本發(fā)明涉及生物技術和免疫學領域。更具體地，本發(fā)明涉及流感病毒蛋白與宿主蛋白CPSF30的相互作用在抑制癌細胞增殖中的應用。
背景技術：
：癌癥是威脅人類健康的重要疾病，全球每年死于癌癥的人數(shù)比死于艾滋病、瘧疾、結核的人數(shù)總和還要多，大概13％的人類死亡源于癌癥，而這一比例正呈逐年上升趨勢。在癌癥類型、患病人口增多的情況下，研發(fā)新型有效的抗癌藥物的重要性毋庸置疑。包括癌細胞在內(nèi)的所有體細胞想要實現(xiàn)細胞增殖，都需要經(jīng)歷細胞周期到達有絲分裂，將1個細胞變成2個，實現(xiàn)細胞數(shù)量的增加。癌癥的誘因有很多種，發(fā)生的部位也不盡相同，但是所有的癌癥都具有一個共同的特征，就是癌細胞相比于正常細胞大多處于細胞分裂的活躍時期，表現(xiàn)為不受限制的、紊亂的細胞生長。因此，不論是傳統(tǒng)的放射線治療和化學治療方法還是其他免疫治療方法，都是為了抑制細胞分裂和增殖，乃至殺死癌細胞。病毒感染對正常機體來說是不利于健康的，但是人們對病毒學的研究發(fā)現(xiàn)，病毒通過和宿主的相互作用可以影響很多宿主信號通路和生理反應，這一點使得病毒也有被加以利用的可能，利用病毒的特性用來治療病變的細胞。在癌癥治療中，利用病毒感染導致細胞死亡的原理殺死癌細胞的想法早在1940年左右出現(xiàn)，但直到1991年，才發(fā)現(xiàn)第一個溶癌病毒(Oncolyticvirus)皰疹病毒可以裂解腦膠質(zhì)瘤細胞，誕生了第一個病毒療法(Virotherapy)。隨后，很多不同的病毒被用來研究其溶癌特性。然而，這種病毒療法主要還是利用病毒感染最終導致細胞裂解的原理，雖然可以實現(xiàn)癌細胞感染特異性，但需要具有復制能力的活病毒，其安全性導致很大的應用限制。此外，目前一些常用的腫瘤治療方法的副作用仍很大，導致病人甚至不得不中止治療。綜上，本領域尚未開發(fā)出令人滿意的抑制癌細胞的藥物，因此迫切需要開發(fā)安全性更好的抑制癌細胞的方法和藥物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是提供一種新穎的、安全性更好的抑制癌細胞的方法和藥物。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種病毒蛋白、或其表達載體、或其激動劑的用途，用于制備(a)用于將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的組合物；和/或(b)用于抑制癌細胞生長的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒蛋白來自選自下組的病毒：流感病毒、副流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒為流感病毒，更佳地為甲型流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞包括哺乳動物的細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物、膳食補充劑、保健品組合物、食品組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括注射劑、口服制劑、透皮制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的癌細胞選自下組：腎癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、食管癌細胞、卵巢癌。在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括病毒載體、質(zhì)粒。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達外源的流感病毒蛋白的載體的用途，用于制備(a)用于將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的組合物；和/或(b)用于抑制癌細胞生長的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括病毒載體、質(zhì)粒。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體包括慢病毒載體、黃熱病毒載體、腺病毒載體。在另一優(yōu)選例中，所述的外源的流感病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種CPSF30抑制劑的用途，用于制備將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑為病毒蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑選自下組：流感病毒的NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑包括小分子化合物、反義核酸、或siRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑包括抗體、配體、或短肽。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制癌細胞或用于治療腫瘤。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物或藥物組合，其特征在于，所述的藥物組合物或藥物組合含有(i)藥學上可接受的載體；(ii)病毒蛋白或其激動劑；和(iii)任選的不同于組分(ii)的其他抗腫瘤活性成分。在另一優(yōu)選例中，所述的組分(ii)和(iii)可以位于同一制劑、或位于不同的制劑中。在另一優(yōu)選例中，所述的組分(iii)為抑制癌細胞的有絲分裂的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的組分(iii)選自下組：raf酶抑制劑(如SORAFENIB(索拉非尼)或其類似藥物)、有絲分裂酶抑制劑(如吉非替尼或其類似藥物)。在另一優(yōu)選例中，所述的組分(iii)為CPSF30抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑選自下組：小分子化合物、反義核酸、、siRNA、抗體、配體、短肽或其組合。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外非治療性的將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的方法，包括步驟：在(a)病毒蛋白或其激動劑，和/或(b)CPSF30抑制劑存在下，培養(yǎng)所述的細胞，從而使得所述細胞的細胞周期停滯于G0/G1期，其中，所述的病毒蛋白選自下組流感病毒蛋白：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是表達CPSF30的細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞來自哺乳動物(如靈長動物)，更佳地人。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞包括正常細胞、或癌細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的癌細胞選自下組：腎癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、食管癌細胞、卵巢癌。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30抑制劑是反義核酸(如siRNA)。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選抗腫瘤候選藥物的方法，包括步驟：(i)在實驗組中，在所述測試物存在下，并且在病毒蛋白存在下，體外培養(yǎng)哺乳動物的細胞，并測試實驗組中所述細胞的細胞周期情況；并且在對照組中，在測試條件相同但無所述測試物存在下，體外培養(yǎng)哺乳動物的細胞，并測試對照組中所述細胞的細胞周期，其中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合；(ii)將實驗組中細胞周期處于G0/G1期的細胞比例數(shù)值Rs與對照組中細胞周期處于G0/G1期的細胞比例數(shù)值Rc進行比較，如果Rs顯著高于Rc，則表明該測試物為潛在的抗腫瘤候選藥物(即與所述病毒蛋白存在相互作用關系的潛在的抗腫瘤候選藥物)；如果Rs不顯著高于Rc，則不將該測試物視為與所述病毒蛋白存在相互作用關系的潛在的抗腫瘤候選藥物；(iii)任選地，對于上一步驟中選出的潛在的抗腫瘤候選藥物，測試其在無所述病毒蛋白存在情況下，對腫瘤細胞的抑制或殺傷能力。在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著高于”指Rs/Rc之比≥1.20，較佳地≥1.50，更佳地≥2.0。另一種本發(fā)明的篩選方法包括步驟：(i)在實驗組中，在所述測試物存在下，并且在病毒蛋白和CPSF30存在下，并測試實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的情況；并且在對照組中，在測試條件相同但無所述測試物存在下，測試實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物情況，其中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合；(ii)將實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的數(shù)量Vs與對照組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的數(shù)量Vc進行比較，如果Vs顯著高于Vc，則表明該測試物為潛在的抗腫瘤候選藥物(即與所述病毒蛋白存在相互作用關系的潛在的抗腫瘤候選藥物)，并可進行步驟(iii)；如果Vs不顯著高于Vc，則不將該測試物視為潛在的抗腫瘤候選藥物；(iii)任選地，對于上一步驟中選出的潛在的抗腫瘤候選藥物，測試其在無所述病毒蛋白存在情況下，對腫瘤細胞的抑制或殺傷能力。在另一優(yōu)選例中，所述的測試物包括小分子化合物、反義核酸、抗體、或其組合。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種復合物，其特征在于，所述的復合物是CPSF30與病毒蛋白形成的復合物，并且所述復合物選自下組：CPSF30/NP二元復合物、或CPSF30/NP/NS1三元復合物。在另一優(yōu)選例中，所述的復合物是CPSF30/NP/NS1三元復合物。在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第七方面所述的復合物的用途，它用于篩選影響細胞周期的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的“影響細胞周期”指將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療方法，所述的治療是將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期，所述方法包括步驟：給需要的對象施用(a)病毒蛋白或其激動劑，和/或(b)CPSF30抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括哺乳動物(如靈長動物)，較佳地人。在另一優(yōu)選例中，所述的施用病毒蛋白包括直接施用蛋白和間接施用蛋白(如施用表達所述蛋白的載體)。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了甲型流感病毒感染人肺癌細胞A549引起細胞周期停滯在G0/G1期。A549細胞以MOI＝2感染1h，感染后24h收細胞，流式細胞術分析細胞周期。圖中，(A)未感染的細胞(對照組,mock)和感染的細胞(感染組,infected)分別用NP的抗體染色，陽性細胞表明感染效率。(B)未感染的細胞(對照組)和感染的細胞(感染組)分別用PI染色，分析細胞周期。(C)使用ModFitLT軟件統(tǒng)計B中處于不同細胞周期的細胞比例。圖2顯示了甲型流感病毒的NS1和NP基因的表達引起細胞周期停滯在G0/G1期。HEK293細胞不轉染(mock)，或者分別轉染可表達GFP或者NP-GFP和NS1-GFP融合蛋白的質(zhì)粒，轉染后24h使用nocodazole(Noc)處理細胞16h，將細胞停滯在G2/M期，收細胞，流式細胞術分析。圖中，(A)各組細胞分別用PI染色，分析細胞周期。(B)使用ModFitLT軟件統(tǒng)計B中處于不同細胞周期的細胞比例。圖3顯示了NS1蛋白抑制細胞周期的能力與其結合CPSF30的能力正相關。用GST-CPSF30蛋白pulldownH5N1NS1和其F103S/M106I突變以及pH1N1NS和其三突變(TripleMut)108K/125D/189D，其中H5N1NS1，pH1N1NS1及其它們的突變蛋白是通過外翻譯試劑盒(Promega)合成的。按圖2同樣的方法分別轉染H5N1株和pH1N1株NS1基因和相應的突變基因，收取細胞然后檢測細胞周期結果。圖4顯示了NP蛋白抑制細胞周期的能力與其結合CPSF30的能力正相關。上圖為用GST-CPSF30蛋白pulldownH5N1NP和其17Gdel/K400R/A451T突變以及pH1N1NP和其三突變17Gdel/K400R/A451T的結果，其中H5N1NP，pH1N1NP及其它們的突變蛋白是通過外翻譯試劑盒(Promega)合成的。下圖為按圖2同樣的方法分別轉染H5N1株和pH1N1株NP基因和相應的突變基因，收取細胞然后檢測細胞周期結果。圖5顯示了抑制CPSF30表達水平導致細胞周期停滯在G0/G1期。圖中，(A-B)HEK293細胞分別轉染CPSF30的siRNA1,siRNA2和NegativecontrolsiRNA(NC),48小時后收集細胞，(A)RT-PCR檢測CPSF30基因的轉錄情況；(B)做免疫蛋白印跡實驗檢測CPSFF30蛋白的表達情況。(C)將驗證有效的siRNA1, siRNA2和NC轉染HEK293細胞，24小時后加入Nocodazole，再經(jīng)24小時后收集細胞檢測細胞周期狀態(tài)。(D)為ModFitLT軟件分析細胞周期圖以得到細胞周期中每一周期的細胞所占百分比，結果用柱狀圖顯示，顯示的是三次獨立實驗的平均值和標準差。圖6顯示了NS1和NP基因的表達可以抑制癌細胞的增殖。分別用表達NS1基因和NP基因的慢病毒或者不表達任何基因的對照病毒以MOI＝20感染人肺癌細胞A549細胞(A和B)以及人子宮頸癌細胞Hela細胞(C和D)，在感染后24、48、72、96、120小時分別向各組細胞中加入MTT反應液，檢測OD值。圖7顯示了抑制CPSF4基因的表達可以抑制癌細胞的增殖。分別用表達siRNA1的慢病毒或者不表達任何基因的對照病毒以MOI＝20感染人子宮頸癌細胞Hela細胞，在感染后24、48、72、96、120小時分別向各組細胞中加入MTT反應液，檢測OD值。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了流感病毒感染可以導致細胞周期停滯在G0/G1期的現(xiàn)象。令人意外的是，兩個流感病毒蛋白NS1和NP能夠有效起到了細胞周期的抑制作用，并且都是通過抑制一個共同的宿主蛋白，即mRNA剪切和多聚腺苷酸化因子CPSF30的活性，實現(xiàn)對細胞周期的抑制。在此基礎上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人利用流感病毒蛋白(NS1和/或NP)抑制細胞周期停滯在G0/G1期的原理，通過在癌細胞中外源表達流感病毒的NS1和NP蛋白，或者用siRNA的方法抑制癌細胞內(nèi)源性CPSF30的表達來抑制癌細胞的增殖。術語如本文所用，術語“停滯于G0/G1期”指對于一細胞群而言，處于G0/G1期的細胞比例顯著提高。例如，與對照組的細胞群相比，實驗組處于G0/G1期的細胞比例顯著提高。通常，這種相對提高幅度為≥20％，更佳地≥50％或更高。本發(fā)明蛋白及其制備如本文所用，術語“本發(fā)明蛋白”指NS1蛋白、NP蛋白或其組合。如本文所用，術語“本發(fā)明的多核苷酸”指用于編碼NS1蛋白、NP蛋白或其組合的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因 組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列包括簡并序列。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的NS1或NP的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，通過擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或本發(fā)明蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；224：1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的本發(fā)明蛋白。一般來說有以下步驟：(1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。mRNA剪切和多聚腺苷酸化因子CPSF30如本文所用，術語“CPSF30”和“CPSF-30”以及“CPSF4”可互換使用，指剪切和多聚腺苷酸化特異性因子30(cleavageandpolyadenylationspecificityfactor30)。應理解，該術語CPSF30不僅包括野生型CPSF30，還包括突變型CPSF30。此外，CPSF30基因或核酸序列包括基因組、cDNA或RNA形式，而CPSF30蛋白或多肽包括全長CPSF30或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的CPSF30是來源于哺乳動物，尤其是人的CPSF30。人CPSF30的核苷酸序列和氨基酸序列的登錄號為GenBankNM_006693.2，它是剪切和多聚腺苷酸化特異性因子家族蛋白中的一員，蛋白大小約30KD,因此被稱為CPSF30，因其是4個家族蛋白中最小的一個；CPSF30與該家族的其他蛋白CPSF73，CPSF100及CPSF160組成復合體負責剪切前體mRNA的3’端并加入多聚腺苷酸尾巴，促進mRNA的成熟。流感病毒蛋白NP如本文所用，術語“流感病毒蛋白NP”和“蛋白NP”可互換使用，指來自于流感病毒的核蛋白。應理解，該術語NP不僅包括野生型NP，還包括突變型NP。此外，NP基因或核酸序列包括DNA或RNA形式，而NP蛋白或多肽包括全長NP或其活性片段。此外，流感病毒蛋白NP不僅包括來自各型或各亞型流感病毒的NP蛋白或其活性片段，還包括來自于類似病毒(如副流感病毒)的NP蛋白或其活性片段，只要該NP蛋白或其活性片段同樣具有與CPSF30蛋白(尤其是人CPSF30蛋白)結合并抑制CPSF30活性的功能。代表性的各型流感病毒包括(但并不限于)：甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等。應理解，不同的流感病毒的基因存在一定的變異。因此，基于本發(fā)明，術語NP包括這些變異的或突變的NP基因和NP蛋白。作為一種代表性的NP蛋白，甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NP的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示：甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NP的核苷酸序列(SEQIDNO.:1)atggcgaccaaaggcaccaaacgatcttacgaacagatggagactgatggagaacgccagaatgccactgaaatcagagcatctgtcggaaaaatgattgatggaattggacgattctacatccaaatgtgcaccgaacttaaactcagtgattatgagggacggctgattcagaacagcttaacaatagagagaatggtgctctctgcttttgacgagaggaggaataaatatctagaagaacatcccagtgcggggaaagatcctaagaaaactggaggacctatatacaggagagtagatggaaagtggaggagagaactcatcctttatgacaaagaagaaataagacgaatctggcgccaagctaataatggtgacgatgcaacggctggtctgactcacatgatgatctggcactccaatttgaatgatgcaacttaccagaggacaagagctcttgttcgcacaggaatggatcccaggatgtgctcactgatgcagggttcaaccctccctaggaggtctggggccgcaggtgctgcagtcaaaggagttggaacaatggtgatggaattgatcagaatgatcaaacgtgggatcaatgatcggaacttctggaggggtgagaatggacggagaacaaggattgcttatgaaagaatgtgcaacattctcaaagggaaatttcaaacagctgcacaaagaacaatggtggatcaagtgagagagagccggaatccaggaaatgctgagttcgaagatctcatctttttagcacggtctgcactcatattgagagggtcagttgctcacaagtcctgcctgcctgcctgtgtgtatggatctgccgtagccagtggatacgact ttgaaagagagggatactctctagtcggaatagaccctttcagactgcttcaaaacagccaagtatacagcctaatcagaccaaatgagaatccagcacacaagagtcaactggtgtggatggcatgccattctgctgcatttgaagatctaagagtatcaagcttcatcagagggacgaaagtggtcccaagagggaagctttccactagaggagttcaaattgcttccaatgaaaacatggagactatggaatcaagtacccttgaactgagaagcagatactgggccataaggaccagaagtggagggaacaccaatcaacagagggcttcctcgggccaaatcagcatacaacctacgttctcagtacagagaaatctcccttttgacagaccaaccattatggcagcattcactgggaatacagaggggagaacatctgacatgagaaccgaaatcataaggctgatggaaagtgcaagaccagaagatgtgtctttccaggggcggggagtcttcgagctctcggacgaaaaggcaacgagcccgatcgtgccctcctttgacatgagtaatgaaggatcttatttcttcggagacaatgcagaggagtacgacaattaa甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NP的蛋白序列(SEQIDNO.:2)MATKGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIDGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVDGKWRRELILYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAAQRTMVDQVRESRNPGNAEFEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGSAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTKVVPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASSGQISIQPTFSVQRNLPFDRPTIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRLMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATSPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN在本發(fā)明中，術語“NP蛋白”指具有NP蛋白活性、以SEQIDNO:2序列為代表的多肽。該術語還包括具有與NP蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括NP蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與NPDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗NP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含NP多肽或其片段的融合蛋白(如與GFP形成的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了NP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有NP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，“NP保守性變異多肽”指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu流感病毒蛋白NS1如本文所用，術語“流感病毒蛋白NS1”和“蛋白NS1”可互換使用，指來自于甲型流感病毒的非結構蛋白1。應理解，該術語NS1不僅包括野生型NS1，還包括突變型NS1。此外，NS1基因或核酸序列包括DNA或RNA形式，而NS1蛋白或多肽包括全長NS1或其活性片段。此外，流感病毒蛋白NS1不僅包括來自各型或各亞型流感病毒的NS1蛋白或其活性片段，還包括來自于類似病毒(如副流感病毒)的NS1蛋白或其活性片段，只要該NS1蛋白或其活性片段同樣具有與CPSF30蛋白(尤其是人CPSF30蛋白)結合并抑制CPSF30活性的功能。代表性的各型流感病毒包括(但并不限于)：甲型流感病毒、乙型流感病毒、 丙型流感病毒等。應理解，不同的流感病毒的基因存在一定的變異。因此，基于本發(fā)明，術語NS1包括這些變異的或突變的NS1基因和NS1蛋白。作為一種代表性的NS1蛋白，甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NS1的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示：甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NS1的核苷酸序列(SEQIDNO.:3)ATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAAAGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCCCTAAGAGGAAGAGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAAACAGCCACCCGTGCTGGAAAGCAAATAGTGGAGCGGATTCTGAAGGAAGAATCTGATGAGGCACTCAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCATCGCGCTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGCACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTACTAAGGGCCTTCACCGAAGAGGGGACAATTGTTGGCGAAATTTCACCACTGCCCTCTCTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATAATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGA甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的NS1的蛋白序列(SEQIDNO.:4)MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSRHWFMLMPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGTIVGEISPLPSLPGHTDEDVKNAVGVLIGGLEWNNNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKRKMAGTIRSEV在本發(fā)明中，術語“NS1蛋白”指具有NS1蛋白活性、以SEQIDNO:4序列為代表的多肽。該術語還包括具有與NS1蛋白相同功能的、SEQIDNO:4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括NS1蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與NS1DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗NS1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽， 如包含NS1多肽或其片段的融合蛋白(如與GFP形成的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了NS1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有NS1多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，“NS1保守性變異多肽”指與SEQIDNO:4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。藥物組合物和治療本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或藥物組合，所述的藥物組合物含有(i)藥學上可接受的載體；(ii)本發(fā)明的病毒蛋白或其激動劑；和(iii)任選的不同于組分(ii)的其他抗腫瘤活性成分。這類藥學上可接受的載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。此外，本發(fā)明的藥物活性成分還可與其他抗腫瘤治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的(a)本發(fā)明病毒蛋白或其激動劑，和/或(b)CPSF30抑制劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明還提供了一種治療方法，所述的治療是將細胞的細胞周期停滯于G0/G1期，所述方法包括步驟：給需要的對象施用(a)病毒蛋白或其激動劑，和/或(b)CPSF30抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括哺乳動物(如靈長動物)，較佳地人。在另一優(yōu)選例中，所述的施用病毒蛋白包括直接施用蛋白和間接施用蛋白(如施用表達所述蛋白的載體)。本發(fā)明的所述治療方法可以用于通過將腫瘤細胞停滯于G0/G1期，從而有效抑制和治療各種不同的腫瘤。藥物篩選本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物的篩選方法，該方法可以更高效地篩選出與本發(fā)明的NP蛋白或NS1蛋白存在相互作用關系的潛在抗腫瘤藥物。典型地，一種篩選方法包括以下步驟：(i)在實驗組中，在所述測試物存在下，并且在病毒蛋白存在下，體外培養(yǎng)哺乳動物的細胞，并測試實驗組中所述細胞的細胞周期情況；并且在對照組中，在測試條件相同但無所述測試物存在下，體外培養(yǎng)哺乳動物的細胞，并測試對照組中所述細胞的細胞周期，其中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合；(ii)將實驗組中細胞周期處于G0/G1期的細胞比例數(shù)值Rs與對照組中細胞周期處于G0/G1期的細胞比例數(shù)值Rc進行比較，如果Rs顯著高于Rc，則表明該測試物為潛在的抗腫瘤候選藥物(即與所述病毒蛋白存在相互作用關系的潛在的抗腫瘤候選藥物)，并可進行步驟(iii)；如果Rs不顯著高于Rc，則不將該測試物視為潛在的抗腫瘤候選藥物；(iii)任選地，對于上一步驟中選出的潛在的抗腫瘤候選藥物，測試其在無所述病毒蛋白存在情況下，對腫瘤細胞的抑制或殺傷能力。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii)中的測試包括體外細胞測試、動物測試等。在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷性和非治療性的。在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法包括：(i)在實驗組中，在所述測試物存在下，并且在病毒蛋白和CPSF30存在下，并測試實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的情況；并且在對照組中，在測試條件相同但無所述測試物存在下，測試實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物情況，其中，所述的病毒蛋白選自下組：NP蛋白、NS1蛋白、或其組合；(ii)將實驗組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的數(shù)量Vs與對照組中所述病毒蛋白與CPSF30結合形成復合物的數(shù)量Vc進行比較，如果Vs顯著高于Vc，則表明該測試物為潛在的抗腫瘤候選藥物(即與所述病毒蛋白存在相互作用關系的潛在的抗腫瘤候選藥物)，并可進行步驟(iii)；如果Vs不顯著高于Vc，則不將該測試物視為潛在的抗腫瘤候選藥物；(iii)任選地，對于上一步驟中選出的潛在的抗腫瘤候選藥物，測試其在無所述病毒蛋白存在情況下，對腫瘤細胞的抑制或殺傷能力。在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著高于”指Vs/Vc之比≥1.20，較佳地≥1.50，更佳地≥2.0。在另一優(yōu)選例中，所述的復合物為CPSF30/NP二元復合物、CPSF30/NS1二元 復合物、或CPSF30/NP/NS1三元復合物。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：(a)首次揭示了流感病毒的蛋白NP和NS1能夠使得人細胞(尤其是癌細胞)停滯于G0/G1期，從而可用于抑制癌細胞的生長。(b)首次揭示了流感病毒的蛋白NS1和NP可有效地通過結合于人CPSF30而使得抑制CPSF30的活性，進而抑制癌細胞的生長。(c)基于本發(fā)明的意外發(fā)現(xiàn)，可以開發(fā)利用NS1與CPSF30的結合和/NP與CPSF30的結合，從而抑制癌細胞生長的藥物。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)為重量百分比和重量份數(shù)。通用方法和材料細胞培養(yǎng)：人肺腺癌細胞系(A549)，人宮頸癌細胞(Hela)以及人胚腎細胞HEK293均從ATCC購得，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，5％濃度的CO2,37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中同時添加50unit/ml青霉素(Invitrogen),50ug/ml鏈霉素(Invitrogen)和0.1mg/ml的卡那霉素(Invitrogen)。病毒基因：流感病毒A/Sichuan/1/2009(H1N1)(2009pH1N1)病毒基因由中國疾病和預防控制中心提供。流感病毒A/Duck/Hubei/L-1/2004(H5N1)病毒基因由武漢病毒所提供。流感病毒A/WSN/33(H1N1)病毒基因獲自公共數(shù)據(jù)庫或馬爾堡大學。質(zhì)粒構建:所有病毒基因的克隆都用相應的引物進行PCR擴增后克隆至pTM1載體(購自Promega公司)用于體外翻譯病毒蛋白。病毒基因另克隆至慢病毒表達載體pLenti-CMV-NS1-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro中(購自和元生物),用于包裝可表達病毒蛋白的慢病毒?；蛘撸瑢P和NS1基因克隆在pEGFP-C1質(zhì)粒(購自Clontech公司)上。突變質(zhì)粒的構建是根據(jù)基于PCR的定點誘變說明書完成的，通過KOD+DNA聚合酶(Toyobo)合成新的突變的質(zhì)粒，然后經(jīng)過DpnI限制性酶(NEB)將原有的質(zhì)粒切碎，然后轉染大腸桿菌來完成。突變質(zhì)粒的序列均通過測序鑒定確認。人的全長CPSF-30cDNA由細胞內(nèi)抽提的RNA經(jīng)過RT-PCR得到，通過CPSF30的cDNA序列設計引物，將全長序列并克隆至pGEX-4T1載體(購自GE公司)上，分別獲得pGEX-4T1-CPSF-30。純化的GST-CPSF-30蛋白，是通過將pGEX-4T1-CPSF-30轉入大腸桿菌BL21，并通過常規(guī)純化方法獲得。CPSF30的siRNA1序列克隆至慢病毒載體。GV115(購自吉凱生物公司)，用于包裝可表達該siRNA的慢病毒。轉染:通過lipofectamine2000(Invitrogen)將帶有NP和NS1基因的pEGFP-C1質(zhì)粒轉入6孔板的50-60％融合狀態(tài)的人胚腎細胞HEK293細胞，24小時后加入400ng/ml市售的Nocodazole(Sigma公司)(一種可以通過使微管解聚而使細胞周期停留在G2/M期的藥物)，一天后用胰酶消化細胞，收集到流式管中，用1ml冷的70％乙醇固定，在4度存放用于流式細胞儀分析細胞周期。siRNA干擾:兩條siRNA序列為：siRNA1:ACGCCAACAGAUGCACCAAA(SEQIDNO.:5),siRNA2:AGAGUCAUCUGUGUGAAUUACCUCG(SEQIDNO.:6)。使用X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent(Roche)，將這些siRNA轉染入HEK293細胞和A549細胞。48小時后，收集細胞做免疫印跡和實時定量PCR(RT-PCR)分析CPSF30的表達情況。CPSF30表達水平降低的HEK293細胞在加入400ng/mlNocodazole處理后，收集下來用于細胞周期的分析。實時定量PCR：從6孔板中收取106個細胞，加入1mlTRIZOL，吹吸至液體澄清，室溫放置5分鐘，然后加0.2ml氯仿，顛倒混勻，4℃12000g離心15分鐘，將上層水相轉入另一干凈EP管中，然后加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。12000g4℃離心10分鐘。棄上清，加入75％冷乙醇1ml，7500g4℃離心5分鐘，棄上清，空氣干燥，溶于20μlDEPC水中。將提取的RNA(2μg)使用ReverTraqPCRRTKit(Toyobo)反轉錄為cDNA，使用RealtimePCRMasterMix(Toyobo)來進行特異性的PCR產(chǎn)物擴增檢測。CPSF-30定量PCR引物序列：Forward:5’-TTGACTTGGAGATCGCGG-3’(SEQIDNO.:7)Revers:5’-GCAGGCAGCTTTCAAAAAGA-3’(SEQIDNO.:8)。GAPDH定量PCR引物序列:Forward:5’-GAAATCCCATCACCATCTTCCAC-3’(SEQIDNO.:9)Reverse:5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3’(SEQIDNO.:10)。細胞周期分析:核內(nèi)DNA含量用PI染色然后用流式細胞儀進行分析貼壁生長的細胞用胰酶消化,然后用PBS清洗。細胞在1ml70％的冷乙醇中固定，然后重懸于染色液(50ug/mlPI[Sigma],20ug/mlRNAase)中。在室溫下放置20分鐘后用流式細胞儀(FACScan；BDLSRII)進行分析。每個樣品至少收30，000個細胞進行分析。數(shù)據(jù)分析軟件為ModfitLT2.0(VeritySoftwareHouse)。融合蛋白的原核表達與純化：為了純化融合蛋白GST-CPSF-30，將原核表達質(zhì)粒pGEX4T1-CPSF-30轉化至大腸桿菌表達菌株BL21中，挑取單菌落于15ml含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜，然后以1：100的比例將過夜培養(yǎng)物接種至1L含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)2h左右至OD600＝0.4-0.6，取出1ml未誘導的培養(yǎng)物于1.5ml的離心管中，作為陰性對照。剩下的加入終濃度為1mM的IPTG(Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside),18℃搖床培養(yǎng)4h左右，收集菌液，7000rpm，離心15min，去上清，用預冷的PBS緩沖液重懸后超聲，細胞裂解液于12000rpm,4℃，離心10min，取40μl上清加入6×SDS上樣緩沖液重懸，于100℃煮沸5min，取20μl上樣于SDS-PAGE電泳檢測。上清凍存于-20℃冰箱待純化。融合蛋白的純化采取親和純化樹脂，純化后的融合蛋白GST-CPSF-30用于GSTpull-down。GST共沉淀分析(PullDownanalysis):將構建在pTM1載體上的NS1和NP基因直接用帶有T7及轉錄終止信號的引物對來PCR目的基因，然后利用TNTtranscription/translationkit(Promega)體外合成HA-taggedNS1和NP。將等量的GST與GST-CPSF-30蛋白加到GlutathioneSepharoseBeads(GE)，4℃旋轉混勻1h,用預冷的PBS洗珠三次以去除未結合的GST與GST-CPSF-30，然后加入體外轉錄的目的蛋白，4℃旋轉過夜，預冷的PBS洗珠三次,加入2×SDS上樣緩沖液,100℃煮5min,上樣于SDS-PAGE，Westernblot檢測。免疫印跡實驗:細胞用PBS洗一遍，然后直接用SDS緩沖液(60mMTris-HCl[pH6.8],2％SDS,10％glycerol,5％2-mercaptoethanol,0.01％bromophenolblue)裂解，之后煮10分鐘。全細胞裂解液跑SDS-PAGE電泳。蛋白被轉移到硝酸纖維素膜(BioRad)上，用5％脫脂奶粉溶于TBST(20mMTris-HCL,150mMNaCL,0.02Tween)，室溫條件下封閉1小時，然后用對應的一抗和二抗檢測。顯影使用enhancedchemiluminescencekit(PIERCE)。在免疫印跡實驗中使用了下列抗體：鼠源單克隆抗體：CPSF-30抗體(購自Abgent)；辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG購自Sigma；抗NP和抗NS1多克隆抗體購自上海生命科學研究院抗體研究中心。實施例1、流感病毒蛋白NS1和NP將細胞周期抑制在G0/G1期在本實施例中，通過感染試驗或轉染試驗，觀察流感病毒以及流感病毒的各蛋白對細胞周期的影響。結果如圖1所示，甲型流感病毒(具體為A/WSN/33(H1N1))感染人肺癌細胞A549引起細胞周期停滯在G0/G1期。在圖1A中，病毒感染效率超過90％。此時，相比較于對照組，感染組的細胞明顯更多的聚集于G0/G1期(圖1B)，數(shù)據(jù)統(tǒng)一表明，只有約30％的細胞處于G0/G1期，而感染組細胞則有約60％處于G0/G1期(圖1C)。此外，通過大量篩選，意外地發(fā)現(xiàn)，通過在HEK293細胞中轉染表達甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的病毒蛋白基因時，該流感病毒的兩種蛋白(即NS1蛋白和NP蛋白)的表達可以分別將細胞周期抑制到G0/G1期(圖2)。如圖2A所示，GFP本身的表達對細胞周期幾乎沒有影響。加入Noc將細胞周期停止在G2/M期可以更清楚的看到細胞在此前的G0/G1和S期的分布，加入noc后，由于GFP的表達對細胞周期沒有影響，因此大多數(shù)細胞順利通過G0/G1和S期進入G2/M期并停止在G2/M期；而表達有NS1-GFP和NP-GFP融合蛋白的細胞則被停滯在G0/G1期，不能其后的S和G2/M期進行(圖2A)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，在NP組中，約50％細胞被抑制G0/G1期；在NS1組中，接近60％細胞被抑制G0/G1期，而在GFP對照組中，只有不到20％細胞被抑制G0/G1期(圖2B)。實施例2、NS1和NP蛋白抑制細胞周期的能力依賴于其與宿主因子CPSF30的結合。為了找出NS1蛋白和NP蛋白抑制細胞周期的分子機制，在本實施例中分析了諸多甲型流感病毒毒株的NS1蛋白和NP蛋白的功能，并且還構建了NS1蛋白和NP 蛋白的多種突變蛋白并觀察這些突變蛋白對細胞周期的影響實驗結果表明，(1)NS1可與CPSF30結合形成復合物。能夠和宿主因子CPSF30相互作用的H5N1病毒的NS1蛋白具有細胞周期的抑制作用，而該H5N1病毒的NS1的F103S,M106I突變體和CPSF30的結合大大減弱，其抑制細胞周期的能力也隨著喪失(圖3)。(2)來自于2009pH1N1病毒的NS1蛋白由于自身和CPSF30的結合能力較差，因此，只有引入三個位點(108K/125D/189D)的突變(TripleMut)增強其與CPSF30的結合才能使其獲得更強的抑制細胞周期的能力(圖3)。(3)NP可與CPSF30結合形成復合物。來自于H5N1和2009pH1N1的NP蛋白都與CSPF4相互作用并具有抑制細胞周期的能力(圖4)。但是，當在NP蛋白上引入三個位點的突變(17Gdel/400R/451T)時(TripleMut)，NP蛋白和CPSF30的結合大大減弱，其抑制細胞周期的能力也隨著喪失。這些實驗結果提示，NS1和NP蛋白抑制細胞周期的能力與其與宿主因子CPSF30的結合有關。另外，由于NP和NS1結合于CPSP30，因此三者可形成CPSF30/NP/NS1三元復合物。實施例3、CPSF30是保持細胞周期正常進行的關鍵性分子實施例1-2的研究表明，CPSF30是細胞周期中的一種重要分子，病毒蛋白結合并劫持CPSF30(降低CPSF30的活性)，從而導致細胞周期的停滯。為了驗證CPSF30對細胞周期的調(diào)控作用，在本實施例中使用siRNA的方法對細胞內(nèi)源性的CPSF30進行表達抑制。結果表明，兩條siRNA序列(siRNA1和siRNA2)都可以有效地抑制CPSF30的mRNA和蛋白表達(圖5A和5B)。轉染有這兩種siRNA的細胞，其細胞周期顯著地停滯在G0/G1期(圖5C和5D)。這表明，抑制CPSF30的表達或活性可以抑制細胞周期的正常進行。此外，通過抑制CPSF30，可以有效地使得細胞周期停滯于G0/G1期。實施例4、在癌細胞中過表達甲型流感病毒的NS1和NP基因可以抑制癌細胞系的增殖為了在癌細胞中高效表達NS1和NP基因，在本實施例中，將兩個病毒基因NP和NS1分別構建于慢病毒表達載體中。以表達有NS1或者NP基因的慢病毒感染癌細胞系A549和Hela,通過MTT方法檢測NS1、NP感染細胞組與陰性對照慢病毒感染細胞組的增殖能力，研究NS1、NP基因對癌細胞增殖能力的影響。結果表明，在感染后96和120小時，表達有NS1蛋白的實驗組的細胞增殖顯 著低于A549陰性對照感染組(**p<0.01，***p<0.001)，而表達有NP蛋白的實驗組的細胞增殖也略低于A549陰性對照感染組(圖6A和B)；同樣的，在感染后96和120小時，表達有NS1蛋白的實驗組的細胞增殖顯著低于Hela陰性對照感染組(**p<0.01，***p<0.001)，表達有NP蛋白的實驗組也顯著低于Hela陰性對照感染組(*p<0.05,***p<0.001)(圖6C和D)。這些結果提示，NS1和NP的基因表達都可抑制A539細胞和Hela細胞的增殖。實施例5、抑制CPSF30的表達可以抑制癌細胞增殖在本實施例中，將抑制CPSF30表達的siRNA系列(siRNA1)克隆于慢病毒表達載體上，并以此慢病毒感染癌細胞系A549和Hela,通過MTT方法檢測抑制CPSF30的表達對A549和Hela細胞增殖能力的影響。結果表明，在A549細胞中，雖然陰性對照感染組與空白組相比，對細胞增殖有抑制作用，但從感染后72小時開始，表達有CPSF30的siRNA的實驗組的細胞增殖就低于A549陰性對照感染組,數(shù)據(jù)分析顯示，在感染后96小時，表達有CPSF30的siRNA的實驗組的細胞增殖顯著低于A549陰性對照感染組(*P<0.05)(圖7A和B)。在Hela細胞中，陰性對照感染組與空白組相比，對細胞增殖幾乎沒有影響，因此，但從感染后24小時開始，表達有CPSF30的siRNA的實驗組的細胞增殖就顯著低于陰性對照感染組(*P<0.05，***P<0.001)(圖7C和D)。這表明，通過RNA干擾技術抑制CPSF30基因表達，可以抑制A549和Hela癌細胞的增殖。討論病毒感染對正常機體來說是不利于健康的，但是人們對病毒學的研究發(fā)現(xiàn)，病毒通過和宿主的相互作用可以影響很多宿主信號通路和生理反應，這一點使得病毒也有被加以利用的可能，利用病毒的特性用來治療病變的細胞。在癌癥治療中，利用病毒感染導致細胞死亡的原理殺死癌細胞的想法早在1940年左右出現(xiàn)，但直到1991年，才發(fā)現(xiàn)第一個溶癌病毒(Oncolyticvirus)皰疹病毒可以裂解腦膠質(zhì)瘤細胞，誕生了第一個病毒療法(Virotherapy)。隨后，很多不同的病毒都被用來研究其溶癌特性。然而，這種病毒療法主要還是利用病毒感染最終導致細胞裂解的原理，雖然可以實現(xiàn)癌細胞感染特異性，但需要具有復制能力的活病毒，其安全性導致很大的應用限制。一個完整的細胞周期，即連續(xù)分裂的細胞從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成，包含G0期(靜息期)、G1期(前期)、S期(中期)、G2期(后期)、M期(有絲分裂期)四個階段。目前，很多抗癌藥物都是抑制癌細胞的有絲分裂。如德國拜爾公司研發(fā)的SORAFENIB(索拉非尼)，就含有RAF抑制劑，抑制有絲分裂酶的活性。英國阿斯利康公司研發(fā)的抗癌新藥易瑞沙(吉非替尼)也是通過抑制有絲分裂酶達到抑制癌細胞分裂增殖的目的。然而，有絲分裂(mitosis)發(fā)生在整個細胞周期的末期。如果能夠將癌細胞抑制在細胞周期的早期，如G0/G1期，從源頭抑制細胞周期的進行，將具有更優(yōu)的抑制效果。本發(fā)明完全跳出這種病毒溶癌原理的局限，開發(fā)了可直接干擾細胞周期的病毒蛋白，從而更安全和更有針對性地抑制細胞周期。通過將甲型流感病毒的NS1和NP基因在癌細胞系中表達，或者通過在癌細胞周中抑制CPSF30基因表達，實現(xiàn)對癌細胞細胞增殖的抑制，對開發(fā)抗癌新方法有重要意義。此外，本發(fā)明的NP和NS1蛋白或其激動劑可有效地將細胞(尤其腫瘤細胞)停滯于G0/G1期，因此，結合現(xiàn)有的抑制有絲分裂的藥物，將會達到更徹底的抑制癌細胞分裂的功效。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3