本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雙級(jí)靶向三元復(fù)合物非病毒核酸遞釋系統(tǒng)及其制備方法，具體涉及一種D型IF-7多肽修飾的還原性樹(shù)枝狀高分子(RHB)自組裝雙靶向三元復(fù)合物核酸遞送系統(tǒng)及其制備方法。

背景技術(shù)：

基因治療是當(dāng)前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)；該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵是需要安全、高效的基因給藥載體系統(tǒng)。與病毒載體相比，非病毒載體具有毒性低、易于合成、免疫反應(yīng)低、可靶向性修飾等特點(diǎn)。陽(yáng)離子聚合物是目前研究較多的一種非病毒基因遞送載體，常用的有聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)、殼聚糖及其衍生物、聚賴(lài)氨酸(Poly(L-lysine)，PLL)、聚脒、聚氨基酯和樹(shù)狀高分子(Dendrimers)等。陽(yáng)離子聚合物載體表面的正電荷可以與細(xì)胞膜表面產(chǎn)生靜電吸附，被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，所以該類(lèi)基因遞送載體系統(tǒng)具有較高的體外轉(zhuǎn)染效率。

目前，所述陽(yáng)離子聚合物載體的體內(nèi)應(yīng)用遠(yuǎn)不如病毒載體的效果，還存在下述許多問(wèn)題亟待解決：

①毒性大：陽(yáng)離子聚合物表面具有大量的正電荷，容易與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的多糖蛋白復(fù)合物發(fā)生靜電作用，引起細(xì)胞毒性；此外，所述陽(yáng)離子聚合物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)很容易發(fā)生聚集、引起紅細(xì)胞凝集，引起機(jī)體毒性，降低體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率；有研究表明，有些陽(yáng)離子聚合物(如PEI)在細(xì)胞內(nèi)釋放出核酸后，聚合物骨架仍然滯留、蓄積在機(jī)體內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞和機(jī)體毒性；

②穩(wěn)定性差：所述陽(yáng)離子聚合物與核酸壓縮形成的復(fù)合物容易與體內(nèi)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)如酶、免疫球蛋白、白蛋白等靜電結(jié)合，使已形成的復(fù)合物解離，不僅降低了復(fù)合物的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，還會(huì)影響正常的生理功能；

③特異性差：所述陽(yáng)離子聚合物與核酸形成的復(fù)合物對(duì)腫瘤無(wú)特異性，與正常細(xì)胞也能發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而引發(fā)肝毒性、腎毒性等；因此，普通的陽(yáng)離子聚合物非病毒載體不能高效地將治療基因經(jīng)靜脈給藥后遞送到靶組織細(xì)胞發(fā)揮疾病治療作用，當(dāng)前非常必要研究高效、低毒、靶向性好、安全的非病毒基因遞送系統(tǒng)。

研究顯示，在聚合物載體材料中，樹(shù)枝狀高分子是高度分支的聚合物，具有單分散性和完全均一的分子結(jié)構(gòu)；有研究公開(kāi)了一種還原型聚氨基胺(RHB)是一類(lèi)由雙丙烯酰胺與三胺 單體發(fā)生Michael加成聚合得到樹(shù)枝狀高分子聚合物，該聚合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可通過(guò)聚合溫度來(lái)加以控制，當(dāng)反應(yīng)溫度提高到48℃以上，即可導(dǎo)致形成超樹(shù)枝化的聚合物；目前RHB僅用于體外轉(zhuǎn)染，尚未見(jiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)染的報(bào)道；其原因是RHB/核酸復(fù)合物表面帶大量正電荷，對(duì)腫瘤靶向性差、血清穩(wěn)定性低，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，基因難以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)；因此，增強(qiáng)RHB/核酸復(fù)合物的腫瘤靶向性、降低表面正電荷性是非病毒基因遞送載體體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種具有穩(wěn)定，低毒，高效轉(zhuǎn)染及靶向性的雙級(jí)靶向三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)，進(jìn)一步用作轉(zhuǎn)染試劑和非病毒基因遞釋載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基于靜電包衣的雙級(jí)靶向三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)，具體涉及一種D型IF-7多肽修飾的還原性樹(shù)枝狀高分子(RHB)自組裝雙靶向核酸遞送系統(tǒng)；該遞送系統(tǒng)具有穩(wěn)定，低毒，高效轉(zhuǎn)染，通過(guò)二硫鍵的生物可降解性以及靶向性的優(yōu)點(diǎn)，可用作轉(zhuǎn)染試劑和非病毒基因遞釋載體。

本發(fā)明針對(duì)腫瘤微環(huán)境和靜脈給藥途徑的特點(diǎn)，克服陽(yáng)離子聚合物載體的局限性，提供了一種新型雙靶向功能自組裝三元復(fù)合物基因遞送載體；選用雙(丙稀酰)胱胺(CBA)和甲叉雙丙烯酰胺(MBA)與1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)為單體，按適當(dāng)摩爾比混合通過(guò)邁克爾加成合成還原型RHB作為載體材料，RHB與質(zhì)粒DNA或siRNA自組裝壓縮成納米級(jí)復(fù)合物，再以靶向腫瘤血管上皮細(xì)胞Anxa1受體的RIF7肽修飾的帶負(fù)電荷且具有CD44受體靶向的HA對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行靜電包衣，形成具有雙靶向功能的RIF7-HA/RHB/DNA或siRNA三元復(fù)合物系統(tǒng)；對(duì)載體進(jìn)行Anxa1受體、CD44雙靶向功能修飾后，納米載體可成功逐級(jí)跨越腫瘤血管屏障和腫瘤細(xì)胞膜屏障，增強(qiáng)納米載體在腫瘤部位的蓄積，進(jìn)一步增加在體內(nèi)對(duì)核酸藥物的遞送，構(gòu)建制得安全、有效、穩(wěn)定的靶向性非病毒遞送載體系統(tǒng)。

基于現(xiàn)有技術(shù)的理論基礎(chǔ)，本申請(qǐng)中，巧妙的引入逆序D型技術(shù)對(duì)IF7多肽進(jìn)行改造，合成了RIF7多肽，在不影響多肽靶向性的基礎(chǔ)上，提高多肽在血漿中的穩(wěn)定性，根據(jù)HA和RIF7的分子結(jié)構(gòu)，將RIF7多肽結(jié)合到HA的分子結(jié)構(gòu)上，彼此不會(huì)影響各自的靶向能力，形成具有雙靶向的載體功能元件。

本發(fā)明中，選用的單體分別為CBA和MBA，制成的RHB結(jié)構(gòu)中的大量胺基，進(jìn)入溶酶體后產(chǎn)生“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，保護(hù)DNA或siRNA不被溶酶體破壞。由于RHB結(jié)構(gòu)中存在二硫鍵，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下被細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽還原降解，使RHB高聚物降解成小分子化合物，不僅可提高基因藥物的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，且明顯降低材料的細(xì)胞毒性。

本發(fā)明中，選擇透明質(zhì)酸為靜電包衣的陰離子聚合物；除了作為靜電包衣材料，HA還可特異性靶向腫瘤細(xì)胞表面CD44受體，由于CD44受體介導(dǎo)的HA腫瘤細(xì)胞靶向僅僅解決了腫瘤細(xì)胞膜屏障，不能有效解決納米遞送系統(tǒng)在傳遞過(guò)程中遇到的腫瘤血管上皮屏障；因此，在以HA靶向腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，本發(fā)明選擇一種特異性靶向腫瘤細(xì)胞膜的配體作為遞送系統(tǒng)的另外一個(gè)靶向頭基；所述IF7肽易與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性高表達(dá)的受體Anxa1結(jié)合；所述IF7雖然具有很強(qiáng)的靶向Anxa1受體的能力，但是與所有的L型多肽類(lèi)似，IF7的穩(wěn)定性非常差，對(duì)多肽進(jìn)行逆序D型改造能顯著增強(qiáng)多肽的穩(wěn)定性和抗蛋白酶活性，并且不影響多肽的生物功能，

具體的，本發(fā)明中，選用聚氨基胺樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物材料與質(zhì)粒DNA形成RHB/DNA二元復(fù)合物，作為所述三元復(fù)合物的內(nèi)核：

本發(fā)明通過(guò)還原性樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物聚氨基胺(RHB)自主壓縮質(zhì)粒DNA形成二元復(fù)合物；采用逆序D型技術(shù)對(duì)靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體Anxa1的IF7多肽進(jìn)行改造，合成了RIF7多肽；通過(guò)酰胺反應(yīng)將RIF7多肽結(jié)合到靶向腫瘤細(xì)胞表面CD44受體的HA的分子結(jié)構(gòu)上，合成雙靶向包衣材料；通過(guò)靜電作用對(duì)形成的RHB/DNA二元復(fù)合物進(jìn)行包衣，形成靶向三元復(fù)合物核酸遞釋系統(tǒng)，制得D型IF-7多肽修飾的還原性樹(shù)枝狀高分子(RHB)自組裝雙靶向核酸遞送系統(tǒng)。

本發(fā)明中，解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝合理，生產(chǎn)成本低，操作簡(jiǎn)單，毒性較低的聚氨基胺及化學(xué)合成方法；即提供一種可生物降解的聚氨基胺聚合物及化學(xué)合成方法；所述可降解的聚氨基胺是由雙(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉雙丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)通過(guò)邁克爾加成而制得；該聚氨基胺是可生物降解的基因傳送聚合物之一，與非生物可降解的陽(yáng)離子聚合物比較，毒性低，更具有體內(nèi)傳送基因的潛力；

所述聚氨基胺的組分及含量為雙丙烯酰胺與三胺摩爾比為2:1；

其合成方法為：按摩爾比(1：2：1.5)分別精密稱(chēng)取雙(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉雙丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)，將CBA和MBA加入盛有AEPZ甲醇/水混合液(7/3，v/v)的圓底燒瓶中，磁力攪拌、N2保護(hù)、避光，50℃油浴反應(yīng)3d，得到粘稠溶液；加入少量4-氨基-1-丁醇(ABOL)，50℃繼續(xù)攪拌12h；將產(chǎn)物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸餾水透析2d，凍干，稱(chēng)重，制得所述RHB，其中可降解的聚氨基胺的分子量為60kDa。

本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案中，在反應(yīng)過(guò)程中不需要加催化劑；所述兩種雙丙烯酰胺單體為雙(丙稀酰)胱胺(CBA)和甲叉雙丙烯酰胺(MBA)(任意摩爾比)與三胺單體通過(guò)Michael加成反應(yīng)而得；

其反應(yīng)方程式為：

本發(fā)明中，解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種可對(duì)RHB/DNA二元復(fù)合物進(jìn)行靜電包衣修飾的陰離子高分子生物材料；

所涉及的陰離子高分子生物材料為透明質(zhì)酸(HA)；所述HA可特異性靶向腫瘤細(xì)胞表面CD44受體；由于CD44受體介導(dǎo)的HA腫瘤細(xì)胞靶向僅僅解決了腫瘤細(xì)胞膜屏障，不能有效解決納米遞送系統(tǒng)在傳遞過(guò)程中遇到的腫瘤血管上皮屏障，為進(jìn)一步加強(qiáng)復(fù)合物的靶向能力，本發(fā)明人在HA上通過(guò)酰胺反應(yīng)鍵合特異性靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體Anxa1的IF7多肽；由于IF7的體內(nèi)的穩(wěn)定性非常差，因此，對(duì)其進(jìn)行了逆序D型改造，合成了穩(wěn)定性明顯提高而特異性不變的RIF7多肽；解決該技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種合成RIF7-HA的方法；解決該技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是利用酰胺反應(yīng)使RIF7與HA合成RIF7-HA；本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案中說(shuō)明，該反應(yīng)的反應(yīng)溶劑為水；將HA的羧基活化后在pH7.4條件下進(jìn)行反應(yīng)。

本發(fā)明中，解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種靶向三元非病毒載體系統(tǒng)的制備方法；該三元體系是由上述的RHB、DNA、RIF7-HA制備而成；本發(fā)明中通過(guò)靜電吸附理論，所述RHB與質(zhì)粒DNA自組裝形成RHB/DNA復(fù)合物，進(jìn)一步采用RIF7-HA對(duì)RHB/DNA二元復(fù)合物進(jìn)行靜電包衣，形成RIF7-HA/RHB/DNA靶向三元復(fù)合物；一方面可利用HA的負(fù)電荷降低RHB/DNA復(fù)合物表面的正電荷，從而降低復(fù)合物的毒性，另一方面可利用高分子之間產(chǎn)生的較強(qiáng)的靜電作用力，長(zhǎng)時(shí)間保持載體系統(tǒng)在血清中的穩(wěn)定性，因此，為該載體系統(tǒng)體內(nèi)轉(zhuǎn)染提供了希望；進(jìn)一步，所述載體系統(tǒng)包衣層的靶向功能可增加復(fù)合物在腫瘤部位的蓄 積，明顯提高其治療效果。

具體而言，本發(fā)明的D型IF-7多肽修飾的還原性樹(shù)枝狀高分子(RHB)自組裝雙靶向核酸遞送系統(tǒng)的制備方法包括，將還原性樹(shù)枝狀聚合物聚氨基胺(RHB)與含有報(bào)告基因或治療基因的質(zhì)粒DNA或小干擾RNA(siRNA)于水溶液中混合后，渦旋5s，靜置5min，經(jīng)自組裝壓縮得到RHB/DNA二元復(fù)合物載體系統(tǒng)；根據(jù)靜電吸附理論，采用逆序D型改造的IF7靶向修飾的透明質(zhì)酸(HA)進(jìn)一步對(duì)RHB/DNA二元復(fù)合物載體系統(tǒng)進(jìn)行靜電包衣，制得靶向三元復(fù)合物載體系統(tǒng)；

本發(fā)明中，所述還原性樹(shù)枝狀聚合物RHB由兩種雙丙烯酰胺單體與三胺單體發(fā)生Michael加成制備而成，并可通過(guò)功能化基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行修飾；

本發(fā)明中，進(jìn)一步靜電包衣修飾的材料為逆序D型改造的IF7修飾的透明質(zhì)酸(HA)；

本發(fā)明中，所述氨基酸序列為RQWLLFI，所有的氨基酸均為D型氨基酸；

本發(fā)明中，合成所述的雙級(jí)靶向靜電包衣材料的方法，包括以下步驟：

精密稱(chēng)取HA(7.5kD)溶解于PBS(pH7.4)磁力攪拌至澄清，加入EDC·HCL和HOBT，繼續(xù)攪拌2h；將等摩爾的RIF7相關(guān)肽用三蒸水溶解后逐滴加入活化的HA溶液中，加入適量的NaCl，加入N-甲基嗎啉調(diào)節(jié)pH至7.4；攪拌過(guò)夜，用分子量3500的透析袋透析，除去未反應(yīng)的多肽，凍干制得RIF7-HA；

本發(fā)明中，合成所述的可降解的還原性樹(shù)枝狀聚合物RHB的方法，包括以下步驟：

按摩爾比(1：2：1.5)分別精密稱(chēng)取雙(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉雙丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)，將CBA和MBA加入盛有AEPZ甲醇/水混合液(7/3，v/v)的圓底燒瓶中，磁力攪拌、N2保護(hù)、避光，50℃油浴反應(yīng)3d，得到粘稠溶液，加入少量4-氨基-1-丁醇(ABOL)，50℃繼續(xù)攪拌12h。將產(chǎn)物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸餾水透析2d，凍干，稱(chēng)重，制得RHB；

本發(fā)明中，所述還原性樹(shù)枝狀聚合物RHB及其化學(xué)合成方法，反應(yīng)所需兩種雙丙烯酰胺單體為雙(丙稀酰)胱胺(CBA)，甲叉雙丙烯酰胺(MBA)，三胺單體為1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)；

所述雙(丙稀酰)胱胺(CBA)、甲叉雙丙烯酰胺(MBA)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)配比(摩爾比)為1：2：1.5，雙丙烯酰胺與三胺的摩爾比為2:1；

其化學(xué)合成原理為Michael加成；

其反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間3d，避光，氮?dú)獗Ｗo(hù)；

其反應(yīng)過(guò)程不需要加催化劑；

所述的還原性樹(shù)枝狀聚合物RHB的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為樹(shù)枝狀，并可生物降解；

本發(fā)明中，所述的雙級(jí)靶向靜電包衣材料RIF7-HA及其制備方法，其化學(xué)合成原理為酰胺合成反應(yīng)。

本發(fā)明的實(shí)施例的方案中提供了一種轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，該方法包含用載體系統(tǒng)壓縮核酸分子接觸細(xì)胞，借此傳送核酸分子進(jìn)入細(xì)胞；該實(shí)施方案中所涉及的核酸分子包括DNA，小干擾RNA(siRNA)。

本發(fā)明通過(guò)還原性樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物聚氨基胺(RHB)自主壓縮質(zhì)粒DNA形成二元復(fù)合物；采用逆序D型技術(shù)對(duì)靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體Anxa1的IF7多肽進(jìn)行改造，合成了RIF7多肽；通過(guò)酰胺反應(yīng)將RIF7多肽結(jié)合到靶向腫瘤細(xì)胞表面CD44受體的HA的分子結(jié)構(gòu)上，合成雙靶向包衣材料；通過(guò)靜電作用對(duì)形成的RHB/DNA二元復(fù)合物進(jìn)行包衣，形成靶向三元復(fù)合物核酸遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明所述遞送系統(tǒng)可有效壓縮和包裹質(zhì)粒DNA，通過(guò)雙級(jí)靶向作用使復(fù)合物逐級(jí)跨越腫瘤血管屏障和腫瘤細(xì)胞膜屏障，提高基因的轉(zhuǎn)染效率，降低載體系統(tǒng)的毒性。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1是合成產(chǎn)物RHB和RIF7-HA的¹H-NMR核磁圖譜(圖1A為RHB，圖1B為RIF7-HA)，結(jié)果表明合成成功。

圖2是透射電鏡下RHB/DNA二元體系和RIF7-HA/RHB/DNA三元體系的形態(tài)(圖2a為RHB/DNA二元體系，圖2b為RIF7-HA/RHB/DNA三元體系)。

圖3是用凝膠阻滯電泳分析證明RHB對(duì)質(zhì)粒DNA的壓縮能力及按不同質(zhì)量比加入HA后瓊脂糖凝膠電泳的變化情況，圖3A表示不同質(zhì)量比RHB對(duì)質(zhì)粒DNA的壓縮能力(lane 1-8分別表示Marker、RHB/DNA(w/w)0:1,1:1,2.5:1,5:1,10:1,50:1,100:1)；圖3B表示按不同質(zhì)量比加入HA后瓊脂糖凝膠電泳的變化情況(lane 1-6分別表示Marker、HA/RHB/DNA質(zhì)量 比為0:5:1,1:5:1,2.5:5:1,5:5:1)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RHB對(duì)質(zhì)粒DNA具有較強(qiáng)的壓縮能力，同時(shí)加入HA包衣后RHB/DNA二元體系仍保持穩(wěn)定。

圖4是經(jīng)HA包衣前后，RHB/DNA對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性(圖4A表示靜電包衣前，RHB/DNA對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性；圖4B表示靜電包衣后，HA/RHB/DNA三元體系對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性)；結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RHB/DNA小于5:1時(shí)，毒性作用顯著低于Lipofectamine^TM2000，而HA/RHB/DNA三元體系在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性隨著HA量的增加逐漸降低，并且均顯著低于Lipofectamine^TM2000。

圖5表示載有報(bào)告基因pEGFP的二元復(fù)合物轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞的熒光顯微照片(A)以及流式細(xì)胞儀定量結(jié)果(B)；顯示隨著RHB/DNA質(zhì)量比的增加，轉(zhuǎn)染效率提高，當(dāng)RHB/DNA質(zhì)量比為5:1或10:1時(shí)，二元復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率與陽(yáng)離子脂質(zhì)體組相當(dāng)。

圖6為載有報(bào)告基因pEGFP的靶向三元復(fù)合物轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞的熒光顯微照片(A)以及流式細(xì)胞儀定量結(jié)果(B)，其中顯示，在無(wú)血清條件下，RIF7-HA/RHB/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率高于RHB/DNA復(fù)合物，達(dá)到85％左右，隨著血清比例的增加，RIF7-HA/RHB/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率一直保持較高水平，說(shuō)明RIF7-HA/RHB/DNA具有更好的血漿耐受性，證明對(duì)多肽靶頭進(jìn)行逆序D型改造對(duì)于增強(qiáng)復(fù)合物載體系統(tǒng)的靶向性具有重要的意義。

圖7是荷蟲(chóng)熒光素酶肺腫瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射復(fù)合物后腫瘤部位實(shí)時(shí)熒光分布圖，其中以陰性siRNA為對(duì)照組，圖中顯示，RHB/siRNA二元復(fù)合物組在注射后48h腫瘤部位熒光強(qiáng)度仍然很高，說(shuō)明二元復(fù)合物系統(tǒng)不能有效將siRNA遞送到腫瘤部位，使蟲(chóng)熒光素表達(dá)降低；HA/RHB/siRNA三元復(fù)合物組注射后24h熒光強(qiáng)度變化不大，48h后觀察到部分降低，而靶向三元復(fù)合物RIF7-HA/RHB/siRNA給藥后24h即出現(xiàn)明顯的沉默蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)效果，48h進(jìn)一步增強(qiáng)，直觀地反映了復(fù)合物體系在腫瘤部位的蓄積過(guò)程；所述的靶向三元復(fù)合物體系可以將治療基因成功遞送到腫瘤部位，并成功完成體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

具體實(shí)施方式

通過(guò)下列實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不局限于此。

實(shí)施例1：合成樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物聚氨基胺(RHB)的方法

精密稱(chēng)取CBA(0.260g，1.0mmol)、MBA(0.308g，2.0mmol)，加入盛有AEPZ(0.193g，1.5mmol)甲醇/水混合液(3.5mL，7/3，v/v)的圓底燒瓶中，磁力攪拌、N2保護(hù)、避光，50℃油浴反應(yīng)3d，得到粘稠溶液。加入少量4-氨基-1-丁醇，50℃繼續(xù)攪拌12h。將產(chǎn)物溶液HCL水溶液(pH＝3)透析1d，蒸餾水透析2d，凍干，稱(chēng)重，制得RHB。

實(shí)施例2：合成RIF7修飾的HA(RIF7-HA)的方法

精密稱(chēng)取HA(7.5kD，50mg，0.005mmol)溶解于PBS(5ml，pH7.4)磁力攪拌至澄清，加入EDC·HCL(20mg，0.1mmol)和HOBT(15mg，0.1mmol)，繼續(xù)攪拌2h。將11.8mgRIF7相關(guān)肽用5ml三蒸水溶解后逐滴加入活化的HA溶液中，加入適量的NaCl，加入140μlN-甲基嗎啉調(diào)節(jié)pH至7.4。攪拌過(guò)夜，用分子量3500的透析袋透析，除去未反應(yīng)的多肽，凍干。

實(shí)施例3：制備RHB/DNA復(fù)合物納米粒的方法

陽(yáng)離子聚合物RHB與DNA自組裝形成納米粒；分別制備1μg/μl的聚合物RHB的水溶液和1μg/μl的DNA水溶液，按照聚合物RHB與DNA的質(zhì)量比(w/w)取相應(yīng)體積的母液分散于pH7.4的PBS中，然后與等體積的DNA溶液混合，渦旋5s并室溫下靜置孵育5min，制得RHB/DNA二元復(fù)合物納米粒。

實(shí)施例4：制備RIF7-HA/RHB/DNA靶向三元復(fù)合物

分別制備1μg/μl的聚合物RHB的水溶液和1μg/μl的DNA水溶液，按照聚合物RHB與DNA的質(zhì)量比(w/w)取相應(yīng)體積的母液分散于pH7.4的PBS中，然后與等體積的DNA溶液混合，渦旋5s并室溫下靜置孵育5min，即得RHB/DNA二元復(fù)合物納米粒；加入適量體積的1μg/μl的RIF7-HA水溶液，混合均勻，室溫下孵育30min，得RIF7-HA/RHB/DNA三元復(fù)合物納米粒。

實(shí)施例5：凝膠電泳阻滯試驗(yàn)

為了證明陽(yáng)離子聚合物RHB對(duì)DNA的壓縮能力和HA的加入對(duì)RHB/DNA二元復(fù)合物的影響，10μl二元復(fù)合物或三元復(fù)合物(含500ng質(zhì)粒DNA)與2μlloading buffer均勻混合，加樣至0.7％瓊脂糖凝膠板中，TBE緩沖溶液中100V電壓進(jìn)行凝膠電泳阻滯試驗(yàn)。

實(shí)施例6：RHB/DNA的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法評(píng)價(jià)二元復(fù)合物對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性作用，以5000個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24hr后，用無(wú)血清培養(yǎng)基置換，分別加入RHB/DNA二元復(fù)合物納米粒，使最終每孔中質(zhì)粒為0.2μg，Lipofectamine^TM2000為對(duì)照組，4hr后去除納米粒培養(yǎng)基，每孔加入100μl新鮮的含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48hr后，吸棄原有培液，每孔加入180μlPBS和20μlMTT溶液(5mg/ml)在37℃孵育4hr，吸棄MTT溶液，每孔加入150μl DMSO，混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，以570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。

實(shí)施例7：HA/RHB/DNA的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法評(píng)價(jià)三元復(fù)合物對(duì)B16F10細(xì)胞的毒性作用，以5000個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24hr后，用無(wú)血清培養(yǎng)基置換，分別加入HA/RHB/DNA三元復(fù)合物納米粒，使最終每孔中質(zhì)粒為0.2μg，Lipofectamine^TM2000為對(duì)照組，4hr后去除納米粒培養(yǎng)基，每孔加入100μl新鮮的含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48hr后，吸棄原有培液，每孔加入180μlPBS和20μlMTT溶液(5mg/ml)在37℃孵育4hr。吸棄MTT溶液，每孔加入150μlDMSO，混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，以570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。

實(shí)施例8：RHB/DNA介導(dǎo)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的體外轉(zhuǎn)染

B16F10細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/0.5ml/孔均勻接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80-90％時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染操作，吸棄舊的培養(yǎng)液，每孔加入0.4ml新鮮的不含血清培養(yǎng)液，然后將制備好的復(fù)合物加入(約100μl)，每孔中質(zhì)粒為0.8μg，每種處方做兩個(gè)或者三個(gè)復(fù)孔，輕輕搖動(dòng)24孔板使復(fù)合物均勻存在于孔中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4hr后，吸棄含有復(fù)合物的培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌一遍，換上含10％FBS的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，每天換以新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr；同時(shí)操作陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine^TM2000作為陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例9：RIF7-HA/RHB/DNA介導(dǎo)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的體外轉(zhuǎn)染

B16F10細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/0.5ml/孔均勻接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80-90％時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染操作，吸棄舊的培養(yǎng)液，每孔加入0.4ml新鮮的不含血清培養(yǎng)液，然后將制備好的復(fù)合物加入(約100μl)，每孔中質(zhì)粒為0.8μg，每種處方做兩個(gè)或者三個(gè)復(fù)孔，輕輕搖動(dòng)24孔板使復(fù)合物均勻存在于孔中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr后，吸棄含有復(fù)合物的培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌一遍，換上含10％FBS的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，每天換以新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr；同時(shí)操作陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine^TM2000作為陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例10：細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的評(píng)定

(1)熒光顯微鏡下觀察評(píng)價(jià)綠色熒光蛋白報(bào)告基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染48hr后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌兩遍，每孔加入2滴HBSS，于顯微鏡下觀察拍照；

(2)流式細(xì)胞儀法評(píng)價(jià)綠色熒光蛋白報(bào)告基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染48hr后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌兩遍，胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞至1.5ml EP管中，1500rpm，5min離心，棄上清，每管中加入適量的PBS，使細(xì)胞濃度在5×10⁵個(gè)/ml，細(xì)胞重懸均勻后，上機(jī)測(cè)試，每次測(cè)試計(jì)數(shù)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

實(shí)施例11：Luciferase(GL2+GL3)siRNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將蟲(chóng)熒光素肺癌A549-Luc細(xì)胞按常規(guī)條件培養(yǎng)，制備2×10⁶/mL的單細(xì)胞懸液，接種到BALB/c裸鼠右腋皮下，每只接種0.2mL，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-200mm³進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；制備RIF7-HA/RHB/siRNA三元復(fù)合物，立即尾靜脈注給藥，每只給藥300μL；麻醉后在小動(dòng)物活體成像儀上觀察拍照，拍照前5分鐘腹腔注射蟲(chóng)熒光素酶底物(150mg/kg)，轉(zhuǎn)染24h或48h后再次拍照。