本發(fā)明涉及微生物和食品、藥品、保健品領域。更具體地，本發(fā)明涉及包括苦瓜粉的組合包在制備用于減少腸道內(nèi)菌群抗抗生素基因或腸道耐藥基因組(gut microflora resistome)的食品、藥品、保健品、營養(yǎng)品的應用。

背景技術：

從二十世紀四十年代開始使用抗生素以來，抗生素的利用大大減少了因感染而造成的死亡，延長了人們的壽命預期。但是，由于濫用和不當使用抗生素，使得在微生物中抗生素抗性迅速發(fā)展，抗生素抗性已經(jīng)成為全球威脅人類健康的重要因素之一?？股乜剐詥栴}大大增加了用于公共衛(wèi)生的花費和投入，延長了病人的住院時間，并且造成了治療失敗的增加以及死亡率的增長¹。

在中國，抗生素濫用嚴重，抗生素抗性已經(jīng)成為一個不可忽視的問題。

以往對抗生素抗性的許多研究多集中在對臨床致病菌的分析。但是，最近越來越多的研究轉向“耐藥基因組”。耐藥基因組這一概念由Vanessa M.D'Costa于2006年在對土壤抗生素抗性基因研究的文章中提出，代表了在特定環(huán)境中所有抗生素抗性基因的總和²。人類的腸道中儲藏著大量的抗生素抗性基因³，這些抗性基因不僅能夠在共生腸道菌之間交換，也能夠轉移到機會致病菌中⁴。在一項大規(guī)模的人群研究中，研究人員利用元基因組測序技術檢測人腸道耐藥基因組，并在其中識別出了成千上萬的抗生素抗性基因⁵。

對于肥胖個體，膳食干預是一項常用的減少體重的方法。同時飲食也已經(jīng)被報道是調節(jié)腸道菌群的主要因素^6,7。在我們實驗室已發(fā)表的一項研究中，我們發(fā)現(xiàn)遺傳性肥胖和單純性肥胖的病人，在經(jīng)過由全谷物、中國傳統(tǒng)醫(yī)藥食材和益生元組成的飲食干預后，他們的體重顯著減少并且生理指標和炎癥情況得到顯著改善。同時在這項膳食干預實驗中，腸道菌群的結構和功能發(fā)生了顯著的變化，包括了毒素產(chǎn)生菌的減少以及有益菌的增加⁸。

迄今為止，還沒有一個能有效減少腸道菌群耐藥基因組的方法。

技術實現(xiàn)要素：

通過利用以基因組為核心的元基因組學分析方法，本發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)，患者通過服用一種組合包(膳食干預)可以用來扶持腸道有益菌，抑制條件致病菌，從而減少腸道內(nèi)菌群抗抗生素基因的數(shù)量和豐度。

因此，本發(fā)明提供一種組合包在制備食品、藥品、保健品、或營養(yǎng)品中的應用，所述食品、藥品、保健品、或營養(yǎng)品用于減少腸道菌群耐藥基因組或在抗生素治療中減少抗生素抗性，所述組合包包括以下組合物，每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位：

第一組合物，包括：全糧谷物；

第二組合物，包括：苦瓜、可溶性膳食纖維和低聚糖；

第三組合物，包括：可溶性膳食纖維和低聚糖。

本發(fā)明還提供一種減少腸道菌群耐藥基因組或在抗生素治療中減少抗生素抗性的方法，包括以下步驟：給予有需要的對象一種組合包，所述組合包包括以下組合物，每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位：

第一組合物，包括：全糧谷物；

第二組合物，包括：苦瓜、可溶性膳食纖維和低聚糖；

第三組合物，包括：可溶性膳食纖維和低聚糖。

根據(jù)本發(fā)明另一方面，本發(fā)明還提供一種組合包，用于減少腸道菌群耐藥基因組或在抗生素治療中減少抗生素抗性，所述組合包包括以下組合物，每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位：

第一組合物，包括：全糧谷物；

第二組合物，包括：苦瓜、可溶性膳食纖維和低聚糖；

第三組合物，包括：可溶性膳食纖維和低聚糖。

在一些實施方案中，所述全糧谷物包括薏仁、燕麥、蕎麥、扁豆、玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子和枸杞。

在一些實施方案中，所述組合包用于人類患者。

在一些實施方案中，所述第一組合物作為主食服用，其形式選自米、面、粥或飯。用所述第一組合物制備米、面、粥或飯前，先將第一組合物的種子、果實或其他植株部位粉碎成顆粒，其中1-70％、15-70％、25-70％、30-70％、50-70％的顆粒直徑為0.65mm或以上。

在一些實施方案中，所述薏仁的重量占所述第一組合物重量的5-35％、10-30％、或15-25％，燕麥的重量占所述第一組合物重量的5-30％或10-20％，所述蕎麥的重量占所述第一組合物重量的5-50％、8-40％、或10-30％，所述扁豆的重量占所述第一組合物重量的5-20％或8-15％，所述山藥的重量占所述第一組合物重量的5-30％、8-20％、或10-15％。

在一些實施方案中，蛋白質的重量占所述第一組合物重量的5-40％或10-20％，碳水化合物的重量占所述第一組合物重量的30-80％或50-70％，脂肪的重量占所述第一組合物重量的0.5-30％或2-15％，膳食纖維的重量占所述第一組合物重量的0.5-30％或2-15％，維生素的重量占所述第一組合物重量的0.1-5％或0.5-1％，礦物質的重量占所述第一組合物重量的0.1-2％或0.8-1.2％。

在一些實施方案中，每100克的所述第一組合物提供320-400千卡總熱量。

在一些實施方案中，每100克的所述第一組合物含有：VA 3-857ugRE，VD0.01-5ugRE，VE 2-79.09mg，VB10.01-1.89mg，VB20.01-1.4mg，VB60.01-1.2mg，VB120.1-2.4mg，VC 1-1170mg，煙酸0.5-28.4mg，Ca 60-2458mg,P 200-1893mg，K 350-1796mg，Na 8-2200mg，Mg 100-350mg，F(xiàn)e 2-20mg。

在一些實施方案中，所述第一組合物中的所述蕎麥包括：普通蕎麥或苦蕎麥。

在一些實施方案中，所述第一組合物中的所述蕎麥包括：蕎麥屬種子。

在一些實施方案中，所述第一組合物中的所述燕麥包括：燕麥屬植物種子。

在一些實施方案中，所述第一組合物中的所述山藥包括：山藥干。

在一些實施方案中，所述第二組合物被制成沖調粉劑，在餐前0.25到1小時服 用。

在一些實施方案中，所述第二組合物的日劑量為5-100克、40-60克、或30-80克，以水沖調。

在一些實施方案中，所述第二組合物中的所述苦瓜包括：苦瓜屬的植物果實全粉。

在一些實施方案中，所述植物果實全粉是通過冷凍干燥或噴霧干燥生產(chǎn)。

在一些實施方案中，所述第二組合物中的所述苦瓜包括：苦瓜提取物。

在一些實施方案中，所述第二組合物中的所述可溶性膳食纖維包括：

Fibersol-2、抗性淀粉、聚葡萄糖、纖維素、半纖維素、果膠或樹膠。

在一些實施方案中，所述第二組合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水蘇糖或低聚乳果糖。

在一些實施方案中，所述苦瓜與所述膳食纖維和所述低聚糖的重量比為10:1-1:1，例如9:1，8:1，或7:1。

在一些實施方案中，所述苦瓜粉的重量占所述第二組合物重量的15-99.8％、30-95％、或45-90％，所述可溶性膳食纖維的重量占所述第二組合物重量的0.1-51％、1-40％、3-30％、或5-20％，所述低聚糖的重量占所述第二組合物重量的0.1-34％、1-25％、2-20％、或3-15％。

在一些實施方案中，所述第三組合物被制成沖調粉劑，餐前2-5小時服用，或與早餐同時服用。

在一些實施方案中，所述第三組合物的日劑量為5-200克、30-100克或50-150克，以300-1500毫升水沖調。

在一些實施方案中，所述第三組合物中的所述可溶性膳食纖維包括：

Fibersol-2，抗性淀粉，聚葡萄糖、纖維素，半纖維素，果膠或樹膠。

在一些實施方案中，所述第三組合物中膳食纖維和低聚糖的重量比為6:1-1:6，例如6:4。

在一些實施方案中，所述第三組合物中的所述低聚糖包括：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚葡萄糖、水蘇糖、或低聚 乳果糖。在一些實施方案中，所述第三組合物中的所述可溶性膳食纖維包括：瓜爾膠、果膠、魔芋粉及其他可發(fā)酵膳食纖維(Fibersol-2、抗性淀粉、半纖維素)等益生元。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明的組合物可用于平衡患者中腸道菌群結構，改善或減少腸道內(nèi)菌群抗抗生素基因；可以多個途徑給予需要的患者，達到恢復健康的目的。

附圖說明

圖1顯示膳食干預之后腸道耐藥基因組整體結構的改變。(a)根據(jù)399個ARGs的數(shù)據(jù)得出的PCA分數(shù)圖顯示在飲食干預之前和之后的樣本中有顯著的分離(log-轉化的，PERMONOVA P＝0.0187,置換＝9999)。(b)ARGs的總數(shù)目和豐度。圖框(box)代表第一和第三四分位數(shù)(分別為第25％和75％)之間的四分位距(IQR)，圖框內(nèi)的線代表中位數(shù)。須(whiskers)代表分別距離第一和第三四分位數(shù)的IQR的1.5倍內(nèi)的最低和最高值。樣本顯示為左邊的點。用雙尾威氏(Wilcoxon)配對符號秩檢驗法(n＝35)進行統(tǒng)計學分析。(c)ARGs和對應于抗性基因類型的ARG的發(fā)生率。

圖2是一個熱圖，顯示96個顯著改變的ARGs以及它們對膳食干預的響應。其中點的顏色對應于ARGs的經(jīng)log-轉化的豐度。根據(jù)抗生素抗性基因類型組織這些ARGs。

圖3顯示膳食干預之后顯著改變的抗生素抗性基因。(a)在我們的膳食實驗(之前和之后)中以及三個另外的群組(中國、丹麥和西班牙，來自文獻[5])中抗生素抗性基因類型的數(shù)目。圖框代表第一和第三四分位數(shù)(分別為第25％和75％)之間的四分位距(IQR)，圖框內(nèi)的線代表中位數(shù)。須代表分別距離第一和第三四分位數(shù)的IQR的1.5倍內(nèi)的最低和最高值。(b)36個顯著改變的基因類型。線/三角標記代表基因類型豐度的中位數(shù)和25％/75％四分位數(shù)。(c)分配到抗生素化合物的ARGs的顯著改變的豐度(校正的P<0.05)。根據(jù)ARDB將抗性基因分配到抗生素。將賦予對同樣的抗生素化合物的抗性的基因進行豐度的加和。(d)分配到各抗生素類別的ARGs的豐度。根據(jù)ARDB將抗生素基因分配到抗生素類別。將賦予對同樣的抗生素類別的抗性的基因進行豐度的加和。對于(a)配對比較的統(tǒng)計學分析， 用雙尾Mann–Whitney U檢驗法和雙尾威氏配對符號秩檢驗法(在n＝35之前，n＝35之后，中國n＝38，丹麥n＝85，西班牙n＝39)進行；對于(b)、(c)和(d)，進行威氏配對符號秩檢驗法(n＝35)。*校正的P<0.05,**校正的P<0.01,***校正的P<0.001(Benjamini & Hochberg 1995)。

圖4顯示通過三類不同機制發(fā)揮抗性的抗生素抗性基因的豐度變化。通過ARDB數(shù)據(jù)庫，抗生素抗性基因被分配到對應的抗性機制。對通過同一種機制發(fā)揮抗性的抗生素抗性基因豐度進行加和。圖框(box)代表第一和第三四分位數(shù)(分別為第25％和75％)之間的四分位距(IQR)，圖框內(nèi)的線代表中位數(shù)。須代表分別距離第一和第三四分位數(shù)的IQR的1.5倍內(nèi)的最低和最高值。樣本顯示為左邊的點。用雙尾威氏配對符號秩檢驗法(n＝35)進行統(tǒng)計學分析。P值校正(Benjamini & Hochberg 1995)。

圖5顯示抗生素抗性基因攜帶者在膳食干預后的變化?；?20個抗生素抗性基因攜帶者的主成分分析表明干預前、后的樣品有著一定的區(qū)分趨勢(log轉化,PERMONOVA P＝0.0584，置換(permutations)＝9999)。

圖6顯示ARGs在ARG攜帶者中的分布網(wǎng)絡。圖中的圓形代表抗生素抗性類別，其他形狀代表不同的門(方形：變形菌門，三角：擬桿菌門，菱形：厚壁菌門)。形狀的大小代表兩類ARG攜帶者(大：>700基因和?。骸?00基因)。各ARG攜帶者豐度變化的方向被分到四類中，由校正的P<0.05確定顯著性(雙尾威氏配對符號秩檢驗法，n＝120，Benjamini & Hochberg 1995)。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

在一項以腸道菌群為靶點的人群膳食干預實驗中。我們對在來自于35個兒童的70份糞便樣品進行深度元基因組測序，共得到平均八千四百萬條高質量測序片段的數(shù)據(jù)，在多個不同水平進行耐藥基因組的比較分析。共有399個抗生素抗性基因從含約兩百多萬個的已建腸道微生物基因集合⁸中被識別出。在膳食干預之后，腸道耐藥基因組整體結構發(fā)生了顯著的變化(圖1a)，整體數(shù)量和豐度均顯著下 降(圖1b，圖2)，在干預后有48個抗生素抗性基因組徹底消失，77％的抗生素抗性基因豐度顯著減少或有減少的趨勢。

我們將399個抗生素抗性基因歸并到抗性基因類別，得到131個抗性基因類別，并與來自于中國、丹麥和西班牙成年人的數(shù)據(jù)進行比較。根據(jù)已有報道，在這三個人群中，中國成年人的耐藥基因組種類最多和豐度最高⁵。我們發(fā)現(xiàn)干預前的樣品中含有比中國成年人更顯著多的抗性基因類別(圖3a)，即這些個體的腸道耐藥組在干預前已經(jīng)有非常高的多樣性。并且和已有文獻觀察的結果一致，我們在所研究對象的腸道耐藥基因組中也同樣看到了TetW,TetQ,TetO,TetM,Tet40,Tet32,ErmB和BacA這些抗性類別在個體中的廣泛存在^5,9,10，以及四環(huán)素抗性基因在耐藥基因組中也同樣是豐度最高⁵。在干預之后，36個抗性基因類別的豐度顯著變化，其中33個顯著減少(圖3b)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中抗性基因與其產(chǎn)生抗性的抗生素之間的對應關系，我們發(fā)現(xiàn)在干預之后，對10/47個抗生素化合物的抗性潛能顯著減少(圖3c)，對8/15個抗生素大類的抗性潛能顯著下降(圖3d)。

細菌的抗生素抗性基因主要通過三種機制產(chǎn)生抗性1)通過削弱通透性或者外排泵，減少細菌細胞內(nèi)的抗生素濃度2)修飾抗生素的靶點從而起到保護作用以及3)水解或者修飾抗生素分子，使抗生素失去活性¹¹。在干預后，通過靶點保護和外排泵這兩種機制產(chǎn)生抗性的抗性基因豐度總和是顯著減少的(圖4)。通過Canopy算法¹²對腸道微生物基因歸并分類，可以得到“共豐度基因集合(CAG)”，隨后對CAG進行從頭組裝和分類地位鑒定。通過上述步驟，我們能夠追溯得到201個抗生素抗性基因(它們的豐度占總耐藥基因組的86％以上)的攜帶者，共計120個CAG，其中24個CAG有高質量基因組草圖，30個CAG能夠在種/屬水平上確定分類學地位，這些CAG的整體結構在干預后有著明顯變化的趨勢(圖5)。在構建的抗生素抗性基因在其攜帶者中的分布網(wǎng)絡中(圖6)，可以看到抗生素抗性基因在厚壁菌門，擬桿菌門和變形菌門中都存在，這表明了這類基因在細菌界中分布廣泛。其中，克雷伯氏菌、腸桿菌和埃希氏菌屬的細菌與多種抗生素抗性基類別相連，以熱點的形式存在，這些細菌是潛在的多重耐藥機會致病菌^13,14，具有能夠對包括β-內(nèi)酰胺類，四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類在內(nèi)的多種抗生素產(chǎn)生抗性的基因潛力。根據(jù)已有的報道，由多重耐藥致病菌引起的感染不僅造成了更高的死亡率和更多的治療失敗，而且對健康衛(wèi)生系統(tǒng)造成了更多的經(jīng)濟損失¹⁵。通過膳食干預，69％的抗生素抗性基因攜帶者顯著減少或有減少趨勢，特別是那些多重耐藥菌，包 括了CAG00001a(Escherichia/Shigella sp.)、CAG00002(Escherichia/Shigella sp.)、CAG00146(Klebsiella sp.)、CAG00008(Klebsiella pneumoniae)以及CAG00356(Enterobacter sp.)。

為了應對抗生素抗性的全球化威脅，人們已經(jīng)從不同的角度做了非常多的努力。我們的研究結果證明了以腸道菌群為靶點的膳食干預不僅能調節(jié)腸道菌群和改善個體的健康狀況，而且能夠顯著的減少他們的腸道耐藥基因組所含耐藥基因的種類和豐度。

相應地，本發(fā)明提供一種作為應對抗生素抗性威脅的一種方法。本發(fā)明的目的之一是將一種組合包應用于制備食品、藥品、保健品、或營養(yǎng)品，所述食品、藥品、保健品、或營養(yǎng)品用于減少腸道菌群耐藥基因組或在抗生素治療中減少抗生素抗性，所述組合包包括以下組合物，每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位：

第一組合物，包括：全糧谷物；

第二組合物，包括：苦瓜、可溶性膳食纖維和低聚糖；

第三組合物，包括：可溶性膳食纖維和低聚糖。

在一些實施方案中，所述全糧谷物選自薏仁、燕麥、蕎麥、扁豆、玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子、枸杞、或以上的組合。一個優(yōu)選實施方案中，扁豆為白扁豆。另一個優(yōu)選實施方案中，玉米為黃玉米。

本發(fā)明上下文中的“抗生素”可以指本領域所知的任何抗生素，例如選自以下抗生素類別：β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷、甘氨酰環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、氯霉素類、四環(huán)素類、喹諾酮類、多肽類、氨基核苷、糖肽類、林可酰胺、鏈陽菌素、磺胺類、磷霉素、或以上的組合。

全糧谷物或全谷物(whole grains)是指包括麩皮、胚乳和胚芽三個部分的完整谷粒，或者在加工過程中保全了天然植物食材的所有營養(yǎng)成分的植物食材。本發(fā)明中使用的全糧谷物可包括但不限于薏仁、燕麥、蕎麥、扁豆、玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子和枸杞，其他可使用的全糧谷物例如小米、高粱、紅薯等。本發(fā)明中使用的三種組合物的各種成分均可通過常規(guī)商業(yè)途徑購得。

例如，作為營養(yǎng)品，可以是飲食補充劑的形式。作為藥品，可以與藥學可接受載體混合以形成藥物組合物。“藥學可接受載體”包括溶劑、分散劑、包衣、 抗菌和抗真菌劑以及等滲和吸收延遲劑等等，適合于藥物給藥。

所述組合包可以配制成與其計劃的給予途徑相適應的劑型。參見例如美國專利No.6,756,196。給予途徑的實例包括口服。所述組合包可以是用于口服的片劑、膠囊、米、粥或飯形式，為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，配制口服組合物將是有利的。術語“劑量單位形式”指適合作為用于治療主體的單一劑量的物理分散單位，每一單位包含與所需的藥學載體結合、計劃產(chǎn)生所需治療效果的預定量的活性成分。

通過運用系統(tǒng)生物學策略，合并分析腸道元基因組特征、宿主和腸道菌群共代謝譜特征及將患者腸道菌群移植給無菌小鼠，我們觀察到了干預后腸道菌群在組成和功能上的顯著變化，宿主健康狀況的顯著改善，共代謝產(chǎn)物中有毒有害物質的減少，干預前患者菌群會對無菌小鼠造成炎癥反應且造成更多的脂肪積累。這些結果說明我們的膳食干預，能夠增加腸道中的有益菌，減少有害菌，改善失調的菌群，減少宿主共代謝產(chǎn)物中的有害物質，從而改善人體健康。

實施例1：遺傳性肥胖及單純性肥胖的膳食干預

為了研究腸道菌群失調在人類肥胖及相關代謝失調中的貢獻，我們招募了一批肥胖患兒和膳食因素導致肥胖的兒童，在醫(yī)院對其進行WTP膳食干預⁸。

營養(yǎng)干預在廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心進行。除了超重、持續(xù)超過3天給予抗生素或參與減肥項目外，參與營養(yǎng)干預的主體在先前的3個月均未患有胃腸道疾病、未進行胃腸道手術或未患有慢性疾病。所述營養(yǎng)干預的主體可以由主體或健康護理專業(yè)人員的判斷而確定，并且可以是主觀的(例如看法)或客觀的(例如可通過檢驗或診斷方法測量的)。例如，所述干預的主體可以是具有低水平腸道有益菌和高水平條件致病菌的主體，或診斷有代謝綜合癥的主體。

“營養(yǎng)干預”定義為通過對主體飲食營養(yǎng)的合理調整，達到減輕、解除、補救、預防或改善代謝綜合癥癥狀，恢復健康的目的。

經(jīng)上海交通大學生命與生物科技學院道德委員會批準，我們進行了開放標記研究及自控研究。臨床試驗在中國臨床試驗注冊中心的注冊編號為ChiCTR-ONC-12002646，并獲得了患兒監(jiān)護人的書面同意。我們還進行了問卷調查，從而收集了人口統(tǒng)計特征、健康狀態(tài)、疾病歷史、胃腸道狀況、飲食習慣及體育活動等信息?；凇吨袊澄锍煞直?2002版)》，隨餐頻率的問卷調查及 24小時的飲食記錄被用于計算基本營養(yǎng)攝入。

我們招募了肥胖患兒37名(年齡范圍2-16歲)。受試者在廣東省婦幼保健院進行30天膳食干預。

所述WTP飲食是指對患兒給予全谷物、中國傳統(tǒng)藥膳以及益生元。具體而言，在本實施例中，所述WTP飲食是指提供一種組合包，包括第一組合物、第二組合物及第三組合物。每種組合物為便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式，所述劑量單位形式是單一劑量的物理分散單位。所述第一組合物、所述第二組合物及所述第三組合物由食品制造商：完美(中國)有限公司制備。

所述第一組合物為事先烹調好的12種選自富含膳食纖維的全糧谷物的混合物，包括：薏仁(薏苡)、燕麥、蕎麥、白扁豆、黃玉米、赤小豆、黃豆、山藥、大棗、花生、蓮子和枸杞，以罐頭粥的形式由食品制造商制備(每罐凈重為370g)。每罐第一組合物含有100g的成分(包括59g碳水化合物、15g蛋白質、5g脂肪、6g纖維；維生素和礦物質的含量：VE 2.8mg/kg；VB20.082mg/100g；Vc 0.3mg/100g；煙酸(煙酰胺)220ug/100g；葉酸11.1ug/100g；鈉67mg/kg；鉀1800mg/kg；銅1mg/kg；鎂337mg/kg；鐵9mg/kg；鋅5mg/kg；錳5mg/kg；鈣158mg/kg；磷74.2mg/100g；碘0.12mg/kg；硒0.016mg/kg；肌醇90mg/kg；亞油酸0.28g/100g；a-亞麻酸0.01g/100g)以及336kcal的熱量(包括70％碳水化合物、17％蛋白質、13％脂肪)，具體成分含量參見下表1。其中，總熱量可以通過氧彈測定能力修正法測定，蛋白質的含量可以通過凱氏微量法測定，碳水化合物的含量可以通過高壓液相色譜測定，脂肪的含量可以通過索氏抽提法測定，膳食纖維的含量可以通過中性洗滌劑法測定，維生素的含量可以通過高壓液相色譜測定，礦物質的含量可以通過分光光度法測定。

所述第一組合物作為主食，制成米、面、粥或飯給予。在經(jīng)過蒸、煮等烹調方式后，其中的淀粉不易糊化，不易升高血糖?；純罕唤o予足夠的第一組合物以滿足饑餓感，并滿足其年齡段的標準營養(yǎng)要求，該標準營養(yǎng)要求規(guī)定于中國營養(yǎng)學會(CNS，2012)建議的《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》(DRI)中。每名患者的飲食記錄被用于基于《中國食物成分表》(2002年)計算營養(yǎng)攝入。

所述第二組合物以沖調粉劑的形式給予(每袋20g)，具體成分和含量參見下表1。其中，低聚糖為2個或2個以上(一般指2-10個)單糖單位以糖苷鍵相連形成的糖分子，例如低聚果糖或低聚異麥芽糖。第二組合物制成沖調粉劑后用溫水沖 調食用，每天沖服60克第二組合物。

所述第三組合物以沖調粉劑的形式給予(每袋20g)，具體成分和含量參見下表1。用溫水沖調食用，每天沖服60克第三組合物。

表1.三種組合物的成分和含量

本發(fā)明組合包的代表性給藥周期為一周至幾個月，例如一周、兩周、一個月、兩個月、四個月和八個月。在主體中腸道有益菌水平開始上升、條件致病菌水平開始下降后，組合物的劑量可以逐步降低。當腸道菌群結構恢復正常時可以結束給藥。

我們發(fā)現(xiàn)，(1)膳食干預能夠緩解遺傳性肥胖及單純性肥胖并改善患者的生化 指標；干預30天后，所有相關的臨床指標在遺傳因素導致的肥胖和單純性肥胖患者中都顯著改善；(2)干預后腸道菌群在小鼠中產(chǎn)生很少炎癥及脂肪堆積；(3)膳食干預改變腸道菌群結構和功能。

實施例2

實施例所采用的數(shù)據(jù)集

在我們已發(fā)表的一項研究中⁸，17個遺傳性肥胖和21個單純性肥胖的兒童接受了以腸道菌群為靶點的膳食干預。我們利用Illumina平臺對他們的糞便樣品進行了元基因組測序(單純性肥胖兒童：0天和30天；遺傳性肥胖兒童：0天、30天、60天和90天)。原始的測序數(shù)據(jù)可以從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中下載(接受號：SRP045211)。在我們這樣配對研究中，我們由于數(shù)據(jù)的不完整性或識別為異常值，去除了三個個體的數(shù)據(jù)(GD10個體缺少30天的數(shù)據(jù)，GD20和GD26個體為異常值)。在剩余的35個肥胖兒童的0天和30天的樣品中，共含有平均八千四百萬的高質量測序片段。

抗生素抗性基因的識別

我們下載了ARDB數(shù)據(jù)庫中核心的7828條抗生素抗性基因蛋白序列。我們之前所構建的非冗余腸道微生物基因集合中的蛋白序列與這些抗生素抗性基因蛋白序列進行BLASTP的比對，比對結果需要E‐value小于1e‐10，比對序列的70％需要被覆蓋，比對的同一性至少80％⁵。

大的共豐度基因集合(CAG)的基因組組裝

所有滿足90％的總豐度分布在三個以上樣品中的基因，基于他們的豐度，我們利用canopy算法將他們進行歸類。所有攜帶有抗生素抗性基因的大CAG，我們通過與已發(fā)布論文一樣的手段對它們進行組裝⁸。過程簡述：通過與CAG特異的基因進行比對，我們收集樣品特異和CAG特異的測序短序列，然后通過Velvet工具進行從頭組裝。我們引入人類衛(wèi)生組計劃(HMP)對高質量基因組草圖進行判定的6個指標。

CAG的分類地位識別

對于滿足至少5個HMP高質量基因組草圖標準的大CAG，我們通過使用CVtree3.0網(wǎng)頁服務器和SpecI兩個工具確定分類地位⁸。對于小的CAG和沒有高質 量組裝產(chǎn)物的大CAG，我們在核酸和蛋白水平上，將每個CAG中的基因與7991個參考基因組序列進行比對。比對結果通過E‐value(核酸水平：小于1e10，蛋白水平：小于1e‐5)和序列覆蓋度(>70％)進行過濾。根據(jù)已有報道的分類學地位識別閾值¹⁷，CAG被識別到種或者屬的水平(種水平：在DNA水平，90％的基因能夠以95％的同一性比對上相同種的基因組；屬水平：在DNA和蛋白水平上，同時滿足80％的基因能夠比對上同一個屬)。

結果

被改變的抗生素抗性基因

在這項對遺傳性和單純性肥胖的膳食干預項目中，我們已經(jīng)發(fā)表了一篇文章，在該文章中，我們構建了一個包含～200萬個的人腸道菌群非冗余基因集合⁸。通過利用BLAST比對工具，以ARDB數(shù)據(jù)庫為參考序列庫¹⁸，在這個基因集合中我們共識別出399個抗生素抗性基因。

基于抗生素抗性基因整體結構的主成分分析表明，干預前后有著顯著的差異，并且這樣的差異能夠通過置換性MANOVA的檢驗(圖1a)(9999次置換，P值＝0.0187)。抗性基因的總數(shù)量由干預前的185.54±10.56(如無其他聲明，數(shù)據(jù)均以均值±標準差的形式表示)顯著減少到151.91±7.37(圖1b)。干預之后的樣品相比干預之前，有48個抗生素抗性基因消失，但是也有15個新的抗生素抗性基因出現(xiàn)，這表明了在干預過程中，抗生素抗性基因的動態(tài)得失。雖然有新的抗生素抗性基因出現(xiàn)，但是攜帶這些基因的樣品數(shù)量(1.6±1.1,均值±標準差)顯著少于攜帶干預后消失的抗生素抗性基因的樣品數(shù)量(2.9±2.1，均值±標準差)。

并且，在干預之后，抗生素抗性基因的總豐度也發(fā)生了顯著的減少，由4075.51±313.91減少到3410.52±306.90(圖1b)。在所有的399個抗生素抗性基因中，有86個的豐度在干預后顯著減少，它們占了干預前后耐藥基因組總豐度的33.39％±3.39％和24.48％±2.79％?？偣灿?22個抗生素抗性基因在干預后豐度減少，它們占了總耐藥基因組的47.90％±4.48％(干預前)和41.22％±5.68％(干預后)。雖然有10個抗生素抗性基因的豐度在干預后顯著增加，但是它們的豐度僅占總耐藥基因組的1.96％±0.94％(干預前)和8.94％±3.33％(干預后)。干預后顯著減少的抗生素抗性基因主要屬于tet，mdt和erm家族，增加的抗生素抗性基因主要是pbp和erm家族的成員(圖2和下表2)。

表2 干預后豐度顯著變化的96個抗生素抗性基因信息。

被改變的抗性基因類別及所對應的抗生素

所識別出的399個抗生素抗性基因能夠被進一步歸為131個不同的抗性類別。在這131個抗性類別中有15個在所有的70個樣品中均存在，它們是TetW,TetQ,TetO,TetM,Tet40,Tet32,MdtF,MdtE,ErmF,ErmB,Bl2e_cfxa,BacA,AcrB,AcrA和 Aac6Ie。有11個類別僅出現(xiàn)在干預前的樣品中，有4個僅出現(xiàn)在干預后的樣品中(圖1c)。在肥胖兒童干預前的樣品中，抗性類別的數(shù)量顯著高于中國、丹麥和西班牙的成年人(圖3a)。在干預之后，抗性類別的數(shù)量顯著減少，相比中國成年人已經(jīng)沒有顯著差異，但是仍然顯著高于丹麥和西班牙成年人中含有的抗性類別數(shù)量(圖3a)。

在131個抗性類別中，有36個豐度在干預后顯著變化(圖3b)。平均而言，33個顯著減少的類別，它們的豐度總和從1364.2±188.85減少到了761.6±78.81。僅有3個類別的豐度在干預后顯著增加，他們是能夠對林可胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和鏈陽菌素b產(chǎn)生抗性的ErmX，能夠對四環(huán)素類產(chǎn)生抗性的TetL和能夠對青霉素產(chǎn)生抗性的PBP2b。從在樣品中的分布廣泛性看，36個顯著變化的類別中，8個沒有變化，16個在干預后減少(圖3b)。

當我們把所有抗性類別匹配到它們參與產(chǎn)生抗性的抗生素后，我們得到了47個抗生素的潛在抗性能力。這47個中的10個在干預后顯著減少，他們是氯霉素、諾氟沙星、嘌呤霉素、紅霉素、磷霉素、萬古霉素、多黏菌素、依諾沙星、膦胺霉素和春雷霉素(圖3c)。在抗生素大類的水平上，15個大類中的8個在干預后的樣品中，豐度顯著減少，包括鏈陽菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類和糖肽類(圖3d)。

細菌的抗生素抗性基因主要通過三種機制產(chǎn)生抗性：1)通過削弱通透性或者外排泵，減少細菌細胞內(nèi)的抗生素濃度；2)修飾抗生素的靶點從而起到保護作用；以及3)水解或者修飾抗生素分子，使抗生素失去活性¹¹。通過ARDB數(shù)據(jù)庫中的信息，根據(jù)產(chǎn)生抗性的機制，399個抗生素基因被分配到這三種機制中。在干預后，通過靶點保護和外排泵這兩種機制產(chǎn)生抗性的抗性基因豐度總和是顯著減少的(圖4)。紅霉素核糖體甲基化酶(erm)家族通過甲基化16S核糖體RNA基因，從而對大環(huán)內(nèi)酯、林可胺類和鏈陽菌素的抗生素產(chǎn)生抗性¹⁹。膳食干預顯著減少了erm家族中ErmB、ErmG和ErmQ的豐度。并且，通過保護核糖體免受四環(huán)素翻譯限制的TetO和TetPB的豐度，也在干預后顯著減少。其他通過保護靶點產(chǎn)生抗性的抗性類別，包括sul2、arna、ksga和vangu的豐度也都顯著減少。細菌的外排泵系統(tǒng)可以將很多抗生素轉移到胞外，從而減少細胞內(nèi)抗生素的濃度。在干預后，ErmD和10個Mdt(E、F、G、H、K、L、M、N、O和P)家族的多重耐藥泵的豐度，以及AcrAB-TolC多重耐藥泵復合物的豐度都是顯著減少的。這一結果暗示了潛在多重耐藥細菌的減少。除此以外，特異性的外排泵，包括外排桿菌肽的Bcr、外排大 環(huán)內(nèi)酯類的MacB、外排四環(huán)素的Tete40和TetC以及外排磷霉素的RosA-RosB復合物的豐度²⁰，在膳食干預之后顯著減少。

識別抗生素抗性基因的攜帶者

在已經(jīng)發(fā)表的研究中，通過基于基因豐度的相關性，我們依靠canopy算法將非冗余腸道細菌基因集合歸類到“共豐度基因集合(CAG)”中^8,12。根據(jù)包含的基因數(shù)量的不同，CAG被進一步分為兩類。含有超過700個基因的大CAG，被認為是細菌基因組，含有不超過700個基因的小CAG，可能是不完整的細菌基因組或者是噬菌體。在整個耐藥基因組中，201個抗生素抗性基因，能夠找到它們的攜帶者，它們來自38個大CAG和80個小CAG，這201個抗性基因的豐度分別占干預前、后整個耐藥基因組的86.60％±1.11％和87.45％±1.99％。平均而言，在38個大CAG中的抗性基因豐度為87.45％±1.99％(干預前)和334.54±61.70(干預后)。在80個小CAG中的抗性基因豐度為2981.58±246.93(干預前)和2665.39±272.79(干預后)?？偣灿?98個抗生素抗性基因在CAG中追溯到。這一部分的抗性基因豐度總和在干預后由532.63±60.82顯著減少到425.13±103.35。

對每一個攜帶有抗生素抗性基因的CAG我們都進行了從頭組裝(詳見上文“大的共豐度基因集合(CAG)的基因組組裝”)。24個基因組組裝產(chǎn)物滿足了人類微生物組計劃(HMP)對基因組草圖6項質量標準的至少5項。通過CVtree3.0網(wǎng)頁服務器²¹和specI工具²²，這24個基因組草圖的系統(tǒng)發(fā)生信息得以確定。剩余的14個大CAG和80個小CAG的分類學鑒定通過和參考基因組的比對實現(xiàn)(詳見上文“CAG的分類地位識別”)，其中的8個大CAG和22個小CAG能夠在種/屬的水平上得到分類地位的信息。在118個攜帶有抗生素抗性基因的CAG中，含有最多數(shù)量的前三個CAG分別為CAG00002(埃希氏菌屬(Escherichia)/志賀菌屬(Shigella sp.))，CAG00001和CAG00008(肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia))，他們分別攜帶了41，37和20個抗生素抗性基因。在核酸水平上，通過和參考基因組的比較，我們發(fā)現(xiàn)CAG00001中51.5％的基因能夠比對上Escherichia/Shigella，16.7％比對上Weissella(魏斯氏菌屬)以及14.9％比對上Enterococcus(腸球菌屬)，這樣的結果表明了CAG00001的異質性。通過將canopy工具中的參數(shù)“--max_canopy_dist”從0.9提高到0.95，我們對CAG00001中的基因進行了第二輪的分類。得到四個子類，分別標記為CAG00001a到CAG00001d。CAG00001a和CAG00001c為 Escherichia/Shigella sp，但是CAG00001b和CAG00001d無法在種/屬的水平上得到分類學地位的信息。CAG00001a、b、c和d分別攜帶了28、3、5和0個抗生素抗性基因。因為更嚴格的分類參數(shù)設定，有三個抗性基因沒能被歸類到CAG00001～d中。由于一個基因可以被歸類到過個CAG中，所以CAG00001a～d中攜帶的抗生素抗性基因總數(shù)會大于34。

基于基因分類，基因組組裝和分類地位鑒定，我們最終得到了120個(CAG00001a～c+117個攜帶抗性基因的CAG)抗生素抗性基因攜帶者?；诳剐曰驍y帶者豐度的組成分分析表明，干預前后的樣品有一定的區(qū)分趨勢(圖2)(置換性MANOVA test,9999次置換,P＝0.0584)。結合399個抗性基因的主成分分析結果和抗性基因攜帶者的主成分分析結果的procrustes分析表明，耐藥基因組的變化與這些攜帶者的變化顯著相關(Monte‐Carlo檢驗，P<0.001,M2＝0.23)?？紤]到這120個抗性基因攜帶者攜帶了相當高豐度的抗性基因，這暗示著整體耐藥基因組的結構變化主要就是由這些攜帶者所貢獻的。

抗生素抗性基因和其攜帶者的分布

基于抗生素抗性基因和其攜帶者的從屬關系，屬于我們所研究的特定人群中的抗性基因網(wǎng)絡得以構建(圖6)?？股乜剐曰蛟诙鄠€細菌門中存在，包括厚壁菌門，擬桿菌門和變形菌門，這表明了抗生素抗性基因在細菌界中的廣泛分布。在厚壁菌門中的細菌，含有的抗生素抗性基因載荷最小，基本上每個細菌僅含有一種抗性基因類別。對桿菌肽能夠產(chǎn)生抗性的BacA基因類別被厚壁菌門中的細菌大量攜帶，在網(wǎng)絡圖中呈現(xiàn)為熱點?？偣灿?個Lactobacillus(乳桿菌屬)，3個Eubacterium(真細菌屬)和3個梭菌攜帶有該基因類別。在擬桿菌門中的細菌主要(8/11)攜帶有對β‐內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗性的抗性基因類別，包括php2b,BL3_ccra,BL2e_cbla,BL2e_cepa和BL2e_cfxa。抗性基因類別BL2e‐cepa僅在擬桿菌屬中存在，這與ARDB數(shù)據(jù)庫的結果相一致，暗示了這個抗性基因類別的潛在分類學特異性。腸桿菌科中的細菌，特別是克雷伯氏菌、腸桿菌和埃希氏菌屬，在分布網(wǎng)絡中以熱點的形式存在。10個mdt(E,F,G,H,K,L,M,N,O和P)家族的多重耐藥外排泵和AcrAB‐TolC多重耐藥泵復合物，特異性地被這些屬的細菌攜帶。并且這些細菌所攜帶抗性基因類別，能夠對廣泛的抗生素產(chǎn)生抗性包括了β‐內(nèi)酰胺類，四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類。在干預后，這些細菌的豐度被顯著減少或減少，特別是CAG00001a(Escherichia/Shigella sp.)、CAG00002 (Escherichia/Shigella sp.)、CAG00146(Klebsiella sp.)、CAG00008(Klebsiella pneumoniae)以及CAG00356(Enterobacter sp.)。

本說明書引用的所有出版物通過引用整體引入。

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