本發(fā)明涉及新型生物材料和組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種心肌組織工程脫細(xì)胞化膠原膜片的制備方法。

背景技術(shù)：

心肌組織工程是一門以細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)相結(jié)合，研究關(guān)于正常心肌功能的關(guān)系、病理性心肌組織及用于修復(fù)、維持和改善心肌組織功能生物替代品開發(fā)的一門新興學(xué)科，它的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)的器官移植和生物材料移植的限制，修復(fù)受損的心肌組織。心肌組織工程的四要素主要包括種子細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞與生物材料的整合以及植入物與體內(nèi)微環(huán)境的整合。

心肌組織工程支架材料除了保持組織形態(tài)和功能，還應(yīng)對細(xì)胞的粘附、生長、增殖、分化起到調(diào)控作用。目前常用的心肌組織工程支架材料有脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料、天然生物材料、復(fù)合材料、生物衍生材料及納米材料等。脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)是通過生物或化學(xué)方法去除基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞制備而成的接近人體的三維結(jié)構(gòu)，具備良好的生物相容性和生物力學(xué)強(qiáng)度，基質(zhì)表面具備細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，能夠引導(dǎo)組織再生，因此具備臨床應(yīng)用價(jià)值。天然生物材料來源于細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原、殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等，具備良好的生物相容性及細(xì)胞親和性。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，具 有天然源性，其各種基質(zhì)蛋白比例合適，具有可塑性。膠原特有的細(xì)胞粘附信號(hào)肽序列RGD為支架材料增加了粘附識(shí)別位點(diǎn)，有助于細(xì)胞粘附并保持細(xì)胞活性。膠原固有的空間結(jié)構(gòu)分布利于心肌細(xì)胞的矩陣排列。

目前，已有報(bào)道選用牛肌腱膜片用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)；豬蹄筋來源的膠原膜片用于類心肌組織構(gòu)建，尤其是選用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞的報(bào)道尚未知曉。本發(fā)明選用的原材料為天然豬蹄筋，取材方便，價(jià)格低廉；豬蹄筋結(jié)構(gòu)呈纖維狀平行排列，與心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)相似；由于蹄筋來源于豬，因此具有與人類基因較多的同源性；豬蹄筋中含有豐富的膠原蛋白，能增強(qiáng)細(xì)胞生理代謝，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞延纖維方向伸展，因此，本發(fā)明脫細(xì)胞化膠原膜片可用于培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，旨在構(gòu)建類心肌組織。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種心肌組織工程脫細(xì)胞化膠原膜片的制備方法，本發(fā)明所述方法制備過程穩(wěn)定，產(chǎn)物形貌均一可控，操作簡單，制得的膠原膜片具有良好的生物相容性和生物可降解性，通過對膜片結(jié)構(gòu)和成分的分析表明，膜片的主要成分為膠原蛋白，結(jié)構(gòu)呈纖維狀平行排列，與心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)相似，可維持心肌細(xì)胞跳動(dòng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞延纖維方向伸展，因此脫細(xì)胞化膠原膜片非常適合用于心肌組織工程構(gòu)建和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

本發(fā)明具體提供了一種心肌組織工程脫細(xì)胞化膠原膜片的制備方法，該方法按照以下步驟進(jìn)行：

首先，清洗豬蹄去除鹽漬、污物和油污，解剖豬蹄，將豬蹄筋取出，剔除表面筋膜，生理鹽水清洗，獲得長0.5～2cm，直徑0.5～1.5cm的豬蹄筋；

其次，采用反復(fù)凍融和核酸酶處理方法聯(lián)合去除豬蹄筋組織內(nèi)在細(xì)胞：將上述豬蹄筋置于耐低溫的容器內(nèi)，通入液氮，1～5min后快速轉(zhuǎn)移至盛有生理鹽水的容器內(nèi)，37℃恒溫水浴復(fù)溫5～10min，反復(fù)凍融3～5次；采用DNase和RNase對豬蹄筋進(jìn)行脫細(xì)胞化處理(優(yōu)選將反復(fù)凍融后的蹄筋放入含有50～200μg/mL DNase和50～200μg/mL RNase的容器內(nèi)，置于37℃恒溫?fù)u床震蕩6～24h后，PBS清洗干凈)；將豬蹄筋用OTC冰凍包埋劑包埋預(yù)凍后,利用冰凍切片機(jī)制備出不同厚度的去細(xì)胞化膠原膜片，厚度在5～30μm之間。

反復(fù)凍融法是利用反復(fù)冷凍與融化，使蹄筋中的細(xì)胞形成冰晶，剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎，破壞蹄筋內(nèi)固有的細(xì)胞，改變蹄筋及細(xì)胞表面抗原，從而顯著降低蹄筋的抗原性。

本發(fā)明所述的脫細(xì)胞化方法，在反復(fù)凍融破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合核酸酶處理，此方法溫和，脫細(xì)胞效果較好，避免了化學(xué)方法對膠原蛋白的破壞，保留了細(xì)胞外基質(zhì)的糖氨聚糖和特有蛋白屬性，同時(shí)膠原膜片的纖維結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能得以保留。

本發(fā)明選用的原材料為天然豬蹄筋，取材方便，價(jià)格低廉；由于蹄筋來源于豬，因此具有與人類基因較多的同源性；豬蹄筋中含有豐富的膠原蛋白，能增強(qiáng)細(xì)胞生理代謝；所得脫細(xì)胞化膠原膜片結(jié)構(gòu)呈纖維狀平行排列，與心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)相似。

本發(fā)明選用的細(xì)胞為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，因其具有無限增殖的能力，細(xì)胞來源廣泛，無倫理道德因素限制。

采用本發(fā)明所述方法制備的脫細(xì)胞化膠原膜片適用于類心肌組織的構(gòu)建，也適用于骨、神經(jīng)、肌腱組織的構(gòu)建，同時(shí)可以作為多種細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料用于組織工程修復(fù)。所述脫細(xì)胞化膠原膜片滅菌處理后，將心肌細(xì)胞接種于膜片上，采用生物學(xué)上常用的細(xì)胞檢測手段對脫細(xì)胞化膠原膜片上的細(xì)胞進(jìn)行檢測，所述細(xì)胞檢測手段包括細(xì)胞死活染色、免疫熒光染色、電生理檢測。所述膠原膜片能維持心肌細(xì)胞存活，表達(dá)肌鈣蛋白cTnT，心肌細(xì)胞能夠沿著膠原絲方向生長并順絲方向跳動(dòng)，進(jìn)而帶動(dòng)膠原膜片收縮或舒張。

附圖說明

圖1：脫細(xì)胞化膠原膜片的制備流程示意圖。

圖2：脫細(xì)胞化膠原膜片的傅立葉紅外譜圖。

圖3：膠原膜片脫細(xì)胞前后的熒光染色、HE染色和掃描電鏡圖片。

圖4：膠原膜片脫細(xì)胞前后的蛋白表達(dá)熒光圖片。

圖5：脫細(xì)胞化膠原膜片上心肌細(xì)胞的熒光染色圖片。

圖6：脫細(xì)胞化膠原膜片上心肌細(xì)胞的掃描電鏡圖片。

圖7：脫細(xì)胞化膠原膜片上心肌細(xì)胞的順絲跳動(dòng)圖片。

圖8：心肌細(xì)胞帶動(dòng)膠原膜片收縮和舒張的圖片。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

3μm厚度的心肌組織工程脫細(xì)胞化膠原膜片的制備。

清洗豬蹄去除鹽漬和污物，進(jìn)一步清洗去除油污，解剖豬蹄，將豬蹄筋取出，剔除表面筋膜，生理鹽水清洗干凈。獲得長0.5cm，直徑0.5cm的豬蹄筋；將豬蹄筋置于耐低溫的容器內(nèi)，通入液氮，1min后快速轉(zhuǎn)移至盛有37℃生理鹽水的容器內(nèi)，37℃恒溫水浴內(nèi)復(fù)溫5min，反復(fù)凍融5次。將反復(fù)凍融后的蹄筋放入含有100μg/mLDNase和100μg/mLRNase的容器內(nèi)，置于37℃恒溫?fù)u床震蕩12h后，PBS清洗5次，30min/次。將豬蹄筋用OTC冰凍包埋劑包埋，-80℃預(yù)凍2h，利用冰凍切片機(jī)制備出3μm厚的膠原膜片，陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：

30μm厚度的心肌組織工程脫細(xì)胞化膠原膜片的制備。

清洗豬蹄去除鹽漬和污物，進(jìn)一步清洗去除油污，解剖豬蹄，將豬蹄筋取出，剔除表面筋膜，生理鹽水清洗干凈。獲得長2cm，直徑1cm的豬蹄筋；將豬蹄筋置于耐低溫的容器內(nèi)，通入液氮，1min后快速轉(zhuǎn)移至盛有37℃生理鹽水的容器內(nèi)，37℃恒溫水浴內(nèi)復(fù)溫5min，反復(fù)凍融5次。將反復(fù)凍融后的蹄筋放入含有100μg/mLDNase和100μg/mLRNase的容器內(nèi)，置于37℃恒溫?fù)u床震蕩12h后，PBS清洗5次，30min/次。將豬蹄筋用OTC冰凍包埋劑包埋，-80℃預(yù)凍2h，利用冰凍切片機(jī)制備出30μm的膠原膜片，陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1為脫細(xì)胞化膠原膜片的制備流程示意圖，圖2為脫細(xì)胞化膠原膜 片的傅立葉紅外譜圖，由圖2可知，本發(fā)明所述膠原膜片的紅外譜圖與標(biāo)準(zhǔn)的sigma I型膠原的主要出峰位置相似；3299cm^-1附近是N-H伸縮振動(dòng)，1626cm^-1是酰胺I帶的C-O伸縮振動(dòng)，1540cm^-1附近是酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動(dòng)，1438～1226cm^-1附近的吸收峰表明了膠原蛋白3股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。1226cm^-1(0.157)與1438cm^-1(0.160)的峰強(qiáng)度比值為0.98，非常接近膠原特征值1.0。由此可見，制備脫細(xì)胞化膜片主要成分為I型膠原。本發(fā)明對膠原膜片的脫細(xì)胞效果進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示，脫細(xì)胞的膠原膜片均不表達(dá)F-actin和DAPI(圖3.A-B)，HE染色進(jìn)一步證明了脫細(xì)胞化效果良好(圖3.C-D)。掃描電鏡圖片顯示脫細(xì)胞后膠原膜片表面結(jié)構(gòu)和厚度均無明顯變化(圖3.E-H)。脫細(xì)胞的膠原膜片仍表達(dá)I型膠原和糖氨聚糖(圖4)，可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

實(shí)施例3：

脫細(xì)胞化膠原膜片的細(xì)胞培養(yǎng)以及心肌組織構(gòu)建。

利用實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞化膠原膜片，構(gòu)型如圖1所示。將脫細(xì)胞化膠原膜片浸泡于75％乙醇，紫外滅菌2h，含有10％雙抗的PBS溶液浸泡過夜，采用matrigel進(jìn)行表面修飾后脫細(xì)胞化膠原膜片接種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，接種密度為3×10⁶個(gè)/mL，24h細(xì)胞貼壁后換液，細(xì)胞培養(yǎng)3天后，每天顯微鏡觀察細(xì)胞死活、心肌跳動(dòng)情況；細(xì)胞培養(yǎng)7天后，進(jìn)行相關(guān)染色，細(xì)胞增殖、表型維持等功能檢測，Image Pro軟件分析，結(jié)果見圖5-8。

所述膠原膜片能維持心肌細(xì)胞存活，心肌細(xì)胞以單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)形式 生長，表達(dá)肌鈣蛋白cTnT，同時(shí)產(chǎn)生肌節(jié)結(jié)構(gòu)(圖5)。心肌細(xì)胞能夠沿著膠原絲方向生長(圖6)并順絲方向跳動(dòng)(圖7)，進(jìn)而帶動(dòng)膠原膜片收縮或舒張(圖8)。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。