本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及奧昔卡因在制備藥物中的用途及藥物組合物，更具體地，本發(fā)明涉及奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途及一種用于治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物組合物。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是世界上最為普遍的慢性病毒性感染。HBV主要通過血液傳播、性行為傳播、母嬰傳播等途徑傳播。乙肝病毒感染為世界頂級的健康問題，在全世界導(dǎo)致每年有768000人死亡,是世界第十大致死原因。

而目前治療乙肝病毒感染的藥物應(yīng)用于臨床的只有兩種干擾素，分為干擾素(IFN)和聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)兩種形式，先后于1990和2005年被FDA批準；和五種核苷類似物的病毒聚合酶抑制劑藥物，即拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)，阿德福韋(Adefovir,ADV)，恩替卡韋(Entecavir,ETV)，替比夫定(Telbivudine,LdT)和替諾福韋(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。但是干擾素僅對不到40％的病人有效，并且還有較強副作用；而聚合酶抑制劑不能清除cccDNA，停藥后病毒復(fù)制會迅速反彈，并且長期服用還會使病毒發(fā)生變異而產(chǎn)生抗藥性。

因此，篩選新的抗乙型肝炎病毒感染的藥物顯的尤為迫切和重要。

奧昔卡因(Oxethazaine)在臨床上一直是作為一個有效的局部麻醉劑使用，同時奧昔卡因還可以控制由多種腸胃失調(diào)，例如食道炎，慢性胃炎和消化性潰瘍導(dǎo)致的疼痛和抑制胃酸的分泌。

然而，奧昔卡因的用途還有待進一步開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

本申請是基于發(fā)明人對以下事實的發(fā)現(xiàn)和認識而作出的：

奧昔卡因可以明顯抑制HBeAg(分泌型的e抗原)的分泌，并對肝細胞內(nèi)HBV病毒總DNA都有明顯的抑制作用，同時，奧昔卡因還可以顯著抑制HBV病毒顆粒的組裝。這說明奧昔卡因是以病毒顆粒組裝為靶標(biāo)，影響肝細胞內(nèi)的病毒顆粒的組裝，進而抑制病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制。

為此，本發(fā)明提出了奧昔卡因在制備以HBV病毒顆粒的組裝為靶標(biāo)的、抗乙型肝炎病毒感染的藥物中的新用途。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于抑制乙型肝炎病毒顆粒組裝；或治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染。根據(jù)本發(fā)明的實施例，奧昔卡因或藥學(xué)上可接受的鹽可顯著抑制HBV的核衣殼組裝和肝細胞內(nèi)HBV病毒總DNA，因此，本發(fā)明所提出的奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物可顯著抑制乙型肝炎病毒顆粒組裝；或顯著治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途還可以進一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療或者預(yù)防人類乙型肝炎病毒感染。在本發(fā)明的一些實施例中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽可顯著抑制人肝癌細胞系HepAD38細胞中HBV的核衣殼組裝和細胞上清和細胞內(nèi)HBV病毒總DNA。因此，本發(fā)明所提出的奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預(yù)防人類乙型肝炎病毒感染的效果進一步提高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種用于治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物組合物包括：奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明的實施例，奧昔卡因顯著抑制HBV的核衣殼組裝和肝細胞內(nèi)HBV病毒總DNA，以奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物可以顯著抑制HBV病毒顆粒的組裝為靶點，有效用于治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述藥物組合物還可以進一步包括藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，藥學(xué)上可接受的載體可提高所述藥物組合物的穩(wěn)定性和有效成分的可利用度，從而進一步提高了所述藥物組合物對乙型肝炎病毒感染的治療或者預(yù)防。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物組合物進一步包括第二藥劑，所述第二藥劑不同于奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽并且用于治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二藥劑與奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽聯(lián)用進一步提高了所述藥物組合物對乙型肝炎病毒感染的治療或者預(yù)防。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二藥劑包括選自下列的至少一種：干擾素(IFN)、聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)、拉米夫定(Lamivudine,3TC或LMV)、阿德福韋(Adefovir,ADV)、恩替卡韋(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替諾福韋(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋是HBV病毒聚合酶抑制劑藥物。奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽的抑制HBV病毒感染的靶點不同于上述第 二藥劑，奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽以核衣殼組裝為靶點，不存在使病毒產(chǎn)生抗藥性突變的風(fēng)險，能持續(xù)有效地達到清除乙型肝炎病毒的目的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述第二藥劑的至少之一與奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽聯(lián)用，所述藥物組合物的對乙型肝炎病毒感染的治療或者預(yù)防的效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物組合物呈片劑、注射劑、粉劑、酏劑、膠囊、混懸液、糖漿、藥丸、緩釋制劑、控釋制劑或納米制劑。各種劑型的藥物組合物以可以預(yù)期的給藥方式給藥，抑制HBV病毒顆粒的組裝，從而進一步有效治療或者預(yù)防乙型肝炎病毒感染。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物組合物用于治療或者預(yù)防人類乙型肝炎病毒感染。在本發(fā)明的一些實施例中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，奧昔卡因可顯著抑制人肝癌細胞系HepAD38細胞中HBV的核衣殼組裝和細胞上清和細胞內(nèi)HBV病毒總DNA，所述藥物組合物用于治療或者預(yù)防人類乙型肝炎病毒感染效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，以奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分的藥物組合物可以包括藥物上可接受的載體，且藥物組合物的劑型和給藥方式不受特別限制。對于口服給藥，該藥物上可接受的載體可以包括粘合劑，潤滑劑，崩解劑，賦形劑，增溶劑，分散劑，穩(wěn)定劑，懸浮劑，著色劑和芳香劑。對于注射制劑，藥物上可接受的載體可以包括緩沖劑，防腐劑，止痛劑，增溶劑，等滲壓劑(isotonic agent)和穩(wěn)定劑。對于局部給藥的制劑，藥物上可接受的載體可以包括堿，賦形劑，潤滑劑和防腐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以與上述的藥物上可接受的載體結(jié)合被制備成各種劑型。例如，對于口服給藥，藥物組合物可以被制備成小片，片劑，膠囊，酏劑，混懸液或糖漿。對于注射制劑，藥物組合物可以被制備成例如一次劑量的劑型的安瓿或例如多劑量容器的單元型劑型。藥物組合物還可以被制備成溶液，懸浮液，藥片，藥丸，膠囊、長效制劑、緩釋制劑、控釋制劑或納米制劑。

其中，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，適合藥物配方的載體中賦形劑和稀釋液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯，羥苯丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。

根據(jù)本發(fā)明的另一些實施例，本發(fā)明的藥物組合物中還可以包括填充劑，抗凝血劑，潤滑劑，保濕劑，芳香劑和防腐劑。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的以奧昔卡因或其藥學(xué)可接受的鹽為活性成分的藥物組合物在無細胞毒性的濃度下，能顯著地抑制乙型肝炎病毒顆粒的組裝，從而可以在治療或預(yù)防乙型肝炎病毒感染時被給藥。

在本文中所使用的術(shù)語“給藥”指將預(yù)定量的物質(zhì)通過某種適合的方式引入病人。本 發(fā)明的藥物或藥物組合物可以通過任何常見的途徑被給藥，只要它可以到達預(yù)期的組織。給藥的各種方式是可以預(yù)期的，包括腹膜，靜脈，肌肉，皮下，皮層，口服，局部，鼻腔，肺部和直腸，但是本發(fā)明不限于這些已舉例的給藥方式。然而，由于口服給藥時，口服給藥的組合物的活性成分應(yīng)該被包被或被配制以防止其在胃部被降解。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以注射制劑被給藥。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細胞的特定器械來給藥。

本發(fā)明藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過多個相關(guān)因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴重程度以及作為活性成分的藥物類型。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，日劑量可分為適宜形式的1劑、2劑或多劑，以在整個時間段內(nèi)以1次、2次或多次給藥，只要達到治療有效量即可。

術(shù)語“治療有效量”是指化合物足以顯著改善某些與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的量，也即為給定病癥和給藥方案提供治療效果的量。例如，在乙型肝炎病毒感染治療中，減少、預(yù)防、延緩、抑制或阻滯疾病或病癥的任何癥狀的藥物或化合物應(yīng)當(dāng)是治療有效的。治療有效量的藥物組合物或化合物不需要治愈疾病或病癥，但將為疾病或病癥提供治療，使得個體的疾病或病癥的發(fā)作被延緩、阻止或預(yù)防，或者疾病或病癥的癥狀得以緩解，或者疾病或病癥的期限被改變，或者例如疾病或病癥變得不嚴重，或者加速康復(fù)。

術(shù)語“治療”用于指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良作用而言可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋哺乳動物、特別是人的疾病(主要指乙型肝炎病毒感染)的治療，包括：(a)在容易患病但是尚未確診得病的個體中預(yù)防疾病(例如預(yù)防乙型肝炎病毒感染)或病癥發(fā)生；(b)抑制疾病，例如阻滯疾病發(fā)展；或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關(guān)的癥狀。本文使用的“治療”涵蓋將藥物或化合物給予個體以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個體的疾病的任何用藥，包括但不限于將含本文所述以奧昔卡因或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分的藥物組合物給予有需要的個體。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的奧昔卡因藥物或藥物組合物可與常規(guī)治療方法和/或療法相結(jié)合使用，或者可與常規(guī)治療方法和/或療法分開使用。當(dāng)本發(fā)明的奧昔卡因藥物或藥物組合物在采用與其它藥物的聯(lián)合療法中給藥時，它們可序貫地或同時地給予個體。或者，本發(fā)明的藥物組合物可包含本發(fā)明的奧昔卡因、藥學(xué)上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的賦形劑以及本領(lǐng)域已知的其它治療藥或預(yù)防藥的組合。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，對于人體，0.2-0.4mg/kg奧昔卡因的治療劑量下，持續(xù)服藥并未發(fā)現(xiàn)造成毒性反應(yīng)，50kg的成人口服投放20mg的奧昔卡因，經(jīng)一小時后血漿中奧昔卡因的最高濃度約為20μg/mL(約40μM)，遠高于奧昔卡因的有效濃度，奧昔卡因的生物利用度 高，毒性小，代謝途徑明確。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明奧昔卡因可接受的鹽形式都是有用的。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指那些鹽形式對于制藥化學(xué)家而言是顯而易見的，即它們基本上無毒并能提供所需的藥代動力學(xué)性質(zhì)、適口性、吸收、分布、代謝或排泄。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例1的奧昔卡因(Oxethazaine)抗HBV活性檢測結(jié)果圖，

其中，圖1A是奧昔卡因的結(jié)構(gòu)圖，

圖1B是奧昔卡因處理3天對HepAD38細胞的細胞毒性，

圖1C是奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞上清中的HBeAg的結(jié)果圖，

圖1D是奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞上清HBV總DNA的實時定量PCR的結(jié)果，

圖1E是奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞內(nèi)HBV總DNA的實時定量PCR的結(jié)果，

圖1F是奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞內(nèi)的HBV總DNA的Southern blot結(jié)果圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例2的奧昔卡因不影響CMV啟動子控制下的蛋白表達的結(jié)果圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例2的奧昔卡因可以有效下調(diào)胞內(nèi)的HBV總DNA的含量的結(jié)果圖，

其中，圖3A顯示了奧昔卡因處理6天對HepAD38細胞的細胞毒性，

圖3B顯示了奧昔卡因?qū)Π麅?nèi)的cccDNA的影響，

圖3C顯示了奧昔卡因?qū)Π麅?nèi)HBV總DNA的影響；

圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例2的奧昔卡因?qū)τ贖BV的precore mRNA，pgRNA和HBV總RNA的含量沒有顯著影響的結(jié)果圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例2的奧昔卡因?qū)BV的核衣殼組裝和核衣殼內(nèi)的HBV DNA均有顯著的劑量依賴的抑制效果的結(jié)果圖；以及

圖6是根據(jù)本發(fā)明實施例3的對核苷類似物類藥物抗藥性HBV突變株的抗病毒效果的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明的實施例，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均 為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1奧昔卡因抗HBV活性的評價

1.實驗材料

1.1細胞和藥物

HepAD38細胞系：人肝癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，其染色體中整合有HBV基因組，可支持HBV DNA合成和蛋白表達，可產(chǎn)生感染性病毒粒子。在這個細胞系中病毒的復(fù)制是由四環(huán)素調(diào)控的CMV啟動子控制的。

奧昔卡因購自Sigma公司，拉米夫定(3TC)為NIH饋贈。

1.2試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；HBV表面抗原(S抗原)和e抗原檢測試劑盒購于上海科華生物科技有限公司；試劑購自Invitrogen公司；iTaq Universal SYBR Green supermix試劑購自Bio-rad公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II購自Roche公司。

2.實驗方法與結(jié)果

2.1奧昔卡因(Oxethazaine)的細胞毒性檢測

1)將HepAD38細胞按8000細胞/孔(100μL)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后備用。

2)加藥處理細胞：用細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10％胎牛血清)將藥物以2倍梯度稀釋6-10個梯度，每梯度3個復(fù)孔。將100μL含有藥物的細胞培養(yǎng)液加入到步驟(1)中的細胞中，37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后以備檢測。

3)棄去含有藥物的細胞培養(yǎng)物上清，每孔加入含10％試劑的培養(yǎng)液100μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-4h后，用全波段酶標(biāo)儀檢測540nm波長處吸光值，校正波長為620nm，并計算各濃度細胞存活率，或檢測熒光值(激發(fā)光波長：540nm。發(fā)射光波長：595nm)用以計算細胞存活率。

結(jié)果如圖1B所示。

圖1B結(jié)果顯示：奧昔卡因處理3天對HepAD38細胞的CC₅₀(半數(shù)細胞毒性濃度)為54.7微摩爾/升。

2.2奧昔卡因(Oxethazaine)抗HBV活性檢測

1)將HepAD38細胞按8000細胞/孔(100μL)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后備用。

2)加藥處理細胞：用細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10％胎牛血清)將藥物以2倍梯度稀釋，每梯度3個復(fù)孔，將100微升含有藥物的細胞培養(yǎng)液加入到步驟(1)中的細胞中，37℃ 細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h以備檢測。

3)分別收集細胞上清和細胞，用ELISA檢測試劑盒檢測細胞上清中的HBeAg(分泌型e抗原)和HBsAg(表面抗原)的含量。

4)另外分別提取步驟(3)中收集的細胞上清和細胞內(nèi)的HBV總DNA，用實時定量PCR的方法檢測細胞上清和細胞內(nèi)的HBV總DNA。

實時定量PCR所用引物如SEQ ID NO：1～4所示：

引物(HBV S144-正向引物):5’-TCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物):5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

同時，提取細胞內(nèi)的HBV總DNA，用Southern blot的方法檢測細胞內(nèi)的HBV總DNA，實驗步驟如下：

1)將HepAD38細胞2×10⁵細胞/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后備用。

2)加藥處理細胞：用細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10％胎牛血清)將藥物以2倍梯度稀釋。將含有藥物的培養(yǎng)基加入到細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞72h后以備檢測。

3)收集細胞，裂解細胞并提取細胞內(nèi)的HBV總DNA，用Southern blot的方法檢測細胞內(nèi)的HBV總DNA。

結(jié)果如圖1C～1F所示。其中，圖中的3TC表示加入拉米夫定藥物組，C為空白對照組，即未加藥組，RC表示松弛環(huán)狀部分雙鏈DNA，SS表示單鏈DNA。結(jié)果顯示：奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞上清中的HBeAg，其EC₅₀(半數(shù)效應(yīng)濃度)約為10微摩爾/升，而對HBsAg無作用(如圖1C所示)；實時定量PCR的結(jié)果顯示奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞上清(如圖1D所示)和細胞內(nèi)(如圖1E所示)的HBV總DNA，其EC₅₀分別為1.25微摩爾/升和2.5微摩爾/升,這個結(jié)果表明奧昔卡因?qū)τ诎麅?nèi)和胞外的HBV總DNA的抑制率是相當(dāng)?shù)模簿团懦耸菉W昔卡因抑制HBV病毒分泌的可能性；Southern blot分析的結(jié)果也顯示奧昔卡因可以劑量依賴的抑制細胞內(nèi)的HBV總DNA(如圖1F所示)，奧昔卡因?qū)τ诔墒斓幕蚪MDNA rcDNA和基因組復(fù)制的中間產(chǎn)物ssDNA有明顯的并且程度相當(dāng)?shù)囊种?。這一結(jié)果也表明奧昔卡因處理并沒有明顯改變rcRNA/ssDNA的比例，也沒有直接影響HBV的DNA合成。這一結(jié)果表明奧昔卡因很可能通過影響病毒DNA合成之前的病毒復(fù)制階段來實現(xiàn)抗病毒效果的。圖1的結(jié)果也表明奧昔卡因不影響病毒的DNA合成及其以后的病毒復(fù)制階段。因此發(fā)明人推斷奧昔卡因可能影響HBV生活史中的cccDNA(閉合環(huán)狀DNA)的合成和降解，HBV RNA的轉(zhuǎn)錄，HBV核衣殼的組裝階段。

實施例2奧昔卡因(Oxethazaine)直接作用于HBV核衣殼組裝而發(fā)揮抗病毒作用

1.實驗材料

1.1細胞、質(zhì)粒和藥物

HepAD38細胞系：人肝癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，其染色體中整合有HBV基因組，可支持HBV DNA合成，蛋白表達，可產(chǎn)生感染性病毒粒子。在這個細胞系中病毒的復(fù)制是四環(huán)素調(diào)控的CMV啟動子控制的。

Huh7為人源肝癌細胞，為武漢病毒研究所陳新文研究員惠贈。

pFlag-GAPDH為本實驗室構(gòu)建的CMV啟動子控制下的表達融合Flag標(biāo)簽的GAPDH蛋白的質(zhì)粒；

奧昔卡因購自Sigma公司，拉米夫定(3TC)為NIH饋贈。

1.2試劑

MEM和DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司；iTaq Universal SYBR Green supermix試劑購自Bio-rad公司；抗HBV core蛋白的兔源多抗，抗flag的鼠源單抗和抗β-actin的鼠源單抗分別購自Dako公司，Sigma公司和中杉金橋公司；Trizol試劑購于Roche。

2.實驗方法與結(jié)果

2.1奧昔卡因(Oxethazaine)對HepAD38細胞中乙型肝炎病毒的誘導(dǎo)復(fù)制起始作用的研究

1)將Huh7細胞按5×10⁴個/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2)Huh7細胞瞬時轉(zhuǎn)染CMV啟動子控制的表達Flag-GAPDH的質(zhì)粒pFlag-GAPDH，并加藥處理培養(yǎng)細胞3天。

3)收集細胞，通過蛋白免疫印跡(Western blot)檢測帶Flag標(biāo)簽的蛋白的表達情況，來檢測奧昔卡因作用對于CMV啟動子的活性的影響。

結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果顯示，和不加藥組對照相比奧昔卡因并不影響帶flag標(biāo)簽的GAPDH的蛋白表達量(內(nèi)參蛋白β-actin的蛋白表達量仍保持恒定)。這也就表明奧昔卡因并不影響CMV啟動子控制下的蛋白表達和其誘導(dǎo)下的HBV病毒復(fù)制起始。

2.2奧昔卡因(Oxethazaine)對HBV cccDNA的影響

1)在HepAD38細胞中，四環(huán)素誘導(dǎo)病毒復(fù)制起始后，撤掉四環(huán)素，在細胞核內(nèi)逐漸形成穩(wěn)定的cccDNA庫，作為HBV源源不斷復(fù)制的模板。

2)將上述誘導(dǎo)后的HepAD38細胞按4×10⁴細胞/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

3)加藥處理細胞：用DMEM/F12培養(yǎng)基將奧昔卡因稀釋成各種濃度，每組3個重復(fù)，將不同劑量藥物加入到細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，加藥處理6天。

4)收集細胞，分別提取胞內(nèi)的總的HBV DNA和cccDNA(閉合環(huán)狀DNA)。其中，直接抽提胞內(nèi)基因組DNA即可用于檢測HBV總DNA；對于cccDNA的抽提，先是利用氯化鉀高鹽沉淀的方法除去大部分的細胞基因組DNA，再用PSAD酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase，購自Epicentre公司)(特異性降解閉合環(huán)狀雙鏈DNA之外的所有DNA)處理即可除去一條鏈不完整的HBV基因組DNA(環(huán)狀松弛DNA，rcDNA)、單鏈的HBV DNA等HBV DNA復(fù)制中間產(chǎn)物，PSAD酶可以基本完全降解HBV總DNA中除cccDNA的成分，隨后純化后即可得到較為純凈的cccDNA。得到的總的HBV DNA和cccDNA樣品用定量PCR的方法分析研究藥物抗病毒活性并同時評價加藥處理6d的細胞毒性情況。

實時定量PCR所用引物如SEQ ID NO：1～6所示：

引物(NCCC1)：5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3’(SEQ ID NO：5)。

引物(CCCAS2)：5’-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3’(SEQ ID NO：6)。

引物(HBV S144-正向引物)：5’-ACTCACCAACCTCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO：1)。

引物(HBV S144-反向引物)：5’-GACAAACGGGCAACATACCT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物(GAPDH正向引物)：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

結(jié)果如圖3所示。其中，圖3A顯示了加奧昔卡因處理6天對HepAD38細胞的細胞毒性情況；圖3B顯示：與未加藥處理對照組相比奧昔卡因處理在接近最大無毒性濃度的10微摩爾/升時仍對cccDNA的水平?jīng)]有明顯影響，但是對于胞內(nèi)HBV總DNA仍然有顯著的劑量依賴的抑制效果(圖3C)。其中，圖中的3TC表示加入拉米夫定藥物組，C為空白對照組，即未加藥組。圖3結(jié)果顯示：奧昔卡因可以有效下調(diào)胞內(nèi)的HBV總DNA的含量，但是對cccDNA的含量沒有顯著性影響。奧昔卡因的抗病毒效果不是通過影響HBV復(fù)制的模板cccDNA的含量來實現(xiàn)的。

2.3奧昔卡因(Oxethazaine)對乙型肝炎病毒RNA的作用的研究

1)將HepAD38細胞按4×10⁴細胞/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2)加藥處理細胞：用DMEM/F12培養(yǎng)基將奧昔卡因稀釋成各種濃度，每組3個重復(fù)，將不同劑量藥物加入到細胞培養(yǎng)板中，加藥處理細胞3天。

3)收集細胞提取RNA，用實時定量PCR定量分析藥物對HBV各種RNA的作用。

實時定量PCR所用引物如SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：7～12所示：

引物(precoreRNA正向引物)：5'-TCTGCGCACCAGCACCATGCAAC-3'(SEQ ID NO：7)。

引物(precoreRNA反向引物)：5'-GCGAAGGAAAGAAGTCAGAAGGC-3'(SEQ ID NO：8)。

引物(pgRNA正向引物)：5'-CTGGGTGGGTGTTAATTTGG-3'(SEQ ID NO：9)。

引物(pgRNA反向引物)：5'-TAAGCTGGAGGAGTGCGAAT-3'(SEQ ID NO：10)。

引物(HBV總RNA正向引物)：5'-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3'(SEQ ID NO：11)。

引物(HBV總RNA反向引物)：5'-ACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3'(SEQ ID NO：12)。

引物(GAPDH RNA正向引物)：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：3)。

引物(GAPDH RNA反向引物)：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

實驗結(jié)果如圖4所示。其中，圖中的3TC表示加入拉米夫定藥物組，C空白對照組，即未加藥組。圖4顯示：和不加藥對照組相比，不同濃度的奧昔卡因?qū)τ贖BV的precore mRNA，pgRNA和HBV總RNA的含量沒有顯著影響。這個結(jié)果也表明奧昔卡因的抗HBV的活性既不和特異性抑制HBV轉(zhuǎn)錄相關(guān)，也不和特異性降解HBV RNA相關(guān)。

綜上所述，以上的結(jié)果顯示：奧昔卡因的抗HBV的活性和抑制HBV病毒分泌、抑制HepAD38細胞中的CMV啟動子轉(zhuǎn)錄、抑制cccDNA形成和降解、抑制HBV轉(zhuǎn)錄、特異性降解HBV RNA以及抑制HBV DNA合成均不相關(guān)。

2.4奧昔卡因(Oxethazaine)對乙型肝炎病毒核衣殼組裝的作用的研究：

以上實施例的結(jié)果已經(jīng)證明了奧昔卡因的抗病毒作用并不是發(fā)生在病毒復(fù)制周期的HBV cccDNA的合成和降解，病毒DNA合成，病毒RNA轉(zhuǎn)錄和病毒分泌等過程，發(fā)明人就將奧昔卡因發(fā)揮作用的階段縮小到病毒組裝這一過程中了。進而發(fā)明人探討了奧昔卡因?qū)BV核衣殼組裝的作用。實驗過程如下：

1)將HepAD38細胞按2×10⁵細胞/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

2)加藥處理細胞72小時。

3)加入300微升溫和細胞裂解液，室溫裂解30min后收集裂解液到EP管中，并離心去除細胞碎片。裂解液樣品用1％的瓊脂糖凝膠電泳分成各種成分，隨后用毛細管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，轉(zhuǎn)膜緩沖液使用10×SSC，檢測濾膜上的HBV核衣殼用抗HBV core的抗體(Dako)檢測。檢測完的濾膜用堿變性處理釋放核衣殼內(nèi)的病毒DNA，用Southern blot方法檢測核衣殼內(nèi)病毒DNA的水平。

另外用western blot的方法檢測HBV核心蛋白(core protein，組成核衣殼外殼的蛋白)，檢測的抗體抗HBV core的抗體(Dako)檢測。

結(jié)果顯示如圖5所示。圖5顯示：奧昔卡因?qū)BV的核衣殼組裝和核衣殼內(nèi)的HBV DNA均有顯著的劑量依賴的抑制效果。

實施例3奧昔卡因(Oxethazaine)對核苷類似物類藥物抗藥性HBV突變株的抗病毒效果

1.實驗材料

1.1細胞、質(zhì)粒和藥物

Huh7為人源肝癌細胞；

質(zhì)粒REZ31-9-1(59#)含有1.1倍野生型HBV基因組序列；阿德福韋(ADV)抗藥性突變毒株表達質(zhì)粒REZ36-10-1(61#)，其含有N236T突變的1.1倍HBV基因組序列；拉米夫定(3TC)和恩替卡韋(ETV)雙抗藥性突變毒株表達質(zhì)粒REZ7-8-4(70#)，其含有L180M+M204V+S202G三突變的1.1倍HBV基因組序列。以上質(zhì)粒均為武漢病毒研究所陳新文研究員惠贈。

奧昔卡因購自Sigma公司，拉米夫定(3TC)為NIH饋贈；阿德福韋(ADV)和恩替卡韋(ETV)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II購自Roche公司。

2.實驗方法與結(jié)果

本實施例中，發(fā)明人對奧昔卡因(Oxethazaine)對核苷類似物藥物抗藥性HBV突變株的復(fù)制情況的作用進行了研究，實驗步驟如下：

1)將Huh7細胞按2×10⁵個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2)Huh7細胞分別瞬時轉(zhuǎn)染了1.1倍HBV基因組的表達質(zhì)粒(包括野生型WT、含有N236T突變的阿德福韋抗藥性突變毒株、含有L180M+M204V+S202G三突變的拉米夫定和恩替卡韋雙抗藥性突變毒株)，轉(zhuǎn)染后分別加入奧昔卡因(Oxethazaine)，拉米夫定(3TC)，阿德福韋(ADV)和恩替卡韋(ETV)處理，加藥處理3天。

3)收集細胞，提取細胞內(nèi)的HBV核衣殼內(nèi)的DNA，用HBV DNA特異性的地高辛標(biāo)記的探針，用Southern印跡雜交(Southern blot)的方法檢測HBV核衣殼內(nèi)DNA的水平。

結(jié)果如圖6所示。其中，C空白對照組，即未加藥組。圖6顯示：奧昔卡因可以顯著抑制野生型和兩種抗藥性突變株的HBV DNA復(fù)制。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示 例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。