本發(fā)明涉及組合包的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及包括苦瓜粉的組合包在制備用于改善和治療人類小胖威利綜合癥(Prader-Willi syndrome,PWS)的食品、藥品、保健品、營(yíng)養(yǎng)品的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

不良飲食習(xí)慣及遺傳傾向性是肥胖及相關(guān)代謝疾病在全球不斷增長(zhǎng)的兩大主要誘因(1-3)。小胖威利綜合癥(Prader-Willi syndrome，簡(jiǎn)稱“PWS”)是父源15號(hào)染色體(15q11.2-q13)的缺陷導(dǎo)致的，是最為常見的一種人類遺傳因素導(dǎo)致的肥胖(4,5)。PWS患兒能夠在生命早期成為病理性肥胖并發(fā)展為危機(jī)生命的2型糖尿病及心血管疾病(6)。PWS患兒的體重控制被證實(shí)異常困難，這是因?yàn)镻WS患兒的肌肉張力較差，這會(huì)容易導(dǎo)致較少的體育鍛煉、難以消除和不可控的饑餓感以及飽腹感不足，從而導(dǎo)致PWS患兒不斷渴望食物的表現(xiàn)。然而，使上述誘因發(fā)展為PWS患兒肥胖的大部分分子鏈接仍不為人所知(6)。干預(yù)哪些病理性因素從而可以有效防止PWS中的肥胖和/或減緩其發(fā)展仍然是亟待解決的問題。

越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群是膳食誘導(dǎo)的肥胖的發(fā)生原因之一(7,8)。無菌小鼠能夠抵抗高糖、高脂的“西式膳食”誘導(dǎo)的肥胖(9)。將肥胖患者或者小鼠的腸道菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)，能夠引起受體小鼠脂肪的過度積累(10,11)。用廣譜抗生素將小鼠腸道菌群清除后，高脂飲食誘發(fā)的肥胖將不會(huì)發(fā)生。將健康人得腸道菌群移植給肥胖患者，在移植后的6周內(nèi)改善了受體的胰島素抵抗(12)。我們以由全谷物、中國(guó)傳統(tǒng)藥食同源食材和益生元組成的膳食(WTP)對(duì)成年單純性肥胖患者進(jìn)行干預(yù)，受試者腸道中內(nèi)毒素產(chǎn)生菌下降而有益的雙歧桿菌增加，從而減少了內(nèi)毒素入血并顯著改善了慢性炎癥、脂代謝和胰島素抵抗(14,15)。以上證據(jù)充分說明了腸道菌群在人和小鼠膳食誘導(dǎo)的肥胖中的重要作用。

在一些遺傳缺陷的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與遺傳因素造成的肥胖的也有關(guān)系。用廣譜抗生素清除腸道菌群，能夠阻止瘦素缺失的ob/ob小鼠和Toll樣受體5 敲除小鼠由于遺傳缺陷導(dǎo)致的肥胖和胰島素抵抗的發(fā)生(12,16)。將這兩種遺傳性肥胖模型小鼠的腸道菌群移植給野生型無菌小鼠，能夠在受體小鼠中復(fù)制出部分肥胖表型(16,17)。但是腸道菌群在人類遺傳因素導(dǎo)致的肥胖中得作用還不清楚。

然而，人類的遺傳性肥胖的腸道菌群的影響目前從未被表征。也沒有任何現(xiàn)有技術(shù)顯示如何改善人類的遺傳性肥胖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明至少在某種程度上基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即人類小胖威利綜合癥(PWS)患者通過服用一種組合包可以用來扶持腸道有益菌，抑制條件致病菌，進(jìn)而改善或者治療人類小胖威利綜合癥。

因此，本發(fā)明提供一種組合包在制備用于改善和治療人類小胖威利綜合癥的食品、藥品、保健品、營(yíng)養(yǎng)品中的應(yīng)用。

所述組合包包括以下組合物，每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位：

第一組合物包括：薏仁、燕麥、蕎麥、白扁豆、黃玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子和枸杞；第一組合物也可以包括黑麥(rye)、小麥(wheat)、黎麥(quinoa)、或青稞(Hulless barley)。

第二組合物包括：苦瓜、可溶性膳食纖維和低聚糖；

第三組合物包括：可溶性膳食纖維和低聚糖。

在一些實(shí)施方案中，所述組合包用于男性人類小胖威利綜合癥患者。

在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物作為主食服用，其形式選自米、面、粥或飯。用所述第一組合物制備米、面、粥或飯前，先將第一組合物的種子、果實(shí)或其他植株部位粉碎成顆粒，其中1-70％、15-70％、25-70％、30-70％、50-70％的顆粒直徑為0.65mm或以上。

在一些實(shí)施方案中，所述薏仁的重量占所述第一組合物重量的10-30％，燕麥的重量占所述第一組合物重量的5-30％，所述蕎麥的重量占所述第一組合物重量的5-50％，所述白扁豆的重量占所述第一組合物重量的5-20％，所述山藥的重量占所述第一組合物重量的5-30％。

在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的重量占所述第一組合物重量的5-40％或10-20％，碳水化合物的重量占所述第一組合物重量的30-80％或50-70％，脂肪的重量占所述第一組合物重量的0.5-30％或2-15％，膳食纖維的重量占所述第一組合物重量的0.5-30％或2-15％，維生素的重量占所述第一組合物重量的0.1-5％或0.5-1％，礦物質(zhì)的重量占所述第一組合物重量的0.1-2％或0.8-1.2％。

在一些實(shí)施方案中，每100克的所述第一組合物提供320-400千卡總熱量。

在一些實(shí)施方案中，每100克的所述第一組合物含有：VA 3-857ugRE，VD0.01-5ugRE，VE 2-79.09mg，VB10.01-1.89mg，VB20.01-1.4mg，VB60.01-1.2mg，VB120.1-2.4mg，VC 1-1170mg，煙酸0.5-28.4mg，Ca 60-2458mg,P 200-1893mg，K 350-1796mg，Na 8-2200mg，Mg 100-350mg，F(xiàn)e 2-20mg。

在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物中的所述蕎麥包括：普通蕎麥或苦蕎麥。

在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物中的所述蕎麥包括：蕎麥屬種子。

在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物中的所述燕麥包括：燕麥屬植物種子。

在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物中的所述山藥包括：山藥干。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物被制成沖調(diào)粉劑，在餐前0.25到1小時(shí)服用。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物的日劑量為5-100克、40-60克、或30-80克，以水沖調(diào)。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物中的所述苦瓜包括：苦瓜屬的植物果實(shí)全粉。

在一些實(shí)施方案中，所述植物果實(shí)全粉是通過冷凍干燥或噴霧干燥生產(chǎn)。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物中的所述苦瓜包括：苦瓜提取物。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物中的所述可溶性膳食纖維包括：

Fibersol-2、抗性淀粉、聚葡萄糖、纖維素、半纖維素、果膠或樹膠。

在一些實(shí)施方案中，所述第二組合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水蘇糖或低聚乳果糖。

在一些實(shí)施方案中，所述苦瓜與所述膳食纖維和所述低聚糖的重量比為 10:1-1:1。

在一些實(shí)施方案中，所述苦瓜粉的重量占所述第二組合物重量的15-99.8％，所述可溶性膳食纖維的重量占所述第二組合物重量的0.1-51％，所述低聚糖的重量占所述第二組合物重量的0.1-34％。

在一些實(shí)施方案中，所述第三組合物被制成沖調(diào)粉劑，餐前2-5小時(shí)服用，或與早餐同時(shí)服用。

在一些實(shí)施方案中，所述第三組合物的日劑量為5-200克、30-100克或50-150克，以300-1500毫升水沖調(diào)。

在一些實(shí)施方案中，所述第三組合物中的所述可溶性膳食纖維包括：

Fibersol-2，抗性淀粉，聚葡萄糖、纖維素，半纖維素，果膠或樹膠。

在一些實(shí)施方案中，所述第三組合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水蘇糖、或低聚乳果糖。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明的組合物可用于平衡人類小胖威利綜合癥患者中腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善代謝綜合癥，施用于受試者時(shí)，能夠增加短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的數(shù)量，減少內(nèi)毒素產(chǎn)生菌的數(shù)量；可以多個(gè)途徑給予需要其的人類小胖威利綜合癥患者，通過對(duì)人類小胖威利綜合癥患者飲食營(yíng)養(yǎng)的合理調(diào)整，達(dá)到減輕、解除、補(bǔ)救、預(yù)防或改善代謝綜合癥癥狀，恢復(fù)健康的目的。

附圖說明

圖1顯示了PWS患者遺傳分子檢測(cè)。其中，第1-4列：亞硫酸鹽處理樣品；第5-9列未處理樣品；第1和5列：父親；第2和5列：母親；第3和7列：淵源者；第4和8列：對(duì)照；第9列：空白，M,100bp DNA marker。

圖2顯示了(a)人體測(cè)量指標(biāo)；(b)肝功能指標(biāo)；(c)血糖平衡；(d)血脂代謝；(e)炎癥相關(guān)指標(biāo)。(f)IL-6、脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、LBP的測(cè)量。所示的數(shù)據(jù)為mean±s.e.m.。Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))是用來分析PWS或SO患兒各時(shí)間點(diǎn)之間的差異。*P＜0.05，P＜0.01。對(duì)于大多數(shù) 的生化變量，PWS:n＝17SO:n＝21；對(duì)于OGTT血糖AUC,OGTT胰島素AUC，PWS:n＝16，SO:n＝20；對(duì)于CRP，w.b.c.，SAA，AGP，脂聯(lián)素，IL-6，PWS:n＝16，SO:n＝19。

圖3顯示了PWS患者干預(yù)前的腸道菌群引起悉生小鼠代謝損傷。

圖4顯示了腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與宿主健康改善相關(guān)。

圖5顯示了膳食干預(yù)過程中腸道菌群Beta多樣性分析。

圖6顯示了膳食干預(yù)后基因多樣性顯著下降。

圖7顯示了膳食干預(yù)顯著改善生理狀況。

圖8顯示了腸道菌群改變與生理指標(biāo)變化的相關(guān)性。

圖9顯示了腸道菌群基因組水平的互作群的劃分。

圖10顯示了一個(gè)種里處于同一個(gè)GIG的菌株基因組的相似性高于屬于不同GIG的同種的其他菌株。

圖11顯示了膳食干預(yù)前后沒有發(fā)生顯著變化的GIG。

圖12顯示了CAG00184組裝基因組與參考基因組比較。

圖13顯示了CAG00184基因組中碳水化合物利用相關(guān)的基因。

圖14顯示了膳食干預(yù)中腸道菌群功能變化。

圖15顯示了膳食干預(yù)中糞便中代謝物的變化。

圖16顯示了不同分組的OPLS-DA模型。

圖17顯示了OPLS-DA系數(shù)圖表明干預(yù)前后糞便樣品中顯著變化的代謝物。

圖18顯示了干預(yù)30天SO患者糞便中顯著變化的代謝物。

圖19顯示了干預(yù)60天PWS患者糞便中顯著變化的代謝物。

圖20顯示了干預(yù)后糞便總菌量減少。

圖21顯示了短鏈脂肪酸相對(duì)含量的變化。

圖22顯示了干預(yù)后糞便提取液對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性減少。

圖23顯示了PCA分析則顯示299CAZy家族干預(yù)前后發(fā)生顯著變化。

圖24顯示了降解六種不同底物的CAZy基因家族豐度變化。

圖25顯示了乙酸、丙酸和丁酸產(chǎn)生相關(guān)基因的變化。

圖26顯示了膳食干預(yù)中尿液代謝譜的變化。

圖27顯示了不同分組的OPLS-DA模型。

圖28顯示了OPLS-DA系數(shù)圖表明干預(yù)前后糞便樣品中顯著變化的代謝物。

圖29顯示了膳食干預(yù)中顯著變化的尿液代謝物。

圖30顯示了尿液代謝物與腸道菌群共變化分析。

圖31顯示了腸道菌群和宿主共代謝的變化。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是將一種組合包應(yīng)用于制備改善和治療人類遺傳性肥胖/PWS的食品、藥品、保健品、營(yíng)養(yǎng)品中。

例如，作為營(yíng)養(yǎng)品，可以是飲食補(bǔ)充劑的形式。作為藥品，可以與藥學(xué)可接受載體混合以形成藥物組合物。“藥學(xué)可接受載體”包括溶劑、分散劑、包衣、抗菌和抗真菌劑以及等滲和吸收延遲劑等等，適合于藥物給藥。

所述組合包可以配制成與其計(jì)劃的給予途徑相適應(yīng)的劑型。參見例如美國(guó)專利No.6,756,196。給予途徑的實(shí)例包括口服。所述組合包可以是用于口服的片劑、膠囊、米、粥或飯形式，為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，配制口服組合物將是有利的。術(shù)語“劑量單位形式”指適合作為用于治療主體的單一劑量的物理分散單位，每一單位包含與所需的藥學(xué)載體結(jié)合、計(jì)劃產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性成分。

為了研究腸道菌群失調(diào)在人類遺傳性肥胖及相關(guān)代謝失調(diào)中的貢獻(xiàn)，我們招募了一批重度肥胖的PWS患兒和膳食因素導(dǎo)致肥胖的兒童，在醫(yī)院的對(duì)其進(jìn)行WTP膳食干預(yù)(14)。通過運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)策略，合并分析腸道元基因組特征、宿主和腸道菌群共代謝譜特征及將患者腸道菌群移植給無菌小鼠，我們發(fā)現(xiàn)，與膳食誘導(dǎo)的單純性肥胖(simple obesity，簡(jiǎn)稱“SO”)類似，腸道菌群失調(diào)在遺傳因素造成的肥胖中也有重要貢獻(xiàn)。這些結(jié)果說明腸道菌群失調(diào)無論在遺傳因素造成的肥胖還是單純性肥胖中，都扮演著“分子哨卡”的作用。

實(shí)施例一：遺傳性肥胖及單純性肥胖的膳食干預(yù)

(1)膳食干預(yù)能夠緩解遺傳性肥胖及單純性肥胖并改善患者的生化指標(biāo)

營(yíng)養(yǎng)干預(yù)在廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心進(jìn)行。除了超重、持續(xù)超過3天給予抗生素或參與減肥項(xiàng)目外，參與營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的主體在先前的3個(gè)月均未患有胃腸道疾病、未進(jìn)行胃腸道手術(shù)或未患有慢性疾病。所述營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的主體可以由主體或健康護(hù)理專業(yè)人員的判斷而確定，并且可以是主觀的(例如看法)或客觀的(例如可通過檢驗(yàn)或診斷方法測(cè)量的)。例如，所述干預(yù)的主體可以是具有低水平腸道有益菌和高水平條件致病菌的主體，或診斷有代謝綜合癥的主體。

“營(yíng)養(yǎng)干預(yù)”定義為通過對(duì)主體飲食營(yíng)養(yǎng)的合理調(diào)整，達(dá)到減輕、解除、補(bǔ)救、預(yù)防或改善代謝綜合癥癥狀，恢復(fù)健康的目的。

經(jīng)上海交通大學(xué)生命與生物科技學(xué)院道德委員會(huì)批準(zhǔn)，我們進(jìn)行了開放標(biāo)記研究及自控研究。臨床試驗(yàn)在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心的注冊(cè)編號(hào)為ChiCTR-ONC-12002646，并獲得了患兒監(jiān)護(hù)人的書面同意。我們還進(jìn)行了問卷調(diào)查，從而收集了人口統(tǒng)計(jì)特征、健康狀態(tài)、疾病歷史、胃腸道狀況、飲食習(xí)慣及體育活動(dòng)等信息?；凇吨袊?guó)食物成分表(2002版)》，隨餐頻率的問卷調(diào)查及24小時(shí)的飲食記錄被用于計(jì)算基本營(yíng)養(yǎng)攝入。對(duì)患兒家長(zhǎng)進(jìn)行為小胖威利綜合癥設(shè)計(jì)的攝食過量問卷調(diào)查，從而評(píng)估干預(yù)前后的攝食過量(2)。

我們招募了PWS患兒17名(平均年齡9.26歲，范圍5-16歲)和單純性肥胖(SO)患兒21名(平均年齡10.52歲，范圍2-16歲)兩個(gè)人群年齡沒有顯著差異，患者信息見表1。PWS患者均經(jīng)過遺傳分子檢測(cè)確診(圖1)。受試者在廣東省婦幼保健院進(jìn)行30天膳食干預(yù)。根據(jù)PWS患兒家長(zhǎng)的要求，所有的PWS患兒又繼續(xù)進(jìn)行了60天住院干預(yù)。其中一名PWS患兒(GD02)在醫(yī)院進(jìn)行了285天干預(yù)。

表1：入組的PWS和SO患兒基本信息

所示的年齡數(shù)據(jù)為mean±s.d.，在學(xué)生T-檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))中PWS和SO沒有顯著差別。

所述WTP飲食是指對(duì)患兒給予全谷物、中國(guó)傳統(tǒng)藥膳以及益生元。具體而言，在本實(shí)施例中，所述WTP飲食是指提供一種組合包，包括第一組合物、第二組合物及第三組合物。每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位。所述第一組合物、所述第二組合物及所述第三組合物由食品制造商：完美(中國(guó))有限公司制備。

所述第一組合物為事先烹調(diào)好的12種選自富含膳食纖維的全谷物及傳統(tǒng)中醫(yī)植物的食材的混合物，包括：薏仁(薏苡)、燕麥、蕎麥、白扁豆、黃玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子和枸杞，以罐頭粥的形式由食品制造商制備(每罐凈重為370g)。每罐第一組合物含有100g的成分(包括59g碳水化合物、15g蛋白質(zhì)、5g脂肪、6g纖維)以及336kcal的熱量(包括70％碳水化合物、17％蛋白質(zhì)、13％脂肪)。其中，總熱量可以通過氧彈測(cè)定能力修正法測(cè)定，蛋白質(zhì)的含量可以通過凱氏微量法測(cè)定，碳水化合物的含量可以通過高壓液相色譜測(cè)定，脂肪的含量可以通過索氏抽提法測(cè)定，膳食纖維的含量可以通過中性洗滌劑法測(cè) 定，維生素的含量可以通過高壓液相色譜測(cè)定，礦物質(zhì)的含量可以通過分光光度法測(cè)定。

所述第一組合物作為主食，可以制成米、面、粥或飯給予。在經(jīng)過蒸、煮等烹調(diào)方式后，其中的淀粉不易糊化，不易升高血糖。患兒可被給予足夠的第一組合物以滿足饑餓感，并滿足其年齡段的標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)要求，該標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)要求規(guī)定于中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)(CNS，2012)建議的《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》(DRI)中。每名患者的飲食記錄被用于基于《中國(guó)食物成分表》(2002年)計(jì)算營(yíng)養(yǎng)攝入。

所述第二組合物以沖調(diào)粉劑的形式制備(每袋20g)，包括：苦瓜和低聚糖。其中，低聚糖為2個(gè)或2個(gè)以上(一般指2-10個(gè))單糖單位以糖苷鍵相連形成的糖分子，例如低聚果糖或低聚異麥芽糖。第二組合物制成沖調(diào)粉劑后用溫水沖調(diào)食用，每天沖服5-100克第二組合物。

第三組合物包括：可溶性膳食纖維和低聚糖，其中可溶性膳食纖維包括：瓜爾膠、果膠、魔芋粉及其他可發(fā)酵膳食纖維(Fibersol-2、抗性淀粉、半纖維素)等益生元，第三組合物以沖調(diào)粉劑的形式給予。用300-1500毫升的水調(diào)勻沖服5-200克第三組合物，早晨空腹飲用。

本發(fā)明組合包的代表性給藥周期為一周至幾個(gè)月，例如一周、兩周、一個(gè)月、兩個(gè)月、四個(gè)月和八個(gè)月。在主體中腸道有益菌水平開始上升、條件致病菌水平開始下降后，組合物的劑量可以逐步降低。當(dāng)腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常時(shí)可以結(jié)束給藥。

膳食干預(yù)期間，兩類兒童總熱量攝入相比干預(yù)前均下降了30％。攝入蛋白質(zhì)的供能比變化不大，仍占總熱量的13-％14％。攝入碳水化合物的供能比在PWS患兒中從52％增加到62％，在SO患兒中從57％增加到62％。碳水化合物的種類則從干預(yù)前以精細(xì)加工的米面為主變?yōu)橐匀任餅橹鳌z入脂類的供能比在PWS患兒中從34％減少到20％，在SO患兒中從30％減少到20％。最本質(zhì)的改變是膳食纖維攝入量的變化，在PWS患兒中從每天6g增加到49g，在SO患兒中從每天9g增加到51g(表2和表3)。

表2：PWS患兒干預(yù)前后主要營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入情況

所示的數(shù)據(jù)為中位數(shù)(最大-最小)或者mean±s.e.m.，在學(xué)生T-檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))中PWS和SO沒有顯著差別。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001相對(duì)于基準(zhǔn)線。對(duì)于干預(yù)前,n＝12；天數(shù)為30,60，90,n＝17。

表3：PWS患兒干預(yù)前后主要營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入情況

所示的數(shù)據(jù)為中位數(shù)(最大-最小)或者mean±s.e.m.，在學(xué)生T-檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))中PWS和SO沒有顯著差別。*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001相對(duì)于基準(zhǔn)線。對(duì)于干預(yù)前,n＝5；天數(shù)為30,60，90,n＝21。

我們用干預(yù)期間受試者的人體測(cè)量指標(biāo)和血液代謝物來跟蹤身體狀況的變化。干預(yù)30天后，所有相關(guān)的臨床指標(biāo)在遺傳因素導(dǎo)致的肥胖和單純性肥胖患者中都顯著改善(圖2)。經(jīng)過30天的干預(yù)，SO患兒的體重減少了9.5±0.4％(mean±s.e.m.)，而PWS減少了7.6±0.6％(圖2a)。血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)降低表征肝功能的改善(圖2b)。血糖穩(wěn)態(tài)顯著改善，表征胰島素敏感性增加(圖2c)。血液中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)減少(圖2d)。PWS患兒在繼續(xù)干預(yù)60天后，體重最終減少了18.3±1.0％，其他代謝健康指標(biāo)也進(jìn)一步改善。不僅如此，PWS患兒暴食癥行為得到整體改善(表4)。GD02在285天住院干預(yù)中，從140.1kg減少到83.6kg，他出院后繼續(xù)在家干預(yù)，在總共干預(yù)430天后減低到73kg。他所有的生理指標(biāo)均恢復(fù)到正常水平。這種膳食干預(yù)能夠顯著改善人類遺傳因素造成的肥胖相關(guān)的代謝失調(diào)，膳食導(dǎo)致的減重程度可與接受胃腸繞道手術(shù)的效果媲美(18)。30天干預(yù)后，多種與協(xié)同炎癥相關(guān)的指標(biāo)在PWS和SO中都發(fā)生顯著下降，包括C反應(yīng)蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白(SAA)，alpha酸性糖蛋白和白細(xì)胞(圖2e)。脂聯(lián)素作為一種抗炎因子，干預(yù)后水平增加，瘦素水平減少，說明代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素下降。脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)是細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素進(jìn)入血液的量的分子標(biāo)識(shí)物，干預(yù)后下降。這說明兩類人干預(yù)后腸道菌群都變得健康，產(chǎn)生的能夠引起慢性炎癥的抗原減少。

表4:PWS患兒干預(yù)前后食欲問卷分析

所示的數(shù)據(jù)為mean±s.e.m.，n＝11，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的變化的Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))*P<0.05。

表5:PWS患兒膳食干預(yù)前后生化指標(biāo)

所示的數(shù)據(jù)為mean±s.e.m.，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的變化的威氏配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)(雙邊檢驗(yàn))*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001相對(duì)于基準(zhǔn)線；$P<0.05,$$P<0.01and$$$P<0.001v.s.30天；+P<0.05,++P<0.01,+++P<0.001v.s.60天。

BMI:身體質(zhì)量指數(shù)；DBP:舒張壓；SBP:收縮壓；HOMA-IR:穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗；OGTT:口服葡萄糖耐量試驗(yàn)；HDL:高密度脂蛋白；LDL:低密度脂蛋白；CRP:C反應(yīng)蛋白；W.B.C.:白細(xì)胞計(jì)數(shù)；ALT:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST:谷草轉(zhuǎn)氨酶；SAA:血清淀粉樣蛋白A；AGP:α-酸性糖蛋白；LBP:脂多糖結(jié)合蛋白。

對(duì)于大多數(shù)生化變量,n＝17；對(duì)于OGTT血糖AUC,OGTT胰島素AUC,CRP,W.B.C.,SAA,AGP,脂聯(lián)素及IL-6:n＝16。

(2)干預(yù)后腸道菌群在小鼠中產(chǎn)生很少炎癥及脂肪堆積

為了比較干預(yù)前后腸道菌群引起代謝紊亂能力的差異，我們把同一名PWS志愿者(GD58)干預(yù)前后的腸道菌群分別移植給無菌野生型C57BL/6J小鼠。接受了干預(yù)前腸道菌群的小鼠在移植后前兩周體重出現(xiàn)顯著下降，說明移植物有一定的毒害作用，在接下來的兩周中這些小鼠體重迅速增加。接受了干預(yù)后腸道菌群的小鼠沒有出現(xiàn)體重下降，在移植后的四周中其體重像正常小鼠一樣有所增加(圖3a)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，盡管移植了干預(yù)前腸道菌群的小鼠體重仍然低于移植干預(yù)后菌群的小鼠，但是其脂肪比例顯著高于后者(圖3b)。附睪脂肪組織切片的脂肪細(xì)胞染色反映出，由于移植了毒性較大的菌群，菌群移植兩周后移植了干預(yù)前 腸道菌群的小鼠脂肪細(xì)胞顯著小于移植干預(yù)后菌群的小鼠，移植四周后前者脂肪細(xì)胞則顯著大于后者，但是移植移植干預(yù)后菌群的小鼠的脂肪細(xì)胞大小沒有顯著變化(圖3c)。反轉(zhuǎn)錄定量PCR表明，移植了干預(yù)前腸道菌群的小鼠肝臟、回腸和結(jié)腸中TNFα、IL6和TLR4基因表達(dá)增加，說明最初一段時(shí)間的體重下降與其較高炎癥水平相關(guān)(圖3d-f)。以上結(jié)果表明，PWS患兒干預(yù)前的腸道菌群比干預(yù)后的菌群有更強(qiáng)的引起炎癥和脂肪積累的能力。

(3)膳食干預(yù)改變腸道菌群結(jié)構(gòu)

為了研究膳食干預(yù)過程中腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的變化，我們用Illumina Hiseq2000平臺(tái)對(duì)PWS(0天、30天、60天和90天)和SO(0天和30天)糞便樣品進(jìn)行了元基因組測(cè)序，平均每個(gè)樣本得到76.0±18.0million(mean±s.d.)高質(zhì)量reads。我們對(duì)這些高質(zhì)量序列進(jìn)行de novo的組裝和基因預(yù)測(cè)，共得到2,077,766個(gè)非冗余基因?；贑anopy算法，這兩百多萬個(gè)基因根據(jù)其豐度共變化相關(guān)性大于0.9的原則，歸并為28,072個(gè)的基因群(co-abundance gene groups，CAGs)，屬于同一個(gè)CAG的基因很有可能是來自同一個(gè)基因組(26)。其中有376個(gè)CAGs包含的基因數(shù)大于700，可以被認(rèn)為是可能是細(xì)菌基因組，這些CAGs共包含識(shí)別出的基因的36.4％(775,515)。這376個(gè)CAG中，有161個(gè)在不少于20％的樣本中被檢測(cè)到。我們對(duì)這161個(gè)CAG基因組進(jìn)行組裝，得到118個(gè)組裝基因組符合人類元基因組計(jì)劃六條高質(zhì)量組裝基因組標(biāo)準(zhǔn)中的至少5條。有50個(gè)組裝基因組與現(xiàn)有參考基因組的相似性大于95％且占有率大于80％。有10個(gè)種的細(xì)菌得到了多于1個(gè)組裝基因組，比如Faecalibacterium prausnitzii有9個(gè)組裝基因組，而Eubacterium eligens有5個(gè)，說明這些細(xì)菌在菌株水平的多樣性。

基于376細(xì)菌CAG的Bray-Curtis距離做PCoA，反映出腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成在膳食干預(yù)30天后就發(fā)生了顯著變化(MANOVA檢驗(yàn),P＝2.17e-6，圖4a和b)。無論干預(yù)前后，PWS和SO的腸道菌群均沒有顯著差異(P＝0.99，P＝0.8)，說明PWS和SO干預(yù)前的腸道菌群有著類似的失調(diào)結(jié)構(gòu)，而膳食干預(yù)對(duì)兩者腸道菌群的影響類似(圖4b)?；谄渌嚯x的β-多樣性分析及腸道菌群16S rRNA基因V1-V3區(qū)焦磷酸測(cè)序的結(jié)果反映了同樣的結(jié)果(圖5)。干預(yù)后兩類人群腸道菌群的多樣性均顯著下降(圖6)。更為重要的是，將基于376個(gè)CAG的PCoA結(jié)果(圖3a)和臨床指標(biāo)的PCA結(jié)果(圖7)進(jìn)行普氏分析(procrustes analysis)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與PWS和SO人群臨床指標(biāo)的變化顯著相關(guān)，說明在細(xì)菌基因組水平的結(jié)構(gòu)變化與宿 主健康狀況的改善有密切關(guān)系(M²＝0.891,P<0.0001,999次Monte-Carlo模擬，圖8)。

(4)基因組水平的共變化分析

在腸道生態(tài)系統(tǒng)中，細(xì)菌基因組是組成不同的功能群對(duì)于膳食干預(yù)進(jìn)行反應(yīng)的(27-29)，為了建立研究這種反應(yīng)(30)，我們基于161個(gè)高共有率的細(xì)菌CAG在所有時(shí)間點(diǎn)和所用個(gè)體中分布，建立豐度共變化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系?；赽ootstrapped Spearman相關(guān)系數(shù)的Ward聚類算法和置換MANOVA檢驗(yàn)(9999次置換,P<0.001)將細(xì)菌CAG分為18個(gè)基因組水平的互作群(GIG，圖3c和圖9)。值得注意的是，同一個(gè)種的不同CAG，比如屬于Faecalibacterium prausnitzii的9個(gè)CAG，屬于不同的GIG，說明同一個(gè)種下的不同菌株在腸道生態(tài)中可能處于不同的代謝生態(tài)位。一個(gè)種里處于同一個(gè)GIG的菌株基因組的相似性高于屬于不同GIG的同種的其他菌株，說明屬于不同GIG的同種菌株可能具有功能上的差異(圖10)。將基于18個(gè)GIG和臨床指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行普氏分析，表明GIG水平的菌群變化和宿主臨床指標(biāo)的變化均是沿著第一個(gè)坐標(biāo)軸，說明GIG豐度變化與宿主健康狀況變化顯著相關(guān)(M²＝0.898,P<0.0001,999次Monte-Carlo模擬，圖3d)。GIG豐度變化與宿主健康狀況的密切關(guān)系說明這種將人腸道菌群劃分成基因組水平的互作群的分析策略為研究腸道菌群與宿主的互作提供了一個(gè)很好的框架。

組群水平豐度分析表明，有6個(gè)GIG在膳食干預(yù)前后沒有顯著變化，包括以Prevotella copri占主要地位的GIG13(圖11)。GIG1、3和4在膳食干預(yù)后顯著增加，而GIG7、8、11、12、14、15、16、17和18在膳食干預(yù)后顯著減少(圖4e)。GIG3的豐度與GIG8、15、16和18呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r>0.45,FDR<0.01，圖3c)。GIG3是膳食干預(yù)后增加最為顯著的組群。值得注意的是，GIG3主要由屬于Bifidobacterium的基因組組成。CAG00184是干預(yù)后增加最顯著組裝基因組，與參考基因組Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 20438的相似度為98.6％且占有率為81.2％(圖12)。CAG00184的組裝基因組中包含有編碼發(fā)酵單糖、二糖、低聚糖和多聚糖產(chǎn)生乙酸和乳酸的代謝通路的基因(圖13)(28,31-33)。

(5)膳食干預(yù)改變腸道菌群功能

為了研究腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的改變?nèi)绾斡绊懫浯x潛能，我們用HUMAnM對(duì)元基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將基因與其所在的生化反應(yīng)途徑相關(guān)聯(lián)?？偣灿?,234個(gè)KEGG同源群(KO)被識(shí)別并定量。對(duì)所用KO做主成分分析發(fā)現(xiàn)干預(yù)前后KO發(fā) 生了顯著變化(MANOVA檢驗(yàn),P＝2.00e-7,圖14a和b)，表明膳食干預(yù)造成的菌群結(jié)構(gòu)的改變也影響了其代謝潛能。無論干預(yù)前后，PWS和SO在KO水平都沒有顯著差異(MANOVA檢驗(yàn)，P＝0.712且P＝0.291,圖14b)。因此，干預(yù)前后，PWS和SO患兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能均相似。

用線性判別分析(LDA)相應(yīng)水平(LEfSe)方法，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定出67個(gè)生化反應(yīng)通路在干預(yù)前后有顯著差異(P<0.05，圖14c)。41個(gè)反應(yīng)通路在干預(yù)后顯著降低，而26個(gè)通路顯著增加。值得注意的是，在顯著增加的通路中有碳水化合物分解代謝相關(guān)的通路，包括淀粉和蔗糖代謝(ko00500)和基糖和核苷酸糖代謝(ko00520)。在顯著減少的途徑中則包含脂類和蛋白質(zhì)代謝通路，如脂肪酸合成(ko00061)、苯丙氨酸代謝(ko00360)和色氨酸代謝(ko00380)。另外，脂多糖生物合成(ko00540)、肽聚糖生物合成(ko00550)和鞭毛組裝(ko02040)顯著減少，說明細(xì)菌來源的抗原合成在干預(yù)后顯著減少。外源性化學(xué)物質(zhì)生物降解(ko00627、ko00633和ko00930)和DNA損傷修復(fù)相關(guān)通路(ko03410、ko03430和ko03440)也顯著減少，或許反映了干預(yù)后腸道環(huán)境中外源有毒物質(zhì)及突變壓力減少。

(6)碳水化合物導(dǎo)致的腸道中代謝變化

干預(yù)所使用的膳食富含大量人自身不能消化的碳水化合物，到達(dá)大腸后很可能會(huì)影響腸道菌群的代謝(表2和3)。用NMR對(duì)干預(yù)前后PWS和SO患兒的糞便提取液進(jìn)行代謝物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和隱變量正交投影判別分析(OPLS-DA)表明，干預(yù)后代謝譜發(fā)生了顯著變化(圖15和16)。OPLS-DA系數(shù)圖表明糞便中不能消化的碳水化合物顯著增加(圖17)在PWS患兒中19種代謝物顯著減少，而SO患兒中18種代謝物減少(圖18和19)。這些減少的代謝物很多是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，這與定量PCR發(fā)現(xiàn)干預(yù)后腸道中細(xì)菌總量減少的結(jié)果一致(圖20)。盡管細(xì)菌代謝產(chǎn)物減少，乙酸在短鏈脂肪酸中得相對(duì)比例增加，而異丁酸和異戊酸比例減少，表明腸道菌群從發(fā)酵蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)酵碳水化合物(圖21)。三甲基胺是細(xì)菌發(fā)酵食物中脂類來源的膽堿所產(chǎn)生的有毒代謝物，干預(yù)后在糞便提取液中顯著減少(圖18和19)。體外實(shí)驗(yàn)表明，干預(yù)后PWS和SO患兒的糞便提取液對(duì)人源Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著下降說明干預(yù)后腸道菌群產(chǎn)生的有毒代謝物減少(圖22)。

為了進(jìn)一步考察膳食干預(yù)對(duì)腸道菌群碳水化合物代謝的改變，我們將所有 2,077,766非冗余基因與dbCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定出碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)。共有84,549個(gè)基因?qū)儆?99個(gè)CAZy家族，這些基因在干預(yù)前后發(fā)生顯著變化，說明腸道菌群碳水化合物代謝相關(guān)的基因發(fā)生變化(圖23)。與降解淀粉(GH13、97和31)、菊粉(GH32和91)及纖維素(GH1,3,5,8,9,44and 48)相關(guān)的CAZys在干預(yù)后顯著增加，而與降解黏膜多糖相關(guān)的CAZys則顯著減少(圖24)。Formate-tetrahydrofolate ligase是乙酸產(chǎn)生途經(jīng)中的關(guān)鍵酶，我們發(fā)現(xiàn)編碼這個(gè)酶的基因在干預(yù)后顯著增加，這解釋了干預(yù)后乙酸相對(duì)比例的增加(圖25)。這些都反映了結(jié)腸中可利用的植物來源的碳水化合物增加，雙歧桿菌這樣的攜帶大量碳水化合物發(fā)酵相關(guān)基因的細(xì)菌就會(huì)大量增加，并且產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物比如乙酸。

(7)腸道菌群和宿主代謝互作

在本研究中，我們用NMR這種無主觀偏好的技術(shù)獲得膳食干預(yù)前后尿液代謝譜，從而找出干預(yù)顯著影響的代謝物。用NMR對(duì)干預(yù)前后PWS和SO患兒的尿液進(jìn)行代謝物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和隱變量正交投影判別分析(OPLS-DA)表明，干預(yù)后代謝譜發(fā)生了顯著變化(圖26a)。在所有NMR檢測(cè)到的代謝物中，利用OPLS-DA模型只找到13種代謝物在PWS或SO患兒干預(yù)前后有顯著變化(圖26b-d和圖27-29)。13種代謝物中有4種是腸道菌群和宿主的共代謝產(chǎn)物，這些代謝物干預(yù)后都顯著降低。它們是氧化三甲基胺(TMAO)、吲哚硫酸鹽(indoxyl sulfate)、苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和馬尿酸(hippurate)。細(xì)菌產(chǎn)生的TMA進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)，宿主肝臟產(chǎn)生TMAO。其他三種代謝物的前體則是細(xì)菌在腸道中發(fā)酵氨基酸的產(chǎn)物，比如吲哚硫酸鹽的前體吲哚是細(xì)菌發(fā)酵色氨酸的產(chǎn)物。TMAO在臨床上能夠作為預(yù)測(cè)心血管事件的獨(dú)立分子標(biāo)識(shí)物，而且在人和小鼠中都被證實(shí)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制。類似的，吲哚硫酸鹽被認(rèn)為與慢性腎炎病人發(fā)生高血壓和心血管疾病有關(guān)。另一方面，菌群代謝膽堿產(chǎn)生TMAO減少，與人自身代謝膽堿產(chǎn)生的二甲基甘氨酸(DMG)在尿液中增加相互印證(圖26c和d)。這說明干預(yù)膳食中脂類來源的膽堿主要被人吸收代謝，而不是被腸道中的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生TMA。

對(duì)376個(gè)細(xì)菌CAG和尿液代謝物進(jìn)行協(xié)慣量分析(Co-inertia analysis)，表明兩者之間有顯著的共變化關(guān)系(R＝0.52,P<0.01，圖30和31a)。利用Bootstrapped Spearman相關(guān)分析找出了所有與干預(yù)前后有顯著變化的尿液代謝物正相關(guān)或負(fù)相 關(guān)的細(xì)菌CAGs(|r|>0.4and FDR<0.01，圖31b)。在所有與潛在有毒代謝物吲哚硫酸鹽正相關(guān)的細(xì)菌CAG中，9個(gè)屬于GIG7和18(大部分是Bacteroides spp.和Alistipes spp.)的CAG的基因組中有編碼將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚的色氨酸酶的基因(圖31c)。在所有與有毒代謝物TMAO正相關(guān)的細(xì)菌CAG中，13個(gè)屬于GIG7、8、14、15、16和18(大部分是Ruminococcus spp.、Parabacteroides spp.和Bacteroides spp.)的CAG的基因組中有編碼膽堿厭氧降解相關(guān)膽堿TMA裂解酶和膽堿TMA裂解酶激酶基因簇(圖31d)。這些CAG所代表的菌株很可能是腸道中產(chǎn)生吲哚和TMA的細(xì)菌，他們所屬的GIG都是干預(yù)后減少的。他們豐度的下降對(duì)于遺傳因素導(dǎo)致的肥胖和單純性肥胖患者代謝失調(diào)的改善都有貢獻(xiàn)。

PWS相關(guān)的肥胖似乎是遺傳因素決定的，但是其推動(dòng)因素與單純性肥胖相似，仍然是過度飲食和低能量消耗。我們的研究表明，遺傳因素造成的肥胖和單純性肥胖患者的腸道菌群有著相似的結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)，比如1)產(chǎn)生的能夠引起代謝損傷的有毒物質(zhì)如吲哚硫酸鹽和TMAO較多；2)編碼產(chǎn)生有毒共代謝物相關(guān)酶的基因豐度較高；3)產(chǎn)生細(xì)菌來源的抗原如內(nèi)毒素的生物合成通路較多。將PWS患兒干預(yù)前的腸道菌群移植給無菌小鼠，能夠引起后者腸道炎癥和脂肪積累。WTP膳食干預(yù)改變腸道菌群的代謝，使其從發(fā)酵蛋白質(zhì)和脂類變?yōu)榘l(fā)酵碳水化合物，這種改變與遺傳因素造成的肥胖和單純性肥胖代謝失調(diào)的改善相關(guān)。

腸道菌群的一些結(jié)構(gòu)特征被認(rèn)為是于肥胖相關(guān)，比如厚壁菌門與擬桿菌門的比例升高或者低基因豐度。但是腸道菌群中參與肥胖和代謝失調(diào)發(fā)生發(fā)展的特定的成員及其功能互作關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群的重要功能可能是種甚至菌株特異性的，而許多元基因組相關(guān)的研究由于技術(shù)條件所限無法將獨(dú)立的基因組組裝出來，只能在屬甚至更高的水平上進(jìn)行分析。來源于同一個(gè)基因組DNA分子上的兩個(gè)基因的豐度在整個(gè)復(fù)雜的元基因組數(shù)據(jù)中相關(guān)性應(yīng)該是極高的，基于上述原理，最近提出的canopy算法將豐度共變化高度相關(guān)的基因歸并為一個(gè)群。如果測(cè)序深度足夠，屬于一個(gè)CAG的序列讀段能夠組裝為一個(gè)高質(zhì)量的基因組，因此我們可以在基因組水平分析膳食干預(yù)引起的腸道菌群變化。比如，我們發(fā)現(xiàn)膳食干預(yù)顯著富集了具有豐富碳水化合物利用能力的B.pseudocatenulatum。這個(gè)種很可能是通過增加乙酸和其他物質(zhì)的產(chǎn)生來抑制有害菌，從而形成健康的腸道生態(tài)環(huán)境的“關(guān)鍵物種”。

腸道菌群產(chǎn)生有毒的代謝物比如TMA和吲哚進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)，很可能是影 響宿主健康的方式之一。但是對(duì)于腸道菌群--特別是人腸道--中能夠產(chǎn)生這些特定化合物的成員，我們還知之甚少。在前期以健康人群為對(duì)象做得方法研究中，我們指出可以將腸道微生物群落中特定成員與特定尿液代謝物的變化關(guān)聯(lián)起來，從而揭示“群落中哪種細(xì)菌做了什么”。在這個(gè)研究中，我們將腸道中獨(dú)立的細(xì)菌基因組與特定的尿液代謝物的變化關(guān)聯(lián)起來，揭示了“群落中哪個(gè)細(xì)菌的基因組執(zhí)行了哪種功能”。一些細(xì)菌的基因組與尿液中TMAO或者吲哚硫酸鹽的水平顯著相關(guān)，在這些基因組中確實(shí)有編碼由膽堿或色氨酸產(chǎn)生這兩種物質(zhì)前體的酶的基因。在以后可以將這些關(guān)鍵細(xì)菌分離出來，進(jìn)一步做深入的機(jī)制研究。

綜上所述，我們證明了無論是遺傳因素引起的還是膳食誘導(dǎo)的重度肥胖兒童，腸道菌群有著相似失調(diào)。富含不能被人體消化的復(fù)雜碳水化合物的膳食能夠改善腸道菌群的失調(diào)，使得利用蛋白質(zhì)或脂類產(chǎn)生有毒物質(zhì)的細(xì)菌豐度下降，而發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生有益物質(zhì)的細(xì)菌增加。這種膳食對(duì)腸道菌群的改變顯著改善了PWS和SO患兒代謝失調(diào)，說明失調(diào)的腸道菌群在無論是遺傳因素還是不當(dāng)膳食導(dǎo)致的肥胖發(fā)生過程中的普遍病理作用。因此，膳食改善腸道菌群可以成為管理代謝性疾病的有價(jià)值和前途的手段。

實(shí)施例2

對(duì)一位體重175千克的志愿者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，并對(duì)干預(yù)過程中身體各項(xiàng)生理生化指標(biāo)和腸道菌群的變化進(jìn)行系統(tǒng)的分子監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步描述本發(fā)明。

(1)志愿者干預(yù)前的身體狀況

該志愿者為26歲男性。身高172.5厘米，體重174.9千克，BMI(Body Mass Index)58.78，腰圍156.1厘米，根據(jù)亞洲成年人肥胖評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷，為重度肥胖患者。經(jīng)系統(tǒng)體檢，發(fā)現(xiàn)其患有嚴(yán)重的代謝綜合癥，其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)如下表6所示。

(2)干預(yù)過程中身體的生理生化指標(biāo)變化與干預(yù)效果的分子評(píng)價(jià)。

相比較于該志愿者干預(yù)前0天的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)9周、23周后，體重和BMI顯著下降；空腹血糖、空腹胰島素、糖化血紅蛋白和胰島素抵抗指數(shù)的降低，直接反映糖穩(wěn)態(tài)情況及其在干預(yù)下的好轉(zhuǎn)；甘油三酯和總膽固醇的下降表明機(jī)體脂代謝的改善；谷草轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的明顯

表6：實(shí)施例1志愿者營(yíng)養(yǎng)干預(yù)前及干預(yù)后9周、23周生理生化指標(biāo)

降低，逐漸恢復(fù)到正常范圍內(nèi)，說明肝臟細(xì)胞的損傷的減輕；同時(shí)脂肪肝與血壓均有所改善；炎性標(biāo)記物中的C反應(yīng)蛋白、炎性因子白介素6，提示腸道菌群引發(fā)的破壞身體的炎性反應(yīng)的水平在干預(yù)下降低；抗炎因子脂聯(lián)素的升高表明機(jī)體消除炎性反應(yīng)的機(jī)能在干預(yù)后恢復(fù)；內(nèi)毒素結(jié)合蛋白的減少提示進(jìn)入血液的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的水平在干預(yù)下降低。綜合上述各項(xiàng)指標(biāo)，該志愿者經(jīng)過干預(yù)之后，代謝綜合癥各項(xiàng)表征均明顯改善。

干預(yù)過程中腸道菌群結(jié)構(gòu)變化情況如下：16S rRNA基因V3-DGGE指紋圖譜 及注釋見說明書附圖。0d：為干預(yù)前時(shí)間點(diǎn)，4w、9w、13w、18w、23w：分別為干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)4周、9周、13周、18周和23周。紅色箭頭(23W泳道旁的2處箭頭)所示為營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后增加的條帶(2條條帶)，藍(lán)色箭頭(M泳道旁的5處箭頭)所示為營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后逐漸減弱的條帶(5條條帶)。從DGGE圖譜可以看到營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)該個(gè)體腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大影響，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)是比較相似，這說明營(yíng)養(yǎng)干預(yù)顯著地改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)。

454焦磷酸測(cè)序結(jié)果顯示該志愿者的變形菌門發(fā)生明顯下降,其中以腸桿菌科變化最明顯，由-30d的17.90％降為9w的0.10％和23w降為0.10％，表現(xiàn)在屬的水平上即為機(jī)會(huì)性病原菌腸桿菌的明顯下降。另外，屬水平在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后呈上趨勢(shì)的有Faecalibacterium，該屬菌種具有抗炎和產(chǎn)生丁酸鹽的作用，對(duì)宿主的能量代謝，保護(hù)腸粘膜完整性起著重要作用。

由此可見，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后，該志愿者機(jī)會(huì)性病原菌數(shù)量發(fā)生明顯下降，進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)的腸道內(nèi)內(nèi)毒素減少，從而降低了宿主炎性反應(yīng)水平，有效地緩解了該志愿者代謝綜合癥的癥狀。

實(shí)施例3

對(duì)89位中心型Ⅱ度肥胖癥志愿者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，并對(duì)干預(yù)過程中身體各項(xiàng)生理指標(biāo)和腸道菌群的變化進(jìn)行系統(tǒng)的分子監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步描述本發(fā)明。

(1)干預(yù)全過程中身體的生理變化與干預(yù)效果的分子評(píng)價(jià)

相比較于志愿者干預(yù)前30天的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，干預(yù)9周、23周后，體重和BMI持續(xù)顯著下降；空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的降低，直接反映糖穩(wěn)態(tài)情況的好轉(zhuǎn)；甘油三酯和總膽固醇的下降表明機(jī)體脂代謝的改善；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的明顯降低，說明肝臟細(xì)胞的損傷減輕；同時(shí)脂肪肝(志愿者有68.5％干預(yù)后狀況好轉(zhuǎn)，其中18.0％干預(yù)后轉(zhuǎn)為正常)與血壓均有所改善；炎性標(biāo)記物中的C反應(yīng)蛋白、炎性因子白介素6和腫瘤壞死因子α的減少，反映腸道菌群引發(fā)的炎性反應(yīng)的水平在干預(yù)下降低；抗炎因子脂聯(lián)素的升高表明機(jī)體消除炎性反應(yīng)的機(jī)能在干預(yù)后的恢復(fù)；內(nèi)毒素結(jié)合蛋白的減少提示進(jìn)入血液的細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的水平在干預(yù)下降低。

表7：實(shí)施例2志愿者營(yíng)養(yǎng)干預(yù)全過程生理生化指標(biāo)

數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，或中位數(shù)(四分位數(shù)間距)。顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的配對(duì)t檢驗(yàn)(正態(tài)分布數(shù)據(jù))或非參數(shù)分布Wilcoxon檢驗(yàn)(非正態(tài)分布數(shù)據(jù))。

腸道通透性測(cè)試，干預(yù)前30天和干預(yù)后9周收集得到的樣品數(shù)為89，干預(yù)后23周的收集樣品數(shù)為76。

干預(yù)后9周、23周與干預(yù)前30天比較，^*P<0.05，^**P<0.01；干預(yù)后23周與干預(yù)后9周比較，^§P<0.05，^§§P<0.01。

干預(yù)過程中腸道菌群結(jié)構(gòu)變化情況如下:

454焦磷酸測(cè)序結(jié)果顯示營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后志愿者變形菌門數(shù)量顯著下降，放線菌門數(shù)量顯著上升。主要有三個(gè)科在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后發(fā)生顯著變化，腸桿菌科和脫硫弧菌科數(shù)量發(fā)生顯著下降，而雙歧桿菌科數(shù)量顯著上升。

營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后，志愿者腸桿菌科和脫硫弧菌科兩個(gè)常見的致病菌類型數(shù)量發(fā)生顯著下降，而保護(hù)腸屏障的雙歧桿菌科數(shù)量顯著上升，腸壁通透性下降，進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)的腸道的內(nèi)毒素量減少，從而降低了宿主炎性反應(yīng)水平，緩解了代謝綜合癥的癥狀。

本說明書引用的所有出版物通過引用整體引入。

引用文獻(xiàn)

1.Y.C.Wang,K.McPherson,T.Marsh,S.L.Gortmaker,M.Brown,Health and economic burden of the projected obesity trends in the USA and the UK.Lancet 378,815(Aug 27,2011).

2.G.S.Hotamisligil,Inflammation and metabolic disorders.Nature 444,860(Dec 14,2006).

3.J.P.Despres,I.Lemieux,Abdominal obesity and metabolic syndrome.Nature 444,881(Dec 14,2006).

4.Q.Xia,S.F.Grant,The genetics of human obesity.Ann N Y Acad Sci 1281,178(Apr,2013).

5.M.G.Butler,Prader‐Willi Syndrome:Obesity due to Genomic Imprinting.Curr Genomics 12,204(May,2011).

6.D.Lacroix et al.,Metabolic and adipose‐tissue signatures in adults with Prader‐Willi syndrome,a model of extreme adiposity.J Clin Endocrinol Metab,jc20143127(Dec 5,2014).

7.F.Backhed et al.,The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc Natl Acad Sci U S A 101,15718(Nov 2,2004).

8.L.Zhao,The gut microbiota and obesity:from correlation to causality.Nature reviews.Microbiology 11,639(Sep,2013).

9.F.Backhed,J.K.Manchester,C.F.Semenkovich,J.I.Gordon,Mechanisms underlying the resistance to diet‐induced obesity in germ‐free mice.Proc Natl Acad Sci U S A 104,979(Jan 16,2007).

10.P.J.Turnbaugh,F.Backhed,L.Fulton,J.I.Gordon,Diet‐induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome.Cell Host Microbe 3,213(Apr 17,2008).

11.V.K.Ridaura et al.,Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice.Science 341,1241214(Sep 6,2013).

12.P.D.Cani et al.,Changes in Gut Microbiota Control Metabolic Endotoxemia‐Induced Inflammation in High‐Fat Diet–Induced Obesity and Diabetes in Mice.Diabetes 57,1470(June 2008,2008).

13.A.Vrieze et al.,Transfer of intestinal microbiota from lean donors increases insulin sensitivity in individuals with metabolic syndrome.Gastroenterology143,913(Oct,2012).

14.S.Xiao et al.,A gut microbiota‐targeted dietary intervention for amelioration of chronic inflammation underlying metabolic syndrome.FEMS Microbiol Ecol 87,357(Feb,2014).

15.N.Fei,L.Zhao,An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice.ISME J 7,880(Apr,2013).

16.M.Vijay‐Kumar et al.,Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll‐like receptor 5.Science 328,228(Apr 9,2010).

17.P.J.Turnbaugh et al.,An obesity‐associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.Nature 444,1027(Dec 21,2006).

18.S.T.Papavramidis,E.V.Kotidis,O.Gamvros,Prader‐Willi syndrome‐associated obesity treated by biliopancreatic diversion with duodenal switch.Case report and literature review.J Pediatr Surg 41,1153(Jun,2006).

19.G.Labruna et al.,High leptin/adiponectin ratio and serum triglycerides are associated with an"at‐risk"phenotype in young severely obese patients.Obesity 19,1492(Jul,2011).

20.J.Zweigner,R.R.Schumann,J.R.Weber,The role of lipopolysaccharide‐binding protein in modulating the innate immune response.Microbes Infect 8,946(Mar,2006).

21.P.D.Cani et al.,Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance.Diabetes 56,1761(Jul,2007).

22.R.E.Ley et al.,Obesity alters gut microbial ecology.Proc Natl Acad Sci USA 102,11070(Aug 2,2005).

23.P.J.Turnbaugh et al.,A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature457,480(Jan 22,2009).

24.A.Cotillard et al.,Dietary intervention impact on gut microbial gene richness.Nature 500,585(Aug 29,2013).

25.E.Le Chatelier et al.,Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers.Nature 500,541(Aug 29,2013).

26.H.B.Nielsen et al.,Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes.Nature biotechnology 32,822(Aug,2014).

27.Y.Zhou et al.,Biogeography of the ecosystems of the healthy human body.Genome Biol 14,R1(Jan 14,2013).

28.A.M.Ellison et al.,Loss of foundation species:consequences for the structure and dynamics of forested ecosystems.Frontiers in Ecology and the Environment 3,479(Nov,2005).

29.M.J.Claesson et al.,Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly.Nature 488,178(Aug 9,2012).

30.L.A.David et al.,Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome.Nature 505,559(Jan 23,2014).

31.K.P.Scott,S.W.Gratz,P.O.Sheridan,H.J.Flint,S.H.Duncan,The influence of diet on the gut microbiota.Pharmacol Res 69,52(Mar,2013).

32.S.Fukuda et al.,Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.Nature 469,543(Jan 27,2011).

33.G.R.Gibson,X.Wang,Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria.J Appl Bacteriol 77,412(Oct,1994).

34.S.Abubucker et al.,Metabolic reconstruction for metagenomic data and its application to the human microbiome.PLoS Comput Biol 8,e1002358(2012).

35.N.Segata et al.,Metagenomic biomarker discovery and explanation.Genome Biol 12,R60(2011).

36.K.M.Maslowski et al.,Regulation of inflammatory responses by gut microbiota and chemoattractant receptor GPR43.Nature 461,1282(Oct 29,2009).

37.V.Tremaroli,F.Backhed,Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.Nature 489,242(Sep 13,2012).

38.W.R.Russell et al.,High‐protein,reduced‐carbohydrate weight‐loss diets promote metabolite profiles likely to be detrimental to colonic health.American Journal of Clinical Nutrition 93,1062(May,2011).

39.H.J.Flint,K.P.Scott,S.H.Duncan,P.Louis,E.Forano,Microbial degradation of complex carbohydrates in the gut.Gut Microbes 3,289(Jul‐Aug,2012).

40.Z.Wang et al.,Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease.Nature 472,57(Apr 7,2011).

41.B.L.Cantarel,V.Lombard,B.Henrissat,Complex carbohydrate utilization by the healthy human microbiome.PLoS One 7,e28742(2012).

42.G.Zeller et al.,Potential of fecal microbiota for early‐stage detection of colorectal cancer.Mol Syst Biol 10,766(2014).

43.W.R.Wikoff et al.,Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites.Proc Natl Acad Sci U S A 106,3698(Mar 10,2009).

44.L.Hood,Tackling the microbiome.Science 336,1209(Jun 8,2012).

45.M.Li et al.,Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,2117(Feb 12,2008).

46.Z.Wang et al.,Prognostic value of choline and betaine depends on intestinal microbiota‐generated metabolite trimethylamine‐N‐oxide.Eur Heart J 35,904(Apr,2014).

47.F.C.Barreto et al.,Serum indoxyl sulfate is associated with vascular disease and mortality in chronic kidney disease patients.Clin J Am Soc Nephrol 4,1551(Oct,2009).

48.M.E.Dumas et al.,Metabolic profiling reveals a contribution of gut microbiota to fatty liver phenotype in insulin‐resistant mice.Proc Natl Acad Sci U S A 103,12511(Aug 15,2006).

49.M.C.Deeley,C.Yanofsky,Transcription initiation at the tryptophanase promoter of Escherichia coli K‐12.J Bacteriol 151,942(Aug,1982).

50.S.Craciun,E.P.Balskus,Microbial conversion of choline to trimethylamine requires a glycyl radical enzyme.Proc Natl Acad Sci U S A 109,21307(Dec26,2012).。