本發(fā)明涉及一種用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑及制備方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前無論基礎(chǔ)和臨床，盡管近幾十年對心肌梗死的治療有了很大的進(jìn)步，目前尚沒有任何能夠根治心肌梗死的藥物和療法。細(xì)胞治療被認(rèn)為是治療心肌梗死最有希望的方法之一。無論是基礎(chǔ)和臨床研究均證明：不同類型的干細(xì)胞(包括：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟內(nèi)源性干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞及iPS等)對梗死心肌治，被證明是可行和安全的。但其療效只體現(xiàn)在減小梗死面積，提高射血分?jǐn)?shù)，改善心功能，及改善病理性左心室重構(gòu)，但經(jīng)移植入的干細(xì)胞大部分死亡，未能分化成熟的心肌以再生梗死心肌，因此，目前的研發(fā)瓶頸和前沿是：研發(fā)具有促進(jìn)心梗缺血區(qū)和邊緣區(qū)心肌再生，有效減小梗死面積，改善心功能，改善缺血心肌纖維化、以改善梗死心臟病理重構(gòu)，及有效減小心梗后心衰發(fā)生的細(xì)胞療法及細(xì)胞治療制劑。

造成目前干細(xì)胞療法對心梗治療療效未如理想的原因之一，是目前的細(xì)胞療法往往只是單獨(dú)移植不同種類的干細(xì)胞，而往往忽略了構(gòu)成心肌層各類細(xì)胞存在彼此互為調(diào)控的協(xié)同作用，從而能更有效促進(jìn)心梗邊緣區(qū)不同來源干細(xì)胞增殖和向心肌分化，促進(jìn)心梗缺血區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生、心肌再生，減小梗死面積，改善心功能，改善缺血心肌纖維化、以改善梗死心臟病理重構(gòu)，及有效減小心梗后心衰發(fā)生的療法方面，將會取得比現(xiàn)有單獨(dú)干細(xì)胞療法更好的療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，即目前所有干細(xì)胞治療均不具備修復(fù)缺血心肌梗死區(qū)被破壞，由心臟Teloytes細(xì)胞(CTs)構(gòu)成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的同時，又能有效促進(jìn)經(jīng)移植入的心臟內(nèi)源性干細(xì)胞(CSCs)有效分化為心肌細(xì)胞，從而有效再生梗死心肌，而提供一種用于治療心肌梗死的混 合細(xì)胞制劑。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑，由活性成分和溶劑組成；活性成分主要為心臟Teloytes細(xì)胞(CTs)和心臟內(nèi)源性干細(xì)胞(CSCs)。

所述的活性成分還包括上述CTs和CSCs分別分泌的功能因子和小RNA中的一種或兩種。即所述的用于治療心肌梗死的細(xì)胞制劑優(yōu)選由如下成分組成：CTs和CSCs分別分泌的功能因子和小RNA中的一種或兩種、CTs、CSCs和溶劑組成。兩種細(xì)胞與及其分泌的功能因子、小RNA經(jīng)混合培養(yǎng)，彼此相互作用對該兩種細(xì)胞本身的表型和分泌表型改變，使其在向心肌分化能力、增殖能力、移行能力、抗細(xì)胞死亡、存活能力、抗缺血與缺氧能力、抗炎癥反應(yīng)能力、促進(jìn)血管新生能力、抗纖維化能力的增強(qiáng)，以及該兩種細(xì)胞及分泌功能分子彼此協(xié)同作用，在上述特性而獲得的提高。

所述的功能因子優(yōu)選為能促進(jìn)經(jīng)移植細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟CTs，心臟內(nèi)源性干細(xì)胞及其它來源干細(xì)胞的增殖和分化、移行、存活，抗死亡、抗缺血與缺氧、抗炎癥，及促進(jìn)心肌血管新生，抗心肌纖維化，及其彼此的協(xié)同作用。

所述的小RNA包括microRNA、LncRNA和piRNA等，其作用也是對心肌細(xì)胞、心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟CTs，心臟內(nèi)源性干細(xì)胞和內(nèi)源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抗死亡與促進(jìn)存活、促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)分化。

所述的CTs和所述的CSCs按細(xì)胞數(shù)1:1配比。

所述的CTs的純度優(yōu)選為在95％以上。

所述的CTs在所述的用于治療心肌梗死的細(xì)胞制劑中的濃度為至少2.5×10⁵個細(xì)胞/mL。

所述的CSCs的純度優(yōu)選為在95％以上。

所述的CSCs在所述的用于治療心肌梗死的細(xì)胞制劑中的濃度為至少2.5×10⁵個細(xì)胞/mL。

所述的溶劑是維持細(xì)胞生理狀態(tài)的溶液，如生理鹽水、PBS或含血清的培養(yǎng)液；優(yōu)選為含血清的培養(yǎng)液。

所述的血清優(yōu)選為胎牛血清。

所述的血清的濃度優(yōu)選為體積百分比20％。

所述的培養(yǎng)液優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)液。

所述用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑的制備方法，包括如下步驟：將CTs和CSCs混勻，得到用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑；優(yōu)選包括如下步驟：將CTs和CSCs在溶劑中混勻，于37℃、5％CO₂、95％空氣的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，然后對混合培養(yǎng)后的細(xì)胞消化，回收，得到用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑。

所述的CTs和所述的CSCs按細(xì)胞數(shù)1:1配比。

所述的CTs的純度優(yōu)選為在95％以上。

所述的CTs在所述的用于治療心肌梗死的細(xì)胞制劑中的濃度為至少2.5×10⁵個細(xì)胞/mL。

所述的CSCs的純度優(yōu)選為在95％以上。

所述的CSCs在所述的用于治療心肌梗死的細(xì)胞制劑中的濃度為至少2.5×10⁵個細(xì)胞/mL。

所述的溶劑為含血清的培養(yǎng)液。

所述的消化為通過使用胰酶溶液進(jìn)行消化。

所述的胰酶溶液的濃度優(yōu)選為0.25(w/v)％。

所述的用于治療心肌梗死的混合細(xì)胞制劑的應(yīng)用，是將其直接用于治療心肌梗死或是將其制備成用于治療心肌梗死的藥物或醫(yī)療器械進(jìn)行應(yīng)用；具體包括如下方式與途徑：可通過對缺血心肌的缺血區(qū)和邊緣區(qū)同時進(jìn)行注射，或通過介入的方式對缺血心肌的缺血區(qū)和邊緣區(qū)同時進(jìn)行注射，但實(shí)施治療的途徑不僅限于上述兩種方式，還包括與不同生物體內(nèi)可降解材料相混合，制備成含不同濃度該細(xì)胞制劑的各種細(xì)胞制片，通過手術(shù)覆蓋在缺血心肌缺血區(qū)，以發(fā)揮治療作用；也可以把該細(xì)胞制劑的細(xì)胞使用各類特異性靶向心臟的靶向子(如：抗體或短肽等)進(jìn)行表面修飾，然后通過靜脈注射使用，以實(shí)施經(jīng)靜脈使用的心臟靶向細(xì)胞治療。

所述的制劑發(fā)揮療效實(shí)現(xiàn)途徑包括但不限于如下闡述：①促進(jìn)經(jīng)移植的CSCs或心肌內(nèi)源性CSCs，及其它來源干細(xì)胞在心梗邊緣區(qū)和梗死區(qū)存活、分化與增殖；②促進(jìn)缺血心肌梗死區(qū)CTs構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的修復(fù)與再生；③促進(jìn)缺血心肌缺血區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生；④改善缺血心肌纖維化、以改善梗死心臟的病理重構(gòu)；⑤減小缺血心肌的梗死面積，改善心功能，及有效減小心梗后心 衰的發(fā)生率，從而實(shí)現(xiàn)有效促進(jìn)心梗心臟缺血區(qū)和邊緣區(qū)心肌再生。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑經(jīng)心肌內(nèi)直接注射或介入心肌內(nèi)注射，對急性心肌梗死心臟的缺血區(qū)和缺血邊緣區(qū)實(shí)施該混合細(xì)胞制劑移植，有效促進(jìn)經(jīng)移植的CSCs或心肌內(nèi)源性CSCs，及其它來源干細(xì)胞在心梗邊緣區(qū)存活、分化與增值，從而能更有效再生缺血梗死心肌的功能。

(2)該細(xì)胞制劑經(jīng)心肌內(nèi)直接注射或介入心肌內(nèi)注射，對急性心肌梗死心臟的缺血區(qū)和缺血邊緣區(qū)實(shí)施該細(xì)胞制劑移植，能有效修復(fù)與再生缺血心肌缺血區(qū)嚴(yán)重受損的由CTs構(gòu)成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，以修復(fù)有利于梗死心肌再生的細(xì)胞結(jié)構(gòu)微環(huán)境，從而有利于梗死心肌的再生。

(3)該細(xì)胞制劑對急性心肌梗死實(shí)施移植治療后，在減小梗死面積，改善心梗心臟心功能方面的療效要優(yōu)于目前常用的單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs的療效。

(4)該細(xì)胞制劑對急性心肌梗死實(shí)施移植治療后，在改善缺血心肌纖維化、促進(jìn)缺血區(qū)和邊緣區(qū)血管新生，以及改善梗死心臟病理重構(gòu)，減小心梗后心衰發(fā)生率方面的療效要優(yōu)于目前常用的單獨(dú)使用BMSCs，CSCs和CTs的療效。

附圖說明

圖1是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的心臟梗死面積統(tǒng)計結(jié)果圖；其中，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組和CSCs組，p<0.01；#表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于CTs組，p<0.05。

圖2是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的心功能檢測結(jié)果圖；其中，圖(A)為各組細(xì)胞治療梗死心臟的射血分?jǐn)?shù)圖，心功能越好，其值就越大，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組和CSCs組，p<0.01；#表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于CTs組，p<0.05；圖(B)為各組細(xì)胞治療梗死心臟的收縮末期的左心室最小直徑結(jié)果圖，心功能越好，其值就越小，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.05；圖(C)為各組細(xì)胞治療梗死心臟的舒 張末期的左心室最小直徑結(jié)果圖，心功能越好，其值就越小，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組和CTs組，p<0.05。

圖3是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)心肌增殖統(tǒng)計結(jié)果圖；其中，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于PBS組、BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.01。

圖4是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的心肌層纖維化程度結(jié)果圖；其中，圖(A)為梗死區(qū)纖維化面積結(jié)果圖，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組、BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.05；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.05；圖(B)為非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積結(jié)果圖，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組、BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組和CSCs組，p<0.01。

圖5是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目檢測結(jié)果圖；其中，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組、BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.01。

圖6是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的心肌層血管單位密度結(jié)果圖；其中，圖(A)為梗死區(qū)陽性血管密度的半定量分析結(jié)果圖，圖(B)為邊緣區(qū)陽性血管密度的半定量分析結(jié)果圖；其中，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組、BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.05；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.01。

圖7是使用PBS和不同的細(xì)胞制劑注射心肌梗死模型4周后的梗死區(qū)CTs檢測結(jié)果圖；其中，*表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組、BMSCs組、CSCs組和CTs組分別相對于PBS組，p<0.01；**表示CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組相對于BMSCs組、CSCs組和CTs組，p<0.05。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

一、CTs的制備

1、SD雌性大鼠(250-300g)(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)乙醚麻醉后拉頸處死，在70(v/v)％乙醇中浸泡消毒5min，迅速轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)。

2、無菌條件下迅速剪開胸腔取出心臟，將心臟放入無菌PBS溶液(0.01M，pH7.4)中清洗3次，除去心臟中殘余的血液，在無菌平皿中剪碎心臟組織(1-2mm³)，然后將心臟組織塊轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管，加入37℃預(yù)熱的經(jīng)過濾除菌的消化酶液[0.05(w/v)％膠原酶+0.1(w/v)％胰酶，下同]2.5ml，密閉管蓋后，于37℃水浴搖床內(nèi)(300rpm)消化10min，然后在生物安全柜內(nèi)靜置2min，棄上層懸液。

3、在生物安全柜內(nèi)，往沉淀組織塊中加入消化酶液2.5ml，密閉管蓋后，于37℃水浴搖床(300rpm)內(nèi)再消化15min，然后在生物安全柜內(nèi)使用移液槍充分吹打經(jīng)消化的組織塊，至細(xì)胞充分分離，離心管靜置2min后，取上層懸液置于一支新的15mL無菌離心管，并加入等體積的含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混勻終止酶消化反應(yīng)。

4、往沉淀組織中再重新加入消化酶液2.5ml，密閉管蓋后轉(zhuǎn)移至37℃水浴搖床(300rpm)內(nèi)消化15min，重復(fù)步驟3、4收集含經(jīng)分離細(xì)胞的懸液，直至組織完全消化。

5、將所有經(jīng)分離細(xì)胞的懸液收集，分別使用無菌孔徑為100μm和40μm的尼龍膜濾過，去除體積大組織碎片，然后將細(xì)胞懸液置50×g離心力下離心2min，將上層細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一新的15ml無菌離心管，在458×g離心力下離心5min，棄上清，收集經(jīng)分離細(xì)胞。

6、往含細(xì)胞沉淀的離心管內(nèi)加入5ml無菌PEB液[稱取牛血清白蛋白(BSA)1.00g、乙二胺四乙酸(EDTA)0.12g，溶于200ml PBS緩沖液中，溶解混勻后調(diào)節(jié)pH值至7.2，用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，分裝于無菌瓶中，4℃冰箱中保存；下同]重懸細(xì)胞沉淀，并將懸液在38×g離心力下離心2min，將上層細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的15ml無菌離心管，在200×g離心力下離心10min，收集細(xì)胞，然后加入1ml PEB液混勻細(xì)胞，獲得目標(biāo)分離單細(xì)胞懸液。

7、向所獲目標(biāo)分離單細(xì)胞懸液中加入兔抗大鼠c-Kit抗體5μl(終濃度為體積比稀釋1:200)，混勻后密閉管蓋，4℃旋轉(zhuǎn)孵育40min后，向細(xì)胞懸液中加入2ml PEB液輕微吹打，洗去未結(jié)合抗體，然后在458×g離心力下離心5min，棄上清。

8、向離心管內(nèi)加入180μl PEB液并混勻細(xì)胞，然后加入羊抗兔lgG免疫磁珠 20μl，密閉管蓋置4℃孵育25min后，往細(xì)胞懸液中加入2ml PEB液輕微吹打，洗去未結(jié)合二抗磁珠，然后在458×g離心力下離心5min，以收集細(xì)胞，然后加入500μl PEB混懸細(xì)胞。

9、使用磁珠分選系統(tǒng)，按陽性分選獲得C-kit+的CTs。

10、經(jīng)分離的CTs在含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO₂、95％空氣的無菌培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，對經(jīng)分離的細(xì)胞CTs進(jìn)行傳代擴(kuò)增，經(jīng)該法分離的細(xì)胞近95％的細(xì)胞為c-Kit⁺/CD34⁺，達(dá)到較高的純度。按步驟1～10，能重復(fù)得到CTs。

11、所有用于制備混合細(xì)胞制劑的CTs均為傳代低于五代，以確保細(xì)胞核型沒有發(fā)生改變。

二、CSCs制備

1、灌注系統(tǒng)消毒：消毒水浸泡灌注管道系統(tǒng)，同時打開紫外燈照射30min，排凈消毒水、無菌去離子水充分沖洗灌注管道。

2、實(shí)驗(yàn)前20min，大鼠腹腔注射肝素鈉(500u/kg)。

3、打開胸腔取出心臟，使用冰浴的灌注液清洗后，迅速將心臟懸掛于Langendorff灌注系統(tǒng)上，無鈣離子灌注液(稱取NaCl 3.46g、KCl 0.175g、MgSO₄0.145g、KH₂PO₄0.08g、NaHCO₃1.05g、葡萄糖1.05g，加去離子水容量瓶定容至500ml，調(diào)節(jié)pH7.38-7.42，過濾除菌)灌注5min。

4、加入酶液[含0.025％(v/v)膠原酶P，0.004％(v/v)蛋白酶的無鈣離子灌注液]在37℃，6ml/min恒定流速條件進(jìn)行灌注消化10min，待心臟變白，且心肌層呈現(xiàn)塌陷狀時，取下心臟。

5、在生物安全柜內(nèi)將取下的心臟剪碎(1-2mm³)，加入酶消化液充分吹打，靜置1min，吸出上懸液后，加入等體積含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，未完全消化的組織加入相同的酶消化液，于37℃水浴搖床中繼續(xù)消化15min。

6、將收集到的經(jīng)消化分離的細(xì)胞懸液，依次使用無菌的100μm尼龍膜、41μm尼龍膜濾過，去除較大組織碎片，濾液于50×g離心2min后，棄沉淀，上層細(xì)胞懸液在300×g離心10min，棄上清液以收集經(jīng)分離的細(xì)胞。

7、加入5ml PEB液懸浮細(xì)胞，并把懸液在38×g離心力的作用下離心2min，棄沉淀，取上清在200×g離心力的作用下離心10min收集經(jīng)分離的細(xì)胞，加入1ml PEB液重懸細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液。

8、往上述制備的細(xì)胞懸液中加入兔抗大鼠c-Kit抗體5μl(終濃度為1:200)， 混勻后，于4℃旋轉(zhuǎn)孵育40min，孵育完成后加入2ml PEB液輕微吹打，在458×g離心力下離心4min，棄上清。

9、加入160μl PEB液懸浮細(xì)胞，加入羊抗兔lgG免疫磁珠20μl，在4℃孵育25min后，加入2ml PEB液輕微吹打，在458×g離心力下離心4min，收集沉淀，向沉淀中加入500μl PEB懸浮細(xì)胞。

10、利用美天旎磁珠分選系統(tǒng)陽性分選獲得c-Kit+心臟干細(xì)胞，并使用心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液[DMEM/F12培養(yǎng)液添加15％胎牛血清、bFGF(20μg/L)、LIF(10μg/L)]，在37℃、5％CO₂、95％空氣的無菌培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，對經(jīng)分離的CSCs進(jìn)行傳代擴(kuò)增，經(jīng)該法分離的細(xì)胞大于95％的細(xì)胞為c-Kit+，達(dá)到較高的純度。

11、所有用于制備混合細(xì)胞制劑的CSCs均為傳代低于5代，以確保細(xì)胞核型沒有發(fā)生改變。

三、BMSCs制備

1、SD雌性大鼠(250-300g)(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，乙醚麻醉后拉頸處死，放入70(v/v)％酒精中浸泡5min。

2、在生物安全柜中，剪開大鼠股骨外面的皮膚、剔除肌肉，收集股骨。

3、剪開股骨兩端露出骨髓腔，用無菌注射器吸取4ml 10(v/v)％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，插入骨髓腔一端將骨髓沖出。收集液用200無菌目尼龍膜過濾，然后加入4ml Tris-NH₄Cl(稱取3.735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.3g加水溶解并稀釋至500ml。0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存)溶液吹打均勻，靜置5min。

4、在458×g離心力下離心4min，棄上清液，用含2ml 10(v/v)％FBS的L-DMEM重懸經(jīng)收集的細(xì)胞，并接種到35mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO₂、95％空氣的無菌培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，48小時換液除去未貼壁細(xì)胞，以后每隔一天換液一次。

5、待細(xì)胞生長至90％融合時用0.25(w/v)％胰酶消化，將細(xì)胞按照5×10⁵個/ml的密度接種到35mm培養(yǎng)皿進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的BMSCs以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)該法分離擴(kuò)增得到的細(xì)胞超過97％為CD90⁺、CD73⁺和CD105⁺陽性，低于0.5％的細(xì)胞為CD45⁺、CD14⁺和CD34⁺陽性，純度達(dá)到95％的BMSCs。

6、所有用于制備細(xì)胞制劑的BMSCs均為傳代低于五代，以確保細(xì)胞核型沒有發(fā)生改變。

實(shí)施例2

(一)CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑的制備

將CTs和CSCs用含20％(v/v)胎牛血清的無菌DMED培養(yǎng)液混勻，并按1.25×10⁵:1.25×10⁵的比例將兩種細(xì)胞均勻混合成體積為2mL、細(xì)胞濃度為1.25×10⁵/mL的細(xì)胞混合液。

把該混合細(xì)胞液置于37℃、5％CO₂、95％空氣的無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，然后使用0.25(w/v)％胰酶消化回收經(jīng)混合培養(yǎng)的細(xì)胞，并使用含20％(v/v)胎牛血清的DMEM把細(xì)胞濃度調(diào)制為1×10⁷/mL供移植使用。

(二)CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑對心肌梗死實(shí)施移植治療

使用雌性(250克)S.D.大鼠，行冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)致左心室前壁缺血，進(jìn)行心肌梗死建模，LAD結(jié)扎后30分鐘后，左心室前壁缺血區(qū)和缺血邊緣區(qū)分別行心肌內(nèi)注射步驟(一)制備好的CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，其中，在缺血區(qū)注射10μl，且分別在缺血邊緣區(qū)的12點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)和9點(diǎn)位置各注射10μl。其中同等體積PBS(0.01M，pH7.4)，BMSCs(濃度為1×10⁷/mL),CTs(濃度為1×10⁷/mL)和CSCs(濃度為1×10⁷/mL)分別按相同的注射方法進(jìn)行心肌內(nèi)注射作為對照組，每組動物為5-9只。

(三)檢測指標(biāo)

所有上述經(jīng)心肌內(nèi)細(xì)胞移植組別的模型鼠，于注射后4周使用B超對其進(jìn)行心功能指標(biāo)進(jìn)行測定后，取出心臟，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋和組織切片，并使用Massion Trichrome染色對纖維化及梗死面積進(jìn)行染色，以對不同組別梗死面積和纖維化進(jìn)行比較分析；使用抗vWF(血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)抗體進(jìn)行免疫組化染色，以對不同組別的缺血區(qū)和缺血邊緣區(qū)的血管密度進(jìn)行比較分析，使用抗c-Kit/CD34抗體(CTs標(biāo)記物)對梗死區(qū)CTs密度進(jìn)行比較分析，使用抗PH3抗體和抗α骨骼肌蛋白抗體熒光免疫雙標(biāo)雙標(biāo)對梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)的增殖心肌細(xì)胞進(jìn)行分析(上述方法學(xué)均是本領(lǐng)域廣泛認(rèn)可的常規(guī)方法學(xué))。

(四)CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑對心肌梗死治療的療效

1、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著性減小缺血心肌的梗死面積，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用BMSCs，CSCs和CTs。

對各組梗死面積進(jìn)行半定量比較柱狀圖(如圖1所示)，PBS：PBS對照組；BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；CTs：心臟CTs組；CTs+BMSCs：心臟CTs+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(如下其它部分的均使用該相同的簡寫符號)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，BMSCs、CSCs和CTs組組梗死面積均顯著性小于PBS對照組，差 異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的梗死面積，顯著性小于BMSCs、CSCs和CTs組的梗死面積，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01:vs.BMSCs、CSCs；p<0.05:vs.CTs)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，BMSCs，CSCs和CTs均能顯著性減小缺血心肌的梗死面積，且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑療效優(yōu)于單獨(dú)使用BMSCs，CSCs和CTs。

2、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著性改善缺血梗死心臟的心功能，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用BMSCs，CSCs和CTs。

左心室射血分?jǐn)?shù)，左心室收縮末期直徑，左心室舒張末期直徑是衡量心臟功能的常用主要指標(biāo)。檢測結(jié)果如圖2所示：

①對左心室射血分?jǐn)?shù)指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖2(A)所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs組的左心室射血分?jǐn)?shù)均顯著性大于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的左心室射血分?jǐn)?shù)顯著性大于，CSCs，BMSCs和CTs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01：vs.BMSCs和CSCs；p<0.05：vs.CTs)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性改善缺血心臟的射血分?jǐn)?shù)，且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

②對左心室收縮末期直徑指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖2(B)所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的左心室收縮末期直徑均顯著性小于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。CTs+BMSCs混合細(xì)胞治療用制劑組的左心室收縮末期直徑的均值小于CSCs，CTs和BMSCs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs能顯著性改善缺血心臟的左心室收縮末期直徑，且CTs+BMSCs混合細(xì)胞治療用制劑療效也顯示優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

③對左心室舒張末期直徑指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖2(C)所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞治療用制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的左心室舒張末期直徑均顯著性小于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。CTs+CSCs混合細(xì)胞治療用制劑組的左心室舒張末期直徑的均值小于CTs和BMSCs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。CTs+CSCs混合細(xì)胞治療用制劑組的左心室舒張末期直徑的均值小于CSCs組。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性改善缺血心臟的左心室舒張末期直徑，且CTs+CSCs混合細(xì)胞治療用制劑療效也顯示優(yōu)于單獨(dú)使用CTs或BMSCs，也有優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs的趨勢。

綜合上述三個指標(biāo)證明：CTs+CSCs混合細(xì)胞治療用制劑能顯著性改善缺血梗死心臟的心功能，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs(。

3、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著提高梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)的心肌增殖，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

使用抗PH3(細(xì)胞增殖標(biāo)記物)抗體和抗α骨骼肌肌動蛋白抗體的熒光雙標(biāo)，對各組心臟切片進(jìn)行免疫組化染色，以比較梗死區(qū)處于分裂狀態(tài)下的心肌細(xì)胞密度。對該指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)(如圖3所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)處于分裂狀態(tài)下的心肌細(xì)胞的密度均顯著性高于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。CSCs，BMSCs和CTs組梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)處于分裂狀態(tài)下的心肌細(xì)胞的密度均高于PBS對照組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組梗死區(qū)處于分裂狀態(tài)下的心肌細(xì)胞密度的均值均大于CSCs，BMSCs和CTs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能促進(jìn)缺血邊緣區(qū)心肌細(xì)胞增殖，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

4、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著性改善缺血梗死心臟的纖維化，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。檢測結(jié)果如圖4所示：

梗死區(qū)纖維化面積，及非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積是衡量心肌層纖維化程度的常用主要指標(biāo)。

①對梗死區(qū)纖維化面積指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖4(A)所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的梗死區(qū)纖維化面積均顯著性小于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的梗死區(qū)纖維化面積顯著性小于CSCs，BMSCs和CSCs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性改善缺血心臟的梗死區(qū)纖維化面積，且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑的療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。②對非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖4(B)所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積均顯著性小于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積的均值小于BMSCs和CSCs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積的均值小于CTs組。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性改善缺血心臟的非梗死區(qū)血管周邊纖維化面積，且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑療 效也顯示優(yōu)于單獨(dú)使用BMSCs和CSCs。

綜合上述二個指標(biāo)證明：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著性改善缺血梗死心臟的纖維化，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

5、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能顯著性減小缺血心肌梗死區(qū)，產(chǎn)生膠原纖維的來源細(xì)胞――肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目，從而有效改善缺血心肌的纖維化，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

心肌缺血缺氧會誘導(dǎo)心肌層的成纖維細(xì)胞分化成為肌成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞能大量合成膠原纖維，導(dǎo)致心肌層纖維化。因此，評價心肌層肌成纖維細(xì)胞的單位密度，是目前常用的改善心肌纖維化的一個指標(biāo)。使用抗α平滑肌肌動蛋白(肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物)抗體對各組心臟切片進(jìn)行免疫組化染色。該指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)(如圖5所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的梗死區(qū)的肌成纖維細(xì)胞密度均顯著性小于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組的肌成纖維細(xì)胞密度，顯著性小于CSCs，BMSCs和CTs，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性減少缺血心肌梗死區(qū)肌型成纖維細(xì)胞密度，且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

6、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能促進(jìn)缺血心肌梗死區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

心肌層血管單位密度是評價心肌層血管新生的一個常用指標(biāo)。使用抗vWF(血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物)抗體對各組心臟切片進(jìn)行免疫組化染色。對該指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)(如圖6所示)：1)CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs和CTs組的梗死區(qū)的血管密度均顯著性高于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。BMSCs組的梗死區(qū)的血管密度均值高于PBS對照組，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組梗死區(qū)的血管密度均顯著性高于CSCs，BMSC和CTs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；2)CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組的梗死邊緣區(qū)的血管密度均顯著性高于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組梗死邊緣區(qū)的血管密度均顯著性高于CSCs，BMSCs和CTs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。上述結(jié)果提示：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性促進(jìn)缺血心肌梗死區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

7、CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑能促進(jìn)缺血心肌梗死區(qū)CTs的再生，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

缺血心肌的梗死區(qū)的CTs在心肌梗死時大部分死亡，影響缺血梗死心肌的結(jié)構(gòu)完整和缺血心肌的再生。使用抗c-Kit/CD34(CTs標(biāo)記物)抗體對各組心臟切片進(jìn)行免疫組化染色，以比較梗死區(qū)CTs密度。對該指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)(如圖7所示)：CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組，CSCs，BMSCs和CTs組梗死區(qū)的CTs密度均顯著性高于PBS對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。且CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑組梗死區(qū)CTs密度的均值均大于CSCs，BMSCs和CTs組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。上述結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑，CSCs，BMSCs和CTs均能顯著性促進(jìn)缺血心肌梗死區(qū)CTs的再生，且其療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

綜合上述1～7的結(jié)果證明：使用CTs+CSCs混合細(xì)胞治療制劑對缺血梗死心肌實(shí)施移植治療，能顯著減小缺血心肌的梗死面積，改善缺血心臟的心功能，及減少心肌梗死后心衰的風(fēng)險，實(shí)現(xiàn)上述療效的部分機(jī)理是：有效促進(jìn)經(jīng)移植的CSCs或心肌內(nèi)源性CSCs，及其它來源干細(xì)胞在心梗邊緣區(qū)和梗死區(qū)存活、分化與增殖，有效減小梗死區(qū)產(chǎn)生膠原纖維來源細(xì)胞――肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目，減小梗死區(qū)和邊緣區(qū)的纖維化，以減小缺血心臟的不良左心室重構(gòu)，及促進(jìn)梗死區(qū)和邊緣區(qū)的血管新生，促進(jìn)梗死區(qū)CTs的再生，從而促進(jìn)梗死心肌的修復(fù)及減少心梗死后心衰的風(fēng)險。CTs+CSCs混合細(xì)胞制劑對缺血梗死心肌的上述指標(biāo)的綜合療效優(yōu)于單獨(dú)使用CSCs，BMSCs和CTs。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。