本發(fā)明涉及一種病毒凍干制劑的制備方法，特別是涉及一種新城疫病毒凍干制劑的制備方法。
背景技術：
新城疫病毒屬于動物副粘科病毒，目前生產新城疫病毒凍干制劑的方法是將新城疫病毒LaSota株、clone30株、HBi株、F株或N79株等標準病毒液，接種于10日齡的雞胚尿囊腔內，37℃孵化繁殖。定時收取合格的雞胚尿囊液，與適量冷凍干燥添加劑混合均勻，定量分裝于無菌西林瓶內，經預凍真空加熱干燥制成凍干制劑。
用上述方法生產凍干制劑的過程中存在以下幾個問題：1、凍干制劑保質期較短；2、凍干制劑的生物活性不穩(wěn)定。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種保質期較長的新城疫病毒凍干制劑。
—種病毒凍干制劑的制備方法，包括新城疫病毒原液及冷凍干燥添加劑，所述冷凍干燥添加劑基本上由人血白蛋白和羥乙基淀粉組成。為了更好地維持和保護原液生物的活性，所述冷凍干燥添加劑中還含有抗壞血酸鈉、精氨酸。所述冷凍干燥添加劑各組分的重量體積比為：
所述的新城疫病毒原液與所述冷凍干燥添加劑的比例是新城疫病毒原液：冷凍干燥添加劑＝1:1～5:1。
—種生產病毒凍干制劑的方法，包括以下步驟：
(1)將新城疫病毒原液過0.45ym濾芯，經過濃縮、純化后加入冷凍干燥添加劑混勻無菌過濾，分裝于西林瓶中，半加塞，其中，所述冷凍干燥添加劑基本上由人血白蛋白和羥乙基 淀粉組成；
⑵將西林瓶放入冷凍干燥器內，分別在4.8～5.2C、0.2～0.8C、-5.8～-6.2C各平衡1小時；
⑶快速凍結，將制品溫度降至-48～-52C維持2.5～3.5小時；
(4)真空干燥；
(5)加熱干燥，在制品溫度達到25.5～37.5C條件下持續(xù)2.5～3.5小時；
(6)全部加塞，壓封鋁蓋。
所述病毒原液是將新城疫病毒接種于10日齡雞胚尿囊腔內，36℃孵化繁殖，收取雞胚尿囊液。所述冷凍干燥添加劑中還有抗壞血酸鈉、精氨酸。
所述冷凍干燥添加劑各組分的重量體積比為：
所述病毒原液與所述冷凍干燥添加劑的比例是新城疫病毒原液：冷凍干燥添加劑＝1:1～5:1。
本發(fā)明由于采用了上述技術方案，因此具有以下優(yōu)點：
1.在凍干制劑的減壓一升溫一干燥過程中，適宜的升溫程序對維持生物制品的生物活性、制劑的外觀形態(tài)是重要的。將升溫干燥的終點控制在30C并持續(xù)3小時，使制品中的殘余水分以定量非共價鍵形式存在，以維持原液的形態(tài)、活性的穩(wěn)定，減少成品凍干制劑在保存過程中的效價急速回落，并延長保存時間。
2、本發(fā)明的冷凍干燥添加劑與新城疫病毒原液具有極佳的生物相容性。羥乙基淀粉是一種水溶性變性淀粉，屬于多糖，既能夠很好的保護病毒活性，又是一種很好的凍干賦形劑；精氨酸是一種很好的蛋白保護物質；抗壞血酸鈉是抗細胞膜氧化的維生素；特別是當加入人血白蛋白時，它們共同構成了適合于新城疫病毒原液的仿生體系，有利于原液的休眠與復蘇，本發(fā)明的凍干制劑在4C條件下至少可以保存14個月。
3、微生物在液體凍結過程中，即液體降溫一結冰一形成玻璃化晶態(tài)的過程中會發(fā)生從宏觀到微觀的適應性變形，以保持其生物活性。在凍干制劑生產的凍結過程中采用5C、0C、-6C 各平衡1小時，有利于原液對溫度的適應性變形，對維持凍干制劑的生物效價是必要的。
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
具體實施方式
實施例1、生產本發(fā)明凍干制劑
本發(fā)明新城疫病毒凍干制劑的生產包括以下步驟：
1、生產用種毒為clone30株；
2、孵化：取受精蛋，按照《中華人民共和國生物制品質量標準》(以下簡稱《標準》)中的方法37C孵育10日。用生理鹽水稀釋種毒，使病毒效價為91og2,每雞胚尿囊腔接種該種毒0.1ml，置36C孵育72小時；
3、收獲原液：棄去24小時前死亡的雞胚，剩余的雞胚置4C冷藏過夜。在無菌條件下吸取尿囊液，混勻過濾，密閉保存；
4、將收獲的原液用0.45ym濾芯過濾，用超濾器濃縮，用層析柱純化；
5、配制添加劑
(1)取抗壞血酸鈉108.7克、羥乙基淀粉198.2克、精氨酸19.6克，溶于600毫升蒸餾水中，加入20％人血白蛋白20ml，過濾，115℃消毒40分鐘；
⑵將第⑴溶液，用10％無菌磷酸氫二鈉調節(jié)溶液的pH值至6.8±0.1，補加蒸餾水至1000毫升，混勻；
6、配制凍干制劑液：將效價調整為9log2的原液與添加劑溶液以1:1的比例混勻，注入西林瓶中，半加塞；
7、凍結：將分裝好的凍干制劑液放入冷凍干燥工作箱內，預置降溫程序，分別在5C、0°C、-6C各平衡1小時，啟動快速凍結程序，將物料溫度降至-50C，維持3小時；
8、真空干燥：啟動真空工作程序，待冷凍干燥器內相對壓力降至5Pa，預設升溫程序，以每次升溫15C維持30分鐘，持續(xù)減壓升溫至30C并維持3小時；
9、全部加塞，壓封鋁蓋。
成品凍干制劑按《標準》所列方法檢定，合格。
實施例2、本發(fā)明凍干制劑在2～8C保存條件下的保質期
在2～8C條件下分別測定了3個批次用本發(fā)明方法制備的凍干制劑在不同時期的半數感染率(EID50)，結果如表1所示：
表1:凍干制劑在2～8C保存條件下的EID50
表2:凍干制劑在2～8C保存條件下的病毒滴度
從表中的結果可以看出，本發(fā)明的凍干制劑在2～8C條件下至少可以保存14月。
實施例3、凍干制劑在高溫、高濕度條件下的保質期
觀察在37℃、相對濕度75％的條件下不同保藏時期凍干制劑的EID5。，結果見表3。
表3:凍干制劑在37C相對濕度75％保存條件下的EID5。
從表中的結果可以看出，本發(fā)明凍干制劑的熱穩(wěn)定性符合美國食品與藥物管理局關于新城疫病毒活凍干制劑的穩(wěn)定性考核標準(FDA)的有關規(guī)定。
實施例43批樣品凍干前后的變化
觀察3批樣品凍干前后的外觀性狀、pH值、病毒滴度變化以及水分、水溶情況，結 果見表4。
表4三批樣品凍干試驗結果
由表4可以看出將羥乙基淀粉、精氨酸、白蛋白三種基質按比例做為凍干佐劑進行的實驗中，凍干樣品呈現乳白色疏松團塊，能夠迅速溶解，并且凍干前后的血凝效價、pH都沒有發(fā)生明顯變化，凍干效果非常理想。
上述參照實施例對該種抗癌藥物的制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。