本發(fā)明涉及化合物ID45在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別以節(jié)段1至節(jié)段8命名。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進(jìn)一步分為17個(gè)H(H1-H17)和10個(gè)N(N1-N10)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型。而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。

流感病毒的整個(gè)生活周期需要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)完成。感染的起始是病毒顆粒表面的刺突HA識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，與受體結(jié)合后病毒粒子以?xún)?nèi)吞體的形式進(jìn)入到宿主細(xì)胞。在內(nèi)吞體的酸性pH條件下病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，位于輕鏈N端的融合肽暴露，病毒囊膜與細(xì)胞膜融合。低pH環(huán)境也致使大量H⁺經(jīng)由M2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致M1蛋白與vRNP的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的vRNP釋放到被感染細(xì)胞的胞漿。vRNP隨后轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，復(fù)制時(shí)病毒首先以自身RNA為模板合成互補(bǔ)RNA(cRNA)，然后以cRNA為模板再合成vRNA。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿，翻譯出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。一部分合成蛋白(如NP)需要重新轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與新生成的vRNA組成vRNP，vRNP出核后與其余的病毒蛋白開(kāi)始組裝成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通過(guò)神經(jīng)氨酸酶(NA)水解細(xì)胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點(diǎn)釋放出來(lái)。

防治流感的基本手段分為疫苗注射以及藥物治療兩種。疫苗的有效性建立在制備疫苗的毒株與環(huán)境中存在的或者是將要造成流行的流感病毒毒株的相似性，而由于流感病毒極易發(fā)生變異，給預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性增加了困難，進(jìn)而使疫苗防治的效果受到極大的影響。在疫苗有效性難以把握的情況下,抗流感病毒的藥物研究就顯得尤為重要。而目前FDA批準(zhǔn)上市的抗流感藥物只有四種：金剛烷胺、金剛乙胺、奧司他韋、扎那米韋。前兩種屬于M2離子通道抑制劑，通過(guò)抑制病毒RNA釋放到胞質(zhì)抑制病毒的復(fù)制。后兩種屬于NA活性抑制劑，通過(guò)抑制病毒粒子的釋放和擴(kuò)散抑制病毒的復(fù)制。 然而,隨著病毒對(duì)這些藥物抗藥性的產(chǎn)生以及這些藥物引起的副反應(yīng)等問(wèn)題使得新型抗流感病毒藥物的研發(fā)迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供化合物ID45在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。

化合物ID45即為式(Ⅰ)所示化合物。

本發(fā)明首先要求保護(hù)式(Ⅰ)所示化合物在制備抑制流感病毒的藥物中的應(yīng)用。所述抑制流感病毒可體現(xiàn)為抑制流感病毒復(fù)制和/或抑制流感病毒合胞體形成。所述流感病毒可為A型流感病毒，具體可為A型流感病毒H1N1亞型，更具體可為A/WSN/33毒株。

本發(fā)明還保護(hù)一種抑制流感病毒的藥物，其活性成分為式(Ⅰ)所示化合物。所述抑制流感病毒體現(xiàn)為抑制流感病毒復(fù)制和/或抑制流感病毒合胞體形成。所述流感病毒可為A型流感病毒，具體可為A型流感病毒H1N1亞型，更具體可為A/WSN/33毒株。

本發(fā)明還保護(hù)式(Ⅰ)所示化合物在制備藥物中的應(yīng)用；所述藥物的功能為如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抗流感病毒；(b)治療流感；(c)預(yù)防流感。所述(a)中，所述流感病毒可為A型流感病毒，具體可為A型流感病毒H1N1亞型，更具體可為A/WSN/33毒株。所述(b)和/或(c)中，所述流感可為A型流感病毒引起的流感，具體可為A型流感病毒H1N1亞型引起的流感，更具體可為A/WSN/33毒株引起的流感。

本發(fā)明還保護(hù)一種藥物，其活性成分為式(Ⅰ)所示化合物；所述藥物的功能為如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抗流感病毒；(b)治療流感；(c)預(yù)防流感。所述(a)中，所述流感病毒可為A型流感病毒，具體可為A型流感病毒H1N1亞型，更具體可為A/WSN/33毒株。所述(b)和/或(c)中，所述流感可為A型流感病毒引起的流感，具體可為A型流感病毒H1N1亞型引起的流感，更具體可為A/WSN/33毒株 引起的流感。

本發(fā)明對(duì)于流感病毒的防治具有重大價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例3的結(jié)果。

圖2為實(shí)施例4的結(jié)果。

圖3為實(shí)施例5的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

PBS緩沖液(pH7.0-7.2)：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g、KH₂PO₄0.27g，超純水定容至1L。

Hela細(xì)胞(子宮頸癌細(xì)胞)：ATCC，編號(hào)為CCL-2。293T細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞)：ATCC，編號(hào)為CRL-11268。DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑PEI(按說(shuō)明書(shū)操作)：Polyscience公司。熒光素酶活性測(cè)量試劑盒：Promega公司。MTT：Sigma。蛋白酶抑制劑：購(gòu)自Roche公司。

A/WSN/33流感病毒毒株(簡(jiǎn)稱(chēng)A/WSN/33毒株)：為A型流感病毒H1N1亞型毒株，該毒株記載于“Neumann G1,Watanabe T,Ito H,et al.Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.PNAS,1999(16):9345-9350”一文，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物學(xué)研究所獲得。

pREP4載體：記載于“李云芳,張幼怡,侯嶸等.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)HEK293和DDT1—MF2細(xì)胞天然β2—腎上腺素受體表達(dá)的影響.北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2001年底5期”一文，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物學(xué)研究所獲得。

pHH21載體：參考文獻(xiàn):Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs。

實(shí)施例1、293T-IAV-Luc細(xì)胞的制備

一、pREP4-IAV-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建

人工合成序列表中序列1所示DNA片段。序列1共由1748個(gè)核苷酸組成，第14-58位記為片段1，第59-1711位為螢火蟲(chóng)熒光素酶編碼基因(報(bào)告基因)，第1712-1734 位記為片段2，兩端為BsmB I的識(shí)別位點(diǎn)序列。其中，片段1和片段2均為流感病毒NP蛋白的啟動(dòng)子，在流感病毒存在的情況下，位于該融合質(zhì)粒上的該啟動(dòng)子可被啟動(dòng)，螢火蟲(chóng)熒光素酶才能夠表達(dá)。

用限制性?xún)?nèi)切酶BsmBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pHH21載體的骨架大片段正向相連，將測(cè)序驗(yàn)證正確的中間質(zhì)粒命名為pHH21-IAV-Luc質(zhì)粒。將pHH21-IAV-Luc質(zhì)粒以NheI和PciI內(nèi)切酶(Takara)酶切，回收酶切片段，以Klenow酶(購(gòu)自Takara公司)補(bǔ)平末端后連入PvuII內(nèi)切酶消化的pREP4載體，將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pREP4-IAV-Luc。

二、293T-IAV-Luc細(xì)胞的制備

將重組質(zhì)粒pREP4-IAV-Luc導(dǎo)入293T細(xì)胞，得到重組細(xì)胞，命名為293T-IAV-Luc細(xì)胞。

實(shí)施例2、化合物ID45的制備和表征

一、化合物ID45的制備

按照如下文獻(xiàn)中的方法制備化合物ID45：Antiviral Activity of an Isatin Derivative via Induction of PERK-Nrf2-Mediated Suppression of Cap-Independent Translation.dx.doi.org/10.1021/cb400775z|ACS Chem.Biol.2014,9,1015-1024。

二、化合物ID45的表征

化合物ID45的形態(tài)為：紅色晶體。

化合物ID45的表征數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1化合物ID45的¹H NMR數(shù)據(jù)

以上表征數(shù)據(jù)表明，化合物ID45的化學(xué)式為C₂₂H₁₃Br₂F₂N₃O₂，分子量為549.16，結(jié)構(gòu)式如下：

將化合物ID45溶于DMSO，得到濃度為10μM的ID45溶液。后續(xù)實(shí)施例中的化合物ID45均是以ID45溶液的形式加入的。

實(shí)施例3、化合物ID45抑制H1N1亞型流感病毒的復(fù)制

1、將A/WSN/33毒株、DMEM培養(yǎng)基和化合物ID45混合，得到化合物ID45濃度為10μmol/L的混合液。

2、將293T-IAV-Luc細(xì)胞均勻鋪于96孔板上(每孔20000個(gè)細(xì)胞)，37℃靜置培養(yǎng)12小時(shí)，棄上清，用PBS緩沖液清洗孔中的細(xì)胞。

3、完成步驟2后，取所述96孔板，加入步驟1得到的混合液(MOI＝0.5)，37℃靜置孵育1小時(shí)，棄上清。

4、完成步驟3后，取所述96孔板，加入含10％(體積比)胎牛血清和10μmol/L化合物ID45的DMEM培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12小時(shí)，棄上清，用PBS緩沖液清洗孔中的細(xì)胞。

5、完成步驟4后，取所述96孔板，加入熒光素酶活性測(cè)量試劑盒中的裂解液，37℃靜置孵育30分鐘，取上清。

6、取步驟5得到的上清，采用熒光素酶活性測(cè)量試劑盒檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)水平。

將DMSO作為化合物ID45的陰性對(duì)照。

進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

結(jié)果見(jiàn)圖1(圖1中，DV代表陰性對(duì)照)。結(jié)果表明，化合物ID45可以抑制流感病毒的復(fù)制。

實(shí)施例4、化合物ID45抑制HA假病毒的活性

一、制備HA假病毒

將293T細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿，達(dá)到80％密度后借助轉(zhuǎn)染試劑PEI共轉(zhuǎn)染6μg pNLLucE-R-HIV-Luc質(zhì)粒、6μg pEWSN-HA質(zhì)粒和6μg pCAGGS-NA質(zhì)粒，6小時(shí)后更換為含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，48小時(shí)后將整個(gè)培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移15ml離心管中，吹散細(xì)胞，凍融一次后用0.22μm濾膜過(guò)濾，收集濾液，即為HA假病毒的病毒液，-80℃保存。

提及pNLLucE-R-HIV-Luc質(zhì)粒、pEWSN-HA質(zhì)粒和pCAGGS-NA質(zhì)粒的文獻(xiàn)如下：Junjie Zhang,Ting Liu,Xiaomei Tong,Jinghua Yan,Xin Ye,et al.Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell screening.Antivirus Research.2011；93:48-54.。

二、化合物ID45抑制HA假病毒的活性

1、將293T-IAV-Luc細(xì)胞均勻鋪于24孔板上(每孔16萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)，37℃靜置培養(yǎng)15小時(shí)，棄上清。

2、完成步驟1后，取所述24孔板，每孔加入100μL步驟一制備的HA假病毒的病毒液和400μl含化合物ID45的DMEM培養(yǎng)基(使得化合物ID45在體系中的濃度為10μM)，37℃靜置孵育18小時(shí)，用PBS緩沖液清洗孔中的細(xì)胞。

3、完成步驟2后，取所述96孔板，加入熒光素酶活性測(cè)量試劑盒中的裂解液，37℃靜置孵育30分鐘，取上清。

4、取步驟3得到的上清，采用熒光素酶活性測(cè)量試劑盒檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)水平。

將DMSO作為化合物ID45的陰性對(duì)照。

進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

結(jié)果見(jiàn)圖2(圖1中，DV代表陰性對(duì)照)?；衔颕D45具有抑制HA假病毒復(fù)制 的活性。

實(shí)施例5、化合物ID45抑制流感病毒合胞體形成

1、取6孔板，接種Hela細(xì)胞(每個(gè)孔16萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)，37℃靜置培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞達(dá)到約50％匯合。

2、完成步驟1后，取所述6孔板，每孔轉(zhuǎn)染1μg pEWSN-HA質(zhì)粒，然后37℃靜置培養(yǎng)30h，吸棄上清。

3、完成步驟2后，取所述6孔板，加入含10μM化合物ID45的DMEM培養(yǎng)基，37℃靜置孵育15min，吸棄上清。

4、完成步驟3后，取所述6孔板，加入含10μM化合物ID45的PBS緩沖液，37℃靜置孵育3min，吸棄上清。

5、完成步驟4后，取所述6孔板，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃靜置孵育4小時(shí)，使合胞體形成。

6、完成步驟5后，用4％的多聚甲醛固定10min，然后用結(jié)晶紫溶液染色鏡下觀察結(jié)果。

將DMSO作為化合物ID45的陰性對(duì)照。

結(jié)果見(jiàn)圖3?；衔颕D45可以抑制流感病毒合胞體形成。

實(shí)施例6、細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1、將293T-IAV-Luc細(xì)胞鋪于96孔板(每孔10000個(gè)細(xì)胞)，37℃靜置培養(yǎng)14小時(shí)，棄上清。

2、完成步驟1后，取所述96孔板，加入含梯度濃度化合物ID45的DMEM培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)，棄上清。

3、完成步驟2后，取所述96孔板，加入含0.5mg/ml MTT的DMEM培養(yǎng)基，37℃靜置孵育4小時(shí)，棄上清。

4、完成步驟3后，取所述96孔板，每孔加入100μl DMSO，避光裂解10min，然后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的吸光值。

CC₅₀(50％的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)的藥物濃度)＝34.5μM。