本發(fā)明屬于中草藥技術(shù)領(lǐng)域，特別提供一種通過酶促反應(yīng)而制備富含黃酮苷元的射干高效飲片及其提取物的工藝。

背景技術(shù)：

射干為鳶尾科植物射干Belamcanda chinensis(L.)DC.干燥根莖的加工品，具有清熱解毒，消痰，利咽的功效。多用于熱毒痰火郁結(jié)，咽喉腫痛，痰涎壅盛，咳嗽氣喘。作為治療上呼吸道疾病之要藥，射干中含有黃酮類及其衍生物、酮類、酚類、苯類、二環(huán)三萜類、甾類及揮發(fā)性成分。其中黃酮類成分作為主要的藥理活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒的作用。

射干中已報(bào)道的黃酮類成分(包括苷及苷元)有30余種，其中關(guān)于鳶尾苷(tectoridin)、鳶尾苷元(tectorigenin)、野鳶尾苷(iridin)和野鳶尾苷元(irigenin)等的活性研究報(bào)道較多。研究表明射干中黃酮苷元類成分(鳶尾黃素、野鳶尾黃素)在抗炎、抗氧化、抑菌等活性較相應(yīng)的苷類成分(鳶尾苷、野鳶尾苷)強(qiáng)。

以射干中的鳶尾苷苷元和鳶尾苷分別治療炎癥，發(fā)現(xiàn)二者均可以抑制12-O-十四酰佛波-13-乙酸酯或毒胡蘿卜素對(duì)環(huán)氧合酶-2的誘導(dǎo)作用，抑制前列腺素E₂(PGE₂)的產(chǎn)生，并且鳶尾苷元抑制PGE₂的產(chǎn)生能力強(qiáng)于鳶尾苷。

采用生物化學(xué)發(fā)光法測(cè)得射干根莖中分離得到的異黃酮成分野鳶尾苷元、鳶尾苷元、鳶尾苷、5，6，7，4′-四羥基-8-甲氧基異黃酮均具有清除自由基的作用，其中鳶尾苷元對(duì)自由基清除作用的能力最強(qiáng)。

采用單細(xì)胞生物測(cè)定法對(duì)射干的抗菌作用進(jìn)行了研究。通過硅膠凝膠色譜柱和反相HPLC分離出活性組分為鳶尾苷元。采用17種真菌和6種細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鳶尾苷元對(duì)發(fā)癬菌屬的皮膚癬菌有顯著的抑菌作用。

然而，中藥射干中的苷元含量有限，若是通過一定的方法人為的來促進(jìn)苷類成分降解成苷元，對(duì)于提高飲片的臨床療效就具有積極的意義。

大孔吸附樹脂吸附技術(shù)最早用于廢水處理、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、分析化學(xué)、臨床檢定和治療等領(lǐng)域，近年來在我國(guó)已廣泛用于中草藥有效成分的提取、分離、純化工作中。與中藥制劑傳統(tǒng)工藝比較，應(yīng)用大孔吸附樹脂技術(shù)所得提取物體積小、不吸潮、易制成外型美觀的各種劑型，特別適用于顆粒劑、膠囊劑和片劑，改變了傳統(tǒng)中藥制劑的粗、黑、大現(xiàn)象，有利于中藥制劑劑型的升級(jí)換代，促進(jìn)了中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展。在射干的總黃酮提取中，也有吸附樹脂分離的報(bào)道，但是到目前為止，所報(bào)道的方法中，皆是制備總黃酮提取物，沒有以分離黃酮苷元為目標(biāo)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種富含黃酮苷元的射干飲片及其提取物的制備工藝，該工藝可以顯著提高射干飲片中的黃酮苷元的含量，從而提高飲片在抗菌消炎等方面的功效。以此為原料，通過大孔吸附樹脂技術(shù)進(jìn)一步對(duì)總苷元進(jìn)行富集、純化，為下一步開展的制劑開發(fā)提供保證。

本發(fā)明所述富含黃酮苷元的射干飲片的制備方法，其特征在于：在 25-55℃的條件下，在中藥射干中加入β-葡萄糖苷酶，并浸泡在pH＝4-5的緩沖液中，β-葡萄糖苷酶的加入量為2000-6000萬U/kg，浸泡24-48小時(shí)，取出，瀝干水分，干燥，篩去碎屑，制成富含黃酮苷元的射干飲片，該射干飲片中黃酮苷元鳶尾黃素及野鳶尾黃素含量高于原射干藥材1倍以上。所述射干為射干原藥材、原藥材切制的飲片或破碎后的藥材粉末。

其中，所述β-葡萄糖苷酶的活性為：10000U-100000U/mg，緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉或檸檬酸-磷酸氫二鈉，所述緩沖液的加入體積優(yōu)選為射干藥材重量的3-6倍(L/Kg)。在緩沖液中浸泡后取出，干燥溫度在40-60℃。

本發(fā)明還提供了一種利用以上方法制備得到的射干飲片制備射干提取物的方法，其特征在于：所述射干飲片經(jīng)水提或醇提后調(diào)整含醇量為0～30％的上清液上于大孔吸附樹脂柱上，先用1～2倍量柱體積含醇量為25-40％的溶液洗脫，續(xù)用2-5倍柱體積、體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓干燥至干得富含黃酮苷元的射干提取物。

本發(fā)明所述制備射干提取物的方法，其特征在于，所述水提或醇提過程以及工藝參數(shù)為：中藥射干，加6～10倍pH為7.5～9的水或純度為20～70％的稀乙醇，在40～70℃條件下，浸泡1～2小時(shí)，回流提取2～3次，濾過，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收水或乙醇，調(diào)整為含醇量為0～30％的上清液，至每1ml含0.2～0.5g藥材的藥液，靜置12～24小時(shí)，除去沉淀。

本發(fā)明所述制備射干提取物的方法，其特征在于：所述大孔吸附樹脂柱為苯乙烯類大孔吸附樹脂柱。

本發(fā)明所述制備射干提取物的方法，其特征在于：上清液上于NKA-9、X-5、AB-8、S-8、HPD450、HPD500或HPD600的苯乙烯類大孔吸附樹脂 上，先用1～2倍量柱體積含醇量為0～30％的溶液洗脫，續(xù)用2～5倍柱體積、體積分?jǐn)?shù)為30～80％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓干燥至干得射干提取物。

本發(fā)明所述制備射干提取物的方法，其特征在于，具體制備工藝如下：

在45℃的條件下，在射干飲片中加入β-葡萄糖苷酶，并浸泡在pH＝4-5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，β-葡萄糖苷酶的加入量為2000-6000萬U/kg，緩沖液的加入體積為射干藥材重量的3-6倍，浸泡24-48小時(shí)，取出，瀝干水分，于40-60℃條件下干燥，篩去碎屑；飲片經(jīng)水提或醇提后調(diào)整為含醇量為0～30％的上清液上于大孔吸附樹脂柱上，先用1～2倍量柱體積含醇量為30％的溶液洗脫，續(xù)用3倍柱體積、體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓干燥至干，即得射干提取物。

本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)單，所得射干提取物的雜質(zhì)含量低。

附圖說明

圖1市售未經(jīng)處理的射干飲片。

圖2經(jīng)處理的射干飲片。

圖3射干提取物(注：A，鳶尾苷；B，野鳶尾苷；C，鳶尾黃素；D，野鳶尾黃素)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

射干中總苷元酶法轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化

儀器：Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫公司)，Phenomenex色譜柱(Phenomenex Synergi 4u polar-RP 80A 250×4.6mm 4micron)，PHS-25C PH計(jì)(上海唐儀儀器有限公司)，KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

試藥：射干飲片(安徽滬譙中藥飲片廠，批號(hào)：20141120)；檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140415)、檸檬酸鈉(沈陽試劑一廠，批號(hào)：880703)；β-葡萄糖苷酶(湖北大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20150103效價(jià)：10萬U/mg)。

以射干中的總苷及總苷元的含量為考察指標(biāo)，對(duì)射干中總苷元酶法轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其最優(yōu)工藝為每100g飲片，在45℃的條件下，加入400萬單位的β-葡萄糖苷酶及4倍體積的pH 4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，浸泡24小時(shí)。確定的最佳工藝條件下3批成品的驗(yàn)證結(jié)果如表1.

表1試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例2

用商品化D101大孔吸附樹脂富集、純化總苷元的工藝方法，步驟如下：

(1)在45℃的條件下，在1Kg射干飲片中加入4000萬U的β-葡萄糖苷酶，并浸泡在pH＝4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中48小時(shí)，取出，瀝 干水分，干燥，粉碎，之后用8倍、6倍體積的70％乙醇回流提取2次，每次2h，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，調(diào)節(jié)醇濃度至30％，靜置12小時(shí)，離心除去少量不溶物，得到每1ml含0.5g生藥的吸附液2000ml。

(2)將2BV的上述吸附液通過裝有D101的大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內(nèi)徑10cm，柱長(zhǎng)150cm，裝有6000mL濕樹脂)，吸附速度為1.0BV/h；

(3)吸附完成后，用2BV的30％乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質(zhì)洗脫下來，速度為1.0BV/h；

(4)用5BV的80％乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.0BV/h，收集解吸液；

(5)將上述解吸液經(jīng)減壓蒸餾并回收乙醇，然后經(jīng)濃縮、真空干燥，得到總苷元提取物30.19g。

(6)經(jīng)HPLC分析測(cè)定，提取物中總苷元含量為15.1％(w％)。

實(shí)施例3

與實(shí)施例2的不同之處在于步驟(1)中，β-葡萄糖苷酶的加入量為5000萬U，浸泡在pH＝5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中24小時(shí)。最終得到總苷元提取物31.60g，經(jīng)HPLC分析測(cè)定，提取物中總苷元含量為15.5％(w％)。

實(shí)施例4

與實(shí)施例2的不同之處在于步驟(1)中，β-葡萄糖苷酶的加入量為2000萬U，浸泡在pH＝4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中48小時(shí)。最終得到總苷元提取物29.69g，經(jīng)HPLC分析測(cè)定，提取物中總苷元含量為14.5％(w％)。

實(shí)施例5

與實(shí)施例2的不同之處在于步驟(2)中，樹脂選用AB-8的大孔吸附樹脂，吸附速度為1.0BV/h。最終得到總苷元提取物30.43g，經(jīng)HPLC分析測(cè)定，提取物中總苷元含量為13.5％(w％)。

實(shí)施例6

與實(shí)施例2的不同之處在于步驟(3-4)中，以3BV的30％乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質(zhì)洗脫下來，速度為1.0BV/h；用8BV的80％乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.0BV/h，收集解吸液。最終得到總苷元提取物31.67g，經(jīng)HPLC分析測(cè)定，提取物中總苷元含量為14.2％(w％)。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。