本發(fā)明關(guān)于一種用于制備抗口腔癌的醫(yī)藥品的用途，尤指以希樂葆(celecoxib)用于制備抗口腔癌的醫(yī)藥品的用途。

背景技術(shù)：

中國臺灣男性口腔癌的死亡率占全癌癥死因的第四位，且超過90％的口腔癌患者診斷為鱗狀上皮細(xì)胞癌，其特征為容易復(fù)發(fā)及易轉(zhuǎn)移至周邊局部淋巴結(jié)，因此造成患者其預(yù)后及存活率較低。因此，如何給早期口腔癌患者臨床上的化學(xué)藥物治療以防止其惡化或轉(zhuǎn)移，以及降低化學(xué)藥物的副作用都是目前口腔癌的重要臨床研究議題。過去的研究發(fā)現(xiàn)將近有90％的頭頸癌組織中的環(huán)氧合酶第二型(cyclooxygenase-2，COX-2)具高度表現(xiàn)，而臺灣煙酒檳榔誘發(fā)的口腔癌亦已證實(shí)其對腫瘤組織的COX-2、前列腺素(prostaglandin，PGE2)、前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)等皆具高度表現(xiàn)，顯示其對腫瘤發(fā)展相當(dāng)重要?，F(xiàn)有研究顯示檳榔青及其主要檳榔堿(arecoline)可誘發(fā)口腔正常細(xì)胞與口腔癌細(xì)胞株的COX-2訊息傳導(dǎo)上的調(diào)節(jié)(up-regulation)現(xiàn)象。因此如何有效治療具COX-2高度表現(xiàn)的口腔癌以抑制口腔癌細(xì)胞的惡化或轉(zhuǎn)移，并降低復(fù)發(fā)率及提升口腔癌病患的預(yù)后及存活率為其治療目標(biāo)之一。希樂葆{4-[5-(4-Methylphenyl)-3-trifluoromethyl)-1H-pyrazol-yl]benzenesulfonamide}為一種選擇性COX-2抑制劑，目前臨床的適應(yīng)癥主要用于緩解骨關(guān)節(jié)炎的癥狀與征兆，緩解成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀以及減少家族性腺瘤息肉癥病患的息肉數(shù)目等用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有口腔癌的環(huán)氧合酶第二型(cyclooxygenase-2，COX-2)具高度表現(xiàn)，故本發(fā)明的目的在于提供一種希樂葆(celecoxib)用于制造治療或減輕口腔癌醫(yī)藥品的用途，以抑制口腔癌細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)移或爬行，并降低復(fù)發(fā)率及提升口腔癌病患的預(yù)后及存活率。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供一種希樂葆用于制造抗口腔癌的醫(yī)藥品的用途，該醫(yī)品包含有效治療劑量的希樂葆以及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。

依據(jù)本發(fā)明，“抗口腔癌”是指有效抑制口腔癌細(xì)胞株增生(proliferation)、爬行(migration)、侵犯(invasion)或舒緩口腔癌；“有效劑量”是指在劑量上及對于所需要的時間段而言，對達(dá)成所要抑制口腔癌細(xì)胞株增生、爬行、侵犯或舒緩口腔癌結(jié)果有效的量；依據(jù)本發(fā)明，是指能夠使得口腔癌細(xì)胞的生長減緩、停止，甚至死亡，其如本發(fā)明所例示的，效抑制或舒緩口腔癌的劑量可通過MTT試驗(yàn)、抑制口腔癌細(xì)胞株增生、爬行以及侵犯試驗(yàn)而得知。

在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，抑制口腔癌細(xì)胞株增生效果可分別通過檢測增生細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)以及Ki-67核蛋白標(biāo)記而得知。

在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，抑制口腔癌癌細(xì)胞株爬行效果可通過檢測傷口愈合爬行分析(wound healing migration assay)以及轉(zhuǎn)移盤爬行分析(transwell migration assay)而得知；其中轉(zhuǎn)移盤爬行分析是模擬口服希樂葆透過外圍血液循環(huán)間接作用于口腔癌癌細(xì)胞上的爬行性抑制效應(yīng)。

在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，抑制口腔癌細(xì)胞株侵犯效果可通過模擬口服希樂葆透過外圍血液循環(huán)間接作用于口腔癌癌細(xì)胞上的侵犯性抑制效應(yīng)而得知。

較佳的，所述的口腔癌包括，但不限于口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、疣狀癌(verrucous carcinoma)、腺樣囊狀癌(adenoid cystic carcinoma)及黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma)。

依據(jù)本發(fā)明，“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑”包括生理上兼容的任意及所有溶劑、分散介質(zhì)、衣料、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延緩劑及其類似物。藥學(xué)上可接受的載劑的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物的一或多種及其組合。在許多情況中，較佳的組合物包括等張劑，例如糖、諸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載劑可進(jìn)一步包含微量輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。

較佳的，所述的有效治療劑量的濃度介于0μM至200μM之間。

更佳的，所述的有效治療劑量的濃度介于25μM至100μM之間。

本發(fā)明所述的醫(yī)藥品可以多種形式存在。該等形式包括，但不限于液體、半固體及固體藥劑形式，諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、藥膏、錠劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體、栓劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、凝膠劑及緩釋劑。較佳的形式取決于預(yù)期的投藥模式及治療應(yīng)用。在本發(fā)明的實(shí)施例中，用于抗口腔癌的包 含有效劑量希樂葆的醫(yī)藥品是通過口服方式施予。

較佳的，所述的醫(yī)藥品更包括賦形劑(excipient)，使醫(yī)藥品適用于經(jīng)腸道的或非經(jīng)腸道的劑型。

較佳的，所述的經(jīng)腸道的劑型是口服劑型，其包括，但不限于溶液、懸浮液、粉劑及膠囊。

較佳的，所述的醫(yī)藥品是以口服方式施予。

本發(fā)明通過特定濃度范圍的希樂葆以達(dá)到有效抗抑制口腔癌癌細(xì)胞細(xì)胞活性、增生、爬行及侵犯的效果。

附圖說明

圖1A是本發(fā)明以顯微鏡觀察SCC-9人類口腔癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)圖。

圖1B是本發(fā)明以顯微鏡觀察Cal-27人類口腔癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)圖。

圖1C是本發(fā)明以顯微鏡觀察Ca9-22口腔癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)圖。

圖2是本發(fā)明的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌細(xì)胞株經(jīng)MTT測試不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM、100μM及200μM)在12小時、24小時與48小時處理后所得的細(xì)胞存活率圖。

圖3是本發(fā)明的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌細(xì)胞株經(jīng)細(xì)胞核增生標(biāo)記(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)檢測所得的聚丙烯酰胺電泳圖，其中上列是以PCNA抗體(購于GeneTex公司)雜交所得的條帶(band)，分子量為36kDa；下列是以beta-actin抗體(購于Millipore公司)雜交所得的條帶當(dāng)作蛋白質(zhì)表現(xiàn)的內(nèi)參指標(biāo)，分子量為43kDa。

圖4A是SCC-9口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為0μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖4B是SCC-9口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為100μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖5A是Cal-27口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為0μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖5B是Cal-27口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為100μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖6A是Ca9-22口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為0μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞 核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖6B是Ca9-22口腔癌細(xì)胞株以希樂葆濃度為100μM，歷經(jīng)24小時處理后以細(xì)胞核增生標(biāo)記Ki-67核蛋白標(biāo)檢測的免疫熒光染色細(xì)胞圖。

圖7A是SCC-9口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)分別歷經(jīng)0小時、12小時及24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖7B是Cal-27口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)分別歷經(jīng)0小時、12小時及24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖7C是Ca9-22口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)分別歷經(jīng)0小時、12小時及24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖8A是SCC-9口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖8B是Cal-27口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖8C是Ca9-22口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)24小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞爬行圖。

圖9A是SCC-9口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)32小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞侵犯圖。

圖9B是Cal-27口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)32小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞侵犯圖。

圖9C是Ca9-22口腔癌細(xì)胞株以不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)歷經(jīng)32小時以顯微鏡觀察的癌細(xì)胞侵犯圖。

具體實(shí)施方式

以下配合圖式及本發(fā)明的較佳實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段。

制備例1細(xì)胞株來源

如圖1A至圖1C所示，其是以倒立式顯微鏡(型號Leica DM IL)放大倍率為100倍分別觀察SCC-9、Cal-27及Ca9-22口腔癌細(xì)胞株。其中SCC-9是市售的人類口腔癌細(xì)胞株(購于美國ATCC，產(chǎn)品編號CRL-1629)；Cal-27是市售人類口腔癌細(xì)胞株(購于美國ATCC，產(chǎn)品編號CRL-2095)；Ca9-22市售人類口腔癌細(xì)胞株(購于日本JCRB， 產(chǎn)品編號JCRB0625)。

實(shí)施例1希樂葆抑制口腔癌細(xì)胞株的濃度及時間測試

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT}測定是利用細(xì)胞粒腺體內(nèi)膜中的琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase)能將黃色的MTT還原為紫色結(jié)晶顆粒，而其還原能力的強(qiáng)弱可代表琥珀酸去氫酶的活性，亦代表細(xì)胞的生理活性狀況。

將由制備例所獲得的含有5x10⁴細(xì)胞數(shù)的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞分別種植于96孔(96-well)盤，并置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。隔日去除原有培養(yǎng)基液后，再分別加入含不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM、100μM及200μM)的DMEM/F-12培養(yǎng)基，歷經(jīng)12小時、24小時及72小時處理后，分別以MTT(購自于Sigma公司，產(chǎn)品編號為M5655)試劑進(jìn)行酵素免疫分析，并以570nm波長讀取其吸光值，并比較各希樂葆濃度與時間點(diǎn)的口腔癌癌細(xì)胞活性。

如圖2所示，希樂葆濃度越高越可抑制口腔癌癌細(xì)胞的細(xì)胞活性，且處理時間越長，抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞活性越明顯。

實(shí)施例2希樂葆抑制口腔癌細(xì)胞株增生(proliferation)測試

抑制口腔癌細(xì)胞株增生分別是通過癌細(xì)胞的增生細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)以及Ki-67核蛋白標(biāo)記進(jìn)行檢測。

增生細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測的步驟：將10⁶細(xì)胞數(shù)的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞分別種植于10公分培養(yǎng)盤，待細(xì)胞約80％滿時，加入以DMEM/F-12培養(yǎng)基配制不同濃度的希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)培養(yǎng)液培育24小時。去除培養(yǎng)基后，以磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞三次后，每盤分別加入100毫升(uL)的RIPA細(xì)胞裂解液(cell lysis buffer)進(jìn)行細(xì)胞核膜的溶解，再以超音波震蕩器(型號為MISONIX sonicator 3000)于冰浴中震蕩30秒(10秒三次)；以14,000g于4℃離心30分鐘，取上清液至新的微量離心管。再以蛋白質(zhì)定量分析染料(protein assay dye，購自BIO-RAD公司)測定個樣本的總蛋白質(zhì)量。

將各樣本取30毫克(μg)總蛋白質(zhì)量的細(xì)胞萃取液進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析；以0.45毫尺(μm)微孔PVDF轉(zhuǎn)漬膜(購于Millipore公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)漬，再以PCNA一級抗體(primary antibody；購于GeneTex公司)于4℃冰箱進(jìn)行過夜(overnight)雜交(hybrid)反應(yīng)與后續(xù)洗滌，并以二級 抗體(anti-rabbit secondary antibody；購于Millipore公司)于室溫雜交與后續(xù)洗滌，最后以冷光呈色劑(購于Millipore公司)進(jìn)行呈色，以底片進(jìn)行感光、沖洗、判讀與記錄。

如圖3所示，希樂葆可有效抑制口腔癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)PCNA蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，尤其在高濃度(100μM)更為明顯。

檢測Ki-67核蛋白標(biāo)記的步驟：將5x10³的口腔癌癌細(xì)胞分別種植于含有0.1％(w/v)的多聚賴氨酸溶液(poly-L-lysine solution，購于ScienCell公司)覆蓋處理的直徑18毫米(mm)及厚度0.17mm的無菌圓形蓋玻片上，并將蓋玻片置于12-well盤內(nèi)，待細(xì)胞約80％滿時，分別加入含有不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)的DMEM/F-12培養(yǎng)基，歷經(jīng)24小時處理。

以磷酸鹽緩沖液沖洗后，加入0.5毫升(mL)的4％三聚甲醛(paraformaldehyde，購于Merk公司)于室溫歷經(jīng)10分鐘以固定，以清洗緩沖液(0.1％BSA in 1X PBS)清洗后，加入0.5mL封阻液[blocking buffer，其濃度為10％正常山羊血清(normal goat serum)中含有0.3％Triton X-100]于室溫孵育歷經(jīng)1小時后，再依序以Ki-67一級抗體配制液(1:200，購于Cell Signaling公司)、二級熒光抗體(goat anti-rabbit IgG(H+L)antibody，產(chǎn)品編號為Alexa 488)進(jìn)行雜交；再以含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的核熒光染料的封片液(購于Invitrogen公司)進(jìn)行封片。

將以上免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染片(Imuunocytochemistry-immunofluorescence，ICC-IF)以倒立式熒光顯微鏡(型號Leica DM 400)以及MetaVue軟件進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光影像攫取。熒光濾片設(shè)定：DAPI染料熒光強(qiáng)度作為細(xì)胞核對比染色(nuclear counterstain)，其最高光譜吸收波長358納米(nm)，而熒光最高散射光譜為461nm(藍(lán)色)。Ki-67核蛋白標(biāo)識的最高光譜吸收波長495nm，且熒光最高散射光譜為519nm(綠色)，且放大倍率為100倍。

如圖4A至圖6B所示，希樂葆皆可有效抑制SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)Ki-67增生蛋白質(zhì)標(biāo)記的表現(xiàn)。

實(shí)施例3希樂葆抑制口腔癌細(xì)胞株爬行(migration)測試

抑制口腔癌癌細(xì)胞株爬行測試可分別經(jīng)由(1)傷口愈合爬行分析(wound healing migration assay)以及(2)轉(zhuǎn)移盤爬行分析(transwell migration assay)進(jìn)行測試。

(1)傷口愈合爬行分析的步驟：將含有5x10⁵細(xì)胞數(shù)的SCC-9、Cal-27與Ca9-22 口腔癌癌細(xì)胞分別種植于12-well盤，待細(xì)胞約達(dá)90％滿，以利用1mL的無菌尖嘴吸管(tip)于種有口腔癌癌細(xì)胞的各個孔中間畫出一直線的刮痕，以模擬其創(chuàng)傷狀況。再分別加入含有不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)的DMEM/F-12培養(yǎng)基，分別于0小時、12小時及24小時分別以100X的倒立式顯微鏡(型號為Leica DM IL LED-Leica Microsystems)進(jìn)行觀察并拍攝希樂葆抑制口腔癌癌細(xì)胞爬行能力的效應(yīng)。

如圖7A至圖7C所示，以希樂葆分別處理SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞12小時及24小時后，希樂葆濃度越高愈可有效地抑制癌細(xì)胞的爬行能力。

(2)轉(zhuǎn)移盤爬行分析為模擬口服希樂葆透過外圍血液循環(huán)間接作用于口腔癌癌細(xì)胞上的爬行性抑制效應(yīng)。爬行性抑制效應(yīng)的步驟：分別混合含有5x10⁴細(xì)胞數(shù)的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞于0.5mL的0.5％的胎牛血清培養(yǎng)基(fetal bovine serum-free DMEM/F-12medium)并將其分別種植于24-well盤的上層藥室(upper chambers；具8.0μM聚對苯二甲二乙酯(polyethylene terephthalate，PET)膜；購于Millipore公司)，再將0.7mL含有不同濃度希樂葆(0μM、25μM、50μM及100μM)的10％的胎牛血清培養(yǎng)基(fetal bovine serum-contained DMEM/F-12medium)分別加入24-well盤子的每一個檢體槽(wells)內(nèi)，并將其置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時至36小時間。24-well盤子的上層藥室依序歷經(jīng)清洗、固定后，以0.1％結(jié)晶紫(w/v)/20％甲醇(v/v)進(jìn)行細(xì)胞染色，再以100X的倒立式顯微鏡隨機(jī)選取上層藥室的5個視野進(jìn)行拍攝，并觀察希樂葆抑制口腔癌癌細(xì)胞在8.0μM的PET膜轉(zhuǎn)移盤的爬行效果。

如圖8A至圖8C所示，相較于濃度為0μM的希樂葆(未治療模式，即對照組)，濃度為25μM至100μM的希樂葆對于SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞爬行能力具有明顯抑制效果，尤其在濃度為50μM及100μM的希樂葆具有較明顯的抑制性效應(yīng)。

實(shí)施例4希樂葆抑制口腔癌細(xì)胞株侵犯(invasion)測試

本實(shí)施例使用BioCoat^TMMatrigel^TM侵犯試驗(yàn)試劑組(購于BD公司)進(jìn)行侵犯分析，試劑包含上層藥室(含8.0μm PET膜的invasion chambers及matrigel)、24-well Falcon盤。侵犯測試為仿真口服希樂葆透過外圍血液循環(huán)間接作用于口腔癌癌細(xì)胞上的侵犯性抑制效應(yīng)。以上測試步驟與實(shí)施例轉(zhuǎn)移盤爬行分析相同，差異在于每上層藥室分別植入培養(yǎng)10⁵細(xì)胞數(shù)的SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞，培育時間介 于24小時至36小時，并以倒立式顯微鏡(型號Leica DM IL)放大倍率100倍觀察細(xì)胞圖。

如圖9A至圖9C所示，模擬口服希樂葆透過外圍血液循環(huán)間接作用對SCC-9、Cal-27與Ca9-22口腔癌癌細(xì)胞的侵犯性的抑制效應(yīng)，其結(jié)果顯示，隨著希樂葆治療濃度的增加(0μM、25μM、50μM及100μM)，其抑制口腔癌侵犯能力就越明顯。

結(jié)果顯示，希樂葆濃度越高越能有效抑制口腔癌癌細(xì)胞的侵犯性能力，在濃度100μM即可達(dá)到最明顯的抑制效應(yīng)。

以上所述僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。