本發(fā)明涉及中藥，具體涉及中藥提取物單體鴉膽子苦素D在制備Wnt/Notch信號(hào)通路抑制劑藥物中的應(yīng)用，尤其涉及中藥提取物單體鴉膽子苦素D在制備預(yù)防/治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝癌既包括肝細(xì)胞癌(HCC)和肝內(nèi)膽管癌(CC)，是世界第五大癌癥，每年,大約有750000例被診斷,而700000人死于肝癌，使其成為全球死亡率第三大癌癥，嚴(yán)重影響著人們的健康。近年來，在肝癌的診斷及治療方面雖然取得一些進(jìn)展，但晚期肝癌存活率仍較低。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是原發(fā)性肝癌的最主要類型。肝細(xì)胞癌的主要特點(diǎn)為侵襲性強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移，其發(fā)生，并且其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟、多階段的過程。目前，針對(duì)肝細(xì)胞癌的治療方法主要分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療，由于肝切除術(shù)可根治肝細(xì)胞癌，提高患者生存率，是公認(rèn)的最有效的治療肝細(xì)胞癌的手段之一，然而仍然存在其局限性：腫瘤細(xì)胞增殖快，惡性程度高，極易發(fā)生散播和轉(zhuǎn)移；多數(shù)腫瘤為多中心發(fā)生，很難徹底根除；肝細(xì)胞癌患者大部分具有肝硬化基礎(chǔ)，導(dǎo)致肝功能代償無法實(shí)施手術(shù)。因此，聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)治療與各種非手術(shù)治療成為治療肝細(xì)胞癌的優(yōu)先選擇。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與完成，如Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路，TLR4/NF-kB信號(hào)通路，Ras、Jnk信號(hào)通路，mTOR通路等，近年來Wnt/Notch信號(hào)通路成為肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)而倍受關(guān)注。

鴉膽子也叫老鴉膽或苦參子。系苦木科植物Brucea javanica(L)Merr的干燥成熟果實(shí)。性苦寒，歸大腸，肝經(jīng)。始載于《本草綱目拾遺》。鴉膽子是中國(guó)常用中藥，具有清熱解毒、截瘧、止痢的功效。治療熱性赤痢或便血、瘧疾、雞眼等。在我國(guó)的南方沿海熱帶地區(qū)發(fā)現(xiàn)有鴉膽子生長(zhǎng)。此外，亞熱帶地區(qū)和云南等地區(qū)也有鴉膽子分布。鴉膽子主要產(chǎn)于中國(guó)南方沿海熱帶、亞熱帶地區(qū)及云南等地。鴉膽子的主要活性成分----苦木內(nèi)酯化合物具有抗瘧、抗病毒、抗炎及抗 腫瘤活性。四環(huán)三萜類內(nèi)酯-苦木內(nèi)酯類化合物最早是由J.Polansky于1967年從該屬植物中分離的，后續(xù)不斷有研究人員陸續(xù)從該屬植物中發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤活性的苦木內(nèi)酯類化合物。19世紀(jì)70年代。鴉膽子就開始用于治療各種惡性腫瘤。對(duì)鴉膽子油乳抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、周期、免疫功能及多藥耐藥方面均有影響。該藥現(xiàn)已成為當(dāng)代治療腫瘤最活躍的中藥制劑之一。對(duì)肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、大腸癌、白血病、胰腺癌、腦癌、前列腺癌、膀胱癌等多種腫瘤具有良好的療效。鴉膽子(Brucea javanica)中含有一類特征性的化合物，苦木素類(四環(huán)三萜苦木內(nèi)酯、苦木內(nèi)酯)化合物，也是鴉膽子中主要的抗癌活性成分，目前從鴉膽子水提取物中已經(jīng)分離得到30多種苦木素類化合物。主要包括苦木素A-I和鴉膽子苷A-P。也有其它成分如鴉膽子苦內(nèi)酯A-D，鴉膽子苦醇，鴨膽丁等等。另外從鴉膽子中還可以提取到油酸，亞油酸，硬脂酸和棕櫚酸等脂溶性成分。鴉膽子中含量較高的苦木素類化合物包括：鴉膽苦醇(Brusatol)，鴉膽子苦素D(Bruceine D)，鴉膽子苦素E(Bruceine E)，鴉膽子苦素H(Bruceine H)，鴉膽子苷A(Yadanzioside A)，鴉膽子苷B(Yadanzioside B)。其中對(duì)鴉膽子苦素D的抗腫瘤機(jī)制研究的較為深入，2008年由Lau et al課題組發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D具有顯著的抗胰腺癌增殖和促凋亡的作用(Lau,S.T.,et al.,Brucea javanica fruit induces cytotoxicity and apoptosis in pancreatic adenocarcinoma cell lines.Phytother Res,2008.22(4):p.477-86.)。

Wnt/Notch信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)，在肝細(xì)胞癌中也具有重要的作用。目前關(guān)于通路通路的抑制劑普遍局限于γ-分泌酶抑制劑上，關(guān)于鴉膽子苦素D的抗腫瘤活性報(bào)道較多，對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，但其作用機(jī)制仍不十分明確，并且未見有Wnt/Notch信號(hào)通路抑制活性的報(bào)道。本發(fā)明人以293T作為工具細(xì)胞用報(bào)告基因的方法篩選到Wnt/Notch信號(hào)通路抑制劑的活性化合物，從活性化合物中選擇鴉膽子苦素D(BD)作為研究對(duì)象，考察鴉膽子苦素D體外抗腫瘤活性，鴉膽子苦素D對(duì)Wnt/Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的影響。Wnt/Notch信號(hào)通路之間有著復(fù)雜的相互聯(lián)系，驗(yàn)證了通路在癌中的重要作用的同時(shí)也闡述了Wnt/Notch信號(hào)通路之間的內(nèi)在關(guān)系，宜進(jìn)一步開發(fā)鴉膽子苦素D新的治療用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)鴉膽子苦素D(BD)用以制備藥物的用途。

本發(fā)明提供了鴉膽子苦素D在制備Wnt/Notch信號(hào)通路抑制劑藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了鴉膽子苦素D在制備預(yù)防/治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

鴉膽子苦素D(BD)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明人利用人肝癌腫瘤細(xì)胞系和人正常肝細(xì)胞系模型評(píng)估鴉膽子苦素D體外抗腫瘤功效。將兩種肝癌腫瘤細(xì)胞和兩種人正常肝細(xì)胞給予不同濃度的鴉膽子苦素D(0-20μM)處理48h,并通過CCK-8檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活力。結(jié)果顯示，鴉膽子苦素D可以顯著抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，其半數(shù)抑制濃度為1.87μM(圖1)。而對(duì)正常肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，說明鴉膽子苦素D對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。相同濃度下不同時(shí)間點(diǎn)鴉膽子苦素D抑制Hep3B細(xì)胞增殖的效率不同(圖1)。另外，軟瓊脂克隆形成結(jié)果表明，經(jīng)(0.25-1μM)鴉膽子苦素D處理24h后的肝細(xì)胞癌細(xì)胞與對(duì)照組比較克隆形成能力明顯降低(圖1)。利用蛋白免疫印跡的方法和RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D可以抑制Notch信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，尤其對(duì)最上游關(guān)鍵配體Jagged1在基因和蛋白水平的表達(dá)抑制作用顯著。Notch信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)，用鴉膽子苦素D處理Huh7和Hep3B細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)周期素D1(cyclinD1),生存素(survivin)和凋亡相關(guān)蛋白PARP,caspase3顯著下調(diào)。此外用三種方法驗(yàn)證了鴉膽子苦素D對(duì)Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵酶γ-分泌酶活性的沒有影響：對(duì)γ-分泌酶亞基表達(dá)量沒有影響；對(duì)轉(zhuǎn)染了γ-分泌酶的直接底物Notch1NEXT的293T細(xì)胞,鴉膽子苦素D對(duì)Notch1NEXT的產(chǎn)物NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)表達(dá)量沒有影響，而γ-分泌酶陽性抑制劑DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)確可顯著抑制內(nèi)源性NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)的產(chǎn)生；另外鴉膽子苦素D對(duì)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染的人源γ-分泌酶底物N100的變化沒有影響。肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Jagged1質(zhì)粒后可抵抗鴉膽子苦素D對(duì)其促凋亡抗增殖作用，同時(shí)肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染shJagged1質(zhì)粒后也可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖，以上結(jié)果說明了鴉膽子苦素D是通過抑制Notch信號(hào)通路中上游Jagged1的表達(dá)而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)也說明了Jagged1在肝癌細(xì)胞增殖過程中的重要作用。

本發(fā)明人還利用放線菌酮(放線菌酮)考察鴉膽子苦素D對(duì)Jagged1穩(wěn)定性的影響，經(jīng)1μM鴉膽子苦素D處理huh7細(xì)胞24h后加入15μg/ml的放線菌酮與單獨(dú)經(jīng)放線菌酮處理后Jagged1的半衰期沒有變化。再利用蛋白酶抑制劑MG132發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D對(duì)jagged1蛋白的降解沒有影響。而鴉膽子苦素D對(duì)Jagged1 的基因水平有顯著下調(diào)作用，推測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)Notch信號(hào)通路以外的通路有抑制作用。接著，用FOP/TOP熒光素酶報(bào)告基因的方法證實(shí)了鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路中β-catenin/Tcf4轉(zhuǎn)錄后水平有抑制作用。另外，斑馬魚實(shí)驗(yàn)也證明了鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路具有抑制作用。用shβ-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后β-catenin、Jagged1表達(dá)水平都顯著下調(diào)，而shJagged1處理后的Huh7細(xì)胞β-catenin蛋白水平?jīng)]有變化,據(jù)此得出β-catenin處于Jagged1的上游，Jagged1是β-catenin/Tcf4的靶基因之一。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鴉膽子苦素D對(duì)肝癌細(xì)胞系胞漿中的β-catenin的表達(dá)量沒有影響，然而卻引起TOP Flash活性降低。因此進(jìn)一步考察了鴉膽子苦素D對(duì)細(xì)胞核中β-catenin的影響。分別提取胞漿蛋白和核蛋白發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D處理后細(xì)胞核中的β-catenin表達(dá)量降低，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示鴉膽子苦素D影響了β-catenin的入核。最后采用Pull-down的方法將Huh7細(xì)胞裂解液或人重組蛋白β-catenin與結(jié)合或未結(jié)合鴉膽子苦素D的瓊脂糖磁珠共孵育，結(jié)果顯示只有結(jié)合了鴉膽子苦素D的磁珠經(jīng)洗脫后能檢測(cè)到β-catenin的表達(dá)。考察鴉膽子苦素D對(duì)肝癌腫瘤干細(xì)胞活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鴉膽子苦素D具有潛在的抗肝癌腫瘤干細(xì)胞活性。

本發(fā)明人進(jìn)行了鴉膽子苦素D的體內(nèi)抗腫瘤活性研究，用肝細(xì)胞癌皮下腫瘤模型評(píng)估了鴉膽子苦素D對(duì)裸鼠皮下Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中劑量組1.5mg/kg與對(duì)照組相比顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制率為50％(p<0.001),且給藥組體重與對(duì)照組比較無明顯變化。而高劑量組3mg/kg由于具有一定毒性，使個(gè)別裸鼠體重有下降趨勢(shì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鴉膽子苦素D的抗腫瘤機(jī)制，我們分別取三只獨(dú)立的對(duì)照組和給藥組裸鼠皮下的腫瘤組織分別用免疫組化和蛋白免疫印跡方法檢測(cè)了notch及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果表明，經(jīng)鴉膽子苦素D治療后的腫瘤組織中jagged1，cyclinD1和survivin的表達(dá)量顯著降低。上述體內(nèi)結(jié)果與體外細(xì)胞水平結(jié)果再一次驗(yàn)證了鴉膽子苦素D的抗肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制，因此在細(xì)胞水平和體內(nèi)水平同時(shí)證實(shí)了鴉膽子苦素D是通過抑制wnt和notch信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

本發(fā)明人用斑馬魚模型評(píng)價(jià)化合物鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100μM鴉膽子苦素D在不引起斑馬魚死亡的條件下可以觀察到Wnt信號(hào)通路抑制后所引起的體軸發(fā)育異常。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鴉膽子苦素D能用于制備預(yù)防/治療肝癌藥物。

鴉膽子苦素D能用于制備抑制wnt和notch信號(hào)通路預(yù)防/治療肝癌藥物。

本發(fā)明所述藥物為由鴉膽子苦素D為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。

本發(fā)明所述藥物組合物為口服制劑、注射劑或皮膚給藥制劑。

本發(fā)明揭示了鴉膽子苦素D的體內(nèi)外抗腫瘤活性，首次公開鴉膽子苦素D對(duì)wnt和notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的影響，驗(yàn)證了wnt和notch信號(hào)通路在肝癌中的重要作用，闡述了兩通路之間的內(nèi)在關(guān)系，提供鴉膽子苦素D在制備預(yù)防/治療肝癌藥物的新用途，為臨床提供新的預(yù)防/治療肝癌藥物，有很大的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1實(shí)施例1左上圖表示鴉膽子苦素D(0-10μM)濃度范圍內(nèi)對(duì)正常肝細(xì)胞系7701及兩株肝癌細(xì)胞系huh7和hep3B增殖抑制作用，其中圓圈代表正常細(xì)胞7701，正方形代表肝癌細(xì)胞系huh7，三角形代表肝癌細(xì)胞系hep3B；右上圖表示24h,48h,72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)鴉膽子苦素D(0-20μM)濃度范圍內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞系hep3B增殖抑制作用，其中圓圈代表24h，正方形代表48h，三角形代表72h；左下圖表示經(jīng)(0.5-1μM)鴉膽子苦素D處理24h后的肝細(xì)胞癌細(xì)胞huh7與對(duì)照組(DMSO)比較克隆形成能力明顯降低，左起第一皿表示DMSO對(duì)照，第二皿表示0.5μM鴉膽子苦素D處理，第三皿表示1μM鴉膽子苦素D處理；右下圖表示經(jīng)(0.25-0.5μM)鴉膽子苦素D處理24h后的肝細(xì)胞癌細(xì)胞Hep3B與對(duì)照組(DMSO)比較克隆形成能力明顯降低，左起第一皿表示DMSO對(duì)照，第二皿表示0.25μM鴉膽子苦素D處理，第三皿表示0.5μM鴉膽子苦素D處理。

圖2實(shí)施例1鴉膽子苦素D濃度依賴性的促進(jìn)肝癌細(xì)胞系凋亡。流式凋亡圖中上右區(qū)代表晚期凋亡，下右區(qū)為早期凋亡，一般用這兩個(gè)象限之和代表凋亡細(xì)胞總數(shù)，柱形圖為根據(jù)凋亡細(xì)胞數(shù)做的圖*表示t檢驗(yàn)時(shí)，P值<0.1,**表示t檢驗(yàn)時(shí)，P值<0.05,***表示t檢驗(yàn)時(shí)，P值<0.01

圖3實(shí)施例1左上圖和右上圖表示鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌酶組nicastrin,presenilin1,presenilin2蛋白表達(dá)量沒有影響，其中第一行表示nicastrin蛋白表達(dá)量，第二行表示presenilin1蛋白表達(dá)量，第三行表示presenilin2蛋白表達(dá)量；中圖表示western方法檢測(cè)鴉膽子苦素D(100nM-200nM)條件下對(duì)γ-分泌酶活性沒有影響；下圖表示酶標(biāo)儀檢測(cè)鴉膽子苦素D(100nM-200nM)條件下對(duì)γ-分泌酶活性沒有影響。

圖4實(shí)施例1鴉膽子苦素D對(duì)notch信號(hào)通路的影響。左圖表示鴉膽子苦素D處理huh7細(xì)胞，左圖第一列表示DMSO對(duì)照，第二列表示0.5μM鴉膽子苦素D處理，第三列表示1μM鴉膽子苦素D處理，左圖第一行表示jagged 1蛋白的表達(dá)，第二 行表示Notch1蛋白的表達(dá)，第三行表示notch2蛋白的表達(dá)，第四行表示notch3蛋白的表達(dá)，第五行表示NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)蛋白的表達(dá)，第六行表示HES1蛋白的表達(dá)，第七行表示caspase9蛋白的表達(dá)，第八行表示PARP蛋白的表達(dá)，第九行表示參比GAPDH蛋白的表達(dá)。左圖表示鴉膽子苦素D處理Hep3B細(xì)胞，左圖第一列表示DMSO對(duì)照，第二列表示0.5μM鴉膽子苦素D處理，第三列表示1μM鴉膽子苦素D處理，左圖第一行表示jagged 1蛋白的表達(dá)，第二行表示Notch1蛋白的表達(dá)，第三行表示notch2蛋白的表達(dá)，第四行表示notch3蛋白的表達(dá)，第五行表示NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)蛋白的表達(dá)，第六行表示HES1蛋白的表達(dá)，第七行表示caspase9蛋白的表達(dá)，第八行表示PARP蛋白的表達(dá)，第九行表示參比GAPDH蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，鴉膽子苦素D(0.5μM-1μM)下調(diào)huh7和Hep3B細(xì)胞中jagged1、NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)、HES1、caspase9、PARP蛋白的表達(dá)，對(duì)Notch1,notch2,notch3的表達(dá)沒有影響。其中，第一行

圖5鴉膽子類似物對(duì)Notch信號(hào)通路jagged1表達(dá)的影響

圖6過表達(dá)和干擾jagged1后鴉膽子苦素D對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

左圖表示干擾jagged1對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制增殖促進(jìn)凋亡的作用；右圖表示過表達(dá)jagged1可以保護(hù)鴉膽子苦素D對(duì)腫瘤細(xì)胞的傷害。左右圖均使用Huh7細(xì)胞。

圖7鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路的作用及wnt與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系

左上圖表示TOP-flash實(shí)驗(yàn)結(jié)果。肝癌細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染含β-catenin/Tcf結(jié)合位點(diǎn)(TOP-flash)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因、突變的β-catenin/Tcf結(jié)合位點(diǎn)(FOP-flash)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因和海腎熒光素酶(Renilla luciferase)基因后經(jīng)不同濃度的鴉膽子苦素D處理24小時(shí)。結(jié)果證實(shí)鴉膽子苦素D可以抑制wnt通路下游β-catenin/Tcf4轉(zhuǎn)錄水平。

右上圖表示用免疫印跡方法證明鴉膽子苦素D對(duì)Wnt通路相關(guān)蛋白c-Myc，cyclinD1，survivin具有抑制作用而對(duì)β-catenin和Tcf4的蛋白表達(dá)沒有影響

左下圖表示用RT-PCR的方法檢測(cè)到鴉膽子苦素D對(duì)wnt通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(Huh7 細(xì)胞)

右下圖表示用RT-PCR的方法檢測(cè)到鴉膽子苦素D對(duì)wnt通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(Hep3B細(xì)胞)

圖8鴉膽子苦素D抑制β-catenin的入核

在正常情況下細(xì)胞中β-catenin的量很少，大部分會(huì)被胞漿中蛋白酶體降解途徑降解而不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核中。腫瘤細(xì)胞中如肝癌細(xì)胞中的β-catenin是過量表達(dá)的，過量的β-catenin就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核中與核中的轉(zhuǎn)錄因子如Tcf4等結(jié)合啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

左上圖表示用免疫印跡方法考察經(jīng)鴉膽子苦素D處理Huh7細(xì)胞24h后提取胞漿蛋白，發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D對(duì)胞漿蛋白中β-catenin表達(dá)沒有影響。

右上圖表示用免疫印跡方法考察經(jīng)鴉膽子苦素D處理Huh7細(xì)胞24h后提取細(xì)胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D顯著下調(diào)了核蛋白中β-catenin的表達(dá)。

下圖表示用免疫熒光的方法再次驗(yàn)證了鴉膽子苦素D可以抑制β-catenin的入核。

圖9鴉膽子苦素D體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

左上圖表示鴉膽子苦素D對(duì)裸鼠皮下肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Huh7細(xì)胞)皮下腫瘤接種模型的生長(zhǎng)抑制作用。上方曲線表示對(duì)照組；下方曲線表示1.5mg/kg鴉膽子苦素D尾靜脈給藥組。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，鴉膽子苦素D可顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞Huh7的體內(nèi)成瘤能力。

右上圖表示鴉膽子苦素D給藥對(duì)裸鼠體重沒有明顯影響。

左下圖表示蛋白免疫印跡方法檢測(cè)對(duì)照組和給藥組裸鼠皮下的腫瘤組織Notch及wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果表明，經(jīng)鴉膽子苦素D治療后的腫瘤組織中jagged1，cyclinD1和survivin的表達(dá)量顯著降低。

右下圖表示用免疫組化方法檢測(cè)對(duì)照組和給藥組裸鼠皮下的腫瘤組織Notch及wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果表明，經(jīng)鴉膽子苦素D治療后的腫瘤組織中jagged1，cyclinD1和survivin的表達(dá)量顯著降低。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例所用試劑和材料通過市售得到。

實(shí)施例1 鴉膽子苦素D的體外抗腫瘤活性及其機(jī)制研究

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞系Huh7,Hep3B及人正常肝細(xì)胞系QSG7701均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

(二)藥品和試劑

鴉膽子苦素D化合物購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司

(三)主要儀器

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)方法

1、細(xì)胞的傳代

(1)當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至90％左右即可傳代，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，洗去培養(yǎng)基中的血清成分；

(2)加入適當(dāng)體積的胰酶，放入孵箱中數(shù)分鐘，待細(xì)胞開始從培養(yǎng)皿上脫落時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化，一般加入的完全培養(yǎng)基的體積是胰酶體積的2倍；

(3)輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞吹散成單細(xì)胞懸液后，1000rpm離心5min；

(4)棄去上清，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2-1:3將細(xì)胞接種到新培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2、細(xì)胞的凍存

(1)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％左右時(shí)，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化，離心；

(2)去掉上層培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀加入1ml凍存液(900μl完全培養(yǎng)基+100μl DMSO)于凍存管中，立刻放入預(yù)冷的程序凍存盒中，于-80℃冰箱保存過夜，第二天移到液氮中可長(zhǎng)期保存。

3、細(xì)胞的計(jì)數(shù)：

(1)將用酒精清洗過的計(jì)數(shù)板和蓋玻片，吹干后備用；

(2)細(xì)胞消化離心后，用新鮮培養(yǎng)基重懸，按一定比例稀釋細(xì)胞懸液；

(3)將細(xì)胞懸液吹打均勻后，取10μl輕輕加到計(jì)數(shù)板蓋玻片的一側(cè)，避免產(chǎn)生氣泡；

(4)用10×物鏡觀察四大方格中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)；

(5)細(xì)胞數(shù)/ml＝(四個(gè)方格中的細(xì)胞數(shù)的平均值)×10⁴/ml。

4、細(xì)胞的復(fù)蘇

(1)從液氮中取出凍存的細(xì)胞后立刻于37℃水浴鍋中不斷搖晃使之快速融化；

(2)待凍存管中的細(xì)胞融化后，用75％的酒精噴洗凍存管，將融化的凍存細(xì)胞加入到5ml 37℃預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基中，輕輕吹打均勻；

(3)1000rpm離心5min之后盡可能的吸去舊培養(yǎng)基，用新鮮的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，接種于10cm新培養(yǎng)皿中，于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天更換培養(yǎng)基去除死細(xì)胞和DMSO(二甲基亞砜)成分。

(二)Notch信號(hào)通路抑制劑篩選

1、實(shí)驗(yàn)原理

螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)可以催化熒光素(luciferin)氧化成oxyluciferin，在熒光素氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。螢火蟲熒光素酶也稱為發(fā)光酶，是催化生物發(fā)光的酶系的總稱。熒光素酶(Firefly luciferase)催化的氧化過程中釋放的生物熒光(bioluminescence) 可以通過熒光酶標(biāo)儀測(cè)定。所要檢測(cè)的基因就可以通過熒光素酶(Firefly luciferase)和其底物(luciferin)這一生物發(fā)光體系被靈敏、高效地表達(dá)出來。在實(shí)際研究中firefly luciferase的上游常?？寺∫恍┧芯康幕蜣D(zhuǎn)錄的調(diào)控元件。報(bào)告基因質(zhì)粒就是這樣構(gòu)建的。利用這種構(gòu)建好的報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染特定研究的細(xì)胞，然后加入藥物或干預(yù)因素處理適當(dāng)時(shí)間后將細(xì)胞裂解。通過酶標(biāo)儀測(cè)定裂解液中的熒光值反應(yīng)熒光素酶的活性。藥物對(duì)所研究的基因的影響即可通過熒光素酶活性的高低進(jìn)行評(píng)價(jià)。Rinilla luciferase(海腎熒光素酶基因)通常作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，用來消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率造成的差異。螢火蟲熒光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)HEK293細(xì)胞系最適puromycin濃度的篩選

1.1第1d(天)，將HEK293細(xì)胞加入24孔板；

1.2第2d，配制puromycin(嘌呤霉素)(sigma，Cat#P8833)母液1mg/ml。待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至80％時(shí)，將puromycin按照0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/ml的工作濃度加入到細(xì)胞中；

1.3第3-6d觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：從第4d開始，加入puromycin的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；在第6d，puromycin的2-10μg/ml濃度組的細(xì)胞全部死亡。據(jù)此得出結(jié)論2μg/ml的puromycin是最低劑量篩選濃度。鑒于后期實(shí)驗(yàn)需要，選取6μg/ml的puromycin為最終陽性細(xì)胞篩選濃度。

(2)穩(wěn)定表達(dá)調(diào)控型Luciferase(熒光素酶)293細(xì)胞系的篩選

說明：由于訂購(gòu)Qiagen的CLS-014L試劑盒，沒有熒光報(bào)告基因，所以不適合做最佳MOI的篩選，只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇最佳MOI；為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，實(shí)驗(yàn)室分別構(gòu)建了表達(dá)CMV-Luciferase(熒光素酶)陽性和CMV-TRAIL的陰性慢病毒，用于下游的熒光檢測(cè)。

2.1第1d，接種細(xì)胞于25cm的培養(yǎng)瓶中；

2.2第2d，觀察細(xì)胞長(zhǎng)至60％左右，換新鮮培養(yǎng)基，每瓶分別加入100μl的lentivirus(CLS-014L)(慢病毒)、50MOI的CMV-Luciferase lentivirus(表達(dá)熒光素酶的慢病毒)和CMV-TRAIL lentivirus(慢病毒)；

2.3第3天，繼續(xù)培養(yǎng)；第4天，換含有6μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

2.4每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。約3-6d后，未整合puromycin的細(xì)胞大量死亡，同時(shí)在培養(yǎng)瓶底零星出現(xiàn)單克隆細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3-4d，若單克隆能夠生長(zhǎng)，則用吸管吸取克隆團(tuán)，輕輕吹打混勻，按照極限稀釋法，置于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，并標(biāo)記克隆號(hào)；

2.5待單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，轉(zhuǎn)移至25cm培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；每個(gè)單克隆細(xì)胞凍存3支以上，剩余細(xì)胞進(jìn)行下游luciferase檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；

(三)細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK8法)

1、接種細(xì)胞及加藥

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系或人正常肝細(xì)胞系制成7×10⁴cells/ml的混懸液。

(1)取96孔板，每孔加100μl細(xì)胞混懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

(2)設(shè)以下實(shí)驗(yàn)組:

空白組：培養(yǎng)基、CCK8、DMSO(二甲基亞砜)；

對(duì)照組：含細(xì)胞培養(yǎng)基、CCK8、DMSO；

給藥組：含細(xì)胞培養(yǎng)基、CCK8、DMSO、鴉膽子苦素D濃度梯度為：0，0.1，0.2，0.5，1，2.5，5，10(μM)。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

將加好樣的細(xì)胞培養(yǎng)板放置于5％CO₂，37℃恒溫孵育24h，48h或72h。

3、比色

每孔中加入10μl CCK-8培養(yǎng)1-2小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光值(吸光度范圍控制在1.5左右為宜)，以百分比計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率＝[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100％

分別以細(xì)胞增殖率和細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，各給藥劑量為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

(四)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)原理

不同細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中存活率是不一樣的，細(xì)胞接種存活率可以反應(yīng)貼壁的細(xì)胞數(shù)多少。然而貼壁的細(xì)胞不代表都能存活并形成克隆。我們將可以形成克隆的貼壁細(xì)胞稱為有增殖能力的細(xì)胞。不同細(xì)胞由于自身特性不同，增殖能力也不盡相同。細(xì)胞增殖能力和群體依賴性可以用克隆形成率表示。一般情況下，傳代細(xì)胞系的克隆形成率大于原代細(xì)胞克隆形成率；腫瘤細(xì)胞的克隆形成率大于正常細(xì)胞克隆形成率。另外，克隆形成率的大小還與接種的細(xì)胞密度有關(guān)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞一定要是分散的單細(xì)胞，持續(xù)培養(yǎng)至少一周時(shí)間，期間要隨時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞形成克隆時(shí)可以終止培養(yǎng)。

2、主要試劑

(1)用無菌雙蒸水分別配置1.2％和0.7％兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖溶液。注意：該溶液高壓滅菌后保持溶液溫度在40℃左右防止凝固；

(2)0.25％胰蛋白酶；

(3)20％胎牛血清的培養(yǎng)基。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化成為單細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀；

(2)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，用20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；

(3)將1.2％的瓊脂糖溶液和20％胎牛血清完全培養(yǎng)基按1:1比例混合均勻后，取3mL該混合培養(yǎng)液于6孔板中，放于超凈臺(tái)中使其冷卻凝固；

(4)將0.7％的瓊脂糖溶液和20％胎牛血清完全培養(yǎng)基按1:1比例混合均勻后，再向其中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，使最終細(xì)胞密度為1000個(gè)/孔。充分混合均勻后加入到凝固好的含1.2％瓊脂糖培養(yǎng)基中，超凈臺(tái)中冷卻至凝固形成雙瓊脂層。于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～14天。

(5)將培養(yǎng)皿置于顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，1個(gè)克隆數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)克隆形成率，拍照。

集落數(shù)＝n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n

克隆形成率＝(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))100％

(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：根據(jù)集落數(shù)和克隆形成率進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析不同組別之間的差異。

(五)細(xì)胞凋亡測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在正常情況下，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期時(shí)，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)就會(huì)由脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V(膜聯(lián)蛋白V)屬于Ca²⁺依賴型的磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸具有非常高的親和力。因此可以與發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞上的細(xì)胞膜暴露的磷脂酰絲氨酸特異性的結(jié)合。所以Annexin V成為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡常用蛋白。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中常常用熒光素EGFP和FITC將Annexin V進(jìn)行標(biāo)記。這樣標(biāo)記了的Annexin V就可以作為熒光探針存在于處理的細(xì)胞中，然后可以利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。在凋亡實(shí)驗(yàn)中還有一種常用的核酸染料即碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)(碘化丙啶)。該染料可以特異性地透過凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜使細(xì)胞核染上紅色，而對(duì)正常細(xì)胞完整的細(xì)胞膜沒有影響。因此在評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡時(shí)期實(shí)驗(yàn)中常常將Annexin V與PI兩種染料結(jié)合使用。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

人肝癌細(xì)胞系Huh7及Hep3B經(jīng)過不同濃度的鴉膽子苦素D處理24小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，按凋亡試劑盒使用說明書進(jìn)行試驗(yàn)。使用冷卻好的buffer(具體中文緩沖劑名稱)000rpm條件下離心5min。將洗滌的細(xì)胞重懸于500ul buffer 中，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10⁵cells/ml,立即加入5μl的Annexin V和propidium iodide(PI)染料染色，于4℃條件下避光孵育10min。最后將處理好的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析凋亡情況。

(六)γ-分泌酶活性檢測(cè)

γ-分泌酶(γ-secretase)是一種復(fù)雜的由多個(gè)亞基組成的復(fù)合體，可以水解多種跨膜蛋白，作為Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶，γ-分泌酶水解Notch信號(hào)通路的受體后釋放出活性形式的NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)來發(fā)揮作用。γ-分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor,GSI)最初被用來治療阿爾茨海默病。近年來研究表明GSI對(duì)多種惡性腫瘤具有明顯的抗腫瘤作用，如黑色素瘤、大腸癌、隨母細(xì)胞瘤等。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)GSI對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系并無增殖抑制作用，而鴉膽子苦素D作為潛在的Notch信號(hào)通路抑制具有很好的抗肝癌活性，鴉膽子苦素D是否影響Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶γ-分泌酶活性，我們用三種方法考察了鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌酶活性的影響。

1、提取膜蛋白：

(1)準(zhǔn)備試劑：按照碧云天膜蛋白提取試劑盒P0033說明書，室溫條件下將膜蛋白抽提試劑A和B融解混勻后分裝。取適量的膜蛋白抽提試劑A和B于冰浴上備用，臨用前加入PMSF。

(2)收集細(xì)胞：將處理好的細(xì)胞2-5×10⁷用預(yù)冷的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖液洗滌三遍，洗掉培養(yǎng)基中的成分。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后離心，盡可能地吸去PBS上清液。注意不要使用胰酶將細(xì)胞消化下來而是用刮刀，因?yàn)橐让笇?duì)膜蛋白有破壞作用。

(3)洗滌細(xì)胞：取一定量的預(yù)冷過的PBS將細(xì)胞沉淀小心重懸起。將細(xì)胞在4℃，600g條件下離心5分鐘，棄掉上清。在同樣條件下再離心1分鐘，這次離心的目的是將管壁上可能殘留液體離下來并進(jìn)一步沉淀細(xì)胞。最后，盡可能地吸去上清液。

(4)細(xì)胞預(yù)處理：在洗滌好的細(xì)胞沉淀中用1ml加入含有PMSF(苯甲基磺酰氟化物)的膜蛋白抽提試劑A，輕輕并充分懸浮細(xì)胞，冰上反應(yīng)10-15分鐘。

(5)細(xì)胞的破碎：采用凍融發(fā)將上述樣品在-80℃和室溫交替進(jìn)行五次，達(dá)到反復(fù)凍融充分破碎細(xì)胞的效果。

(6)去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞：將上述樣品于4℃700g離心10分鐘，輕輕吸出上清液于新的離心管中。注意一定不要接觸到沉淀，甚至可以有少量的上清液殘留。

(7)沉淀細(xì)胞膜碎片：要想沉淀細(xì)胞膜碎片則需要更高的轉(zhuǎn)速通常在4℃，14000g條件下離心30分鐘。

(8)收集細(xì)胞漿蛋白：離心后得到的上清即為細(xì)胞漿蛋白，可保存在-80℃冰箱備用。

(9)抽提膜蛋白：再在4℃14000g的條件下離心10秒，以更好的沉淀膜蛋白。注意要盡可能的吸掉上清液即胞漿蛋白來保證膜蛋白的純度。根據(jù)膜蛋白沉淀的量加入適量的膜蛋白抽提試劑B，用最高速劇烈渦旋震蕩10秒是沉淀重新懸起來，冰浴5-10分鐘。重復(fù)這一步驟渦旋冰浴3次。最后在4℃14000g條件下離心5分鐘，得到的上清即為所要的細(xì)胞膜蛋白溶液。

2、內(nèi)源性γ-分泌酶活力檢測(cè)

(1)實(shí)驗(yàn)原理：

T-ERx-HeLa-N100細(xì)胞是在人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞上穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)四環(huán)素阻遏蛋白、N100-GV以及熒光素酶luciferase幾個(gè)質(zhì)粒后構(gòu)建的細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以利用四環(huán)素誘導(dǎo)與否實(shí)現(xiàn)對(duì)某一蛋白的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)具有熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，可報(bào)告某一基因的表達(dá)情況，N100為來自人源的notch跨膜區(qū)附近的氨基酸，是γ-分泌酶的直接底物。其設(shè)計(jì)的具體原理如下：細(xì)胞表達(dá)的四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合在N100-GV基因的啟動(dòng)子上，抑制后者的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)加入四環(huán)素后，細(xì)胞可利用四環(huán)素，四環(huán)素與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合，是四環(huán)素阻遏蛋白從啟動(dòng)子上脫落，從而N100-GV基因得到表達(dá)。GV即Gal4-VP16，是一段上游激活序列，融合于N100上，N100被細(xì)胞內(nèi)源的γ-分泌酶剪切后，產(chǎn)生的NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)-GV進(jìn)入細(xì)胞核，激活熒光素酶luciferase的表達(dá)。細(xì)胞被裂解后，luciferase釋放出來，當(dāng)加入底物熒光素，酶就會(huì)催化熒光素發(fā)生氧化還原反應(yīng)，該反應(yīng)可以發(fā)出生物熒光，利用酶標(biāo)儀可以測(cè)得發(fā)光強(qiáng)度，數(shù)值大小與細(xì)胞內(nèi)源γ-分泌酶活力成正比。

(2)實(shí)驗(yàn)步驟：

2.2.1 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)：DMEM+10％FBS+1％雙抗+5μg/ml Blasticidin S(殺稻瘟菌素)

2.2.2以2×10⁵個(gè)HeLa細(xì)胞/孔接種于24孔板中，24小時(shí)后，細(xì)胞匯合度達(dá)到約80％左右時(shí)，用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑將pGL4.31[luc2p/GAL4UAS/Hygro]和pcDNA4/TO-N100-GV質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，同時(shí)加入四環(huán)素(0.5μg/ml),24小時(shí)后分別加入不同濃度的DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)和鴉膽子苦素D化合物。每塊板均含有對(duì)照組包括：僅轉(zhuǎn)染pGL4.31[luc2p/GAL4UAS/Hygro]組，不加四環(huán)素誘導(dǎo)組，DMSO處理組。每組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。24小時(shí)后吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl裂解液，室溫孵育5分鐘，吸取其中90μl裂解液于黑色不透光的96孔板中然后加入90μl熒光素酶底物。輕輕混合均勻后用酶標(biāo)儀讀取發(fā)光值。

3、內(nèi)源性γ-分泌酶活力檢測(cè)(免疫印跡法)

(1)實(shí)驗(yàn)原理

293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染γ-分泌酶的直接底物Notch1NEXT后，如果γ-分泌酶的活性受到抑制，notch1NEXT的直接產(chǎn)物NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)(Notch細(xì)胞內(nèi)片段)的量就會(huì)增多，用免疫印跡的方法檢測(cè)NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)的表達(dá)量來評(píng)價(jià)γ-分泌酶的活性。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

a、將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞以2×10⁵個(gè)/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被過的12孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1ml。

b、輕搖培養(yǎng)板，是細(xì)胞分散均勻后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

c、待細(xì)胞貼壁后密度接近80％左右時(shí)用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑將Notch 0Epc3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，pcDNA3作為空白對(duì)照。

d、24小時(shí)后換液加入不同濃度的DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)和鴉膽子苦素D處理，DMSO作為陰性對(duì)照。

e、24小時(shí)后加入裂解液，用免疫印跡的方法檢測(cè)NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)的表達(dá)量。

(七)Western Blot(蛋白免疫印跡)方法檢測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)Notch信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響

1、實(shí)驗(yàn)原理：

Western blot屬于印跡法的一種，印跡法(blotting)指的是先將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后利用相應(yīng)的反應(yīng)手段來檢測(cè)樣品的方法。二十世紀(jì)70年代名叫Southern的研究者首次將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA雜交技術(shù)成功檢測(cè)了特定的DNA片段，因此該法命名為Southern印跡法。Western印跡法則是用來檢測(cè)蛋白分子并可以對(duì)蛋白進(jìn)行半定量的方法。基本原理為在電場(chǎng)的作用下首先將蛋白按分子量的不同分布在SDS-PAGE凝膠上，然后再在電場(chǎng)的作用下將其轉(zhuǎn)移到固相載體(NC膜，PVDF膜)上。固相載體和蛋白分子以非共價(jià)鍵形式結(jié)合，然后以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，加入所要研究蛋白的對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，再用酶或同位素標(biāo)記過的二抗與一抗特異地反應(yīng)，最后通過顯色反應(yīng)來檢測(cè)反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)情況。

2、實(shí)驗(yàn)方法

(1)溶液配制

10％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液

在45ml水中溶解5g電泳級(jí)SDS，加濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至50ml。

10％過硫酸銨(AP)

稱量0.1g AP溶于1ml水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

10×Tris緩沖鹽溶液(TBS中文沒有，提供供應(yīng)商)

87.68g NaCl,121.12gTris堿溶解于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1×電泳緩沖液

準(zhǔn)確稱取3.02g Tris堿，18.8g glycine，1g SDS中文加水溶解定容至1L，室溫保存。

1×電轉(zhuǎn)緩沖液

準(zhǔn)確稱取3.03gTris堿和14.4g glycine，加入200ml甲醇后加水溶解定容至1L，4℃保存。

1M Tris-HCl(pH 6.8)

稱取121.1g Tris，加800ml水充分?jǐn)嚢枞芙猓肏Cl調(diào)節(jié)pH至6.8，再加水定容至1L，于室溫保存。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)

稱取181.7g Tris，加800ml水充分?jǐn)嚢枞芙猓肏Cl調(diào)節(jié)PH至8.8，再加水定容至1L，于室溫保存。

2×TBS緩沖液(三羥甲基氨基甲烷緩沖液)

稱取24.2gTris和14.4g NaCl加入1L水中，用HCl調(diào)pH至7.6。

TBST緩沖液(蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))即WESTERN BLOT中常用的一種緩沖溶液,其中含有Tris-Hcl,NaCl,tween20這三種物質(zhì))

1000ml 1×TBS中文中加入1ml吐溫20,混勻后室溫保存。

封閉緩沖液

稱2.5g脫脂奶粉加入到50ml TBS Buffer中，再加入200μl 10％疊氮鈉，溶解后于4℃保存一周內(nèi)使用。

抗體稀釋液

同封閉緩沖液。

30％Acrylamide(丙烯酰胺)

150g丙烯酰胺，4gN、N-亞甲基丙烯酰胺，混均加雙蒸水，37℃溶解，定溶500ML。

最后用0.2μM的濾紙過濾后于4℃棕色瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE濃縮膠(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)(5％Acrylamide)

表1-1SDS-PAGE 5％濃縮膠配方表

SDS-PAGE分離膠(10％Acrylamide)

表1-2SDS-PAGE 10％分離膠配方表

Western細(xì)胞裂解液20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1％Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)X-100，以及sodium pyrophosphate(焦磷酸鈉)，β-glycerophosphate(磷酸甘油)，EDTA(乙二胺四乙酸)，Na₃VO₄(釩酸鈉)，leupeptin(亮肽酶素)多種抑制劑。

(2)蛋白樣品制備

a、取2×10⁵個(gè)Huh7或者Hep3B細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，加入藥物濃度梯度為(1，2μM)作用24h，同時(shí)設(shè)置空白組給予等量DMSO。

b、吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍后，每孔加入50μl細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮將細(xì)胞收集于離心管中于冰上裂解30min，12000r/min，4℃離心30min，取上清40μl，再加入8μl 6×loading buffer,煮沸5min后12000r/min，4℃離心2min。另外，取剩余部分蛋白上清用于蛋白含量測(cè)定。細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)jagged1、NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)、Notch1、Notch2、Notch3、Hes1、PARP、Caspase9、c-Myc、survivin、cyclinD1、β-catenin、Tcf4的影響。

(3)蛋白定量

Bradford法蛋白定量

該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)定量是相當(dāng)精確的，特別是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污劑的濃度超過0.2％則影響定量結(jié)果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

1)Bradford染液配制：(考馬斯亮藍(lán)：95％的乙醇：濃磷酸：雙蒸水)以(2:1:2：4)的比例溶解后于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)作標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，例如進(jìn)行抗體定量，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)將待測(cè)樣本溶于100μl緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同；

4)按1：5用雙蒸水稀釋濃染料結(jié)合溶液，過濾離心沉淀物；

5)每個(gè)樣本加5μl稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5-30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，即可在595nm光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顏色反應(yīng)不得超過30min；

6)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。

紫外分光光度檢測(cè)法

蛋白質(zhì)紫外光吸光率是所有的蛋白質(zhì)定量方法中最快的方法。通常在280nm光波長(zhǎng)下讀數(shù)。其在280nm光波長(zhǎng)下的最大吸光率主要處決于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波長(zhǎng)的吸收也常用到。其在205nm光波長(zhǎng)下的最大吸光率主要處決于肽鏈，盡管氨基酸也有影響。另外，一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，樣本不會(huì)遭到損害。

BCA(2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉)法蛋白定量

按照試劑盒說明書，BSA(牛血清白蛋白)配成0.5mg/ml，將A液與B液按照50:1混合混勻后得到工作液。

按下表繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

樣品濃度測(cè)定：96孔板放于冰上，每孔加入2μl蛋白樣品，PBS補(bǔ)足到20μl。各孔加入200μl BCA工作液，于37℃孵育30min后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)562nm處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品最終濃度。

BCA法特點(diǎn)：

1)靈敏度高，最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到25μg/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5μg，待測(cè)樣品體積為1-20μl。

2)BCA工作液在檢測(cè)樣品的蛋白濃度時(shí)可以不受樣品中大部分化學(xué)物質(zhì)的影響。SDS、Triton X-100及Tween 20，60，80的濃度控制在5％以下即可。

3)在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

4)檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。

5)螯合劑和還原劑對(duì)BCA溶液的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM

(4)SDS-PAGE電泳

配膠

配制10％分離膠、5％濃縮膠，4℃保存于保鮮膜內(nèi)備用

電泳

A上樣前先檢查玻璃板的安裝，保證不漏液。

B加入電泳液后，每孔中加入煮沸過的樣品(40-60μg)，為了保證蛋白條帶的美觀最好在樣品兩側(cè)的泳道加入等體積的1×loading buffer，最后在邊緣一側(cè)的泳道加入5μl Marker。

C先以80V進(jìn)行恒壓電泳，20min后改為120V恒壓電泳。

D當(dāng)溴酚藍(lán)跑到玻璃板下邊緣處即可結(jié)束電泳。

轉(zhuǎn)膜

A浸泡NC膜：用無水甲醇浸泡NC膜5min左右

B取膠：輕輕的將膠從玻璃板上卸下，保持膠的完整及濕潤(rùn)。保留所要研究蛋白的分子量范圍的膠，按海綿-三層濾紙-膠-PVDF(聚偏二氟乙烯)膜-濾紙-海綿的順序緊密排列，最后用玻璃棒趕走氣泡。

C電轉(zhuǎn)：將膜和膠分別對(duì)應(yīng)于電轉(zhuǎn)槽的正負(fù)極，加滿電轉(zhuǎn)液(含冰塊)于220mA恒流條件下根據(jù)分子量的大小電轉(zhuǎn)60-120min。注意蛋白分子量不同轉(zhuǎn)膜時(shí)間不同：分子量越大轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)。

封閉

封閉的目的是為了去除抗體與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景。將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，于封閉液(5％脫脂奶粉)中室溫緩慢搖晃封閉1h。

孵育一抗

將抗體按照推薦的比例用封閉液(5％脫脂奶粉)稀釋，4℃緩慢搖晃過夜。

一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜三次，每次5min，一抗回收后于4℃保存可重復(fù)利用。

孵育二抗

根據(jù)一種屬來源選擇相對(duì)應(yīng)的二抗，按(1:2000-1:5000)比例稀釋，室溫避光孵育1-2h。

二抗孵育結(jié)束后，回收的二抗于-20℃避光保存。TBST洗膜三次，每次5min。

掃膜

將洗過的NC膜保持濕潤(rùn)狀態(tài)，置于Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器中掃膜，用自帶軟件進(jìn)行灰度掃描分析。(軟件提供美國(guó)LICOR公司)

(八)RT-PCR方法檢測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)相關(guān)基因mRNA水平影響

1、實(shí)驗(yàn)原理

PCR技術(shù)(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該反應(yīng)需要在模板、引物、四種脫氧核苷酸及DNA聚合酶共同存在的條件下才能進(jìn)行。該反應(yīng)具有特異性，特異性由設(shè)計(jì)的引物序列決定。反應(yīng)分三步：

A、變性：利用加熱的方法破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)使氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；

B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻到一定的溫度，讓引物與模板很好地結(jié)合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg²⁺存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。

RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR(reverse transcription PCR)和實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，也叫反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此DNA為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：

a、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；

a、Rnase(RNA酶)水解活性：水解RNA雜合體中的RNA；

c、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.

(1)RNA抽提(細(xì)胞RNA的提取)

1)每組取約1*10⁶個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞消化離心后，去上清，按RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行(飛捷生物RNAfast200)。

2)在處理好的樣品管中，加入RA2液500μl，充分顛倒混勻10次，靜置1min。

3)將樣本裂解物全部吸入內(nèi)套管(已插在外套管中)離心1min。

4)取出內(nèi)套管，吸去外套管中的液體后放回內(nèi)套管，加入500μl洗液，離心1min。

5)重復(fù)1.4步驟再洗一次。

6)取出內(nèi)套管，吸去外套管中液體后放回內(nèi)套管，不加洗液，離心1min。

7)將內(nèi)套管移入新的1.5ml Buffer(離心管)，在膜中央加入洗脫液30μl。

8)室溫靜置1min后，離心1min，獲得總RNA

9)將獲取的RNA混勻后定量。

注：提取過程離心速度為12000rpm；操作過程中要避免RNA酶的污染。

(2)檢測(cè)所得RNA純度

定量檢測(cè)

取2μl提取的RNA樣品于Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)中，在Take3模塊下根據(jù)OD₂₆₀/OD₂₈₀的值確定RNA的含量和純度。當(dāng)R在1.9-2.1的范圍內(nèi)，說明提取的RNA符合實(shí)驗(yàn)要求；當(dāng)R<1.8，則表明樣品中有蛋白或其它有機(jī)物污染；當(dāng)R>2.2時(shí)，提示RNA發(fā)生了水解，應(yīng)當(dāng)舍棄。

(3)引物設(shè)計(jì)

采用Pubmed提供引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并利用blast網(wǎng)頁進(jìn)行同源性分析，優(yōu)選score值最高，Evalue值最低的設(shè)計(jì)引物，委托Invitrogen公司合成引物。

(4)mRNA測(cè)定所用引物序列

Jagged1引物序列：

上游引物，ACAAAGGGCACAGCGAGTG

下游引物，GGAGACTGGAAGACCGACAC

c-Myc引物序列：

上游引物，GCTGCTTAGACGCTGGATTT

下游引物，CGAGGTCATAGTTCCTGTTGG

Survivin引物序列：

上游引物，TAGTGTGGTGGTGCCCTATG

下游引物，CCAGTGTGATGATGGTGAGG

cyclinD1引物序列：

上游引物，CCTGTCCTACTACCGCCTCA

下游引物，TCCTCCTCTTCCTCCTCCTC

AXIN2引物序列：

上游引物，CCTGCCACCAAGACCTACAT

下游引物，TTTCCTCCATCACCGACTG

LEF1引物序列：

上游引物，CGAAGAGGAAGGCGATTTAG

下游引物，GAGAGGTTTGTGCTTGTCTGG

Oct4引物序列：

上游引物，CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA

下游引物，CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA

Sox2引物序列：

上游引物，AAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGGAG

下游引物，CAGCTGTCATTTGCTGTGGGTGATG

Nanog引物序列：

上游引物，AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG

下游引物，TGCGTCACACCATTGCTATTCTTC

Nestin引物序列：

上游引物，GGCGCACCTCAAGATGTCC

下游引物，CTTGGGGTCCTGAAAGCTG

Bmi-1引物序列：

上游引物，TCATCAGCCTCGATATTCCATCT

下游引物，TTCTGAATACAAGGTGCCCGG

GAPDH引物序列：

上游引物，CTCAGACACCATGGGGAAGGT

下游引物，TGATCTTGAGGCTGTTGTCATA

(5)合成DNA

A、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1)將DEPC(二乙基焦磷酰胺)處理過的PCR管放在冰上，分別加入

隨機(jī)引物(0.5μg/μl) 1μl

無RNA酶水 9ul

至總體積 12μl

輕輕充分混合均勻后，在3000rpm條件下離心30s。

2)將上述混合物于PCR儀上在70℃的條件下變性反應(yīng)5分鐘后，于冰上冷卻。

3)PCR管置冰上，依次加入

5×RT緩沖液 4μl

RNase inhibitor(20U/μl) 1μl

10mM dNTP Mix 2μl

輕輕充分混合均勻后，在3000rpm的條件下離心30s。

4)置PCR儀上25℃5分鐘。取出置冰上冷卻。

5)加入M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)1μl至終體積20μl。

6)于PCR儀中按照下面條件進(jìn)行反應(yīng)

25℃ 10分鐘

42℃ 60分鐘

70℃ 10分鐘

上述反應(yīng)結(jié)束后得到的是cDNA產(chǎn)物，立刻于冰上冷卻。也可于-20℃保存。

B、PCR擴(kuò)增

1)取200μIPCR管依次加入

在3000rpm的條件下離心30s。

2)按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：

(九)細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞核蛋白提取方法

(1)準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒(碧云天細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒P0027)中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻備用。分別根據(jù)細(xì)胞的量相應(yīng)的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑和細(xì)胞核蛋白抽提試劑，按比例加入PMSF(苯甲基磺酰氟)。其余試劑于-20℃保存。

(2)對(duì)于貼壁細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS洗兩遍細(xì)胞，洗掉培養(yǎng)基成分。徹底吸凈PBS后用刮刀刮下細(xì)胞。1000rpm條件下離心收集細(xì)胞沉淀部分。注意不要用胰酶消化細(xì)胞。

(3)細(xì)胞沉淀和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A按照1:10的比例加入。

(4)用最高的速度劇烈渦旋震蕩10-20s，讓細(xì)胞沉淀完全溶解在細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中。

(5)冰浴10-15分鐘。

(6)再加入10μl細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B。同樣用最大的速度劇烈渦旋震蕩5-10s，冰浴1分鐘。

(7)最高速劇烈Vortex 5秒，4℃12,000-16,000g離心5分鐘。

(8)得到的上清即為細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。吸取上清時(shí)為了保證細(xì)胞漿蛋白的純度要剩余少量上清不要吸到沉淀部分。

(9)沉淀部分要離心后盡可能的吸掉上清，根據(jù)沉淀部分的量加入適量的冰冷的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。

(10)用最高的速度劇烈渦旋震蕩20s，然后放回冰浴中2min。如此反復(fù)兩個(gè)過程15-20次達(dá)到充分將沉淀部分裂解的目的。

(11)4℃12,000-16,000g離心10分鐘。

(12)得到的上清部分即為細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍存。

(十)免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)原理：

免疫細(xì)胞化學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)顧名思義也是一種免疫反應(yīng)，離不開抗原抗體的反應(yīng)。首先需要將已知的抗體標(biāo)記上熒光素，利用這種帶熒光標(biāo)記的抗體作為探針與細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原反應(yīng)。熒光素受到特定激發(fā)波長(zhǎng)的光照射后會(huì)發(fā)出一定顏色的光。因此可以利用熒光共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡通過熒光的位置進(jìn)行定性和定量分析。免疫熒光化學(xué)的的優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)，可以在細(xì)胞水平進(jìn)行準(zhǔn)確的定位，因此在分子生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

2、實(shí)驗(yàn)方法

(1)固定

棄掉培養(yǎng)基，用PBS室溫洗滌三遍，每次5min。用4％多聚甲醛室溫固定20min。PBS漂洗三次，每次5min。

(2)打孔

用含0.5％Triton-X-100的PBS在室溫通透化處理15min,用PBS漂洗三次，每次5min。

(3)封閉

用含5％BSA的PBS室溫封閉1h,PBS漂洗三次，每次5min。

(4)孵一抗

加入β-catenin一抗(用1％BSA稀釋)4℃緩慢搖晃過夜。

(5)孵二抗

回收一抗，用PBS漂洗三次，每次5min,加入FITC標(biāo)記的二抗(用1％BSA稀釋)室溫緩慢搖晃孵育1h。

(6)染核

DAPI(1μg/ml)進(jìn)行核染15min,PBS漂洗后于熒光顯微鏡下觀察。

(十一)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1、實(shí)驗(yàn)原理

將外源的特定分子如DNA、RNA等導(dǎo)入到真核細(xì)胞中的技術(shù)稱為轉(zhuǎn)染技術(shù)。常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為兩種，即瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的外源DNA/RNA沒有整合到其染色體中，但在細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)入多個(gè)拷貝，因此可以實(shí)現(xiàn)特定基因高表達(dá)的目的。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)是所需時(shí)間短，一般48h即可成功轉(zhuǎn)染進(jìn)行后續(xù)研究。缺點(diǎn)是這種轉(zhuǎn)染效果只可保持幾天，隨著細(xì)胞的不斷增殖復(fù)制會(huì)逐漸丟失。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源基因被整合到真核細(xì)胞的基因組中。外源基因成為細(xì)胞基因的一部分隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制。因此可以得到永久性表達(dá)某種基因的細(xì)胞 系。然而要想得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系需要長(zhǎng)時(shí)間的篩選過程。其中常用的方法是將外源基因與抗生素抗性基因共同轉(zhuǎn)染到基因組中。這樣就可以利用相應(yīng)的抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染特定基因的細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染效率的影響因素主要有：

A、轉(zhuǎn)染試劑：每種轉(zhuǎn)染試劑的說明書上都會(huì)標(biāo)明已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的參考文獻(xiàn)。因此在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前應(yīng)根據(jù)需要選擇最適合的高效并且低毒轉(zhuǎn)染試劑。

B、細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞代數(shù)在50代以下，且處于指數(shù)生長(zhǎng)期。因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)越旺盛最容易成功轉(zhuǎn)染。除此之外細(xì)胞密度也與轉(zhuǎn)染效率有著很大的關(guān)系。因此在選用新的轉(zhuǎn)染試劑或細(xì)胞系時(shí)，首先要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

C、血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，但血清的存在會(huì)影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，因此在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)要用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑。

D、抗生素：細(xì)胞培養(yǎng)過程中通常要添加抗生素來防止細(xì)菌造成的污染。但有些轉(zhuǎn)染試劑會(huì)增加細(xì)胞的通透性，這樣抗生素就可以進(jìn)入細(xì)胞，造成一定的細(xì)胞毒性。

E、DNA質(zhì)量：DNA質(zhì)量的好壞也是能否成功轉(zhuǎn)染的決定因素。首先要保證DNA的濃度，高濃度的DNA比低濃度的DNA轉(zhuǎn)染效率高。另外要保證DNA的純度。鹽離子，蛋白，內(nèi)毒素，脂多糖分子等的污染都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)LB培養(yǎng)基的配置：

稱取蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化鈉10g，用去離子水溶解定容至1L，調(diào)PH至7.0，高壓滅菌后待冷卻至室溫加入1ml 1000×Amp后，4℃保存?zhèn)洹?/p>

(2)1000×抗生素配置：

稱取50mg氨芐青霉素，用1ml去離子水溶解后過濾(0.2μM)配成濃度為50mg/ml的儲(chǔ)備液分裝備用。

(3)菌液擴(kuò)增：

取20μl shjagged1,shβ-catenin菌種于25ml LB培養(yǎng)基中(裝于50ml離心管中)，37℃200rpm，搖菌過夜12-14h。

(4)保種

培養(yǎng)細(xì)菌，一般12-16個(gè)小時(shí)(至OD600到0.6-0.8時(shí))，用一個(gè)1.5mlEP管，50％的甘油和菌液1比1混勻，直接放入-80度冰箱可長(zhǎng)期保存。

(5)提取質(zhì)粒：

原理：質(zhì)粒提取除了可以根據(jù)染色體DNA分子大小不同進(jìn)行分離，還可以根據(jù)堿基組成的差異提取分離。

材料：過夜培養(yǎng)的大腸桿菌質(zhì)粒菌、異丙醇、70％乙醇、滅菌離心管、微型離心機(jī)、ThePlasmid DNA Miniprep Kit。

步驟：

1)平衡柱子：將試劑盒中的核酸純化柱放好，加2ml平衡緩沖液(EQ1)到柱上。讓平衡緩沖液憑重力自然流過柱子。

2)收集菌液：將過夜擴(kuò)增后的菌液20ml于5000rpm離心10分鐘，去掉上清。

3)重懸：加入0.4ml的重懸緩沖液(含RNaseA)于沉淀中，將菌體重新懸起直到均一的菌液產(chǎn)生。

4)裂解：加入0.4ml裂解液(L7)，上下顛倒離心管五次，輕柔混勻不要渦旋，室溫孵育5min.

5)沉淀：加入0.4ml沉淀緩沖液(N3)后立刻上下顛倒離心管至沉淀均一，注意不要渦旋。12000g每分鐘轉(zhuǎn)速室溫離心10min。

6)結(jié)合：將上清液載入平衡好的柱子上，自然流過

洗滌：用洗滌液(W8洗脫柱子兩次，每次都盡可能讓洗脫液流干凈。

洗脫：將滅菌離心管放于洗脫柱子下，加入0.9ml洗脫液(E4)于柱子上，讓洗脫液慢慢流下，洗脫液中含有純化的質(zhì)粒。

7)沉淀及洗滌：在洗脫液中加入0.63ml異丙醇，充分混合，在4℃12000g離心30分鐘。去掉上清液，加入1ml 70％的乙醇洗滌沉淀后4℃12000g離心5分鐘去掉上清。

8)重懸：將質(zhì)粒在空氣中干燥10min，加入20μl TE緩沖液重懸，控制質(zhì)粒濃度≥1μg/ml左右。質(zhì)粒保存在-20℃。

(6)質(zhì)粒定量檢測(cè)

原理：利用核酸在260nm處具有紫外吸收特性，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。

方法：

1)取2μl質(zhì)粒溶液，點(diǎn)于Biotec(美國(guó)生物技術(shù)公司)RNA/DNA檢測(cè)板上，置于Biotec酶標(biāo)儀中檢測(cè)。

2)記錄OD260值，通過計(jì)算確定DNA濃度，公式如下:

質(zhì)粒DNA(μg/ml)＝50×OD260×稀釋倍數(shù)

3)純度

根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值(A260/280＝OD260/OD280)估計(jì)核酸的純度

A260/280＝1.8 DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求

A260/280>1.9 RNA污染

A260/280<1.6 有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染

(7)轉(zhuǎn)染：

a、Huh7細(xì)胞以2×10⁵個(gè)細(xì)胞每孔鋪于六孔板中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)過夜。

b、細(xì)胞密度最好在70-80％的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

C、每孔取2.5μg質(zhì)粒于25μl Opi-MEM混勻孵育5min，取Lipofentamine TM2000 5μl于25μl Opti-MEM轉(zhuǎn)染稀釋液中混勻孵育5min。

d、將質(zhì)粒復(fù)合物和轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物混勻后室溫孵育20min。

e、每孔緩慢滴加50μl轉(zhuǎn)染混合試劑于六孔板中，轉(zhuǎn)染24h后換液，加藥繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行蛋白免疫印跡等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(一)穩(wěn)定表達(dá)調(diào)控型Luciferase293(熒光素酶)細(xì)胞系的鑒定

1、PCR鑒定

提取TRE-luciferase單克隆細(xì)胞株的DNA，利用PCR方法分別鑒定Puromycin、luciferase(熒光素酶)檢測(cè)該基因是否整合入基因組。

檢測(cè)結(jié)果表明Puromycin和luciferase均整合入細(xì)胞基因組DNA。

表1-3 引物序列

Tab.1-3Sequence of primers

2、Luciferase鑒定

利用promega的E1500試劑盒于96孔板中檢測(cè)luciferase的活性。實(shí)驗(yàn)組 TRE-luciferase clone1-14均能檢測(cè)到luciferase的活性，其發(fā)光系數(shù)從380380-903850不等，均為6個(gè)數(shù)量級(jí)；陽性對(duì)照組CMV-Luciferase clone4,5,6,8,9的luciferase活性，其發(fā)光系數(shù)從137830-445360不等，均為6個(gè)數(shù)量級(jí)；陰性對(duì)照組CMV-TRAIL clone1-6的luciferase活性，其發(fā)光系數(shù)從20-137不等，僅為2個(gè)數(shù)量級(jí)。

(二)Notch信號(hào)通路天然小分子抑制劑的篩選

根據(jù)上述篩選的細(xì)胞系，選取clone3(克隆3)作為下游篩選用的細(xì)胞系。將1600種化合物，分別按照10μM,5μM,2μM,1μM,500nM,200nM,100nM的濃度梯度，3個(gè)重復(fù)加入到96孔板中，48h后測(cè)試luciferase，獲得11個(gè)候選化合物(圖1)。根據(jù)化合物活性及文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果最終選擇鴉膽子苦素D化合物做后續(xù)抗腫瘤活性研究

(三)鴉膽子苦素D對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響

利用人肝癌腫瘤細(xì)胞系和人正常肝細(xì)胞系模型評(píng)估鴉膽子苦素D體外抗腫瘤功效。我們將兩種肝癌腫瘤細(xì)胞和兩種人正常肝細(xì)胞給予不同濃度的鴉膽子苦素D(0-20μM)處理48h,并通過CCK-8檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活力。結(jié)果顯示，鴉膽子苦素D可以顯著抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，其半數(shù)抑制濃度為1.87μM。而對(duì)正常肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，這說明鴉膽子苦素D對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。相同濃度下不同時(shí)間點(diǎn)鴉膽子苦素D抑制Hep3B細(xì)胞增殖的效率不同。

另外，軟瓊脂克隆形成結(jié)果表明，經(jīng)(0.25-1μM)鴉膽子苦素D處理24h后的肝細(xì)胞癌細(xì)胞與對(duì)照組(DMSO)比較克隆形成能力明顯降低(圖1)。

(A)鴉膽子苦素D對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞Huh7、Hep3B細(xì)胞和肝正常細(xì)胞QSG-7701生長(zhǎng)的影響。三種細(xì)胞系給予不同濃度的鴉膽子苦素D處理48小時(shí)，細(xì)胞活力通過CCK-8方法進(jìn)行測(cè)定。(B)以不同濃度鴉膽子苦素D處理24、48、72小時(shí)后對(duì)Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)活力的抑制作用。(C)以不同濃度鴉膽子苦素D處理24后軟瓊脂培養(yǎng)10天對(duì)Huh7、Hep3B細(xì)胞的克隆形成能力的抑制作用。

(四)鴉膽子苦素D濃度依賴性的促進(jìn)肝癌細(xì)胞系凋亡

Huh7、Hep3B細(xì)胞經(jīng)不同濃度鴉膽子苦素D(0，2，4μM)處理24小時(shí)后，經(jīng).Annexin V-FITC(膜融合蛋白V異硫氰酸熒光素)和propidium iodide(PI)染料染色用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001與對(duì)照組比較)。

見(圖2)

(五)鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌酶的影響

γ-分泌酶是位于細(xì)胞膜上的由四種亞基組成的蛋白復(fù)合體，我們用膜蛋白 提取試劑盒提取Huh7及Hep3B細(xì)胞系膜蛋白后用western(蛋白免疫印跡)的方法發(fā)現(xiàn)(1-2μM)鴉膽子苦素D處理后對(duì)兩種細(xì)胞系中四種組分的蛋白表達(dá)沒有影響(圖3)。

用△ENotch質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后加入不同藥物發(fā)現(xiàn)，空載質(zhì)粒組由于沒有γ-分泌酶的底物未檢測(cè)到NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)表達(dá)，DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)可以很好的抑制γ-分泌酶活性，使得底物不能被催化產(chǎn)生NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)，鴉膽子苦素D則與DMSO陰性對(duì)照組一樣不能抑制γ-分泌酶活性(圖3)。

將來源于酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的DNA結(jié)合序列與來源于單純皰疹病毒的轉(zhuǎn)錄激活序列VP16融合表達(dá)于N100的C末端，即構(gòu)成N100-GV質(zhì)粒。當(dāng)N100被γ-分泌酶在細(xì)胞膜上剪切后，GV即跟隨被剪切下的NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)離開細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因熒光素酶的表達(dá)。因此，熒光素酶的表達(dá)量與γ-分泌酶剪切N100-GV活性呈直接關(guān)聯(lián)關(guān)系。本研究結(jié)果再一次證明了鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌酶活性沒有影響(圖3)。

(A)(0-1μM)鴉膽子苦素D處理肝癌細(xì)胞系48h后對(duì)γ-分泌酶不同組分表達(dá)量的影響。(B)蛋白免疫印跡法驗(yàn)證鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌活力的影響。(C)通過酶標(biāo)儀檢測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)γ-分泌酶活性的影響。

(六)鴉膽子苦素D對(duì)notch信號(hào)通路的影響

鑒于鴉膽子苦素D從Notch信號(hào)通路抑制劑篩選模型中篩得，而鴉膽子苦素D對(duì)于Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵的γ-分泌酶活性沒有影響，因此我們用免疫印跡的方法考察鴉膽子苦素D對(duì)Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白是否有影響，并同時(shí)考察了鴉膽子苦素D對(duì)于凋亡增殖相關(guān)蛋白的影響。

結(jié)果表明，經(jīng)鴉膽子苦素D處理24h后huh7和hep3B細(xì)胞中Jagged1,NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段),Hes1,顯著下調(diào)。凋亡增殖相關(guān)蛋白cyclinD1,survivin(生存素),c-Myc,caspase9,PARP(DNA修復(fù)酶)也顯著下調(diào)(圖4)。因此我們推斷鴉膽子苦素D可能是通過抑制Notch信號(hào)通路中最上游的配體jagged1的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致下游NICD(NOTCH細(xì)胞內(nèi)片段)、Hes1的表達(dá)下降從而發(fā)揮生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)凋亡的抗腫瘤功效，另外從凋亡蛋白caspase9和PARP的表達(dá)再次驗(yàn)證了鴉膽子苦素D可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡(圖4)。

Huh7和Hep3B細(xì)胞給予鴉膽子苦素D(1或2μM)處理24小時(shí)后，利用免疫印跡分析Notch信號(hào)通路及與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，其中GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)作為內(nèi)參。

除了鴉膽子苦素D，本發(fā)明人從鴉膽子(云南西雙版納熱帶植物園)分離得到的苦木素類化合物還包括鴉膽子苦苷A，鴉膽子苦苷B，鴉膽子苦素E，鴉膽 子苷A，鴉膽子苷G(表1-4)

表1-4 鴉膽子類似物名稱及編號(hào)

我們用蛋白免疫印跡的方法分別考察這些類似物對(duì)Notch信號(hào)通路上游配體jagged1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了鴉膽子苦素D對(duì)jagged1表達(dá)有影響外其它類似物不能下調(diào)jagged1的表達(dá)(圖5)。

鴉膽子及其類似物在2μM的條件下處理huh7細(xì)胞24h后對(duì)Notch信號(hào)通路配體jagged1表達(dá)的影響?？疾禅f膽子苦素D對(duì)jagged1蛋白抑制作用的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。用1μM鴉膽子苦素D處理huh7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)8小時(shí)后jagged1的表達(dá)量開始降低，另外用不同濃度的鴉膽子苦素D處理huh7細(xì)胞24小時(shí)發(fā)現(xiàn)500nM的鴉膽子苦素D即可下調(diào)jagged1的表達(dá)量

(七)過表達(dá)jagged1后鴉膽子苦素D對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系huh7增殖凋亡的影響

由以上結(jié)果推測(cè)鴉膽子苦素D通過抑制β-catenin(β-連環(huán)蛋白)的入核，使得細(xì)胞核中β-catenin/Tcf4轉(zhuǎn)錄活性降低，導(dǎo)致下游靶基因jagged1的表達(dá)降低進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和促凋亡，因此我們?cè)趈agged1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huh7細(xì)胞的條件下評(píng)價(jià)鴉膽子苦素D對(duì)huh7細(xì)胞的增殖凋亡作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)jagged1的條件下(圖6)加入鴉膽子苦素D臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染前比較鴉膽子苦素D對(duì)抑制huh7細(xì)胞的增殖作用減弱。流式細(xì)胞儀凋亡結(jié)果顯示jagged1過表達(dá)后可以抵抗鴉膽子苦素D對(duì)huh7細(xì)胞的促凋亡作用。另外，shjagged1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huh7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在干擾jagged1后可以起到抑制huh7細(xì)胞增殖和促進(jìn)huh7細(xì)胞凋亡的作用。

(A)Huh7細(xì)胞經(jīng)jagged1質(zhì)粒過表達(dá)48h以及過表達(dá)jagged124h后再加入鴉膽子苦素D化合物處理24h或jagged1干擾48h后不同情況jagged1表達(dá)量的情況。

(B)jagged1過表達(dá)或干擾掉之后對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響。(C)jagged1過表達(dá)或干擾掉之后對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響。

(八)鴉膽子苦素D抑制Wnt信號(hào)通路及Wnt與Notch信號(hào)通路的關(guān)系

鑒于鴉膽子苦素D明顯下調(diào)Notch信號(hào)通路中Jagged1的基因水平，因此推測(cè)鴉膽子苦素D可能作用于Notch信號(hào)通路的上游某個(gè)蛋白，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道wnt和notch的密切關(guān)系，Jagged1是Wnt/β-catenin通路的靶基因，因此我們先用FOP/TOP方法考察鴉膽子苦素D是否對(duì)Wnt下游有抑制作用，結(jié)果表明，鴉膽子苦素D在Hep3B和Huh7細(xì)胞中抑制基礎(chǔ)的和LiCl-誘導(dǎo)的Top flash activity，且呈濃度依賴性；同時(shí)對(duì)Fop activity無影響。接著用免疫印跡的方法證明了鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路靶基因c-Myc，cyclinD1，survivin相關(guān)蛋白的抑制作用而對(duì)β-catenin和Tcf4的表達(dá)沒有影響，另外，用RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(圖7)。

(A)肝癌細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染了含β-catenin/Tcf結(jié)合位點(diǎn)(TOP-flash)或者突變的β-catenin/Tcf結(jié)合位點(diǎn)(FOP-flash)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因和海腎熒光素酶(Renilla luciferase)基因后經(jīng)不同濃度的鴉膽子苦素D處理24小時(shí)。海腎熒光素酶作為內(nèi)參，相對(duì)熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶)代表報(bào)告基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；每組實(shí)驗(yàn)樣品3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)孔，并至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(*P<0.05，***p<0.001)。(B)不同濃度的鴉膽子苦素D化合物對(duì)肝癌細(xì)胞系中Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(C)RT-PCR檢測(cè)鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路靶基因的影響。為進(jìn)一步在HCC細(xì)胞中證明Wnt和notch的上下游關(guān)系，我們用shβ-catenin,shjagged1質(zhì)粒分別干擾掉Huh7、Hep3B細(xì)胞中的Jagged1和β-catenin基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾掉β-catenin的同時(shí)Jagged1的表達(dá)量下調(diào)，在shβ-catenin和鴉膽子苦素D的共同作用下可使jagged1下調(diào)更加明顯，而干擾掉Jagged1，β-catenin的表達(dá)量沒有影響。因此有理由推測(cè)β-catenin處于Jagged1的上游。鴉膽子苦素D是通過影響上游β-catenin的活性導(dǎo)致jagged1基因水平的改變。

(九)鴉膽子苦素D抑制β-catenin的入核

β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)，過量的β-catenin通過入核后與Tcf4等蛋白的結(jié)合啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。經(jīng)鴉膽子苦素D處理huh7、Hep3B細(xì)胞后分別提取胞漿蛋白和核蛋白發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素D對(duì)胞漿蛋白中β-catenin表達(dá)沒有影響，確顯著下調(diào)了核蛋白中β-catenin的表達(dá)。用免疫熒光的方法再次驗(yàn)證了鴉膽子苦素D可以抑制β-catenin的入核(圖8)。由此可以推斷鴉膽子苦素D化合物有可能是通過抑制β-catenin的入核，導(dǎo)致 β-catenin/Tcf4復(fù)合物減少，進(jìn)而影響了下游jagged1以及增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。(圖8)

五、統(tǒng)計(jì)分析方法

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS軟件運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett’s進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水平為p<0.05，所有數(shù)據(jù)表示為mean±SEM(標(biāo)準(zhǔn)誤)。

實(shí)施例2 鴉膽子苦素D的體內(nèi)抗腫瘤活性研究

一、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

(一)實(shí)驗(yàn)材料

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸鼠：Balb/c，雄性，4周齡，體重10-14g，12只。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)：2007000516082，動(dòng)物飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)無特定病原體(specific pathogen free，SPF)環(huán)境中，恒溫(23±2)℃，濕度45％-60％，每日光照12h。常規(guī)高壓滅菌飲食。

2、藥品與試劑

3、實(shí)驗(yàn)儀器

(一)實(shí)驗(yàn)方法

1、溶液配制

(1)動(dòng)物組織固定液4％多聚甲醛

稱取4g多聚甲醛(EM級(jí))和100ml PBS,然后加入幾滴NaOH。用磁力攪拌棒在通風(fēng)廚中加熱到60℃直至溶解。冷卻至室溫后調(diào)整PH值至7.4。注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

(2)1.68％γ-cylodextrin

取1.68gγ-cylodextrin于100ml 0.9％生理鹽水中，過濾，4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)50％Matrigel

將Matrigel基質(zhì)膠于冰上過夜融化，用預(yù)冷的DMEM稀釋Matrigel至50％濃度。

2、裸鼠皮下荷瘤模型建立

選取四周齡的BALB/C裸鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)按規(guī)定飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)4天后，稱重編號(hào)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7細(xì)胞消化離心后重懸于無血清并含50％(v/v)Matrigel的DMEM培養(yǎng)基中，隨后皮下注射到裸鼠右側(cè)腹股溝處，每只裸鼠5×10⁶Huh7。每天觀察并檢測(cè)裸鼠的生長(zhǎng)狀況，腫瘤大小和體重變化。

3、給藥及取材

將腫瘤大小均一，健康狀況良好的裸鼠隨機(jī)分成四組(n＝6)，分別為對(duì)照組，低劑量組，中劑量組和高劑量給藥組。鴉膽子苦素D溶于含1.68％γ-環(huán)糊精的生理鹽水(經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾)中，由低到高劑量分別為0.75mg/ml,1.5mg/ml,3mg/ml。對(duì)照組給予相同體積的1.68％γ-環(huán)糊精的生理鹽水。通過裸鼠尾靜脈給藥，給藥頻率為每天給藥，共治療10天。腫瘤大小按如下公式計(jì)算：1/2×a×b²。

末次給藥24h后，測(cè)量并記錄各組腫瘤大小計(jì)算腫瘤體積，稱重。脫臼法將裸鼠處死后立刻取出皮下腫瘤，用PBS清洗兩遍后，隨機(jī)取其中三只的腫瘤組織于4％多聚甲醛中免疫組化實(shí)驗(yàn)備用。另外三只-80℃保存WB實(shí)驗(yàn)備用。

統(tǒng)計(jì)分析：除特別指出外，所有數(shù)據(jù)以“平均值+_標(biāo)準(zhǔn)誤(mean+_s.e.m)”表示，結(jié)果來自至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并用Student’s t test進(jìn)行檢驗(yàn)，P值小于0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。

4、免疫組化及WB

免疫組化操作步驟：

(1)切片常規(guī)脫蠟至水，如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行；

(2)緩沖液洗3min/2次；

(3)為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色,將切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10-15分鐘；

(4)緩沖液洗2次，5min/次；

(5)滴加Ultra V Block，在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。

(注：孵育不要超過10分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5-10％正常羊血清，這一步可以省略。)

(6)緩沖液洗2次，5min/次。

(7)滴加一抗工作液37℃孵育1-2小時(shí)。(具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者最終決定)

(8)緩沖液洗2次，5min/次。

(9)滴加Primary Antibody Enhancer(增強(qiáng)子),在室溫下孵育20分鐘。

(10)緩沖液洗5min/2次。

(11)滴加HRP Polymer(酶標(biāo)二抗)，在室溫下孵育30分鐘。

(注：HRP Polymer對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。)(12)緩沖液洗5min/2次。

(13)向1ml DAB Plus Substrate(底物)(或AEC Plus Substrate(底物))中滴加1-2滴DAB Plus Chromogen(鉻精)(或AEC Plus Chromogen(鉻精)),混勻后滴加到切片上，孵育3－15分鐘。(具體時(shí)間由染色深淺決定。)

(14)自來水充分沖洗,復(fù)染，脫水,透明,封片。

組織樣品的WB實(shí)驗(yàn)前處理方法：

稱重腫瘤組織，先將腫瘤組織用小的眼科剪剪碎，然后充分研磨搗碎，按1mg腫瘤組織加入1ml裂解液，冰上充分裂解1h,離心后取上清進(jìn)行蛋白定量，其余方法同第一章中WB方法。

(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證鴉膽子苦素D的抗肝癌腫瘤活性，用肝細(xì)胞癌皮下腫瘤模型評(píng)估了鴉膽子苦素D對(duì)裸鼠皮下Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中劑量組1.5mg/kg與對(duì)照組相比顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制率為50％(p<0.001),且給藥組體重與對(duì)照組比較無明顯變化(圖9)。而高劑量組3mg/kg由于具有一定毒性，使個(gè)別裸鼠體重有下降趨勢(shì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鴉膽子苦素D的抗腫瘤機(jī)制，分別取三只獨(dú)立的對(duì)照組和給藥組裸鼠皮下的腫瘤組織分別用免疫組化和蛋白免疫印跡方法檢測(cè)了notch及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果表明，經(jīng)鴉膽子苦素D治療后的腫瘤組織中jagged1，cyclinD1和survivin的表達(dá)量顯著降低。上述體內(nèi)結(jié)果與體外細(xì)胞水平結(jié)果再一次驗(yàn)證了鴉膽子苦素D的抗肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制，因此在細(xì)胞水平和體內(nèi)水平同時(shí)證實(shí)了鴉膽子苦素D是通過抑制wnt和notch信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

(A)對(duì)照組和給藥組體內(nèi)肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。Huh7細(xì)胞皮下注射 到雄性裸鼠腹股溝，并尾靜脈給予對(duì)照或1.5mg/kg鴉膽子苦素D連續(xù)治療10天，每天測(cè)量腫瘤的大小和裸鼠的體重變化。(B)給藥組和對(duì)照組裸鼠的體重變化。(C)圖例顯示了對(duì)照組和給藥組裸鼠腫瘤組織。(D)蛋白免疫印跡分析對(duì)照組和給藥組裸鼠腫瘤組織wnt和notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。(E)免疫組化方法分析對(duì)照組和給藥組wnt和Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

二、斑馬魚模型評(píng)價(jià)化合物鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用

(一)、實(shí)驗(yàn)方法

1、材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥物

化合物鴉膽子苦素D購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，母液為10mM，-20℃保存，臨用前稀釋。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

解剖顯微鏡(SZX7，Olympus公司)；96孔板(Nest Biotech)；MESAB(Sigma，批號(hào)20120216)；IWR-1(Lot#101M4624V，Sigma)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚胚胎由環(huán)特生物自行生產(chǎn)。斑馬魚的繁殖方式屬于自然成對(duì)交配，一對(duì)成年斑馬魚可產(chǎn)200-300個(gè)胚胎，每次實(shí)驗(yàn)數(shù)目在4-5對(duì)左右。在胚胎產(chǎn)生后，在6h及24h兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行篩選，選擇存活的合適胚胎，使其進(jìn)入養(yǎng)魚專用水孵育((養(yǎng)魚用水水質(zhì)：28℃下，每1L反滲透水中含200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6mg/L CaCO3))。斑馬魚胚胎營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源于自身的卵黃囊，故9d內(nèi)無需喂食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將不同發(fā)育階段的斑馬魚分別使用三卡因甲磺酸過度暴露并麻醉處死。麻醉處死的操作步驟符合美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AVMA)對(duì)動(dòng)物麻醉處死的規(guī)范要求。

1.2.基于斑馬魚表型評(píng)價(jià)化合物鴉膽子苦素D對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用

–化合物鴉膽子苦素D的四個(gè)評(píng)價(jià)濃度為：3μM、10μM、30μM、100μM；

–陽性對(duì)照組：IWR-1；

–陰性對(duì)照組：溶劑組；

–所有實(shí)驗(yàn)組(除空白對(duì)照組)均含有相同濃度的溶劑；

–空白對(duì)照組用于證明溶劑不會(huì)對(duì)斑馬魚產(chǎn)生有害影響；

–用96孔板處理斑馬魚，每個(gè)濃度處理2個(gè)孔，每個(gè)孔處理5尾斑馬魚，每孔200μL養(yǎng)魚用水。在16個(gè)細(xì)胞期時(shí)分別加入化合物鴉膽子苦素D，8h后移除藥物，48h觀察結(jié)果；

–化合物鴉膽子苦素D處理結(jié)束后，在顯微鏡下觀察有無Wnt信號(hào)通路抑制后的特異表型：體軸發(fā)育異常(身體變短、尾部缺失、背側(cè)彎曲)。根據(jù)表型判斷化合物鴉膽子苦素D是否對(duì)斑馬魚Wnt信號(hào)通路有影響；

–(三)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

100μM鴉膽子苦素D在不引起斑馬魚死亡的條件下可以觀察到Wnt信號(hào)通路抑制后所引起的體軸發(fā)育異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.1、。

表3.1 化合物對(duì)斑馬魚表型的影響

不同濃度的鴉膽子苦素D化合物處理斑馬魚后，斑馬魚表型的改變情況，10μM IWR-1為陽性對(duì)照化合物。