，其中有些已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但目前的Hsp90抑制劑中尚無(wú)成為臨床用藥者。

‘蛋白乙?；且环N蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，一般是指蛋白質(zhì)鏈上的Lys(K)的氨基接上一個(gè)乙?；鶊F(tuán)，而不是指蛋白鏈末端其他氨基；組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)是分別控制組蛋白N-端Lys乙?；腿ヒ阴；?、功能相反的兩類酶；乙酰化修飾是由HDAC和HAT調(diào)控的可逆過(guò)程,受環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、藥物等多種因素影響，乙?；苯訉?dǎo)致蛋白質(zhì)功能的差異；一般而言，乙?；龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，如p53、E2F1、FATA1、RelA、YY1、Bcl-6等；有關(guān)蛋白乙酰化的研究顯示，首先在組蛋白中發(fā)現(xiàn)乙?；揎棧髞?lái)在非組蛋白中同樣發(fā)現(xiàn)乙?；揎?，乙?；瘜?duì)非組蛋白P53和FoxO1的功能影響研究使蛋白乙酰化成為研究的熱點(diǎn)之一；在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)是主要的信息調(diào)控和傳遞的分子，任何修飾都會(huì)對(duì)蛋白的功能產(chǎn)生或正或負(fù)面的影響，合理利用這些負(fù)面影響對(duì)腫瘤細(xì)胞可能是致命的；HDAC分為HDAC-I、II、III三類，到目前為止發(fā)現(xiàn)有18個(gè)不同的HDAC蛋白，有研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)可以抑制HDAC-I/II/III的抑制劑，但僅HDAC-I/II抑制劑在腫瘤防治方面有潛在價(jià)值；另有研究表明，HDAC抑制劑如SAHA(vorinostat)、LAQ824、LBH 589均增加p21、p27的表達(dá)，也誘導(dǎo)促凋亡蛋白如Bax、Bak和Bim的表達(dá)，同時(shí)影響抗凋亡蛋白如Bcl-xl、XIAP、AKT、c-Raf和survivin的水平；組蛋白去乙?；敢种苿┚哂幸种颇[瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞分化及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其中SAHA和LBH589已上 市，此外MS-275、Trichostatin(TSA)、FK228及西達(dá)苯胺等多種組蛋白去乙?；敢种苿┻M(jìn)入臨床研究；然而，實(shí)踐顯示HDAC抑制劑缺少專一性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷無(wú)專一性。

有研究公開(kāi)了腫瘤病人和小鼠腫瘤樣品，其中顯示腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞中的Hsp90是以乙?；揎椥问酱嬖?，hsp90的乙?；湍[瘤大小相對(duì)應(yīng)，與腫瘤惡化程度相對(duì)應(yīng)；目前，Hsp90抑制劑的篩選多數(shù)是基于大腸桿菌表達(dá)的Hsp90的ATP結(jié)合片段為模型篩選，該篩選模型缺乏對(duì)Hsp90的乙?；揎梿?wèn)題的考慮，造成篩選到的小分子化合物對(duì)腫瘤Hsp90抑制效果有限，以及缺乏腫瘤細(xì)胞選擇性。

本申請(qǐng)前期研究表明，不同部位的乙?；瘜?duì)hsp90的功能影響不同，不一定導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡；hsp90中7個(gè)位點(diǎn)可以被HDAC抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生乙?；?，分別是K69、K100、K292、K327、K478、K546和K558，經(jīng)過(guò)乙?；M突變K/Q分析發(fā)現(xiàn)，在C-端的乙?；际瞧茐膆sp90的功能，但在中間段乙?；瘎t有不同，K292位于hsp90中端起始部位的鏈接(hinge)區(qū)域，該鏈接區(qū)域在各種物種中是高度保守的，但K292乙?；瘶O大地增強(qiáng)了hsp90與ATP、激酶伴侶分子p50cdc37及泛素化E3連結(jié)酶CHIP的結(jié)合，這意味著hsp90如果在K292位點(diǎn)上單乙?；脑?，將使失活的蛋白激酶更快地降解，hsp90發(fā)揮分子伴侶功能時(shí)對(duì)ATP的濃度要求降低，其分子伴侶功能更強(qiáng)大，這將大大增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗藥性和蛋白激酶的信號(hào)，更有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散；另一個(gè)事實(shí)是，hsp90的K292乙?；湍[瘤大小及腫瘤的惡化程度有著緊密的相關(guān)性，如果腫瘤中乙?；茐膆sp90的分子伴侶功能，腫瘤細(xì)胞死亡；基于此，提出“乙?；疕sp90是腫瘤癥治療的新靶標(biāo)”的概念,進(jìn)而建立乙酰化Hsp90抑制劑的篩選模型，發(fā)現(xiàn)乙?；痟sp90抑制劑對(duì)腫瘤的防治具有重要意義。

基于上述研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明擬提供一種含有含有辛伐他汀與組蛋白去乙?；敢种苿┑牡乃幬锝M合物，以及在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于現(xiàn)有技術(shù)的研究基礎(chǔ)，提供一種含有辛伐他汀與組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幬锝M合物，及其在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應(yīng)用。 更具體涉及一種含有辛伐他汀作為乙?；痟sp90抑制劑和去乙?；敢种苿㎜BH589的藥物組合物，及其在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應(yīng)用

本發(fā)明中還提供了一種篩選乙?；痟sp90抑制劑的方法。

本發(fā)明基于現(xiàn)有技術(shù)的研究基礎(chǔ)，用K292Q突變模擬K292位點(diǎn)乙?；膆sp90，建立穩(wěn)定表達(dá)Flag-hsp90-K292Q及HA-p50CDC37的細(xì)胞株，然后用細(xì)胞株的裂解液經(jīng)Alpha Technology技術(shù)比較熒光信號(hào)強(qiáng)弱，篩選乙酰化hsp90抑制劑；熒光信號(hào)越弱，說(shuō)明小分子化合物抑制乙酰化hsp90-p50cdc37結(jié)合的能力越高，由此提出了辛伐他汀強(qiáng)烈抑制乙?；痟sp90的分子伴侶功能；

鑒于辛伐他汀是他汀類羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，原為血脂調(diào)節(jié)劑，研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用；本發(fā)明經(jīng)研究顯示，辛伐他汀抑制hsp90-p50cdc37復(fù)合物的形成，同樣抑制乙?；痟sp90與p50cdc37復(fù)合物形成的功能，從而使hsp90失去對(duì)腫瘤中蛋白激酶的分子伴侶功能；同時(shí)經(jīng)研究顯示，去乙?；敢种苿㎜BH589可以誘導(dǎo)細(xì)胞中hsp90在K292位的乙?；鰪?qiáng)其與cdc37復(fù)合物的形成，本發(fā)明中采用含有辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑的組合物，使其中的辛伐他汀和去乙酰化酶抑制劑LBH589聯(lián)用，具有破壞hsp90和p50cdc37復(fù)合物的形成的作用。

本發(fā)明的含有辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑的組合物中，所述辛伐他汀可以為辛伐他汀及其衍生物及其結(jié)構(gòu)類似物。

本發(fā)明藥物組合物中的辛伐他汀的結(jié)構(gòu)式如式I所示：

本發(fā)明的藥物組合物中，所述辛伐他汀組分包括但不限于辛伐他汀藥物本身，還可以是其可藥用的鹽、水合物、類似物或衍生物等。

本發(fā)明中，所述組蛋白去乙?；敢种苿┛梢詾槿魏谓Y(jié)構(gòu)類型的組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥物，如苯甲酰胺類、脂肪酸類等，具體可以是但不限于如：panobinostat(LBH589)、vorinostat(SAHA)、Trichostatin(TSA)。

本發(fā)明藥物組合物中組蛋白去乙?；敢种苿﹥?yōu)選為L(zhǎng)BH589，SAHA和TSA，其中，LBH589由Novartis公司研發(fā)，通用名為panobinostat，已通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市，商品名為Farydak^TM，其結(jié)構(gòu)式如II所示：

其中SAHA是第一個(gè)批準(zhǔn)上市的HDAC抑制劑，由默克公司開(kāi)發(fā)，通用名為vorinostat，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，其結(jié)構(gòu)式如III所示：

本發(fā)明藥物組合物中，所述的組蛋白去乙酰化酶抑制劑組分包括但不限于上述藥物本身，還可以是它們的可藥用的鹽、水合物、類似物或衍生物等；也可以是式I的羥基和式II或式III的羥肟酸基團(tuán)形成羥肟酸酯的形式將兩藥偶聯(lián)在一起。

本發(fā)明的含有辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥物組合物可以用于制備治療各種腫瘤的藥物，所述腫瘤包括但不限于三陰性乳腺腫瘤。

本發(fā)明藥物組合物在制備治療三陰性乳腺腫瘤藥物中，組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589與辛伐他汀的摩爾比為1:1-20。

優(yōu)選的，本發(fā)明藥物組合物在制備治療三陰性乳腺腫瘤藥物中，所述SAHA和辛伐他汀的摩爾比為1:1-15。

本發(fā)明中，含有辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┙M合物在用于治療三陰性乳腺腫瘤的應(yīng)用中，將本發(fā)明組合物制成同時(shí)給藥的藥劑方案中，辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┛梢栽谕环N制劑如片劑或膠囊中，也可以將辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑分別做成制劑，如分別做成片劑或膠囊，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，使用者按照藥品說(shuō)明書(shū)的指示同時(shí)服用；

本發(fā)明中，在將本發(fā)明組合物制成先后給藥的藥劑方案中，可以將辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑分別做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，使用者然后按照藥品說(shuō)明書(shū)指示的先后順序進(jìn)行服用，或?qū)⑸鲜鼋M合物中的兩種成分制成一種控釋的制劑，先釋放組合物中的一種成分、然后再釋放組合物中的另一種成分，使用者只需要服用該控釋組合物制劑；

本發(fā)明中，在將本發(fā)明組合物制備成交叉給藥的藥劑方案中，可以將辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┓謩e做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，使用者然后按照藥品說(shuō)明書(shū)指示的交叉順序服用，或者將該藥物組合物制備成辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┙徊驷尫诺目蒯屩苿?。

本發(fā)明的辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑組合物在制備治療三陰性乳腺腫瘤藥物的應(yīng)用中，所述組合物中的辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┛梢酝瑫r(shí)使用或以任何先后的順序使用，如可以將辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑同時(shí)給患者服用；也可以先將辛伐他汀藥物給患者服用、然后服用組蛋白去乙酰化酶抑制劑，或先服用組蛋白去乙?；敢种苿⑷缓蠓眯练ニ∷幬?，對(duì)于兩者服用的時(shí)間間隔沒(méi)有特別要求，但優(yōu)選服用兩種藥物的時(shí)間間隔不超過(guò)一天；或者兩種藥物交替給藥。

本發(fā)明中，可將辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成適于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選將辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┲瞥晌改c道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊，控釋或緩釋制劑。在本發(fā)明辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑組合物的藥物制劑中，根據(jù)不同的制劑形式和制劑規(guī)格，所述組合物在制劑中的含量可以質(zhì)量計(jì)為1％-99％，優(yōu)選為10％-90％；制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的 輔料，以不和本發(fā)明組合物發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提；所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進(jìn)行制備。

本發(fā)明中，所述的組合物的制備方法沒(méi)有限制，辛伐他汀和組蛋白去乙酰化酶抑制劑兩者可以進(jìn)行直接混合然后做成制劑，也可以分別和/或相應(yīng)的輔料混合分別做成制劑，然后再按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式包裝在一起，或分別和相應(yīng)的輔料混合然后再混合做成制劑。

本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對(duì)象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在人體內(nèi)能夠達(dá)到有效的血藥濃度為前提。

本發(fā)明分別進(jìn)行了辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┙M合抑制(殺死)MDA-MB-231(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MDA-MB-468(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、BT-483(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、BT474(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MDA-MB-453(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MCF-7(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MCF-10A(乳腺纖維囊性病上皮細(xì)胞株)和A549(肺腫瘤細(xì)胞株)的試驗(yàn)，結(jié)果顯示，本發(fā)明得辛伐他汀和組蛋白去乙?；敢种苿┙M合在治療三陰性乳腺腫瘤和肺腫瘤的應(yīng)用中具有顯著的協(xié)同效應(yīng)；小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去乙?；敢种苿┡c辛伐他汀相互增強(qiáng)對(duì)方的抗腫瘤藥效，降低用藥劑量，減少副作用的發(fā)生。

附圖說(shuō)明

圖1.辛伐他汀對(duì)hsp90-cdc37結(jié)合的影響。

圖2.辛伐他汀與LBH589對(duì)細(xì)胞凋亡因子的影響。

圖3.辛伐他汀及LBH589對(duì)hsp90共伴侶結(jié)合的影響。

圖4.辛伐他汀及LBH589對(duì)hsp90伴侶分子的影響。

圖5.辛伐他汀及LBH589對(duì)hsp90伴侶分子磷酸化的影響。

圖6.辛伐他汀及LBH589對(duì)小鼠中三陰性乳腺腫瘤生長(zhǎng)的影響。

圖7.辛伐他汀及LBH589對(duì)小鼠中三陰性乳腺腫瘤重量的影響。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明并不受限于此。

實(shí)施例1：

為了驗(yàn)證辛伐他汀(Simvastatin)是乙?；痟sp90的抑制劑，將Flag-hs90及Flag-hsp90-K292Q突變體分別轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中，用16μM濃度的辛伐他汀處理24小時(shí)后，檢測(cè)Flag-hsp90和蛋白激酶伴侶分子cdc37的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，辛伐他汀不但可以抑制hsp90與cdc37的結(jié)合，也可以抑制hsp90乙?；M分子K292Q與cdc37結(jié)合的能力，但是K292Q模擬乙?；笷lag-hsp90與cdc37的結(jié)合能力提高約3倍；由于腫瘤組織中hsp90的K292位點(diǎn)處于乙?；癄顟B(tài)而優(yōu)先和腫瘤組織、而非正常組織中的cdc37形成復(fù)合物，因此辛伐他汀顯然具有抑制腫瘤組織中hsp90與cdc37結(jié)合的能力；

圖1顯示了，在HEK293細(xì)胞中，K292Q具有比hsp90強(qiáng)得多的與cdc37結(jié)合的能力，辛伐他汀不但抑制hsp90和cdc37復(fù)合物的形成，也抑制乙?；痟sp90與cdc37復(fù)合物的形成。

實(shí)施例2：辛伐他汀與LBH589聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)測(cè)定

細(xì)胞：MDA-MB-231(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MDA-MB-468(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、BT483(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、BT474(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MDA-MB-453(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MCF-7(乳腺腫瘤細(xì)胞株)、MCF-10A(乳腺纖維囊性病上皮細(xì)胞株)和A549(肺腫瘤細(xì)胞株)均來(lái)源于American Type Culture Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA；

藥品：辛伐他汀購(gòu)自Sigma；組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589和Trichostatin(TSA)均購(gòu)自Selleck Chemicals；

方法：準(zhǔn)確稱量藥物組合物相應(yīng)組分，分別溶于二甲基亞礬配成30mM的貯存液，保存在-20℃冰箱，使用時(shí)用新鮮的培養(yǎng)基稀釋到合適的濃度，然后分別取1微升混合備用。所有的試驗(yàn)中，二甲基亞礬的最終濃度均低于1‰(V/V)；

將所有的細(xì)胞于含10％小牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO₂的濕度條件下培養(yǎng)，在加藥的前一天，在96孔板上進(jìn)行細(xì)胞接種2X10⁴/孔，然后向細(xì)胞中加入按上述方法制備的藥物組合物溶液，使各組分達(dá)到其工作濃度，然后用兩種不同方法測(cè)定聯(lián)合指數(shù)，結(jié)果如表1和表2所示；

本實(shí)施例中，作如下的技術(shù)說(shuō)明：

A.單層細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

使用兩種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)方法，它們是：1)CCK-8檢測(cè)和2)CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)，使用孵育特定小時(shí)后抑制25％、50％、75％或90％細(xì)胞的化合物濃度即IC₂₅、IC₅₀、IC₇₅和IC₉₀來(lái)作為抗增殖效力的度量；

CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)是測(cè)定細(xì)胞增殖速率的比色試驗(yàn)，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀定量測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量；

CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)是通過(guò)利用溶解于緩沖溶液中高純度的刃天青檢測(cè)活性細(xì)胞的數(shù)目，細(xì)胞可將深藍(lán)色的氧化型染料(刃天青)轉(zhuǎn)化為紅色的還原型染料(試鹵靈)，因?yàn)闊o(wú)活性的細(xì)胞很快喪失了代謝能力而不能還原刃天青，也就不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，所以，該系統(tǒng)特異性檢測(cè)活性細(xì)胞，試驗(yàn)產(chǎn)生的熒光和比色信號(hào)與樣品中活細(xì)胞的數(shù)量成比例；

上述試驗(yàn)中，用8點(diǎn)或10點(diǎn)藥物滴定在多孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行試驗(yàn)，使外側(cè)各列保持空置，將細(xì)胞以不少于10⁴細(xì)胞/mL的密度懸浮于完全培養(yǎng)基中，并加入每孔中，然后加入適當(dāng)培養(yǎng)基(200μL)，24小時(shí)后，將20μL的CellTiter-Blue或CCK-8溶液加入一個(gè)板中以測(cè)定加入化合物時(shí)(T₀)的活性，將該板在37℃孵育適宜的時(shí)間，并經(jīng)Tecan infinite M200Pro使用儀器配套程序i-control在450nm(CCK-8檢測(cè))及560nm激發(fā)光激發(fā)下在590nm(CellTiter-Blue)測(cè)量光密度，T₀板作為在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段的初始活性參考，接種完24小時(shí)后，開(kāi)始加入化合物，該時(shí)間與T₀測(cè)定的時(shí)間相同，在96孔板中加入各個(gè)化合物的一系列濃度稀釋物，最高濃度位于板邊緣，一式三份地加入稀釋物中的每一種，并將完全培養(yǎng)基加入沒(méi)有細(xì)胞的空的外側(cè)的各列中，化合物單獨(dú)加入或與組蛋白去乙酰化酶抑制劑組合加入，接種后將該板在37℃孵育72小時(shí)，加入CellTiter-Blue或CCK-8溶液(同T₀板)并在適宜的時(shí)間后讀取，為分析數(shù)據(jù)，從各實(shí)驗(yàn)孔中減去單獨(dú)溶媒(背景)的平均值，并計(jì)算化合物各個(gè)稀釋物的三個(gè)值的平均值，使用以下公式計(jì)算生長(zhǎng)百分比；

B.聯(lián)合指數(shù)(CI)

為測(cè)定組蛋白去乙?；敢种苿┡c其它化合物一起是否具有加合作用、協(xié)同作用或拮抗作用，測(cè)定用于各組合所產(chǎn)生的杭增殖活性的、被稱為聯(lián)合指數(shù)的參數(shù)。CI通過(guò)等效線圖解法方程CI＝(D)₁/(D_x)₁+(D)₂/(D_x)₂來(lái)測(cè)定，組合中的藥物1(D)₁和藥物2(D)₂抑制X％且(D_x)₁和(D_x)₂是也抑制X％的藥物1和藥物2單獨(dú)的劑量，對(duì)于每種化合物，在各劑量使用在CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)和CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試驗(yàn)中所測(cè)定的％生長(zhǎng)值，CI值小于1表明了協(xié)同作用，等于1表明了加合作用，且大于1表明了拮抗作用，CI可在IC₂₅、IC₅₀、IC₇₅和IC₉₀測(cè)定。

表1.辛伐他汀與LBH589聯(lián)用的聯(lián)合指數(shù)，使用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)。

表2.辛伐他汀與LBH589組合的聯(lián)合指數(shù)，使用CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)。

實(shí)施例3：辛伐他汀以及與LBH589聯(lián)用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡及壞死的影響

將乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231用不同濃度辛伐他汀(Simva.)在有/或無(wú)LBH589存在下分別處理24小時(shí)，隨后，用Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒處理，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)，數(shù)值代表細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)比例的平均值+S.E.M.，結(jié)果顯示，辛伐他汀與LBH589聯(lián)用，主要引起細(xì)胞的凋亡，結(jié)果如表3所示。

表3.

本實(shí)施例中，檢測(cè)了辛伐他汀及其與LBH589聯(lián)用引起的凋亡蛋白caspase3的活化及其底物Parp1酶切狀態(tài)，結(jié)果顯示，辛伐他汀與LBH589聯(lián)用可以增強(qiáng)辛伐他汀誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例4

辛伐他汀以及與LBH589聯(lián)用只影響hsp90與共伴侶的結(jié)合，而不影響hsp90共伴侶分子及調(diào)節(jié)分子的表達(dá)，將乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231用不同濃度辛伐他汀(Simva.)在/或無(wú)LBH589存在下分別處理24小時(shí)，檢測(cè)熱休克蛋白hsp40、hsp70、hsp90及共伴侶分子cdc37、HOP、hsp90激活分子AHA1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，有無(wú)LBH589的存在，辛伐他汀對(duì)這些蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著影響，尤其是沒(méi)有誘導(dǎo)hsp70等熱休克蛋白的表達(dá)，減少了產(chǎn)生抗藥性的一種可能性，也是有別于其他hsp90抑制劑所在，因而比一般的hsp90抑制劑更有優(yōu)勢(shì)；

但是，對(duì)hsp90的伴侶底物分子的穩(wěn)定性，尤其是對(duì)磷酸化底物分子的穩(wěn)定性有顯著影響，同時(shí)，Hsf1及磷酸化的Hsf1(活性Hsf1)的穩(wěn)定性減弱，所以Hsp70等熱休克蛋白的表達(dá)不能被誘導(dǎo)；

辛伐他汀及其與LBH589的聯(lián)用側(cè)重破壞hsp90伴侶底物分子磷酸化的特性表明，辛伐他汀及其與LBH589的聯(lián)用優(yōu)先破壞蛋白激酶的穩(wěn)定性，結(jié)果證實(shí)辛伐他汀及其與LBH589的聯(lián)用降低了蛋白激酶Raf1和CDK4的穩(wěn)定性，但有些激 酶的穩(wěn)定性并不受影響，如CDK1。

實(shí)施例5

辛伐他汀及其與LBH589的聯(lián)用抑制三陰性乳腺腫瘤生長(zhǎng)。Balb/c裸鼠接種2x10⁶個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞，接種腫瘤細(xì)胞兩周后(腫瘤約長(zhǎng)至120mm³)開(kāi)始口服給藥，每周兩次，測(cè)量腫瘤體積、體重和最后腫瘤重量，結(jié)果顯示，辛伐他汀與LBH589的聯(lián)用顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑制效果明顯比辛伐他汀及LBH589單獨(dú)給藥對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制強(qiáng)許多：

同樣，辛伐他汀、LBH589及辛伐他汀與LBH589的聯(lián)用對(duì)腫瘤重量的影響，也和對(duì)腫瘤腫瘤體積的影響有相似的效果，而對(duì)小鼠體重沒(méi)有顯著影響。