本發(fā)明涉及結(jié)合人CD3的人源化或嵌合抗體、包含所述人源化或嵌合抗體的組合物和所述人源化或嵌合抗體在治療疾病中的用途。發(fā)明背景分化簇3(CD3)已被了解很多年，和因此在許多方面是關(guān)注對象。特別是，已知針對CD3或T-細(xì)胞受體復(fù)合物(CD3作為其一部分)產(chǎn)生的抗體。已經(jīng)描述了五種人源化OKT3效應(yīng)器功能變體抗體的體外表征[1]。在缺少持續(xù)的免疫抑制藥物療法的情況下，在發(fā)生1型糖尿病后至少2年，用抗-CD3單克隆抗體hOKT3γ1(Ala-Ala)治療導(dǎo)致改進(jìn)的C-肽反應(yīng)和臨床參數(shù)[2]。改進(jìn)靶向抗體療法的有前景的方法是通過遞送特別針對表達(dá)抗原的癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性細(xì)胞。已經(jīng)描述了使用T細(xì)胞以有效殺死腫瘤細(xì)胞的這一概念[3]。然而，最初的臨床研究相當(dāng)令人失望，主要由于低的功效、嚴(yán)重的副作用(細(xì)胞因子爆發(fā))和雙特異性抗體的免疫原性[4]。設(shè)計(jì)和應(yīng)用雙特異性抗體的進(jìn)展部分地克服了細(xì)胞因子爆發(fā)的最初障礙和改進(jìn)了臨床有效性，沒有劑量限制的毒性[5]。例如，以一條臂靶向腫瘤細(xì)胞上的抗原和以另一條臂靶向例如T細(xì)胞上的CD3的某些雙特異性抗體，提供通過Fc區(qū)的Fc受體結(jié)合。在結(jié)合時(shí)，形成結(jié)合抗體Fc區(qū)的T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的復(fù)合物，導(dǎo)致殺死腫瘤細(xì)胞[4]?？ㄍ姿鲉慰褂尚∈驣gG2a/大鼠IgG2b異源二聚體組成，和已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腹膜內(nèi)應(yīng)用后成功用于治療癌癥-相關(guān)的腹水[6]。然而，小鼠/大鼠雜合體產(chǎn)生免疫原性[7]和不能在人類中應(yīng)用于長期靜脈內(nèi)治療。頻繁治療-相關(guān)的不良事件歸因于卡妥索單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞因子-釋放-相關(guān)的癥狀(即發(fā)熱、惡心、嘔吐、發(fā)冷、心動(dòng)過速和低血壓)[8]-[9]，這涉及到卡妥索單抗的Fc區(qū)的效應(yīng)器功能。另一種抗體是厄馬索單抗(ertumaxomab)(HER2xCD3)，其在具有低HER2表達(dá)的細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。厄馬索單抗已經(jīng)處于對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的II期臨床開發(fā)中[10]-[11]。已經(jīng)描述了與食蟹猴和/或恒河猴CD3有交叉反應(yīng)的CD3抗體[12]-[13]，然而需要對所述交叉反應(yīng)性抗體的進(jìn)一步改進(jìn)。發(fā)明簡述本發(fā)明的目標(biāo)是提供人源化或嵌合CD3抗體。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合人CD3的人源化或嵌合抗體，其中所述抗體包含結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含分別具有SEQIDNO:1、2和3所示的序列的重鏈可變(VH)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，和分別具有SEQIDNO:4所示的序列、序列GTN和SEQIDNO:5或SEQIDNO:60所示的序列的輕鏈可變(VL)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合人CD3的人源化或嵌合抗體，其中所述抗體包含結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含分別具有SEQIDNO:1、2和3所示的序列的重鏈可變(VH)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，和分別具有SEQIDNO:4所示的序列、序列GTN和SEQIDNO:5所示的序列的輕鏈可變(VL)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。在另一方面，本發(fā)明涉及雙特異性抗體，其包含本發(fā)明的抗體的第一結(jié)合區(qū)，和與所述第一抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的靶標(biāo)的第二結(jié)合區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的氨基酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及表達(dá)載體，其包含(i)編碼本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的重鏈序列的核酸序列，(ii)編碼本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的輕鏈序列的核酸序列，或(iii)(i)和(ii)兩者。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體的組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體、組合物或藥物組合物，其用作藥物。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體、組合物或藥物組合物，其用于治療疾病。在另一方面，本發(fā)明涉及治療疾病的方法，包括給予有需要的受試者本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體、組合物或藥物組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及診斷特征為涉及或積聚表達(dá)CD3的細(xì)胞的疾病的方法，包括給予受試者本發(fā)明的人源化或嵌合抗體、組合物或藥物組合物，任選地其中所述人源化或嵌合抗體用可檢測試劑標(biāo)記。在另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體的方法，包括步驟：a)培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，和b)從培養(yǎng)基純化抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體的診斷組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中CD3抗原或表達(dá)CD3的細(xì)胞的存在情況的方法，包括步驟：a)使樣品與本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體在允許所述抗體或雙特異性抗體和CD3之間形成復(fù)合物的條件下接觸，和b)分析是否已形成復(fù)合物。在另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中CD3抗原或表達(dá)CD3的細(xì)胞的存在情況的試劑盒，其包含i)本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體，和ii)試劑盒的使用說明書。在另一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合本發(fā)明的抗體的抗個(gè)體基因型抗體。附圖簡述圖1顯示(圖1A)IgG1-huCD3的單特異性抗體變體和(圖1B)雙特異性抗體變體bsIgG1huCD3xHER2與人T細(xì)胞系Jurkat的結(jié)合曲線。顯示的數(shù)據(jù)是如實(shí)施例2所述的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。表格顯示導(dǎo)致半-最大結(jié)合的抗體濃度(μg/mL)(EC50)。圖2顯示(圖2A)IgG1-huCD3的單特異性抗體變體和(圖2B)雙特異性抗體變體bsIgG1huCD3xHER2與食蟹猴T細(xì)胞系HSC-F的結(jié)合曲線。顯示的數(shù)據(jù)是如實(shí)施例2所述的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。圖3：通過IgG1-huCD3抗體變體的T細(xì)胞活化。在PBMC培養(yǎng)物中在來自人(圖3A)和食蟹猴(圖3B)來源的T細(xì)胞上的CD69的表達(dá)通過FACS分析測量，如實(shí)施例3所述。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，和顯示來自一個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖4：通過IgG1-huCD3抗體變體誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖。人(圖4A)或食蟹猴(圖4B)PBMC用IgG1-huCD3抗體變體孵育3天，之后通過細(xì)胞增殖ELISA測量增殖，如實(shí)施例4所述。顯示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖5：通過具有非-激活的LFLEDA突變的huCD3抗體變體誘導(dǎo)人(圖5A)和食蟹猴(圖5B)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，按實(shí)施例5所示測定。顯示來自一式兩份進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖6顯示非-激活的IgG1-huCD3的單特異性抗體變體(圖6A)和非-激活的雙特異性抗體變體bsIgG1-huCD3xHER2(圖6B)與人T細(xì)胞系Jurkat的結(jié)合曲線。顯示的數(shù)據(jù)是如實(shí)施例2所述的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。表格顯示導(dǎo)致半-最大結(jié)合的抗體濃度(μg/mL)(EC50)。圖7顯示非-激活的IgG1-huCD3的單特異性抗體變體(圖7A)和非-激活的雙特異性抗體變體bsIgG1-huCD3xHER2(圖7B)與食蟹猴T細(xì)胞系HSC-F的結(jié)合曲線。顯示的數(shù)據(jù)是如實(shí)施例2所述的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。表格顯示導(dǎo)致半-最大結(jié)合的抗體濃度(μg/mL)(EC50)。圖8：通過非-激活的單特異性IgG1-huCD3(圖8A和B)或非-激活的雙特異性bsIgG1-huCD3xHER2抗體變體(圖8C和D)的T細(xì)胞活化。在PBMC培養(yǎng)物中在來自人(圖8A和C)和食蟹猴(圖8B和D)來源的T細(xì)胞上的CD69的表達(dá)通過FACS分析測量，如實(shí)施例3所述。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次和顯示來自一個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖9：通過非-激活的單特異性IgG1-huCD3(圖9A和B)或非-激活的雙特異性bsIgG1-huCD3xHER2抗體變體(圖9C和D)誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖。在人(圖9A和C)或食蟹猴(圖9B和D)PBMC中測量T-細(xì)胞增殖，所述PMBC用各種抗體變體孵育3天，之后通過細(xì)胞增殖ELISA測量增殖，如實(shí)施例4所述。顯示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖10：通過具有非-激活的LFLEDA突變的huCD3抗體變體誘導(dǎo)人(圖10A)和食蟹猴(圖10B)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，如實(shí)施例5所示測定。顯示來自一式兩份進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖11：通過IgG1-huCD3抗體變體的恒河猴T細(xì)胞活化。在PBMC培養(yǎng)物中在來自恒河猴來源的T細(xì)胞上的CD69的表達(dá)通過FACS分析測量，如實(shí)施例6所述。圖12：通過非-激活的huCLB-T3/4抗體的變體的T細(xì)胞活化。對PBMC滴定IgG1-huCLB-T3/4變體。在PBMC培養(yǎng)物中在T細(xì)胞上的CD69的表達(dá)通過FACS分析測量，如實(shí)施例7所述。顯示了3個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性實(shí)例。圖13：通過非-激活的huCLB-T3/4抗體的變體的T-細(xì)胞增殖。PBMC用抗體孵育3天，之后通過細(xì)胞增殖ELISA測量增殖，如實(shí)施例8所述。顯示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖14：通過非-激活的CD3抗體的抗體變體誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。通過抗體變體(N297Q,LFLE,LFLENQ,LFLEDA,DANQ,LFLEDANQPS[圖14A-G])誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，按實(shí)施例9所示測定。顯示一式兩份進(jìn)行的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖15：通過非-激活的huCLB-T3/4變體誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。通過抗體變體(LFLEDALAL[圖15A-C]誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，按實(shí)施例9所述測定。顯示來自一式兩份進(jìn)行的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖16：評價(jià)C1q與非-激活的huCLB-T3/4抗體變體的結(jié)合。C1q與單特異性IgG1huCLB-T3/4(圖16A-C)和bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2(圖B-D)及其非-激活的抗體變體的結(jié)合通過ELISA評價(jià)，如實(shí)施例10所述。圖中的結(jié)果代表了n＝2實(shí)驗(yàn)。圖17：非-激活的huCLB-T3/4抗體變體的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分析與野生型IgG1-huCLB-T3/4抗體相比較，如實(shí)施例11所述。人IgG1的血漿濃度對時(shí)間作圖(圖17A)。血漿清除率按實(shí)施例11所述計(jì)算(圖17B)。水平虛線表示在SCID小鼠中人IgG1抗體的平均清除率(10mL/天/kg)。圖18：在健康HLA-型供體中陽性T細(xì)胞反應(yīng)的頻率。在增殖和IL-2分泌測定法兩者中SI指數(shù)≥1.9被認(rèn)為是陽性反應(yīng)。人源化A33用作臨床基準(zhǔn)對照抗體，其在臨床上顯示高水平的免疫原性和在EpiScreen測定法中常規(guī)誘導(dǎo)20-30%T細(xì)胞反應(yīng)。包括KLH反應(yīng)以檢查PBMC質(zhì)量(解凍后)。圖19：本發(fā)明的人源化CD3抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的序列比對。圖20：在Expi293F上清液中IgG1-huCD3-H1L1變體的表達(dá)水平，如使用抗人IgG固定的傳感器通過OctetRED所測量。圖21：IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA突變體與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。圖22：CD3雙特異性抗體變體與人T細(xì)胞的結(jié)合。圓形表示huCD3-H1L1-LFLEDA變體的結(jié)合，三角形表示huCD3-H1L1-LFLEDA-LK55N變體的結(jié)合，和方形表示CD3-hmAb286-LFLEDA變體的結(jié)合。圖23：huCD3xHER2抗體親和變體對用CD3和HER2親和變體處理的A431細(xì)胞(低HER2表達(dá)細(xì)胞)(圖23A)和AU565細(xì)胞(高HER2表達(dá)細(xì)胞)(圖23B)的細(xì)胞毒性。圖24：在NOD-SCID小鼠中通過huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA在腫瘤接種后7、14、21和28天(圖24A)和在第29天(圖24B)得到的腫瘤大小減小。圖25：在NOD-SCID小鼠中通過huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA在腫瘤接種后7、14和21天(圖25A)和在第21天(圖25B)得到的腫瘤大小減小。發(fā)明詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合人CD3的人源化或嵌合抗體，其中所述抗體包含結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含分別具有SEQIDNO:1、2和3所示的序列的重鏈可變(VH)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，和分別具有SEQIDNO:4所示的序列、序列GTN和SEQIDNO:5或SEQIDNO:60所示的序列的輕鏈可變(VL)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合人CD3的人源化或嵌合抗體，其中所述抗體包含結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含分別具有SEQIDNO:1、2和3所示的序列的重鏈可變(VH)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，和分別具有SEQIDNO:4所示的序列、序列GTN和SEQIDNO:5所示的序列的輕鏈可變(VL)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。本文使用的術(shù)語“抗體”意指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一的衍生物，其在典型的生理?xiàng)l件下具有特異性結(jié)合抗原的能力，具有顯著時(shí)間段的半壽期，例如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約4小時(shí)、至少約8小時(shí)、至少約12小時(shí)、約24小時(shí)或更多、約48小時(shí)或更多；約3、4、5、6、7或更多天等，或任何其它相關(guān)功能定義的時(shí)間(例如足以誘導(dǎo)、促進(jìn)、提高和/或調(diào)節(jié)與結(jié)合抗原的抗體有關(guān)的生理反應(yīng)的時(shí)間和/或抗體足以募集效應(yīng)器活性的時(shí)間)。與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)(或本文也可使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)術(shù)語具有相同的含義)，包含免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)?？贵w(Ab)的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞和T細(xì)胞)和補(bǔ)體系統(tǒng)的組分(例如C1q，補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑的第一補(bǔ)體)。如上所述，本文使用的術(shù)語抗體，除非另外說明或上下文明確矛盾，否則包括保留與抗原特異性相互作用(例如結(jié)合)的能力的抗體的片段。已表明抗體的抗原-結(jié)合功能可通過全長抗體的片段實(shí)現(xiàn)。術(shù)語"抗體"內(nèi)包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab’或Fab片段，一種由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段，或描述于WO2007059782(GenmabA/S)中的單價(jià)抗體；(ii)F(ab')2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)基本上由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；和(iv)基本上由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但它們可使用重組方法通過合成的接頭連接，所述接頭使它們能夠制成單一蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價(jià)分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，參見例如Bird等,Science242,423-426(1988)和Huston等,PNASUSA85,5879-5883(1988))。這樣的單鏈抗體包括在術(shù)語抗體內(nèi)，除非另外注明或上下文清楚指示。盡管這樣的片段通常包括在抗體的含義內(nèi)，但它們共同和各自獨(dú)立地是本發(fā)明的獨(dú)特特征，顯示不同的生物學(xué)性質(zhì)和功用。本發(fā)明語境中的這些和其它有用的抗體片段在本文進(jìn)一步論述。還應(yīng)理解，術(shù)語抗體，除非另外指示，還包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體和人源化抗體，和通過任何已知技術(shù)提供的保留特異性結(jié)合抗原的能力的抗體片段(抗原-結(jié)合片段)，所述技術(shù)例如酶裂解、肽合成和重組技術(shù)。產(chǎn)生的抗體可具有任何同種型。本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白重鏈”、“免疫球蛋白的重鏈”或“重鏈”意指免疫球蛋白的鏈之一。重鏈通常由重鏈可變區(qū)(本文簡稱為VH)和定義了免疫球蛋白的同種型的重鏈恒定區(qū)(本文簡稱為CH)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)通常由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)可進(jìn)一步包含鉸鏈區(qū)。本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白”意指一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖蛋白，其由兩對多肽鏈組成，一對低分子量輕(L)鏈和一對重(H)鏈，所有四條鏈可能通過二硫鍵互相連接。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)已被充分表征(參見例如[14])。在免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi)，兩條重鏈在所謂的“鉸鏈區(qū)”中通過二硫鍵互相連接。與重鏈相同，各輕鏈通常由數(shù)個(gè)區(qū)構(gòu)成：輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為VL)和輕鏈恒定區(qū)(本文簡稱為CL)。輕鏈恒定區(qū)通常包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。此外，VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為具有超變性的區(qū)(或超變區(qū)，其可在結(jié)構(gòu)確定的環(huán)的序列和/或形式中是高度可變的)，亦稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其與稱為框架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)交替。各VH和VL通常由三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，從氨基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(見[15])。CDR序列可通過使用IMGT[16]-[17]提供的方法測定。本文使用的術(shù)語“同種型”是指免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何同種異型，例如由重鏈恒定區(qū)基因編碼的IgG1m(za)和IgG1m(f)[SEQIDNO:15])。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含IgG1類型或其任何同種異型的免疫球蛋白的重鏈。此外，各重鏈同種型可與kappa(κ)或lambda(λ)輕鏈組合。本文使用的術(shù)語“嵌合抗體”是指抗體，其中可變區(qū)來源于非人物種(例如來源于嚙齒動(dòng)物)和恒定區(qū)來源于不同的物種，例如人。嵌合抗體可通過抗體工程產(chǎn)生?！翱贵w工程”是廣泛用于不同類型的抗體修飾的術(shù)語，和其是技術(shù)人員眾所周知的方法。具體而言，嵌合抗體可通過使用描述于[18]的標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)產(chǎn)生。因此，嵌合抗體可以是經(jīng)遺傳學(xué)或酶學(xué)工程改造的重組抗體。產(chǎn)生嵌合抗體在技術(shù)人員的知識(shí)內(nèi)，因此產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合抗體可通過本文所述的方法之外的其它方法實(shí)現(xiàn)。開發(fā)用于治療應(yīng)用的嵌合單克隆抗體以減少抗體免疫原性。它們可通常包含對目的抗原具有特異性的非人(例如鼠)可變區(qū)，和人恒定抗體重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域。在嵌合抗體的背景下使用的術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指包含免疫球蛋白的重鏈和輕鏈兩者的CDR和框架區(qū)的區(qū)。本文使用的術(shù)語“人源化抗體”是指經(jīng)遺傳學(xué)工程改造的非人抗體，其包含人抗體恒定結(jié)構(gòu)域和經(jīng)修飾以包含高水平的與人可變結(jié)構(gòu)域的序列同源性的非人可變結(jié)構(gòu)域。這可通過移植一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的六個(gè)非人抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)到同源的人受體框架區(qū)(FR)上實(shí)現(xiàn)(參見[19]-[20])。為了完全重建母體抗體的結(jié)合親和力和特異性，可能需要置換母體抗體(即非人抗體)的框架殘基到人框架區(qū)中(回復(fù)突變)。結(jié)構(gòu)同源性建?？捎兄阼b定框架區(qū)中對抗體的結(jié)合性質(zhì)重要的氨基酸殘基。因此，人源化抗體可包含非人CDR序列、任選地包含一個(gè)或多個(gè)突變至非人氨基酸序列的氨基酸回復(fù)突變的基本上的人框架區(qū)和完全的人恒定區(qū)。任選地，可應(yīng)用不必然是回復(fù)突變的另外的氨基酸修飾以獲得具有優(yōu)選特征(例如親和力和生物化學(xué)性質(zhì))的人源化抗體。根據(jù)本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨傅娜嗽椿蚯逗峡贵w可稱為“人源化或嵌合CD3抗體”、“本發(fā)明的人源化或嵌合抗體”、“CD3抗體”或“本發(fā)明的CD3抗體”，其全部具有相同的含義和目的，除非上下文另外矛盾。非人來源的抗體的氨基酸序列不同于人來源的抗體，和因此非人抗體當(dāng)給予人患者時(shí)有可能產(chǎn)生免疫原性。然而，盡管抗體的非人來源，其CDR區(qū)段負(fù)責(zé)抗體結(jié)合其靶抗原的能力，和人源化目標(biāo)在于保持抗體的特異性和結(jié)合親和力。因此，進(jìn)行非人治療性抗體的人源化以使其在人中的免疫原性最小，而同時(shí)這樣的人源化抗體保持非人來源的抗體的特異性和結(jié)合親和力。本文使用的術(shù)語“結(jié)合區(qū)”是指能夠結(jié)合任何分子例如多肽(例如存在于細(xì)胞、細(xì)菌或病毒體上)的抗體的區(qū)。本文使用的術(shù)語"結(jié)合''是指抗體與預(yù)定抗原或靶標(biāo)的結(jié)合，當(dāng)在BIAcore3000儀器上通過例如表面等離子體共振(SPR)技術(shù)使用抗原作為配體和抗體作為分析物測定時(shí)，與它們的結(jié)合通常具有對應(yīng)于約10-6M或更小、例如10-7M或更小、例如約10-8M或更小、例如約10-9M或更小、約10-10M或更小或約10-11M或甚至更小的KD的親和力，和以對應(yīng)于比其結(jié)合并非預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的親和力低至少10倍、例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的親和力結(jié)合預(yù)定抗原。親和力更低的程度取決于抗體的KD，以致當(dāng)抗體的KD極低時(shí)(即，抗體是高度特異的)，則抗原的親和力低于非特異性抗原的親和力的程度可以是至少10,000倍。本文使用的術(shù)語"KD"(M)是指特定抗體-抗原相互作用的離解平衡常數(shù)。本文使用的術(shù)語“人CD3”是指人分化簇3蛋白，其是T細(xì)胞共-受體(co-receptor)蛋白復(fù)合物的一部分，和由四種不同的鏈構(gòu)成。CD3也存在于其它物種，和因此術(shù)語“CD3”可在本文中使用和不限于人CD3，除非上下文矛盾。在哺乳動(dòng)物中，該復(fù)合物包含一條CD3γ(gamma)鏈(人CD3γ鏈SwissprotP09693或食蟹猴CD3γSwissprotQ95LI7)、一條CD3δ(delta)鏈(人CD3δSwissprotP04234或食蟹猴CD3δSwissprotQ95LI8)、兩條CD3ε(epsilon)鏈(人CD3εSwissprotP07766；或食蟹猴CD3εSwissprotQ95LI5)、恒河猴CD3ε(SwissprotG7NCB9)，和一條CD3ζ-鏈(zeta)鏈(人CD3ζSwissprotP20963、食蟹猴CD3ζSwissprotQ09TK0)。這些鏈與稱為T-細(xì)胞受體(TCR)的分子締合，和在T淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生活化信號(hào)。TCR和CD3分子一起構(gòu)成TCR復(fù)合物。在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的是，Swissprot編號(hào)所提及的氨基酸序列包括信號(hào)肽，其在蛋白質(zhì)翻譯后被除去。因此，細(xì)胞表面上存在的蛋白質(zhì)，例如CD3，不包括信號(hào)肽。具體而言，表1中所列的氨基酸序列不含有這樣的信號(hào)肽。表1中所列的這樣的蛋白質(zhì)可被稱為“成熟蛋白質(zhì)”。因此，SEQIDNO:14顯示成熟人CD3δ(delta)的氨基酸序列，SEQIDNO:13顯示成熟人CD3ε(epsilon)的氨基酸序列，SEQIDNO:21顯示成熟食蟹猴CD3ε的氨基酸序列，和SEQIDNO:22顯示成熟恒河猴CD3ε的氨基酸序列。因此，本文使用的術(shù)語“成熟”是指不包含任何信號(hào)或前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)。眾所周知的是，信號(hào)肽序列同源性、長度和切割位點(diǎn)位置在不同的蛋白質(zhì)之間顯著不同。信號(hào)肽可通過不同的方法測定，例如本發(fā)明的SEQIDNO:13已根據(jù)SignalP應(yīng)用(可獲自http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)測定。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體結(jié)合CD3的ε鏈，例如人CD3的ε鏈(SEQIDNO:13)。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體結(jié)合人CD3ε(epsilon)(SEQIDNO:13)的N-端部分的氨基酸1-27內(nèi)的表位。在這樣的具體實(shí)施方案中，抗體可甚至進(jìn)一步與其它非人靈長類物種例如食蟹猴(食蟹猴CD3εSEQIDNO:21)和/或恒河猴(恒河猴CD3εSEQIDNO:22)交叉反應(yīng)。本文使用的術(shù)語“交叉反應(yīng)”是指抗體例如本發(fā)明的人源化或嵌合抗體結(jié)合其在不同物種上的靶標(biāo)的能力。具體而言，本文所述的實(shí)施例中例舉的人源化CD3抗體具有結(jié)合人(實(shí)施例2)、食蟹猴(實(shí)施例2)和恒河猴CD3的能力。與原始抗體相比，包含本文定義的CDR序列并進(jìn)一步包含框架區(qū)的本發(fā)明的抗體，可在CDR序列之外的序列上不同，但仍保留完全結(jié)合能力。因此，本發(fā)明還涉及包含與本文所述的任何序列具有一定序列同一性的可變區(qū)的氨基酸序列的抗體。在本發(fā)明的背景中使用的術(shù)語“序列同一性”是指作為所述序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)的兩個(gè)序列之間的同一性百分比(即%同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)x100)，考慮了空位數(shù)和各空位的長度，其需要為兩個(gè)序列的最佳比對而被引入。兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的同一性百分比可例如使用E.Meyers和W.Miller[21]的算法測定。此外，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分比可使用Needleman和Wunsch算法[22]測定。多重比對優(yōu)選使用ClustalW算法[23]進(jìn)行(例如在VectorNTIAdvance?軟件版本11.5；InvitrogenInc.中所用的)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，VH區(qū)與選自以下的VH序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性：a)SEQIDNO:6所示的VH序列；b)SEQIDNO:8所示的VH序列；c)SEQIDNO:7所示的VH序列；和d)SEQIDNO:9所示的VH序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，VH區(qū)與選自以下的VH序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少96%氨基酸序列同一性：a)SEQIDNO:6所示的VH序列；b)SEQIDNO:8所示的VH序列；c)SEQIDNO:7所示的VH序列；和d)SEQIDNO:9所示的VH序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL區(qū)與選自以下的VL序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性：a)SEQIDNO:10所示的VL序列；b)SEQIDNO:11所示的VL序列；和c)SEQIDNO:12所示的VL序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，VL區(qū)與選自以下的VL序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性：a)SEQIDNO:10所示的VL序列；b)SEQIDNO:11所示的VL序列；和c)SEQIDNO:12所示的VL序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH區(qū)選自：a)SEQIDNO:6所示的VH序列；b)SEQIDNO:8所示的VH序列；c)SEQIDNO:7所示的VH序列；和d)SEQIDNO:9所示的VH序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL區(qū)選自：a)SEQIDNO:10所示的VL序列；b)SEQIDNO:11所示的VL序列；和c)SEQIDNO:12所示的VL序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH或VL序列中的只有一個(gè)與本文公開的序列之一100%相同，而另一個(gè)可具有與本文公開的序列之一至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，VH序列與選自以下的VH序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少97%氨基酸序列同一性：a)SEQIDNO:6所示的VH序列；b)SEQIDNO:7所示的VH序列；c)SEQIDNO:8所示的VH序列；和d)SEQIDNO:9所示的VH序列；和VL序列與選自以下的VL序列中所示的至少一個(gè)氨基酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性：i.SEQIDNO:10所示的VL序列；ii.SEQIDNO:11所示的VL序列；和iii.SEQIDNO:12所示的VL序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH和VL序列選自：a)與分別SEQIDNO:6和10；分別7和10；分別8和10；分別9和10；分別6和11；分別7和11；分別8和11；分別9和11；分別6和12；分別7和12；分別8和12；和分別9和12所示的序列具有至少90%同一性的VH和VL序列；b)與分別SEQIDNO:6和10；分別7和10；分別8和10；分別9和10；分別6和11；分別7和11；分別8和11；分別9和11；分別6和12；分別7和12；分別8和12；和分別9和12所示的序列具有至少95%同一性的VH和VL序列；c)與分別SEQIDNO:6和10；分別7和10；分別8和10；分別9和10；分別6和11；分別7和11；分別8和11；分別9和11；分別6和12；分別7和12；分別8和12；和分別9和12所示的序列具有至少97%同一性的VH和VL序列；d)與分別SEQIDNO:6和10；分別7和10；分別8和10；分別9和10；分別6和11；分別7和11；分別8和11；分別9和11；分別6和12；分別7和12；分別8和12；和分別9和12所示的序列具有至少99%同一性的VH和VL序列；e)與分別SEQIDNO:6和10；分別7和10；分別8和10；分別9和10；分別6和11；分別7和11；分別8和11；分別9和11；分別6和12；分別7和12；分別8和12；和分別9和12所示的序列具有至少100%同一性的VH和VL序列；f)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；g)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；h)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；i)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；j)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；k)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；l)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；m)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；n)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；o)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；p)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；q)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；r)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；s)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；t)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；u)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；v)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；x)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；y)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；z)與SEQIDNO:6所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；aa)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；ab)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；ac)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；ad)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；ae)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；af)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；ag)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；ah)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；ai)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；aj)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；ak)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；al)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；am)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；an)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；ao)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；ap)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；aq)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；ar)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；as)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；at)與SEQIDNO:7所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；ba)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；bb)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；bc)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；bd)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；be)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；bf)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；bg)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；bh)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；bi)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；bj)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；bk)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；bl)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；bm)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；bn)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；bo)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；bp)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；bq)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；br)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；bs)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；bt)與SEQIDNO:8所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；ca)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；cb)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；cc)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；cd)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少90%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；ce)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；cf)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；cg)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；ch)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少95%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；ci)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；cj)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；ck)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列；cl)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少97%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；cm)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；cn)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；co)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；cp)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少99%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少100%同一性的VL序列；cq)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少90%同一性的VL序列；cr)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少95%同一性的VL序列；cs)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少97%同一性的VL序列；和ct)與SEQIDNO:9所示的序列具有至少100%同一性的VH序列和與SEQIDNO:10、11或12所示的序列具有至少99%同一性的VL序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)包含選自以下的VH和VL：a)SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；b)SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL；c)SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；d)SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:11所示的VL序列；e)SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；f)SEQIDNO:7所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；g)SEQIDNO:7所示的VH序列，和SEQIDNO:11所示的VL序列；h)SEQIDNO:7所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；i)SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:11所示的VL序列；j)SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；k)SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:11所示的VL序列；和l)SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列。在具體的實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)包含選自以下的VH序列和VL序列：a)SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；b)SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；和c)SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列。本發(fā)明的人源化抗體可通過比較重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系可變區(qū)序列的數(shù)據(jù)庫，以鑒定具有合適的同源性程度的重鏈和輕鏈人序列用作人可變框架區(qū)而產(chǎn)生。可通過移植例如鼠CDR到框架區(qū)上(按上文所述鑒定)并且如果需要的話，通過回復(fù)突變(框架區(qū)中在指定位置上的一個(gè)或多個(gè)人氨基酸殘基突變回到非人氨基酸)成可能對恢復(fù)抗體結(jié)合功效是關(guān)鍵的鑒定的特定鼠殘基序列，來設(shè)計(jì)一系列人源化重鏈和輕鏈可變區(qū)。然后按應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)：iTopeTM和TCEDTM([24]、[25]和[26])所測定的，選擇具有最低發(fā)生率的可能T細(xì)胞表位的變體序列。此外，本發(fā)明的人源化抗體也可以是“去免疫的”。去免疫可能是需要的，因?yàn)樵诘鞍仔蛄欣绫景l(fā)明的人源化抗體內(nèi)，當(dāng)它們具有激活輔助T細(xì)胞的潛力時(shí)人T細(xì)胞表位的存在可增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)特征。輔助T細(xì)胞的這樣的活化可通過去免疫而避免。去免疫可通過引入突變至人源化抗體的氨基酸序列進(jìn)行，以除去T細(xì)胞表位而不顯著減少抗體的結(jié)合親和力。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體可通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生：(i)比較非人完全可變重鏈序列和/或完全可變輕鏈序列與人種系序列的數(shù)據(jù)庫，(ii)選擇與非人序列具有最高同源性的人種系序列，以獲得人源化序列，(iii)如果需要的話，通過回復(fù)突變優(yōu)化人源化序列，和(iv)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)序列。因此，本發(fā)明的全長抗體可通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生：(i)比較非人可變重鏈序列和可變輕鏈序列與人種系序列的數(shù)據(jù)庫，(ii)選擇與非人序列具有最高同源性的人種系序列，(iii)移植非人CDR至選擇的人種系，以獲得人源化序列，(iv)如果需要的話，通過回復(fù)突變優(yōu)化人源化序列，(v)鑒定恒定重鏈和輕鏈序列，和(vi)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)完全重鏈序列和完全輕鏈序列。本發(fā)明的全長抗體因此可按實(shí)施例1所述產(chǎn)生。在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的是，從CDR序列或完全可變區(qū)序列開始，產(chǎn)生全長抗體。因此，技術(shù)人員將知道如何產(chǎn)生本發(fā)明的全長抗體。本文使用的術(shù)語“完全重鏈序列”是指由可變重鏈和恒定重鏈序列組成的序列。本文使用的術(shù)語“完全輕鏈序列”是指由可變輕鏈和恒定輕鏈序列組成的序列?；貜?fù)突變可通過標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變引入。用于DNA誘變的這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于[18]?；蛘撸褂檬惺劭傻玫脑噭┖欣鏠uickchangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene)，或需要的回復(fù)突變可通過從頭的DNA合成引入。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。嵌合抗體可通過用人來源的恒定區(qū)序列置換非人(例如鼠)抗體的所有恒定區(qū)序列產(chǎn)生。因此，完全非人可變區(qū)序列保留在嵌合抗體中。因此，本發(fā)明的嵌合抗體可通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生：在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)非人可變重鏈(SEQIDNO:27)、非人可變輕鏈序列(SEQIDNO:28)、人恒定重鏈和人恒定輕鏈序列，和從而產(chǎn)生全長嵌合抗體?？墒褂脗溥x方法。產(chǎn)生嵌合抗體的這樣的方法在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)，和因此技術(shù)人員將知道，如何產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是全長抗體。本文使用的術(shù)語“全長抗體”是指包含對應(yīng)于在該同種型的野生型抗體中天然存在的那些的所有重鏈和輕鏈恒定和可變結(jié)構(gòu)域的抗體(例如母體或變體抗體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含F(xiàn)c區(qū)，所述Fc區(qū)包含第一和第二免疫球蛋白重鏈。本文使用的術(shù)語“Fc區(qū)”是指在從N-端至C-端的方向上包含至少鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的區(qū)。Fc區(qū)可進(jìn)一步包含在鉸鏈區(qū)的N-端的CH1區(qū)。本文使用的術(shù)語“鉸鏈區(qū)”是指免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區(qū)。因此，例如人IgG1抗體的鉸鏈區(qū)對應(yīng)于根據(jù)Kabat中所述的Eu編號(hào)的氨基酸216-230。除非另外說明或上下文矛盾，否則恒定區(qū)序列的氨基酸在本文中根據(jù)Eu-編號(hào)索引進(jìn)行編號(hào)(描述于[27])和可被稱為“根據(jù)Kabat中所述的Eu編號(hào)”、“根據(jù)Kabat的Eu編號(hào)”或“根據(jù)Eu編號(hào)系統(tǒng)”。本文使用的術(shù)語“CH1區(qū)”或“CH1結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白重鏈的CH1區(qū)。因此，例如人IgG1抗體的CH1區(qū)對應(yīng)于根據(jù)Eu編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸118-215。然而，CH1區(qū)也可以是本文所述的任何其它的亞型。本文使用的術(shù)語“CH2區(qū)”或“CH2結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白重鏈的CH2區(qū)。因此，例如人IgG1抗體的CH2區(qū)對應(yīng)于根據(jù)Eu編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸231-340。然而，CH2區(qū)也可以是本文所述的任何其它的亞型。本文使用的術(shù)語“CH3區(qū)”或“CH3結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白重鏈的CH3區(qū)。因此，例如人IgG1抗體的CH3區(qū)對應(yīng)于根據(jù)Eu編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸341-447。然而，CH3區(qū)也可以是本文所述的任何其它的亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈的同種型選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重鏈可以是在各個(gè)免疫球蛋白類型內(nèi)的任何同種異型，例如IgG1m(f)(SEQIDNO:15)。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈的同種型是IgG1或其任何同種異型，例如IgG1m(f)(SEQIDNO:15)。當(dāng)靶向作為T-細(xì)胞受體(TCR)的一部分的抗原CD3時(shí)，細(xì)胞殺死的T細(xì)胞特有機(jī)制是理想的。其它效應(yīng)器功能，例如補(bǔ)體活化，可能是不需要的，和因此降低效應(yīng)器功能是理想的。C1q結(jié)合是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中的第一步，和因此用作抗體的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)能力的指示物。如果C1q與抗體的結(jié)合可被避免，則補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的活化也可被避免。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含已被修飾的Fc區(qū)，使得C1q與所述抗體的結(jié)合與野生型抗體相比減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。本文使用的術(shù)語“修飾”是指與野生型Fc區(qū)的氨基酸序列不相同的Fc區(qū)的氨基酸序列。即，在野生型Fc區(qū)的指定位置的氨基酸殘基已經(jīng)被置換、缺失或插入，以改變例如對C1q的結(jié)合位點(diǎn)、對其它效應(yīng)分子的結(jié)合位點(diǎn)或與Fc受體(FcR)的結(jié)合。氨基酸序列的這樣的修飾可通過用保守氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸制備，或可通過用與野生型中存在的氨基酸在物理和/或功能上類似的可選擇的氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸制備。置換也可通過用非保守氨基酸置換來制備。在本發(fā)明的背景下，氨基酸可描述為保守或非保守氨基酸，和可因此相應(yīng)地分類。氨基酸殘基還可分為通過可選擇的物理和功能性質(zhì)定義的類型。因此，氨基酸的類型可在一個(gè)或兩個(gè)以下表格中反映：保守類型的氨基酸殘基酸性殘基D和E堿性殘基K、R和H親水不帶電荷殘基S、T、N和Q脂族不帶電荷殘基G、A、V、L和I非極性不帶電荷殘基C、M和P芳族殘基F、Y和W氨基酸殘基的可選擇的物理和功能分類含醇基的殘基S和T脂族殘基I、L、V和M環(huán)烯基-相關(guān)殘基F、H、W和Y疏水殘基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y帶負(fù)電荷殘基D和E極性殘基C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T帶正電荷殘基H、K和R小殘基A、C、D、G、N、P、S、T和V極小殘基A、G和S參與轉(zhuǎn)角形成的殘基A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T柔性殘基Q、T、K、S、G、P、D、E和R在本發(fā)明的背景下，抗體例如人源化或嵌合抗體中的置換如下表示：原始氨基酸–位置–置換的氨基酸；參照公認(rèn)的氨基酸命名法，使用三字母代碼或單字母代碼，包括代碼Xaa和X以指示任何氨基酸殘基。因此，符號(hào)“L234F”或“Leu234Phe”意思是抗體包含在氨基酸位置234上亮氨酸被苯丙氨酸置換。在給定位置上氨基酸置換為任何其它氨基酸如下表示：原始氨基酸–位置；或例如“L234”。對于其中原始氨基酸和/或置換的氨基酸可包含一個(gè)以上但并非全部氨基酸的修飾，所述一個(gè)以上的氨基酸可通過“,”或“/”分開。例如在位置234上置換亮氨酸為苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸或色氨酸：“Leu234Phe,Arg,Lys,Trp”或“Leu234Phe/Arg/Lys/Trp”或“L234F,R,K,W”或“L234F/R/K/W”或“L234至F,R,K或W”。在本發(fā)明的背景下這樣的命名可互換使用，但具有相同的含義和目的。此外，術(shù)語“置換”包括置換成其它19種天然氨基酸中的任一個(gè)，或其它氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，置換位置234上的氨基酸L包括以下各種置換：234A、234C、234D、234E、234F、234G、234H、234I、234K、234M、234N、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234P和234Y。即，通過這種方式，等同于命名234X，其中X指示除了原始氨基酸之外的任何氨基酸。這些置換也可稱為L234A,L234C等，或L234A,C等，或L234A/C/等。所述命名類似地適用于本文提及的各個(gè)和全部位置，本文特別包括這樣的置換中的任一個(gè)。本發(fā)明的抗體還可包含氨基酸殘基的缺失。這樣的缺失可表示為“del”，和包括例如書寫為L234del。因此，在這樣的實(shí)施方案中，位置234上的亮氨酸從氨基酸序列中缺失。術(shù)語“氨基酸”和“氨基酸殘基”在本文可互換使用。本文使用的術(shù)語“C1q結(jié)合”是指當(dāng)抗體結(jié)合至其抗原時(shí)C1q與所述抗體結(jié)合。本文使用的術(shù)語“結(jié)合至其抗原”是指抗體與其抗原在體內(nèi)和體外的結(jié)合。本文使用的術(shù)語“減少”當(dāng)涉及C1q結(jié)合時(shí)，是指當(dāng)與C1q與野生型抗體的結(jié)合相比，本發(fā)明的抗體減少、最小化或甚至完全抑制C1q與抗體結(jié)合的能力。本文使用的術(shù)語“野生型抗體”涉及在本發(fā)明的抗體的比較測定法中使用時(shí)，是指除了并非無活性之外與待測試的抗體相同的抗體。在該背景下，術(shù)語“無活性”是指修飾的Fc區(qū)具有減少或無C1q結(jié)合，如實(shí)施例10所測定，即在C1q結(jié)合通過ELISA測定時(shí)，如實(shí)施例4測定(即T-細(xì)胞增殖在基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法中測量)的減少或無Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖；和/或如實(shí)施例3測定(即Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)在基于PBMC的功能測定法中測定)的減少或無Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)。因此，野生型抗體包含在免疫球蛋白重鏈中天然存在的氨基酸，即不包含任何氨基酸修飾的抗體，所述修飾可改變或減少抗體與例如C1q、Fc受體等相互作用的能力。因此，這樣的野生型抗體將保持為能夠結(jié)合例如C1q的活化抗體。野生型抗體和本發(fā)明的抗體可包含并非影響抗體誘導(dǎo)效應(yīng)器功能的能力的那些的氨基酸修飾，以將抗體制備成雙特異性抗體等。本文使用的術(shù)語“ELISA”是指酶聯(lián)免疫吸附測定法，其為使用抗體和顏色變化來鑒定物質(zhì)的試驗(yàn)。第一特異性抗體連接至平板表面。藉此加入來自樣品的蛋白，其中測試與所述第一特異性抗體的結(jié)合。加入結(jié)合來自樣品的抗體的第二抗體。第二抗體與酶連接，并且在最終步驟中加入包含酶的底物的物質(zhì)。隨后的反應(yīng)產(chǎn)生可檢測信號(hào)，最常見的是底物的顏色變化。ELISA方法的概念是本領(lǐng)域眾所周知的，和進(jìn)行ELISA的各種方式被視為評價(jià)本發(fā)明的抗體的方法的一部分。因此，該解釋不應(yīng)理解為限制，因?yàn)榭蛇M(jìn)行各種形式的ELISA，例如描述于實(shí)施例4。特別是，本發(fā)明的抗體結(jié)合C1q的能力可通過ELISA測定，包括以下步驟：(i)包被所述抗體到96-孔板上，(ii)加入3%血清，(iii)加入抗-人C1q抗體，(iv)將板顯色，和(v)測量OD405nm。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含已被修飾的Fc區(qū)，使得C1q與所述抗體的結(jié)合與野生型抗體相比減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定，包括以下步驟：(i)包被所述抗體到96-孔板上，(ii)加入3%血清，(iii)加入抗-人C1q，(iv)將板顯色，和(v)測量OD405nm。因此，在具體的實(shí)施方案中，C1q的結(jié)合按實(shí)施例10中所述評價(jià)。本文使用的術(shù)語“Fc受體”或“FcR”是指存在于某些細(xì)胞的表面上的蛋白質(zhì)。FcR結(jié)合抗體的Fc區(qū)。存在數(shù)種不同類型的FcR，其根據(jù)它們識(shí)別的抗體的類型分類。例如Fcγ(gamma)受體結(jié)合IgG類型的抗體。本文使用的術(shù)語“Fcγ受體”、“Fcgamma受體”或“FcγR”是指屬于免疫球蛋白超家族的一組Fc受體，和對于誘導(dǎo)調(diào)理(包覆)微生物的吞噬作用是最重要的Fc受體。該家族包括幾個(gè)成員，F(xiàn)cγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b)，它們由于不同的分子結(jié)構(gòu)而在抗體親和力上不同。Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)器功能形成人免疫球蛋白G(IgG)分子的生物活性的一部分。這樣的效應(yīng)器功能的實(shí)例包括例如抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，其通過各種效應(yīng)分子與Fc區(qū)結(jié)合而觸發(fā)。在本發(fā)明的背景下，“Fc結(jié)合”、“Fc受體結(jié)合”、“FcR結(jié)合”和“抗體Fc區(qū)與FcR結(jié)合”是指Fc區(qū)與Fc受體(FcR)或效應(yīng)分子結(jié)合。術(shù)語“FcγR結(jié)合”和“FcγRI結(jié)合”是指分別結(jié)合至或以Fc區(qū)結(jié)合至Fcgamma受體和Fcgamma受體I。當(dāng)CD3抗體結(jié)合T細(xì)胞時(shí)，CD3抗體的野生型Fc區(qū)結(jié)合至其它細(xì)胞(例如單核細(xì)胞)上存在的FcR，這導(dǎo)致非特異性的Fc-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化。這樣的非特異性的Fc-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可能是不需要的。T細(xì)胞也可被靶向的或靶標(biāo)特異性的T細(xì)胞活化激活。對于許多適應(yīng)癥例如癌癥的治療，這樣的靶向的T細(xì)胞活化可為高度需要的。本文使用的術(shù)語“靶向的T細(xì)胞活化”是指通過使用雙特異性抗體指導(dǎo)T細(xì)胞至特定細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞，所述雙特異性抗體包含結(jié)合特定靶標(biāo)例如腫瘤細(xì)胞上的腫瘤靶標(biāo)的第一結(jié)合區(qū)，和結(jié)合T細(xì)胞特異性靶標(biāo)例如CD3的第二結(jié)合區(qū)。因此，T細(xì)胞靶向至特定細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞，可通過使用雙特異性抗體而促進(jìn)，其中結(jié)合區(qū)之一結(jié)合T細(xì)胞上存在的CD3和另一結(jié)合區(qū)結(jié)合靶標(biāo)特異性抗原，例如腫瘤細(xì)胞上的靶標(biāo)特異性抗原。盡管如此，非特異性的Fc-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可能仍然存在，和因此通過Fc-介導(dǎo)的交聯(lián)的這樣的不需要的非特異性的Fc-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化應(yīng)該被避免，和通過制備對這樣的活性而言是無活性的Fc區(qū)可能是需要的。因此，所述無活性Fc區(qū)與存在的Fc受體之間的相互作用被阻止。當(dāng)在幾種不同的測定法(即參見實(shí)施例3-5)中測試時(shí)本發(fā)明的人源化抗體已經(jīng)證明是無活性的。包含F(xiàn)c區(qū)的氨基酸修飾的另一測試的CD3抗體huCLB-T3/4當(dāng)在不同的測定法(即參見實(shí)施例7-10)中測試時(shí)也證明是無活性的。如實(shí)施例中所述的包含氨基酸置換L234F、L235E和D265A的本發(fā)明的人源化CD3抗體顯示在T細(xì)胞上低水平的CD69表達(dá)(實(shí)施例3)、Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖的廢除(實(shí)施例4)和當(dāng)呈雙特異性抗體的形式時(shí)無非特異性靶標(biāo)殺傷(實(shí)施例5)。因此，本發(fā)明的人源化抗體當(dāng)與野生型抗體相比時(shí)在幾種測定法中顯示優(yōu)異的結(jié)果。本發(fā)明的抗體可包含F(xiàn)c區(qū)的修飾。當(dāng)抗體包含這樣的修飾時(shí)，其可變成無活性或非-激活的抗體。本文使用的術(shù)語“無活性”、“無活性的”或“非-激活的”是指至少不能結(jié)合任何Fcγ受體、誘導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的FcR交聯(lián)或通過單個(gè)抗體的兩個(gè)Fc區(qū)誘導(dǎo)FcR-介導(dǎo)的靶抗原交聯(lián)，或不能結(jié)合C1q的Fc區(qū)。人源化或嵌合CD3抗體的Fc區(qū)的無活性合適地使用單特異性形式的抗體測試，但是如此鑒定的無活性Fc區(qū)可以雙特異性或其它人源化或嵌合多特異性CD3抗體使用?？蓸?gòu)建幾種變體以制備對與Fcgamma受體和C1q的相互作用無活性的抗體的Fc區(qū)，用于治療性抗體開發(fā)。這樣的變體的實(shí)例在本文描述。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含已被修飾的Fc區(qū)，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)減少的Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖，減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖在基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法中測量。本文使用的術(shù)語“減少”是指當(dāng)與對照蛋白質(zhì)例如抗體相比活性或表達(dá)減少。具體而言，術(shù)語“減少”當(dāng)涉及T-細(xì)胞增殖時(shí)，是指當(dāng)與通過野生型抗體結(jié)合的T細(xì)胞增殖相比，本發(fā)明的抗體減少、最小化或甚至完全抑制T細(xì)胞增殖的能力。抗體減少T-細(xì)胞增殖的能力可通過基于PBMC的功能測定法評價(jià)，如實(shí)施例4和實(shí)施例8中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，用人PBMC進(jìn)行測定法。在另一實(shí)施方案中，用食蟹猴PBMC進(jìn)行測定法。在又一實(shí)施方案中，用恒河猴PBMC進(jìn)行測定法。由于本發(fā)明的抗體有交叉反應(yīng)性，本文所述的基于PBMC的測定法可用任何物種的PBMC進(jìn)行以顯示T-細(xì)胞增殖的減少，只要使用的物種的PBMC在抗體的交叉反應(yīng)性譜內(nèi)，例如人、食蟹猴或恒河猴。本文使用的術(shù)語“基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法”是指用于評價(jià)本發(fā)明的抗體的功能特征，例如所述抗體影響T-細(xì)胞增殖或CD69表達(dá)的能力的測定法，其中存在的唯一細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，T-細(xì)胞增殖通過包括以下步驟的方法測量：用范圍1-1000ng/mL的抗體在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中孵育PBMC三天；加入化合物，例如BrdU，其摻入至增殖的細(xì)胞的DNA；孵育5小時(shí)，沉淀細(xì)胞，干燥細(xì)胞，任選地在4℃貯存細(xì)胞，包被細(xì)胞到ELISA板，在室溫下用抗-BrdU-過氧化物酶孵育90分鐘，用1mg/mL2,2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)顯色約30分鐘，加入100μL2%草酸終止反應(yīng)，和在合適的微板閱讀器中測量405nm的吸光度。本文使用的術(shù)語“增殖”是指在細(xì)胞分裂的背景下的細(xì)胞生長。本文使用的術(shù)語“BrdU”是指5-溴-2’-脫氧尿苷，其是胸苷的同系物。當(dāng)BrdU加入細(xì)胞培養(yǎng)物中一段有限的時(shí)間(例如4小時(shí))時(shí)，其將摻入增殖的細(xì)胞的DNA中。在固定細(xì)胞后，可在ELISA中使用抗-BrdU-過氧化物酶進(jìn)行摻入的BrdU檢測。BrdU摻入因此是增殖的度量。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含已被修飾的Fc區(qū)，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)在基于PBMC的功能測定法中測定。本文使用的術(shù)語“減少”是指與對照蛋白質(zhì)例如抗體相比，活性或表達(dá)的減少。具體而言，術(shù)語“減少”當(dāng)涉及T細(xì)胞活化標(biāo)記物CD69的表達(dá)水平時(shí)，是指與當(dāng)T細(xì)胞被野生型抗體結(jié)合時(shí)(條件是抗體兩個(gè)結(jié)合區(qū)均結(jié)合CD3)CD69的表達(dá)水平相比，CD69的表達(dá)水平減少?？贵w減少CD69表達(dá)的能力可通過基于PBMC的功能測定法評價(jià)，如實(shí)施例3和實(shí)施例7所述。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，CD69的表達(dá)通過包括以下步驟的方法測量：用范圍1-1000ng/mL的抗體在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中孵育PBMC16-24小時(shí)，洗滌細(xì)胞，在4℃用小鼠抗-人CD28-PE和小鼠-抗-人CD69-APC抗體染色細(xì)胞，和通過流式細(xì)胞術(shù)測定CD28陽性細(xì)胞上的CD69表達(dá)。本文使用的術(shù)語“CD69”是指分化簇69，其是由CD69基因編碼的人跨膜C-型凝集素蛋白質(zhì)。T淋巴細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞在體內(nèi)和體外的活化，誘導(dǎo)CD69的表達(dá)。CD69用作參與細(xì)胞活化事件包括增殖的信號(hào)傳遞受體，用作在淋巴細(xì)胞包括天然殺傷細(xì)胞和血小板中的信號(hào)傳遞受體，和誘導(dǎo)特定基因。本文使用的術(shù)語“基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法”是指用于評價(jià)本發(fā)明的抗體的功能特征，例如所述抗體影響T-細(xì)胞增殖或CD69表達(dá)的能力的測定法，其中存在的唯一細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞。描述于實(shí)施例3、4、5和7的基于PBMC的功能測定法包括以下步驟：(i)用抗體在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中孵育PBMC約16-24小時(shí)，(ii)洗滌細(xì)胞，(iii)在4℃用小鼠抗-人CD28-PE和小鼠-抗-人CD69-APC抗體染色細(xì)胞，和(iv)當(dāng)評價(jià)CD69表達(dá)時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)測定CD28陽性細(xì)胞上的CD69表達(dá)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，CD69表達(dá)可按實(shí)施例3、4、5或7所述測定。因此，F(xiàn)c區(qū)中在與C1q和FcGamma受體的相互作用中起主要作用的氨基酸可被修飾?？杀恍揎椀陌被嵛恢玫膶?shí)例包括位置L234、L235和P331。其組合，例如L234F/L235E/P331S，可引起與人CD64、CD32A、CD16和C1q結(jié)合的顯著降低。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對應(yīng)于L234、L235和P331的至少一個(gè)位置上的氨基酸可以分別是A、A和S([1]、[28])。此外，L234F和L235E氨基酸置換可產(chǎn)生具有與FcGamma受體和C1q的相互作用廢除的Fc區(qū)([29]-[30])。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對應(yīng)于L234和L235的位置上的氨基酸可以分別是F和E。D265A氨基酸置換可降低與所有Fcgamma受體的結(jié)合和防止ADCC([31])。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對應(yīng)于D265的位置上的氨基酸可以是A。與C1q的結(jié)合可通過突變位置D270、K322、P329和P331而廢除。突變這些位置成D270A或K322A或P329A或P331A任一個(gè)可使抗體缺乏CDC活性([32])。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對應(yīng)于D270、K322、P329和P331的至少一個(gè)位置上的氨基酸可以分別是A、A、A和A。使Fc區(qū)與Fcgamma受體和C1q相互作用最小化的備選方法為通過除去抗體的糖基化位點(diǎn)。突變位置N297為例如Q、A和E除去對于IgG-Fcgamma受體相互作用是關(guān)鍵的糖基化位點(diǎn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對應(yīng)于N297的位置上的氨基酸可以是G、Q、A或E([33])。使Fc區(qū)與Fcgamma受體的相互作用最小化的另一備選方法可以通過以下突變獲得：P238A、A327Q、P329A或E233P/L234V/L235A/G236del([31])?；蛘撸M管人IgG2和IgG4亞類被認(rèn)為天然在它們與C1q和Fcgamma受體的相互作用中不足，但是仍有人報(bào)道了與Fcγ受體(Fcgamma受體)的相互作用([34]-[35])。廢除這些殘留相互作用的突變可在這兩個(gè)同種型中進(jìn)行，導(dǎo)致與FcR結(jié)合有關(guān)的不需要的副作用減少。對于IgG2，這些包括L234A和G237A，和對于IgG4，包括L235E。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG2重鏈中對應(yīng)于L234和G237的位置上的氨基酸可以分別是A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG4重鏈中對應(yīng)于L235的位置上的氨基酸可以是E。在IgG2抗體中進(jìn)一步使與Fcgamma受體和C1q相互作用最小化的其它方法包括描述于[36]和[37]中的那些。關(guān)于與Fcgamma受體和補(bǔ)體的相互作用，抗體的鉸鏈區(qū)也可能是重要的([38]-[39])。因此，鉸鏈區(qū)的突變或缺失可影響抗體的效應(yīng)器功能。本文使用的術(shù)語“交聯(lián)”是指通過帶有FcR的細(xì)胞結(jié)合抗體Fc區(qū)的結(jié)合靶抗原的抗體Fab臂(單價(jià)或二價(jià))的間接橋連。因此，在帶有靶抗原的細(xì)胞上結(jié)合其靶抗原的抗體可與表達(dá)FcR的另一細(xì)胞交聯(lián)。本文使用的術(shù)語“非特異性殺死”是指通過T細(xì)胞或其它效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，經(jīng)過所述細(xì)胞的腫瘤靶抗原-非依賴性活化殺死細(xì)胞。因此，非特異性殺死意思是帶有腫瘤靶標(biāo)的細(xì)胞可通過例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺死，而不是通過結(jié)合腫瘤靶標(biāo)的抗體通過例如誘導(dǎo)CDC而殺死。本發(fā)明人已經(jīng)表明(見實(shí)施例3-5、7-10)，非激活的Fc區(qū)可通過修飾Fc區(qū)的至少五個(gè)特定氨基酸位置中的一個(gè)或多個(gè)而獲得。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含第一和第二免疫球蛋白重鏈，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸分別不是L、L、D、N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸分別不是L、L、D、N和P。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸分別不是L、L和D，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。本文使用的術(shù)語“對應(yīng)于位置的氨基酸”是指人IgG1重鏈的氨基酸位置編號(hào)。除非另外說明或上下文矛盾，恒定區(qū)序列的氨基酸在本文中根據(jù)Eu編號(hào)索引(描述于[27])編號(hào)。因此，一個(gè)序列中“對應(yīng)于”另一個(gè)序列中的氨基酸或區(qū)段的氨基酸或區(qū)段是使用標(biāo)準(zhǔn)序列比對程序例如ALIGN、ClustalW或類似程序，通常以默認(rèn)設(shè)置與其它氨基酸或區(qū)段比對，并與人IgG1重鏈具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%同一性的氨基酸或區(qū)段。本領(lǐng)域眾所周知的是，如何比對序列或序列中的區(qū)段和從而確定序列中與本發(fā)明的氨基酸位置相應(yīng)的位置。在本發(fā)明的背景下，氨基酸可如上文所述定義。術(shù)語“氨基酸不是”或類似用語當(dāng)涉及重鏈中的氨基酸時(shí)，應(yīng)理解為意思是氨基酸是并非提及的特定氨基酸的任何其它氨基酸。例如，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234的位置上的氨基酸不是L，意思是氨基酸可以是除了L之外的任何其它天然或非天然存在的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸不是D。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的D265的位置上的氨基酸不是D，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“疏水的”是指選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y組成的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“極性的”是指選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸是脂族不帶電荷、芳族或酸性氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“脂族不帶電荷”是指選自A、G、I、L和V的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、G、I、L和V。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“芳族”是指選自F、T和W的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自F、T和W。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“酸性”是指選自D和E的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自D和E。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、E、F、G、I、L、T、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸不是D。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的D265的位置上的氨基酸不是D，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“疏水的”是指選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y組成的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“極性的”是指選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自由A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y組成的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸是脂族不帶電荷、芳族或酸性氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“脂族不帶電荷”是指選自A、G、I、L和V的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、G、I、L和V。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“芳族”是指選自F、T和W的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自F、T和W。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“酸性”是指選自D和E的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自D和E。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、E、F、G、I、L、T、V和W。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297的位置上的氨基酸不是N。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的N297的位置上的氨基酸不是N，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置P331的位置上的氨基酸是P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297的位置上的氨基酸不是N。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的N297的位置上的氨基酸不是N，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置P331的位置上的氨基酸是P。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別不是L和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234和L235的位置上的氨基酸分別不是L和L，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的氨基酸選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“疏水的”是指選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“極性”是指選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自由C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T組成的氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別不是L和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234和L235的位置上的氨基酸分別不是L和L，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234和L235的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自由C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T組成的氨基酸。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸是脂族不帶電荷、芳族或酸性氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“脂族不帶電荷”是指選自A、G、I、L和V的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、G、I和V。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“芳族”是指選自F、T和W的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自F、T和W。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“酸性”是指選自D和E的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自D和E。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、D、E、F、G、I、T、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E；或A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E；或A和A，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E；或A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E；或A和A，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是F和E。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，至少對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，至少對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸分別是A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別不是L、L和D。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別不是L、L和D，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的氨基酸選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V和W，和對應(yīng)于位置D265的氨基酸選自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“疏水的”是指選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y的氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“極性”是指選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T，對應(yīng)于人重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸是疏水的或極性的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T，對應(yīng)于人重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自C、E、H、K、N、Q、R、S和T。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸是脂族不帶電荷、芳族或酸性氨基酸。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“脂族不帶電荷”是指選自A、G、I、L和V的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、G、I、L和V，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、G、I和V。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“芳族”是指選自F、T和W的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自選自F、T和W。本文使用的關(guān)于氨基酸殘基的術(shù)語“酸性”是指選自D和E的任何氨基酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自選自D和E。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、E、F、G、I、L、T、V和W，和對應(yīng)于L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、D、E、F、G、I、T、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別不是L、L和D。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別不是L、L和D，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸是脂族不帶電荷、芳族或酸性氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、G、I、L和V，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、G、I和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸各自選自D和E。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置D265的位置上的氨基酸選自A、E、F、G、I、L、T、V和W，和對應(yīng)于L234和L235的位置上的氨基酸各自選自A、D、E、F、G、I、T、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；或A、A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；或A、A和A，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；或A、A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；或A、A和A，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置N297和P331的位置上的氨基酸分別是N和P。在具體的實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是A、A和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是A、A和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、Q和S。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一和第二重鏈兩者中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、Q和S。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:8所示的VH序列、SEQIDNO:10所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:8所示的VH序列、SEQIDNO:12所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:6所示的VH序列、SEQIDNO:10所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:6所示的VH序列、SEQIDNO:12所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:9所示的VH序列、SEQIDNO:10所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:9所示的VH序列、SEQIDNO:12所示的VL序列，和在至少一個(gè)重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:31的人IgLC2/IgLC3恒定結(jié)構(gòu)域λ輕鏈。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體可在輕鏈(LC)和/或重鏈(HC)中被修飾以增加表達(dá)水平和/或生產(chǎn)收率。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可在輕鏈(LC)中被修飾。這樣的修飾是本領(lǐng)域已知的，和可按照描述于例如Zheng,L.,Goddard,J.-P.,Baumann,U.,&Reymond,J.-L.(2004)Expressionimprovementandmechanisticstudyoftheretro-Diels-Alderasecatalyticantibody10F11bysite-directedmutagenesis.JournalofMolecularBiology,341(3),807–14.doi:10.1016/j.jmb.2004.06.014的方法進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置T41的位置上的氨基酸不是T。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置T41的位置上的氨基酸選自H、I、K、L、Q、R和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置T41的位置上的氨基酸是H、K或R，例如K。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10的位置上的氨基酸不是F，和其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置T41、K55和L97的氨基酸位置中的一個(gè)或多個(gè)分別不是T、K和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、T41、K55和L97的位置上的氨基酸分別不是F、T、K和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置T41的位置上的氨基酸選自H、I、K、L、Q、R或V，例如選自H、K和R，例如K，和其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、T41、K55和L97的位置上的氨基酸分別是L、K、N和H。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置R23和A35的位置上的氨基酸分別不是R和A。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置R23的位置上的氨基酸選自A、G、H、K、Q、S和T，例如選自A和G，和其中對應(yīng)于A35的位置上的氨基酸選自I、L、M、P、V、G、F和W，例如選自I、L、M、P和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置R23的位置上的氨基酸是A或G，例如A，和對應(yīng)于位置A35的位置上的氨基酸是P。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、R23、A35、R47、D71、A82、D83、S86、I87和F89的位置上的氨基酸分別不是F、R、A、R、D、A、D、S、I和F。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置R23的位置上的氨基酸選自A、G、H、K、Q、S和T，例如選自A和G，其中對應(yīng)于A35的位置上的氨基酸選自I、L、M、P、V、G、F和W，例如選自I、L、M、P，和其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、R47、D71、A82、D83、S86、I87和F89的位置上的氨基酸分別是L、T、G、P、E、A、E和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于位置R23的位置上的氨基酸是A或G，和其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、A35、R47、D71、A82、D83、S86、I87和F89的位置上的氨基酸分別是L、P、T、G、P、E、A、E和Y。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體可在輕鏈(LC)中被修飾以增加抗體的親和力。導(dǎo)致抗體親和力增加的修飾是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體可在輕鏈(LC)中被修飾以降低抗體的親和力。在某些情況下這可能是有利的，和導(dǎo)致功效增加。具體而言，低親和力的CD3臂可能對循環(huán)中和腫瘤位點(diǎn)的T細(xì)胞的活動(dòng)力具有影響，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更好地與T細(xì)胞的接合(engagement)，參見M?lh?j等,MolecularImmunology44(2007)。具體而言，這可用于雙特異性形式，其中CD3抗體用作結(jié)合臂之一。導(dǎo)致抗體親和力降低的修飾是本領(lǐng)域已知的，參見例如Webster等IntJCancerSuppl.1988；3:13-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中(i)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10的位置上的氨基酸不是F，或(ii)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置K55的位置上的氨基酸不是K，或(iii)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10的位置上的氨基酸不是F，和對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置K55的位置上的氨基酸不是K。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含恒定輕鏈(LC)，其中(i)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10的位置上的氨基酸是L，或者(ii)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置K55的位置上的氨基酸是N，或者(iii)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10的位置上的氨基酸是L，和對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置K55的位置上的氨基酸是N。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、T41、K55和L97的位置上的氨基酸分別不是F、T、K和L。這樣的修飾用于增加表達(dá)水平和降低親和力兩者。本發(fā)明的抗體包含輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、T41、K55和L97的位置上的氨基酸分別是L、K、N和H。這樣的修飾用于增加表達(dá)水平和降低親和力兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中對應(yīng)于SEQIDNO:15的人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置分別是F、E和A，和其中對應(yīng)于SEQIDNO:15的人IgG1重鏈的F405的位置是L，和其中(i)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置F10、T41、K55和L97的位置分別是L、K、N和H，或(ii)對應(yīng)于SEQIDNO:10的λ輕鏈的位置T41的位置是K。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:25的重鏈(HC)和SEQIDNO:32的輕鏈(LC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQIDNO:25的重鏈(HC)和SEQIDNO:33的輕鏈(LC)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及多特異性抗體，其至少包含本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅目贵w的第一結(jié)合區(qū)，和與第一結(jié)合區(qū)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)不同的靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)。這樣的多特異性抗體可以是雙特異性抗體。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及雙特異性抗體，其包含本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅目贵w的第一結(jié)合區(qū)，和與第一結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的靶標(biāo)的第二結(jié)合區(qū)。術(shù)語“多特異性抗體”是指對至少兩個(gè)不同的例如至少三個(gè)、通常不重疊的表位具有特異性的抗體。這樣的表位可在相同或不同的靶標(biāo)上。如果表位在不同的靶標(biāo)上，這樣的靶標(biāo)可在相同的細(xì)胞或不同的細(xì)胞或細(xì)胞類型上。術(shù)語“雙特異性抗體”是指對至少兩個(gè)不同的、通常不重疊的表位具有特異性的抗體。這樣的表位可在相同的或不同的靶標(biāo)上。如果表位在不同的靶標(biāo)上，這樣的靶標(biāo)可在相同的細(xì)胞或不同的細(xì)胞或細(xì)胞類型上。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含第一和第二重鏈。涉及Fc區(qū)的修飾的實(shí)施方案和涉及特定氨基酸置換的實(shí)施方案預(yù)期是本發(fā)明的任何雙特異性抗體的一部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二重鏈中的至少一個(gè)包含按本文所述任何實(shí)施方案(例如關(guān)于提供無活性Fc區(qū)而描述的那些)定義進(jìn)行修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二重鏈兩者包含按本文所述任何實(shí)施方案(例如關(guān)于提供無活性Fc區(qū)而描述的那些)定義進(jìn)行修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，雙特異性抗體包含按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨高M(jìn)行修飾的Fc區(qū)；或所述第一和第二重鏈中的至少一個(gè)包含按本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨付x進(jìn)行修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，C1q與所述抗體的結(jié)合減少至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，其中C1q結(jié)合通過ELISA測定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體介導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述T-細(xì)胞增殖用基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)的功能測定法測量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中Fc區(qū)已被修飾，使得與野生型抗體相比，所述抗體減少Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc-介導(dǎo)的CD69表達(dá)用基于PBMC的功能測定法測定。在具體的實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:8所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:6所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:10所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含包含SEQIDNO:9所示的VH序列和SEQIDNO:12所示的VL序列的第一結(jié)合區(qū)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。可用于本發(fā)明的雙特異性抗體分子的實(shí)例包括(i)具有包含不同的抗原結(jié)合區(qū)的兩個(gè)臂的單一抗體，(ii)對兩個(gè)不同的表位具有特異性的單鏈抗體，例如經(jīng)過由額外的肽接頭串聯(lián)的兩個(gè)scFv；(iii)雙重可變結(jié)構(gòu)域抗體(DVD-IgTM)，其中各輕鏈和重鏈包含通過短的肽連鍵串聯(lián)的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域([40])；(iv)化學(xué)連接的雙特異性(Fab’)2片段；(v)TandAb?，其是兩個(gè)單鏈雙抗體的融合物，產(chǎn)生四價(jià)雙特異性抗體，其對每個(gè)靶抗原具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；(vi)柔韌抗體(flexibody)，其是scFv與雙抗體的組合，產(chǎn)生多價(jià)分子；(vii)所謂的“停靠和鎖閉”分子(Dock-and-Lock?)，根據(jù)蛋白質(zhì)激酶A中的“二聚化和對接結(jié)構(gòu)域”，當(dāng)應(yīng)用于Fab時(shí)，其可產(chǎn)生三價(jià)雙特異性結(jié)合蛋白，其由與不同的Fab片段連接的兩個(gè)相同的Fab片段組成；(viii)所謂的Scorpion分子，其包含例如與人Fab臂的兩個(gè)末端融合的兩個(gè)scFv；和(ix)雙抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體是雙抗體、雜合體(cross-body)或經(jīng)過受控的Fab臂交換獲得的雙特異性抗體，例如DuoBody?(例如描述于[41])，如本發(fā)明中描述的那些。不同類型的雙特異性抗體的實(shí)例包括但不限于(i)IgG-樣分子，具有互補(bǔ)CH3結(jié)構(gòu)域以強(qiáng)迫異源二聚化；(ii)重組的IgG-樣雙重靶向分子，其中分子的兩側(cè)各自包含至少兩種不同的抗體的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全長IgG抗體與額外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩(wěn)定的雙抗體與重鏈恒定結(jié)構(gòu)域、Fc-區(qū)或其一部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab-片段融合在一起，與重鏈恒定結(jié)構(gòu)域、Fc-區(qū)或其一部分融合；和(vi)基于ScFv和雙抗體的和重鏈抗體(例如，結(jié)構(gòu)域抗體、Nanobodies?)，其中不同的單鏈Fv分子或不同的雙抗體或不同的重鏈抗體(例如結(jié)構(gòu)域抗體,Nanobodies?)彼此融合，或與融合至重鏈恒定結(jié)構(gòu)域、Fc-區(qū)或其一部分的另一蛋白質(zhì)或載體分子融合。具有互補(bǔ)的CH3結(jié)構(gòu)域分子的IgG-樣分子的實(shí)例包括但不限于Triomab?(TrionPharma/FreseniusBiotech,[42])、Knobs-into-Holes(Genentech,[43])、CrossMAbs(Roche,[44])和靜電配對(Amgen,[45]-[46]；Chugai,[47]；Oncomed,[48])、LUZ-Y(Genentech)、DIG體和PIG體(Pharmabcine)、鏈交換改造結(jié)構(gòu)域體(SEED體)(EMDSerono,[49])、Biclonics(Merus)、FcΔAdp(Regeneron,[50])、雙特異性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,[51])、Azymetric支架(Zymeworks/Merck,[52])、mAb-Fv(Xencor,[53])、二價(jià)雙特異性抗體(Roche)和DuoBody?分子(GenmabA/S,[41])。重組IgG-樣雙重靶向分子的實(shí)例包括但不限于雙重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗體(Genentech)、交聯(lián)Mab(KarmanosCancerCenter)、mAb2(F-Star,[54])、ZybodiesTM(Zyngenia)、用共有輕鏈的方法(Crucell/Merus,[55])、κλBodies(NovImmune)和CovX-body?(CovX/Pfizer)。IgG融合分子的實(shí)例包括但不限于雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)-IgTM(Abbott,[56])、雙重結(jié)構(gòu)域雙頭抗體(Unilever；SanofiAventis,[57])、IgG-樣雙特異性(ImClone/EliLilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(BiogenIdec,[58])、scFv融合物(Novartis)、scFv融合物(ChangzhouAdamBiotechInc,[59])和TvAb(Roche,[59],[60])。Fc融合分子的實(shí)例包括但不限于ScFv/Fc融合物(AcademicInstitution)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、雙重親和力再導(dǎo)向技術(shù)(Fc-DARTTM)(MacroGenics,[62],[63])和雙重(ScFv)2-Fab(NationalResearchCenterforAntibodyMedicine–China)。Fab融合雙特異性抗體的實(shí)例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、雙重作用或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock?(DNL)(ImmunoMedics)、二價(jià)雙特異性(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)?；赟cFv-、雙抗體-的抗體和結(jié)構(gòu)域抗體的實(shí)例包括但不限于雙特異性T細(xì)胞銜接物(BiTE?)(Micromet,TandemDiabody(Tandab)(Affimed)、雙重親和力再導(dǎo)向技術(shù)(DARTTM)(MacroGenics)、單鏈雙抗體(Academic)、TCR-樣抗體(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack)和COMBODY(EpigenBiotech)、雙重靶向nanobodies?(Ablynx)、雙重靶向僅重鏈結(jié)構(gòu)域抗體。還預(yù)期，滿足本文所述的測定條件的任何單特異性抗體可形成雙特異性抗體的基礎(chǔ)。即，其中結(jié)合區(qū)之一結(jié)合CD3的雙特異性抗體可源自在功能測定法中測試并滿足本文所述要求的任何單特異性CD3抗體。這樣的雙特異性抗體可通過描述于[41]的方法提供，其通過引用結(jié)合到本文中。因此，在具體的實(shí)施方案中，所述第一和第二重鏈各自至少包含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)，其中在所述第一重鏈中對應(yīng)于選自人IgG1重鏈的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一個(gè)氨基酸被置換，和在所述第二重鏈中對應(yīng)于選自人IgG1重鏈的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置上的至少一個(gè)氨基酸被置換，和其中所述第一和所述第二重鏈未在相同的位置上被置換。在該情況下，術(shù)語“置換”是指特定氨基酸位置上的氨基酸被另一天然或非天然存在的氨基酸置換。因此，在對應(yīng)于人IgG1重鏈中的位置的位置上“置換的”氨基酸意指在特定位置上的氨基酸不同于IgG1重鏈中天然存在的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和任選地對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是F，和在所述第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈中選自T366、L368、K370、D399、F405和Y407的位置的至少一個(gè)位置上的氨基酸被置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和在所述第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸不是F和任選地對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是K。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸不是F、R和G，和在所述第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的選自T366、L368、K370、D399、Y407和K409的位置的位置上的氨基酸被置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸不是K、L或M，和對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸不是F。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在所述第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L，和在所述第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，或反之亦然。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中包含上述實(shí)施方案中任一個(gè)所公開的一個(gè)或多個(gè)無活性置換，例如L234F、L235E和D265A；和對應(yīng)于F405的位置上的氨基酸不是F。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中包含上述實(shí)施方案中任一個(gè)所公開的一個(gè)或多個(gè)無活性置換，例如L234F、L235E和D265A；和K409位置上的另外的置換，例如K409R。具體而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體在第一和第二重鏈兩者中包含上述實(shí)施方案中任一個(gè)所公開的一個(gè)或多個(gè)無活性置換，例如L234F、L235E和D265A；和F405位置上的置換，例如F405L。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體在第一和第二重鏈兩者中包含上述實(shí)施方案中任一個(gè)所公開的一個(gè)或多個(gè)無活性置換，例如L234F、L235E和D265A；和K409位置上的另外的置換，例如K409R。這樣的抗體可用于產(chǎn)生雙特異性抗體。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、N和P，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R。在備選的實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、N和P，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、N和P，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R。在備選的實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的L234、L235、D265、N297和P331的位置上的氨基酸分別是F、E、A、N和P，在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的K409的位置上的氨基酸是R，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的F405的位置上的氨基酸是L。如本文所述，T細(xì)胞募集至特定靶細(xì)胞，例如癌癥或腫瘤細(xì)胞，提供殺死靶細(xì)胞的方法。本發(fā)明人已證明，在兩條重鏈中包含特定氨基酸置換L234F、L235E和D265A的雙特異性CD3xHER2抗體能夠誘導(dǎo)殺死AU565細(xì)胞，如實(shí)施例5所述。T細(xì)胞介導(dǎo)的殺死可通過第一結(jié)合區(qū)靶向CD3和第二結(jié)合區(qū)靶向另一靶標(biāo)的雙特異性抗體獲得。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的對于人源化或嵌合CD3抗體的任何實(shí)施方案，和第二結(jié)合區(qū)與第一結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的靶標(biāo)。應(yīng)理解，當(dāng)抗體是雙特異性抗體時(shí)，抗體的至少一半，即抗體的重鏈和輕鏈對之一，是本文所述的人源化或嵌合抗體。因此，雙特異性抗體的一半是根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合CD3的人源化或嵌合抗體和另一半可以是結(jié)合第二靶標(biāo)的人源化、嵌合、完全非人或完全人抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含第一和第二重鏈、第一和第二輕鏈，其中所述第一重鏈和所述第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系?，和通過二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和所述第二重鏈和輕鏈?zhǔn)峭耆说模屯ㄟ^二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中所述第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨?，和所述第二結(jié)合區(qū)結(jié)合不同靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含第一和第二重鏈、第一和第二輕鏈，其中所述第一重鏈和所述第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系?，和通過二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和所述第二重鏈和輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系?，和通過二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中所述第一結(jié)合區(qū)根據(jù)本文所述的方面或?qū)嵤┓桨?，和所述第二結(jié)合區(qū)與所述第一結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的CD3表位。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中，對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:8所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:6所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:10所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:19所示的VH序列，和SEQIDNO:20所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含：第一結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:9所示的VH序列，和SEQIDNO:12所示的VL序列；第二結(jié)合區(qū)，包含SEQIDNO:29所示的VH序列，和SEQIDNO:30所示的VL序列；其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A；和其中在第一重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置F405的位置上的氨基酸是L，和在第二重鏈中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置K409的位置上的氨基酸是R。本文使用的術(shù)語“二硫橋”是指兩個(gè)半胱氨酸殘基之間的共價(jià)鍵，即所述相互作用也可稱為Cys-Cys相互作用。本文使用的術(shù)語“靶標(biāo)”是指本發(fā)明的抗體的結(jié)合區(qū)結(jié)合的分子。當(dāng)用于抗體結(jié)合的背景下時(shí)，該術(shù)語包括產(chǎn)生的抗體所針對的任何抗原。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，第一重鏈和第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系模屯ㄟ^二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和第二重鏈和輕鏈?zhǔn)侨说暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨福偷诙Y(jié)合區(qū)結(jié)合不同的靶標(biāo)；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，第一重鏈和第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和第二重鏈和輕鏈?zhǔn)侨说暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨福偷诙Y(jié)合區(qū)與第一結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的CD3表位；和其中在第一和第二重鏈的至少一個(gè)中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，第一重鏈和第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和第二重鏈和輕鏈?zhǔn)侨说暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨?，和第二結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的靶標(biāo)；和其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，第一重鏈和第一輕鏈?zhǔn)侨嗽椿蚯逗系暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第一結(jié)合區(qū)；和第二重鏈和輕鏈?zhǔn)侨说暮屯ㄟ^二硫橋連接，形成第二結(jié)合區(qū)，其中第一結(jié)合區(qū)按照本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨福偷诙Y(jié)合區(qū)與第一結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的CD3表位；和其中在第一和第二重鏈兩者中對應(yīng)于人IgG1重鏈的位置L234、L235和D265的位置上的氨基酸分別是F、E和A。在一個(gè)方面，本發(fā)明的雙特異性抗體包含結(jié)合人HER2或人CD20的第二結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含結(jié)合人CD20的第二結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二結(jié)合區(qū)可源自全長單克隆CD20抗體，例如公開于WO2004035607(GenmabA/S)的抗體，包括奧法木單抗(2F2)、11B8和7D8；公開于WO2005103081(GenmabA/S)的抗體，包括2C6；AME-133；TRU-015；IMMU-106；奧瑞珠單抗(Gazyva?)；托西莫單抗(Bexxar?)；和利妥昔單抗(Rituxan?/MabThera?)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二結(jié)合區(qū)可源自全長單克隆CD20抗體，該抗體結(jié)合CD20上的表位，其不包含或需要位置170的氨基酸殘基丙氨酸或位置172的脯氨酸，但其包含或需要位置163的氨基酸殘基天冬酰胺和位置166的天冬酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含結(jié)合人CD20的第二結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含：(i)SEQIDNO:34的VHCDR1區(qū)、SEQIDNO:35的VHCDR2區(qū)、SEQIDNO:36的VHCDR3區(qū)、SEQIDNO:37的VLCDR1區(qū)、DAS的VLCDR2區(qū)和SEQIDNO:38的VLCDR3區(qū)，(ii)SEQIDNO:41的VHCDR1區(qū)、SEQIDNO:42的VHCDR2區(qū)、SEQIDNO:43的VHCDR3區(qū)、SEQIDNO:44的VLCDR1區(qū)、DAS的VLCDR2區(qū)和SEQIDNO:45的VLCDR3區(qū)，(iii)SEQIDNO:48的VHCDR1區(qū)、SEQIDNO:49的VHCDR2區(qū)、SEQIDNO:50的VHCDR3區(qū)、SEQIDNO:51的VLCDR1區(qū)、DAS的VLCDR2區(qū)和SEQIDNO:52的VLCDR3區(qū)，或者(iv)SEQIDNO:55的VHCDR1區(qū)、SEQIDNO:56的VHCDR2區(qū)、SEQIDNO:57的VHCDR3區(qū)、SEQIDNO:58的VLCDR1區(qū)、DAS的VLCDR2區(qū)和SEQIDNO:59的VLCDR3區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含結(jié)合人CD20的第二結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含：(i)VH序列，其與SEQIDNO:29所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，和VL序列，其與SEQIDNO:30所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，(ii)VH序列，其與SEQIDNO:39所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，和VL序列，其與SEQIDNO:40所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，(iii)VH序列，其與SEQIDNO:46所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，和VL序列，其與SEQIDNO:47所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，或者(iv)VH序列，其與SEQIDNO:53所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性，和VL序列，其與SEQIDNO:54所示的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%氨基酸序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含結(jié)合人CD20的第二結(jié)合區(qū)，所述第二結(jié)合區(qū)包含：(i)SEQIDNO:29的VH序列，和SEQIDNO:30的VL序列，(ii)SEQIDNO:39的VH序列，和SEQIDNO:40的VL序列，(iii)SEQIDNO:46的VH序列，和SEQIDNO:47的VL序列，或者(iv)SEQIDNO:53的VH序列，和SEQIDNO:54的VL序列。核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼表1所示的一個(gè)或多個(gè)序列的核酸構(gòu)建體。因此，本發(fā)明涉及編碼SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26所示的任何一個(gè)序列的核酸構(gòu)建體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體的序列的核酸構(gòu)建體、包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體、包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、和通過在產(chǎn)生和任選地收回所述抗體的合適的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述抗體的方法。人源化CD3抗體亦稱為“huCD3”。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供表達(dá)載體，其包含(i)編碼本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的重鏈序列的核酸序列，(ii)編碼本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的輕鏈序列的核酸序列，或(iii)(i)和(ii)兩者。因此，表達(dá)載體包含本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅囊粋€(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體或核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼選自SEQIDNO:1,2,3,4和5以及序列GTN的重鏈和輕鏈CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供表達(dá)載體，其包含編碼選自SEQIDNO:6、7、8、9、10、11、12、19、20、27、28、29和30的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列或其任何組合的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼SEQIDNO:3所示的VHCDR3氨基酸序列的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼選自SEQIDNO:6、7、8、9、19、27和29的VH氨基酸序列的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼選自SEQIDNO:10、11、12、20、28和30的VL氨基酸序列的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼人抗體輕鏈、人抗體重鏈或兩者的恒定區(qū)的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)SEQIDNO:15、16、23、24、25和26的氨基酸序列的核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)上述氨基酸序列的變體的核酸序列，所述變體具有至多25個(gè)氨基酸修飾，例如至多20個(gè)，例如至多15、14、13、12或11個(gè)氨基酸修飾，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸修飾，例如缺失或插入，優(yōu)選置換，例如保守或非保守置換，或與任何所述序列具有至少80%同一性，例如與任何上述氨基酸序列具有至少85%同一性或90%同一性或95%同一性，例如96%同一性或97%同一性或98%同一性或99%同一性。本發(fā)明還涉及不同于上述核酸序列但由于遺傳密碼的差異而編碼與本發(fā)明的抗體相同的氨基酸序列的核酸序列。例如，核酸序列可不同，但產(chǎn)生與本文所述的任何氨基酸序列相同的氨基酸序列。如何基于遺傳密碼鑒定這樣的另外的核酸序列是技術(shù)人員眾所周知的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼抗體(例如人抗體)的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的恒定區(qū)的核酸序列。上文所述的這樣的表達(dá)載體可用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在本發(fā)明的背景下，表達(dá)載體可以是任何合適的載體，包括染色體、非染色體和合成的核酸載體(包含一組合適的表達(dá)控制元件的核酸序列)。這樣的載體的實(shí)例包括SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、源自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體，和病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合CD3抗體-編碼核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表達(dá)元件(如描述于例如[64])、致密核酸載體(如描述于例如[65]和/或[66])、質(zhì)粒載體例如pBR322、pUC19/18或pUC118/119、"midge"最低大小的核酸載體(如描述于例如[67])，或作為沉淀的核酸載體構(gòu)建體，例如CaPO4--沉淀的構(gòu)建體(如描述于例如[68]、[69]、[70]和[71])。這樣的核酸載體和其用途是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如[72]和[73])。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體適合于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)人源化或嵌合CD3抗體。這樣的載體的實(shí)例包括表達(dá)載體，例如BlueScript(Stratagene)、pIN載體([74])、pET載體(Novagen,MadisonWI)等。表達(dá)載體可另外或備選地是適合于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的載體。可使用適合于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的任何載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如α因子、醇氧化酶和PGH的載體(綜述于[75]和[76])。核酸構(gòu)建體和/或載體可還包含編碼分泌/定位序列的核酸序列，其可將多肽(例如新生的多肽鏈)靶向胞質(zhì)空間或細(xì)胞培養(yǎng)基中。這樣的序列是本領(lǐng)域已知的，和包括分泌前導(dǎo)序列或信號(hào)肽、細(xì)胞器靶向序列(例如核定位序列、ER保留信號(hào)、線粒體運(yùn)輸序列、葉綠體運(yùn)輸序列)、膜定位/錨序列(例如終止轉(zhuǎn)移序列、GPI錨序列)等，其是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明的表達(dá)載體中，人源化或嵌合CD3抗體-編碼核酸可包含或與任何合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)促進(jìn)元件締合。這樣的元件的實(shí)例包括強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子(例如人CMVIE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIVLTR啟動(dòng)子)、有效的多聚(A)終止序列、大腸桿菌中質(zhì)粒產(chǎn)物的復(fù)制起點(diǎn)、作為選擇性標(biāo)記的抗生素抗性基因和/或合適的克隆位點(diǎn)(例如，聚合接頭)。核酸構(gòu)建體和/或載體還可包含與組成型啟動(dòng)子相對的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如CMVIE(技術(shù)人員將知道，這些術(shù)語實(shí)際上是在某些條件下基因表達(dá)程度的描述符)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合CD3抗體-編碼表達(dá)載體位于宿主細(xì)胞或宿主動(dòng)物中，和/或通過病毒載體遞送至宿主細(xì)胞或宿主動(dòng)物。這樣的表達(dá)載體可用于重組產(chǎn)生人源化或嵌合CD3抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅娜嗽椿蚯逗螩D3抗體通過使用產(chǎn)生抗體的重組真核、重組原核或重組微生物宿主細(xì)胞提供。因此，本發(fā)明提供重組真核、重組原核或重組微生物宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生本文定義的人源化或嵌合CD3抗體或免疫球蛋白。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括酵母、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO或HEK-293細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含穩(wěn)定整合至細(xì)胞基因組的核酸序列，其包含編碼本文所述的人源化或嵌合CD3抗體的表達(dá)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含非整合的核酸序列，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌?；蚓€性表達(dá)元件，其包含編碼本文所述的人源化或嵌合CD3抗體的表達(dá)的序列。本文使用的術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡稱"宿主細(xì)胞")意指表達(dá)載體或核酸構(gòu)建體或序列所引入的細(xì)胞。應(yīng)理解，該術(shù)語不僅意指具體的受試細(xì)胞，而且指所述細(xì)胞的子代。因?yàn)樵趥鞔鷷r(shí)由突變或環(huán)境影響導(dǎo)致可存在某些修飾，所述子代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不同，但仍包括在本文使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞包括例如：真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、PER.C6、NS0細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；和原核細(xì)胞，例如大腸桿菌；和其它真核宿主，例如植物細(xì)胞和真菌。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的人源化或嵌合CD3抗體的方法，所述方法包括以下步驟：a)培養(yǎng)上文所述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，和b)從培養(yǎng)基回收和/或純化本發(fā)明的抗體。在進(jìn)一步的方面，編碼人源化或嵌合CD3抗體的序列的核苷酸序列進(jìn)一步編碼第二部分，例如治療多肽。示例性的治療多肽在本文另外描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生人源化或嵌合CD3抗體融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含包含所述核苷酸序列的表達(dá)載體，和b)從培養(yǎng)基回收和/或純化人源化或嵌合CD3抗體融合蛋白。組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本文所述的任何方面和實(shí)施方案的抗體或雙特異性抗體的組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本文所述的任何一個(gè)方面和實(shí)施方案定義的抗體或雙特異性抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物可按照常規(guī)技術(shù)，例如描述于[77]中的技術(shù)，用藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑以及任何其它已知的助劑和賦形劑配制。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑以及任何其它已知的助劑和賦形劑應(yīng)適合于本發(fā)明的人源化或嵌合抗體和選擇的給藥方式。藥物組合物的載體和其它組分的適合性根據(jù)不存在對選擇的本發(fā)明的化合物或藥物組合物對抗原結(jié)合所需要的生物性質(zhì)的顯著的負(fù)面影響來確定(例如，小于實(shí)質(zhì)的影響(10%或更小的相對抑制、5%或更小的相對抑制等))。本發(fā)明的藥物組合物還可包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、去垢劑(例如非離子去垢劑，例如Tween-20或Tween-80)、穩(wěn)定劑(例如糖或無蛋白質(zhì)氨基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑和/或適合于包括在藥物組合物中的其它材料。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可改變，以獲得對具體患者、組合物和給藥方式有效實(shí)現(xiàn)需要的治療反應(yīng)并對患者無毒的量的活性成分。選擇的劑量水平將取決于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物或其酰胺的活性、給藥途徑、給藥次數(shù)、使用的特定化合物的排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間；與使用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料；治療的患者的年齡、性別、體重、病況、一般健康和之前的病史等因素。藥物組合物可通過任何合適的途徑和方式給予。體內(nèi)和體外給予本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的合適途徑是本領(lǐng)域眾所周知的，和可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)胃腸外給予。本文使用的短語"胃腸外給予"和"經(jīng)胃腸外給予"意指腸內(nèi)和局部給藥以外的給藥方式，通常通過注射，和包括表皮、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、腱內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、顱內(nèi)、胸內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物通過靜脈內(nèi)或皮下注射或輸注給予。藥學(xué)上可接受的載體包括任何和所有合適的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑和吸收延遲劑等，其在生理上與本發(fā)明的人源化或嵌合抗體相容?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇、葡萄糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其合適的混合物；植物油例如橄欖油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油；羧甲基纖維素膠體溶液、黃蓍膠和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯，和/或各種緩沖液。其它載體是制藥領(lǐng)域眾所周知的。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。對于藥學(xué)活性物質(zhì)，這樣的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，預(yù)期其在本發(fā)明的藥物組合物中使用。當(dāng)涉及“活性化合物”時(shí)，預(yù)期也涉及本發(fā)明的人源化或嵌合抗體。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可例如，通過使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持所需的粒度，和通過使用表面活性劑來保持。本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥學(xué)上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥基茴香醚(BHA)、丁羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。本發(fā)明的藥物組合物還可在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化鈉。本發(fā)明的藥物組合物還可包含適合于選擇的給藥途徑的一種或多種助劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩沖劑，其可提高藥物組合物的半壽期或功效。本發(fā)明的人源化或嵌合抗體可與保護(hù)化合物免于快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)。這樣的載體可包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和單獨(dú)或與蠟一起的聚乳酸，或本領(lǐng)域眾所周知的其它材料。用于制備這樣的制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的(參見例如[78])。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體可經(jīng)配制以確保適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)分布。用于胃腸外給予的藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。對于藥學(xué)活性物質(zhì)，這樣的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，預(yù)期其在本發(fā)明的藥物組合物中使用。其它活性或治療化合物也可摻入組合物中。注射用的藥物組合物在制備和貯存條件下通常必須是無菌的和穩(wěn)定的。組合物可配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。載體可以是水性或非水性溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其合適的混合物；植物油例如橄欖油，和可注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。合適的流動(dòng)性可例如，通過使用包衣料例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持所需的粒度和通過使用表面活性劑來保持。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇例如甘油、甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠來產(chǎn)生。無菌注射溶液可通過將需要量的活性化合物與按需要例如上文列舉的一種成分或成分的組合一起摻入合適溶劑中，接著無菌微量過濾來制備。一般而言，分散液通過將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散基質(zhì)和需要的其它成分例如上文列舉的那些的無菌溶媒來制備。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況下，制備方法的實(shí)例是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其得到來自其之前無菌過濾溶液的活性成分加任何其它需要的成分的粉末。無菌注射溶液可通過將需要量的活性化合物與按需要上文列舉的一種成分或成分的組合一起摻入合適的溶劑中，接著無菌微量過濾來制備。一般而言，分散液通過將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文列舉的那些的需要的其它成分的無菌溶媒中來制備。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況下，制備方法的實(shí)例是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其得到來自其之前無菌過濾溶液的活性成分加任何其它需要的成分的粉末。治療應(yīng)用在另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨付x的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體或藥物組合物，其用作藥物。在另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨付x的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體或藥物組合物，其用于治療疾病。本發(fā)明的人源化或嵌合抗體或藥物組合物可用于治療其中需要細(xì)胞毒性T細(xì)胞的效應(yīng)器機(jī)制的任何癌癥。例如，人源化或嵌合抗體可給予至例如體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或例如體內(nèi)給予至人受試者，以治療或預(yù)防病癥例如癌癥、炎性或自身免疫性病癥。本文使用的術(shù)語“受試者”通常是對人源化或嵌合抗體或藥物組合物有反應(yīng)的人。受試者可例如包括具有病癥的人患者，所述病癥可通過調(diào)節(jié)靶功能或通過直接或間接導(dǎo)致殺死細(xì)胞來糾正或改善。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防病癥例如癌癥的方法，其中T細(xì)胞的募集將有助于治療或預(yù)防，所述方法包括給予治療有效量的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體或藥物組合物至有需要的受試者。該方法通常包括給予受試者有效治療或預(yù)防所述病癥的量的人源化或嵌合抗體。在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，包括給予本文所述的任何方面和實(shí)施方案中定義的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體或藥物組合物至有需要的受試者。在另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢卸x的用途或方法，其中人源化或嵌合抗體是特異性結(jié)合CD3和癌癥-特異性靶標(biāo)或在癌癥中過量表達(dá)或與癌癥有關(guān)的靶標(biāo)兩者的雙特異性抗體，所述靶標(biāo)例如HER2、CD19、EpCAM、EGFR、CD66e(或CEA、CEACAM5)、CD33、EphA2或MCSP(或HMW-MAA)，和其中疾病是癌癥，例如乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、食管癌和頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、胰腺癌、睪丸癌、惡性黑素瘤、軟組織癌癥(例如滑膜肉瘤)、無痛或侵襲形式的B-細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴性白血病或急性淋巴性白血病。人源化或嵌合抗體的有效劑量和劑量方案取決于待治療的疾病或病況，和可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。本領(lǐng)域具有普通技能的醫(yī)生可容易地確定和處方需要的有效量的藥物組合物。例如，醫(yī)生可以低于為實(shí)現(xiàn)理想的治療效果而需要的水平開始藥物組合物中使用的人源化或嵌合抗體的劑量，和逐漸增加劑量，直到實(shí)現(xiàn)理想的效果。一般而言，本發(fā)明的組合物的合適的劑量為根據(jù)特定的劑量方案有效產(chǎn)生治療效果的最低劑量的人源化或嵌合抗體的量。這樣的有效劑量一般取決于上文所述的因素。例如，治療用途的"有效量"可通過其穩(wěn)定疾病進(jìn)展的能力來測量。化合物抑制癌癥的能力可例如在預(yù)測在人腫瘤中的功效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評價(jià)。或者，組合物的這種性質(zhì)可通過技術(shù)人員已知的體外測定法檢查人源化或嵌合抗體抑制細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的能力來評價(jià)。治療有效量的治療化合物，即本發(fā)明的治療人源化或嵌合抗體或藥物組合物，可減少腫瘤大小，或以其它方式改善受試者的癥狀。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠根據(jù)例如受試者的大小、受試者的癥狀的嚴(yán)重性和特定組合物或選擇的給藥途徑等因素確定這樣的量。本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的治療有效量的示例性的非限制性范圍是約0.001-30mg/kg，例如約0.001-20mg/kg，例如約0.001-10mg/kg，例如約0.001-5mg/kg，例如約0.001-2mg/kg，例如約0.001-1mg/kg，例如約0.001,約0.01,約0.1,約1,約5,約8,約10,約12,約15,約18mg/kg。給藥可例如是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下的，和例如給予至靶標(biāo)位點(diǎn)附近。上述治療方法和用途中的劑量方案經(jīng)調(diào)整以提供最佳需要的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可給予單次推注，可隨時(shí)間給予數(shù)次分開的劑量，或按治療情況的緊急性所指示的，可按比例減少或增加劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療期間，例如在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)，監(jiān)測治療功效。如果需要，藥物組合物的有效日劑量可在全天中以合適的時(shí)間間隔作為單獨(dú)給予的兩次、三次、四次、五次、六次或更多次的子劑量，任選地以單位劑量形式給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體或藥物組合物經(jīng)長時(shí)間例如超過24小時(shí)通過緩慢連續(xù)輸注給予，以使不需要的副作用最小化。盡管有可能單獨(dú)給予本發(fā)明的人源化或嵌合抗體，但優(yōu)選作為上文所述的藥物組合物給予人源化或嵌合抗體。有效劑量的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體也可使用一周一次、兩周一次或三周一次的給藥期給予。給藥期可限制為例如，8周、12周或直到確定臨床進(jìn)展?；蛘?，有效劑量的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體可每隔一周、兩周或三周給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體可通過輸注，以通過mg/m2計(jì)算的每周一次劑量給予。這樣的劑量可例如基于上文提供的mg/kg劑量，根據(jù)以下得到：劑量(mg/kg)x70:1.8。這樣的給藥可重復(fù)例如1-8次，例如3-5次。給藥可通過連續(xù)輸注進(jìn)行2-24小時(shí)的一段時(shí)間，例如2-12小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體可通過緩慢連續(xù)輸注給予一段長的時(shí)間，例如超過24小時(shí)，以減少毒性副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)一周一次給予時(shí)，人源化或嵌合抗體可以作為固定劑量計(jì)算的每周一次劑量給予至多8次，例如4-6次。這樣的方案可按需要重復(fù)一次或多次，例如在6個(gè)月或12個(gè)月后。這樣的固定劑量可例如基于上文提供的mg/kg劑量，體重估計(jì)為70kg。劑量可通過在給予后通過例如獲取生物樣品和使用靶向本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的結(jié)合區(qū)的抗個(gè)體基因型抗體，測量在血液中本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的量來確定或調(diào)整。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體可通過維持療法給予，例如一周一次持續(xù)6個(gè)月或更多的一段時(shí)間。人源化或嵌合抗體也可預(yù)防性給予以減少發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，延遲癌癥進(jìn)展中的事件發(fā)生的開始，和/或當(dāng)癌癥減輕時(shí)減少復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。為容易給予和劑量的均勻性，胃腸外組合物可配制為劑量單位形式。本文使用的劑量單位形式是指適合作為待治療的受試者的單一劑量的物理離散單位；每個(gè)單位包含經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生需要的治療效果的預(yù)定量的活性化合物和需要的藥用載體。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格通過以下方面來指示和直接取決于以下方面：(a)活性化合物的獨(dú)特特征和欲實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中調(diào)配這樣的活性化合物用于治療個(gè)體的敏感性而固有的局限性。人源化或嵌合抗體也可預(yù)防性給予以減少發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，延遲癌癥進(jìn)展中的事件發(fā)生的開始，和/或當(dāng)癌癥緩解時(shí)減少復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。在其中難以定位由于其它生物因素而已知存在的腫瘤的患者中，這可能是特別有用的。診斷應(yīng)用使用包含本文所述的人源化或嵌合抗體的組合物，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體還可用于診斷目的。因此，本發(fā)明提供使用本文所述的人源化或嵌合抗體的診斷方法和組合物。這樣的方法和組合物可用于純粹的診斷目的，例如檢測或鑒定疾病，以及用于監(jiān)測治療性治療的進(jìn)展，監(jiān)測疾病進(jìn)展，評價(jià)治療后的狀態(tài)，監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)，評價(jià)發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)等。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及診斷特征為涉及或積聚CD3-表達(dá)細(xì)胞的疾病的方法，包括給予本發(fā)明的人源化或嵌合抗體，本發(fā)明的組合物，或本發(fā)明的藥物組合物至受試者，任選地其中所述人源化或嵌合抗體用可檢測試劑標(biāo)記。在一個(gè)方面，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體離體使用，例如用于通過在獲自患者的樣品中檢測靶標(biāo)的水平或在其細(xì)胞表面上表達(dá)目的靶標(biāo)的細(xì)胞的水平，診斷其中表達(dá)特定目的靶標(biāo)且被人源化或嵌合抗體結(jié)合的細(xì)胞指示疾病或涉及發(fā)病機(jī)理的疾病。這可例如通過使測試的樣品，任選地與對照樣品一起，在允許抗體與靶標(biāo)結(jié)合的條件下接觸本發(fā)明的人源化或嵌合抗體來實(shí)現(xiàn)。然后可檢測復(fù)合物形成(例如使用ELISA)。當(dāng)使用對照樣品連同測試樣品時(shí)，在兩種樣品中分析人源化或嵌合抗體或抗體-靶標(biāo)復(fù)合物的水平，和測試樣品中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的更高水平的人源化或嵌合抗體或抗體-靶標(biāo)復(fù)合物指示與對照樣品相比，測試樣品中更高水平的靶標(biāo)。其中可使用本發(fā)明的人源化或嵌合抗體的常規(guī)免疫測定的實(shí)例包括而不限于ELISA、RIA、FACS分析、等離子體共振分析、色譜分析、組織免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡和/或免疫沉淀。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷特征為涉及或積聚CD3-表達(dá)細(xì)胞的疾病的方法，包括給予本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅目贵w、雙特異性抗體、組合物或藥物組合物至受試者，任選地其中抗體用可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶標(biāo)或表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞的存在情況的方法，包括：-使樣品與本發(fā)明的人源化或嵌合抗體在允許人源化或嵌合抗體與樣品中的靶標(biāo)結(jié)合的條件下接觸；和-分析是否形成復(fù)合物。通常，樣品是生物學(xué)樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是已知或疑似包含特定靶標(biāo)和/或表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞的組織樣品。例如，原位檢測靶標(biāo)表達(dá)可通過從患者移出組織學(xué)樣本，和提供本發(fā)明的人源化或嵌合抗體至這樣的樣本來實(shí)現(xiàn)。人源化或嵌合抗體可通過施加或涂覆人源化或嵌合抗體至樣本來提供，然后使用合適的工具對其進(jìn)行檢測。然后可能不僅檢測靶標(biāo)或表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞的存在情況，而且檢測靶標(biāo)或表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞在受檢組織中的分布(例如，在評價(jià)癌細(xì)胞的擴(kuò)散的情況下)。使用本發(fā)明，普通技術(shù)人員容易地理解，各種組織學(xué)方法中的任一種(例如染色程序)可被改良，以實(shí)現(xiàn)這樣的原位檢測。在上述測定法中，人源化或嵌合抗體可用可檢測物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，以允許結(jié)合的抗體被檢測?；蛘?，結(jié)合的(第一)特異性人源化或嵌合抗體可通過用可檢測物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記和結(jié)合第一特異性人源化或嵌合抗體的抗體檢測。此外，在上述測定法中，可使用包含本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅目贵w或雙特異性抗體的診斷組合物。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨傅目贵w或雙特異性抗體的診斷組合物。樣品中的靶標(biāo)水平還可使用用可檢測物質(zhì)標(biāo)記的靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物和未標(biāo)記的靶標(biāo)特異性的人源化或嵌合抗體，通過競爭免疫測定法進(jìn)行評價(jià)。在該類型的測定法中，將生物樣品、標(biāo)記的靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物和靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體組合，和測定與未標(biāo)記的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體結(jié)合的標(biāo)記的靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物的量。生物樣品中靶標(biāo)的量與結(jié)合至靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體的標(biāo)記的靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。用于體外診斷技術(shù)的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體、第二抗體和/或靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物的合適的標(biāo)記包括而不限于各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹酰氯和藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；和合適放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、35S和3H。在一個(gè)方面，本發(fā)明的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體用于表達(dá)靶標(biāo)的組織例如腫瘤的體內(nèi)成像。對于體內(nèi)方法，抗體片段例如(Fab’)2、Fab和Fab’片段，因?yàn)槠淇焖俜植紕?dòng)力學(xué)而是特別有利的。體內(nèi)成像可通過任何合適的技術(shù)進(jìn)行。例如，用99Tc、131I、111In或其它發(fā)射γ射線的同位素標(biāo)記的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體(例如抗體或片段)可用于在表達(dá)靶標(biāo)的組織例如腫瘤中，用γ閃爍照相機(jī)(例如ElscintApex409ECT設(shè)備)，通常使用低能高分辨率準(zhǔn)直儀或低能通用準(zhǔn)直儀成像靶標(biāo)特異性抗體積聚或分布。或者，用89Zr、76Br、18F或其它發(fā)射正電子的放射性核素標(biāo)記可在腫瘤中使用正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)，用于成像靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體或抗體片段分布。通過使用這樣的技術(shù)獲得的圖像可用于評價(jià)在患者、哺乳動(dòng)物或組織中的靶標(biāo)的生物分布，例如在使用靶標(biāo)作為癌癥/腫瘤細(xì)胞的存在情況的生物標(biāo)記物的情況下。該技術(shù)的變化可包括使用磁共振成像(MRI)以改進(jìn)經(jīng)γ照相機(jī)技術(shù)的成像。常規(guī)的免疫閃爍成像方法和原理描述于例如[79]、[80]和[81]。此外，這樣的圖像也可或備選地用作除去腫瘤的手術(shù)技術(shù)的基礎(chǔ)。此外，這樣的體內(nèi)成像技術(shù)可在其中患者被鑒定為具有腫瘤(由于存在其它生物標(biāo)記物、轉(zhuǎn)移等)但腫瘤不能通過傳統(tǒng)分析技術(shù)鑒定的情況下，允許鑒定和定位腫瘤。所有這些方法是本發(fā)明的特征。本發(fā)明提供的體內(nèi)成像和其它診斷方法可特別用于檢測人患者(例如，之前未診斷患有癌癥的患者或處于癌癥恢復(fù)/緩解期的患者)中的微小轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供體內(nèi)成像方法，其中本發(fā)明的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體與促進(jìn)檢測的不透射線的試劑綴合，綴合的人源化或嵌合抗體給予至宿主，例如通過注射至血流，和分析標(biāo)記的人源化或嵌合抗體在宿主中的存在情況和位置。通過本文提供的該技術(shù)和任何其它診斷方法，本發(fā)明提供用于篩選在人患者或獲自人患者的生物樣品中疾病相關(guān)細(xì)胞的存在情況的方法和/或用于在靶標(biāo)特異性ADC療法之前評價(jià)靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體的分布的方法。對于診斷成像，放射性同位素可與靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體直接或通過使用中間官能團(tuán)間接結(jié)合。有用的中間官能團(tuán)包括螯合劑，例如乙二胺四乙酸和二亞乙基三胺五乙酸(參見例如[82])。除了放射性同位素和不透射線的試劑之外，診斷方法可使用與染料(例如與生物素-鏈霉抗生物素復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(例如順磁離子)綴合的靶標(biāo)特異性抗體進(jìn)行(參見例如[83]，其描述了MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體的制備)。這樣的診斷/檢測試劑可選自用于MRI的試劑和熒光化合物。為了用放射性金屬或順磁離子加載靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體，可能有必要將其與具有長尾的試劑反應(yīng)，多倍螯合基團(tuán)與所述長尾連接以結(jié)合離子。這樣的尾可以是聚合物例如聚賴氨酸、聚糖或具有側(cè)掛基團(tuán)的另一衍生化或衍生的鏈，螯合基團(tuán)可與所述側(cè)掛基團(tuán)結(jié)合，例如已知用于該目的的卟啉、聚胺、冠醚、雙硫代半卡巴腙、聚肟等基團(tuán)。螯合劑可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)與靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體偶聯(lián)。因此，本發(fā)明提供診斷性靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體，其中靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體與造影劑(例如用于磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層照相術(shù)或超聲對比增強(qiáng)劑)或放射性核素(其可以是例如γ-、β-、α-、Auger電子-或正電子-發(fā)射型同位素)綴合。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體的診斷組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶標(biāo)抗原或表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞的存在情況的試劑盒，包含：-本發(fā)明的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體；和-試劑盒的使用說明書。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中CD3抗原或表達(dá)CD3的細(xì)胞的存在情況的試劑盒，包括以下步驟：a)使樣品與本發(fā)明的抗體或雙特異性抗體在允許在抗體或雙特異性抗體和CD3之間形成復(fù)合物的條件下接觸；和b)分析是否形成復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于診斷癌癥的試劑盒，其包含包含靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體的容器，和用于檢測靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體與靶標(biāo)結(jié)合的一種或多種試劑。試劑可包括例如熒光標(biāo)簽、酶標(biāo)簽或其它可檢測標(biāo)簽。試劑還可包括第二或第三抗體或用于酶反應(yīng)的試劑，其中酶反應(yīng)產(chǎn)生可被顯現(xiàn)的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷試劑盒，其包含在合適的容器中的呈標(biāo)記或未標(biāo)記形式的本發(fā)明的一種或多種靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體、用于間接測定法孵育的試劑，和用于在這樣的測定法中檢測的底物或衍生試劑(取決于標(biāo)簽的性質(zhì))。還可包括對照試劑和使用說明書。還可提供與靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體、例如標(biāo)記的靶標(biāo)特異性抗體使用的診斷試劑盒，用于檢測組織樣品或宿主中靶標(biāo)的存在情況。在這樣的診斷試劑盒中以及在本文他處描述的治療用途的試劑盒中，靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體通?？梢詢龈尚问皆谌萜髦袉为?dú)或與對靶細(xì)胞或肽有特異性的另外的抗體結(jié)合提供。通常，還可包括藥學(xué)上可接受的載體(例如，惰性稀釋劑)和/或其組分，例如Tris、磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑、殺生物劑、惰性蛋白例如血清白蛋白等(通常在分開的容器中用于混合)和另外的試劑(也通常在分開的容器中)。在某些試劑盒中，還包括能夠結(jié)合靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體的第二抗體，其通常存在于單獨(dú)的容器中。第二抗體通常與標(biāo)簽綴合和以類似于本發(fā)明的靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體的方式配制。使用上文和本文他處描述的方法，靶標(biāo)特異性人源化或嵌合抗體可用于定義癌癥/腫瘤細(xì)胞的子集和表征這樣的細(xì)胞和相關(guān)腫瘤組織?？箓€(gè)體基因型抗體在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及抗個(gè)體基因型抗體，其結(jié)合本文所述的本發(fā)明的人源化或嵌合抗體?？箓€(gè)體基因型(Id)抗體是識(shí)別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的獨(dú)特的決定簇的抗體。抗-Id抗體可通過用對其制備了抗-Id的單克隆抗體免疫與CD3單克隆抗體的來源相同的物種和基因型的動(dòng)物制備。免疫的動(dòng)物通?？赏ㄟ^產(chǎn)生對這些個(gè)體基因型決定簇的抗體(抗-Id抗體)而識(shí)別和響應(yīng)免疫抗體的個(gè)體基因型決定簇。這樣的抗體描述于例如US4,699,880。這樣的抗體是本發(fā)明的另外特征?？?Id抗體也可用作"免疫原"以在又一動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Id抗體?？?抗-Id抗體可在表位上與誘導(dǎo)抗-Id抗體的原始單克隆抗體相同。因此，通過使用針對單克隆抗體的個(gè)體基因型決定簇的抗體，有可能鑒定表達(dá)相同特異性的抗體的其它克隆。通過任何合適的技術(shù)，例如本文他處關(guān)于本發(fā)明的CD3-特異性抗體描述的那些技術(shù)，抗-Id抗體可以改變(從而產(chǎn)生抗-Id抗體變體)和/或衍生。例如，單克隆抗-Id抗體可與載體例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)和用于免疫BALB/c小鼠。來自這些小鼠的血清通常包含抗-抗-Id抗體，其具有類似于(如果不相同)原始/親代CD3抗體的結(jié)合性質(zhì)。序列表1CDR區(qū)根據(jù)IMGT定義注釋。實(shí)施例實(shí)施例1–人源化CD3抗體和非-激活的抗體變體的產(chǎn)生CD3抗體的人源化鼠CD3抗體(US8,236,308，本文描述為IgG1-CD3)的人源化通過Antitope(Cambridge,UK)使用其改進(jìn)形式的種系人源化(CDR-移植)技術(shù)(EP0629240)進(jìn)行。使用該技術(shù)，設(shè)計(jì)4個(gè)不同的VH鏈(SEQIDNO:6、7、8和9)和3個(gè)不同的VL鏈(SEQIDNO:10、11和12)。通過組合這些4個(gè)VH與3個(gè)VL鏈，產(chǎn)生12種不同的抗體。人源化變體在本文描述為huCD3。因此，本發(fā)明的包含VH和VL的人源化變體被描述為例如，IgG1-huCD3-H1L1，其意指所述特定變體具有IgG1同種型，是人源化CD3和包含稱為“H1”和根據(jù)SEQIDNO:6定義的VH氨基酸序列和稱為“L1”和根據(jù)SEQIDNO:10定義的VL氨基酸序列。因此，H1是指可變重鏈區(qū)VH1，L1是指可變輕鏈區(qū)VL1，等等。具體而言，產(chǎn)生變體IgG1-huCD3-H1L1(包含SEQIDNO:6所示的VH1序列和SEQIDNO:10所示的VL1序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H1L2(包含SEQIDNO:6所示的VH1序列和SEQIDNO:11所示的VL2序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H1L3(包含SEQIDNO:6所示的VH1序列和SEQIDNO:12所示的VL3序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H3L3(包含SEQIDNO:8所示的VH3序列和SEQIDNO:12所示的VL3序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H4L1(包含SEQIDNO:9所示的VH4序列和SEQIDNO:10所示的VL1序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H3L1(包含SEQIDNO:8所示的VH3序列和SEQIDNO:10所示的VL1序列的人源化CD3)、IgG1-huCD3-H3L3(包含SEQIDNO:8所示的VH3序列和SEQIDNO:12所示的VL3序列的人源化CD3)和IgG1-huCD3-H4L3(包含SEQIDNO:9所示的VH4序列和SEQIDNO:12所示的VL3序列的人源化CD3)，并在本文所述的實(shí)施例中測試。在一些實(shí)施例中，包含huCLB-T3/4的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列(分別為SEQIDNO:17和18)的抗體用作對照抗體(Labrijn等,PNAS2013,110:5145-50)和驗(yàn)證Fc區(qū)中的不同的非-激活的突變組合(見實(shí)施例8-10)。huCBL-T3/4是人源化形式的鼠CD3抗體CLB-T3/4(Parren等,ResImmunol.1991,142(9):749-63)。將兩個(gè)序列(SEQIDNO:17和18)克隆至相關(guān)的pcDNA3.3(Invitrogen)表達(dá)載體和通過共轉(zhuǎn)染在HEK293F細(xì)胞中表達(dá)。得到的對照抗體描述為IgG1-huCLB-T3/4。在一些實(shí)施例中，包含CD20抗體7D8的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列(SEQIDNO:29對應(yīng)于VH序列和SEQIDNO:30對應(yīng)于VL序列)的抗體用作陽性對照。當(dāng)在陽性對照的情況下使用時(shí)，其稱為“IgG1-CD20”。這些IgG1-CD3(即嵌合的親本CD3抗體)、IgG1-huCD3和IgG1-huCLB-T3/4抗體以單特異性和雙特異性形式使用，其中雙特異性抗體按下文所述產(chǎn)生。HER2抗體在一些實(shí)施例中，使用針對HER2的抗體。用于該HER2-特異性抗體的VH和VL序列(抗體169，分別為SEQIDNO:19和20)在之前描述(WO2012/143524[Genmab]；Labrijn等,PNAS2013,110:5145-50)。該抗體以單特異性和雙特異性形式兩者使用，和被稱為“IgG1-HER2”。b12抗體在一些實(shí)施例中，抗體b12，一種gp120特異性抗體(Barbas,CF.JMolBiol.1993Apr5；230(3):812-23.)用作陰性對照，和被稱為“IgG1-b12”。表達(dá)抗體作為IgG1,κ或IgG1,λ表達(dá)，帶有或沒有下文描述的非-激活的突變和具有通過下文描述的方法能夠產(chǎn)生雙特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域中的突變：IgG1-HER2-K409R、IgG1-b12-K409R、IgG1-CD3-F405L。基本上按制造商所述，使用293fectin(Invitrogen,US)，將編碼抗體的重鏈和輕鏈兩者的質(zhì)粒DNA混合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至FreestyleHEK293F細(xì)胞(Invitrogen,US)?？贵w的純化培養(yǎng)上清液通過加載到5mLMabSelectSuRe柱(GEHealthCare)的0.2μm空端過濾器過濾和用0.1M檸檬酸鈉-NaOH,pH3洗脫。洗脫液立即用2MTris-HCl,pH9中和，和過夜透析至12.6mMNaH2PO4,140mMNaCl,pH7.4(B.Braun)?；蛘?，純化后，將洗脫液加載至HiPrep脫鹽柱和將抗體交換至12.6mMNaH2PO4,140mMNaCl,pH7.4(B.Braun)緩沖液。在透析或緩沖液交換后，將樣品經(jīng)0.2μm空端過濾器無菌過濾。通過SDS-PAGE測定純度，和通過280nm的吸光度測量濃度。純化的抗體在2-8℃下貯存。雙特異性抗體的產(chǎn)生使用DuoBody?平臺(tái)技術(shù)，即2-MEA-誘導(dǎo)的Fab-臂交換，如WO2011/147986和Labrijn等(Labrijn等,PNAS2013,110:5145-50；Gramer等,MAbs2013,5:962-973)中所描述，體外產(chǎn)生雙特異性抗體。為了能夠通過該方法產(chǎn)生雙特異性抗體，產(chǎn)生在CH3結(jié)構(gòu)域中帶有單一突變的IgG1分子：在一種親本IgG1抗體中F405L突變(即IgG1-CD3抗體)，在其它親本IgG1抗體中K409R突變(即HER2或b12抗體)。為了產(chǎn)生雙特異性抗體，這兩種親本抗體，各抗體終濃度為0.5mg/mL，用25或75mM2-巰基乙胺-HCl(2-MEA)在總體積500μLTE中在31℃孵育5小時(shí)。當(dāng)通過使用用25mLPBS平衡的PD-10柱(GE-healthcare,product#17-0851-01)將還原劑2-MEA除去時(shí)，終止還原反應(yīng)。脫鹽前，加入2mLPBS(B.Braun,產(chǎn)品號(hào)3623140)至樣品，以調(diào)整體積至2.5mL。在3.5mLPBS中進(jìn)行洗脫。在AmiconUltra離心設(shè)備(30kDMWCO,Millipore,產(chǎn)品號(hào)UFC803096)中收集樣品和通過以3000xg離心8min濃縮。用PBS調(diào)整體積至500μL(當(dāng)需要時(shí))和樣品通過0.2μm過濾器(Millex-GV,產(chǎn)品號(hào)SLGV004SL)無菌過濾。雙特異性產(chǎn)物在2-8℃下貯存。在得到相同的雙特異性抗體的備選方式中，為了產(chǎn)生雙特異性抗體，將100μg的兩種親本抗體混合，和用75mM2-巰基乙胺-HCl(2-MEA)在總體積400μLPBS(B.Braun,產(chǎn)品號(hào)3623140)中在31℃孵育5小時(shí)。當(dāng)通過使用AmiconUltra0.5ml離心設(shè)備(10kDMWCO,Millipore,產(chǎn)品號(hào)UFC501096)和用400μlPBS通過以13000xg離心10min洗滌4次來除去還原劑2-MEA時(shí)，終止還原反應(yīng)。通過倒置過濾器和以1000g離心2min在新管中收集樣品。用PBS調(diào)整體積至200μL(當(dāng)需要時(shí))。測量雙特異性產(chǎn)物的280nm的吸光度(A280)，以確定終濃度。進(jìn)行HPLC陽離子交換色譜(HPLC-CEX)(描述于WO2013/060867)，以確定雙特異性產(chǎn)物的量。樣品在2-8℃下貯存。產(chǎn)生的雙特異性抗體在下文中描述為“K409RIgG1骨架”和“F405LIgG1骨架”。非-激活的突變用Fc區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換產(chǎn)生幾種抗體變體。非-激活的Fc區(qū)阻止抗體與血細(xì)胞(例如單核細(xì)胞)上存在的Fc-受體相互作用，或阻止抗體與C1q相互作用以激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑。在包含F(xiàn)c區(qū)的氨基酸置換的不同組合的抗體變體中測試Fc活性的降低。引入最多5個(gè)氨基酸置換，其包括突變N297Q、L234A、L235A、L234F、L235E、D265A和P331S。在這5個(gè)氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)中的置換被引入K409R和/或F405LIgG1骨架。產(chǎn)生huCLB-T3/4抗體的以下的Fc區(qū)變體：N297Q(是指N297Q置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-N297Q)、LFLE(是指L234F/L235E置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LFLE)、LALA(是指L234A/L235A置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LALA)、LFLENQ(是指L234F/L235E/N297Q置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ)、LFLEDA(是指L234F/L235E/D265A置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA)、DA(是指D265A置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-DA)、DAPS(是指D265A/P331S置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-DAPS)、DANQ(是指D265A/N297Q置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-DANQ)、LFLEPS(是指L234F/L235E/P331S置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS)和LFLEDANQPS(是指L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S置換，稱為IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS)。具體而言，在IgG1-huCD3抗體變體中，3個(gè)氨基酸置換的組合，其包括突變L234F、L235E和D265A和稱為LFLEDA，引入K409R和F405LIgG1骨架中，以產(chǎn)生具有非-激活的Fc區(qū)的抗體。得到的非-激活的抗體變體以后綴“-LFLEDA”命名。實(shí)施例2-人源化CD3抗體和其非-激活的變體與表達(dá)CD3的人和食蟹猴T細(xì)胞系結(jié)合人源化CD3(huCD3)抗體的純化的變體和雙特異性(bs)IgG1-huCD3xHER2分子(見實(shí)施例1)，帶有或沒有Fc區(qū)的LFLEDA突變，與人T細(xì)胞系Jurkat(CloneE6-1,ATCC?TIB-152?,LGCStandardsGmbH,Wesel,Germany)或食蟹猴T細(xì)胞系HSC-F(cat.no.JCRB1164；HealthScienceResearchResourcesBank,Osaka,Japan)的結(jié)合通過FACS分析進(jìn)行分析。除了非-激活的突變LFLEDA之外，抗體變體包含F(xiàn)405L或K409R突變，如實(shí)施例1所述。細(xì)胞(1x105細(xì)胞/孔)在聚苯乙烯96-孔圓底板(Greinerbio-one650101)上用在100μLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中連續(xù)稀釋的抗體制備物(范圍5-10,000ng/mL，以3-倍稀釋)在4℃孵育30min。在用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次后，細(xì)胞在100μL中用第二抗體在4℃孵育30min。作為第二抗體，在PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中以1/100稀釋的R-藻紅蛋白(PE)-綴合的山羊-抗-人IgGF(ab’)2(109-116-098,JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA)用于所有實(shí)驗(yàn)。接著，細(xì)胞在PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中洗滌兩次，重懸于150μLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物和在FACSCantoll(BDBiosciences)上分析。結(jié)合曲線使用非線性回歸(S形劑量反應(yīng)，具有可變斜率)使用GraphPadPrismV5.04軟件(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)進(jìn)行分析。圖1A顯示具有野生型Fc區(qū)的IgG1λ-huCD3變體IgG1-huCD3-H1L1(分別為SEQIDNO:6和10)、IgG1-huCD3-H1L2(分別為SEQIDNO:6和11)、IgG1-huCD3-H1L3(分別為SEQIDNO:6和12)、IgG1-huCD3-H3L3(分別為SEQIDNO:8和12)和IgG1-huCD3-H4L1(分別為SEQIDNO:9和10)與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合對于所有變體都觀察到，和IgG1-CD3-LFLEDA(實(shí)施例1所述的親本CD3抗體，具有非-激活的LFLEDA突變)和具有非-激活的LFLEDA突變的IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA的結(jié)合能力類似于具有野生型Fc區(qū)的huCD3變體。與IgG1-huCD3變體相比，作為陽性對照包括的IgG1-huCLB-T3/4與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合更強(qiáng)。對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖6A顯示具有非-激活的LFLEDA突變的IgG1-CD3-LFLEDA(實(shí)施例1所述的親本CD3抗體，具有非-激活的LFLEDA突變)、IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA、IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA和IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合類似于具有野生型Fc區(qū)的huCD3變體的結(jié)合能力。作為陽性對照包括的IgG1-huCLB-T3/4與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合，與IgG1-huCD3變體相比在低抗體濃度時(shí)更強(qiáng)，但在較高的抗體濃度下類似?？傮w上，人源化CD3變體保持了作為IgG1-CD3抗體與CD3的結(jié)合能力。對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖1B顯示雙特異性抗體變體bsIgG1CD3xHER2、bsIgG1CD3xb12-LFLEDA和bsIgG1huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA也結(jié)合Jurkat細(xì)胞。這些雙特異性抗體的最大結(jié)合值高于單特異性抗體的最大結(jié)合值。雙特異性抗體的EC50濃度為6-10倍。再次，對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖6B顯示雙特異性非-激活的Fc抗體變體bsIgG1huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA也結(jié)合Jurkat細(xì)胞。這些雙特異性抗體的最大結(jié)合值高于單特異性抗體的最大結(jié)合值。雙特異性抗體的EC50濃度為4-10倍。單價(jià)結(jié)合允許更多抗體聚集在細(xì)胞表面上，因此，允許雙特異性抗體的較高的結(jié)合值。再次，對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖2A顯示具有野生型Fc區(qū)的IgG1-huCD3變體IgG1-huCD3-H1L1、IgG1-huCD3-H1L2、IgG1-huCD3-H1L3、IgG1-huCD3-H3L3和IgG1-huCD3-H4L1，和IgG1-CD3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA與食蟹猴T細(xì)胞系HSC-F的結(jié)合是類似的。對于不與食蟹猴CD3交叉反應(yīng)的對照抗體huCLB-T3/4，和陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖7A顯示IgG1-huCD3變體IgG1-CD3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA和IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA與食蟹猴T細(xì)胞系HSC-F的結(jié)合是類似的。對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖2B顯示雙特異性抗體變體bsIgG1CD3xHER2和bsIgG1huCD3-H3L1-LFLEDA也結(jié)合HSC-F細(xì)胞。這些雙特異性抗體的最大結(jié)合值高于單特異性抗-CD3變體的最大結(jié)合值。雙特異性抗體的EC50濃度為單特異性抗-CD3抗體的10-12倍。再次，對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。圖7B顯示雙特異性非-激活的Fc抗體變體bsIgG1huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA也結(jié)合HSC-F細(xì)胞。這些雙特異性抗體的最大結(jié)合值高于單特異性抗-CD3變體的最大結(jié)合值。雙特異性抗體的EC50濃度是單特異性抗-huCD3抗體的3-6倍。再次，對于陰性對照抗體IgG1-b12，未觀察到結(jié)合。實(shí)施例3–通過人源化CD3抗體變體的T細(xì)胞活化CD69表達(dá)是T細(xì)胞活化的早期標(biāo)志物。通過T細(xì)胞表達(dá)的CD3和免疫細(xì)胞表達(dá)的Fc受體經(jīng)由抗體的Fc區(qū)例如IgG1Fc區(qū)的結(jié)合，CD3抗體可介導(dǎo)T細(xì)胞和免疫細(xì)胞的交聯(lián)。這可導(dǎo)致T細(xì)胞活化和CD69的誘導(dǎo)。包含非-激活的Fc區(qū)的抗體變體(LFLEDA突變)不結(jié)合Fc受體。因此，預(yù)期非-激活的CD3抗體不誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和CD69表達(dá)，這是因?yàn)榉?激活的Fc區(qū)不結(jié)合表達(dá)Fc受體的免疫細(xì)胞，和因此不能交聯(lián)T細(xì)胞和免疫細(xì)胞。在用含有和沒有Fc區(qū)的LFLEDA突變的人源化CD3(huCD3)變體孵育后，T細(xì)胞上的CD69表達(dá)通過FACS分析進(jìn)行評價(jià)，以確定T細(xì)胞的早期活化。除了非-激活的突變之外，LFLEDA變體還包含F(xiàn)405L或K409R突變，如實(shí)施例1中所述。通過密度梯度分離使用Leucosep管(#227290；GreinerBio-one,Alphena/dRijn,TheNetherlands)自全血或血沉棕黃層分離PBMC，用PBS洗滌和重懸于培養(yǎng)基中。將劑量反應(yīng)系列的huCD3抗體變體、陰性對照(IgG1-b12)和陽性對照(IgE-huCD3和親本IgG1-CD3)在培養(yǎng)基中制備(范圍0.1-1,000ng/mL，以10倍稀釋)，和加入到包含人或食蟹猴PBMC的96-孔圓底板的各孔。在16-24小時(shí)孵育后，通過離心將細(xì)胞沉淀，和收集上清液(含有細(xì)胞因子)和在-20℃貯存。然后用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌細(xì)胞和在4℃用小鼠-抗-人CD28-PE(854.222.010；Sanquin,Amsterdam,TheNetherlands；T細(xì)胞標(biāo)志物)和小鼠-抗-人CD69-APC抗體(340560；BDBiosciences,FranklinLakes,NJ)染色30分鐘，它們分別與食蟹猴CD28和CD69交叉反應(yīng)。未結(jié)合的抗體通過用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次除去。將細(xì)胞以150μL/孔重懸，和CD28陽性細(xì)胞上的CD69表達(dá)在FACSCantoII(BDBiosciences)上測量。圖3顯示具有野生型IgG1Fc區(qū)的IgG1-CD3(如實(shí)施例1所述)和人源化IgG1-huCD3變體在來自人(圖3A)和食蟹猴(圖3B)來源的T細(xì)胞上誘導(dǎo)類似水平的CD69表達(dá)。非-激活的(LFLEDA)IgG1-CD3-LFLEDA和IgG1-huCD3-H3L1變體在人T細(xì)胞中誘導(dǎo)低水平的CD69表達(dá)。通過非-激活的IgG1-huCD3變體在食蟹猴T細(xì)胞中不誘導(dǎo)CD69表達(dá)。對照抗體IgG1-b12在人或食蟹猴T細(xì)胞中也不誘導(dǎo)CD69的表達(dá)。圖8顯示非-激活的(LFLEDA)IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA、IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA、IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA、IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA和IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA變體在人T細(xì)胞中誘導(dǎo)低水平的CD69表達(dá)。圖8A和8B顯示在來自食蟹猴的T細(xì)胞上誘導(dǎo)CD69表達(dá)。觀察到的通過非-激活的變體的較少活化可能是由于通過CD3抗體的二價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的CD3分子的交聯(lián)。這樣的解釋通過以下觀察結(jié)果得到支持：在最高濃度下活化減少，此時(shí)抗體結(jié)合是單價(jià)的。對照抗體IgG1-b12也未在人或食蟹猴T細(xì)胞中誘導(dǎo)CD69的表達(dá)。圖8C和8D顯示非-激活的雙特異性抗體變體bsIgG1-huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA不誘導(dǎo)在來自人(圖8C)或食蟹猴(圖8D)的T細(xì)胞中CD69的表達(dá)。然而，在較高的抗體濃度下觀察到CD69表達(dá)的一些誘導(dǎo)。實(shí)施例4–通過人源化CD3抗體變體誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖人源化CD3(huCD3)抗體變體(描述于實(shí)施例1)對人和食蟹猴T細(xì)胞的增殖的作用通過來自RocheAppliedScience的細(xì)胞增殖ELISA試劑盒來評價(jià)(細(xì)胞增殖ELISA,BrdU試劑盒,#11647229001；RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)，其按照制造商的說明書進(jìn)行。自全血或血沉棕黃層分離的人或食蟹猴PBMC在96-孔培養(yǎng)板中用稀釋系列(范圍0.1-1,000ng/mL，按10倍稀釋)的IgG1huCD3抗體變體孵育。包括IgE-CD3和IgG1-huCLB-T3/4作為陽性對照和IgG1-b12作為陰性對照。用抗體孵育3天后，加入BrdU(RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)至培養(yǎng)基，和將板孵育5小時(shí)。然后通過離心將細(xì)胞沉淀，和收集上清液并在-20℃貯存。將板干燥和在4℃貯存，直到進(jìn)行ELISA。DNA中的BrdU摻入根據(jù)制造商的說明書(RocheAppliedScience)通過ELISA測定。將細(xì)胞固定至板上，之后在室溫用與過氧化物酶綴合的抗-BrdU抗體將板孵育90分鐘。將板用PBST洗滌和使用ABTS緩沖液(代替試劑盒提供的TMB溶液)檢測結(jié)合。30min后通過加入2%草酸至各孔，終止顯色。然后在EL808ELISA-閱讀器上測量OD405nm。圖4顯示用具有野生型IgG1Fc區(qū)的親本IgG1-CD3和人源化IgG1-huCD3變體孵育PBMC誘導(dǎo)人(圖4A)和食蟹猴(圖4B)T細(xì)胞的強(qiáng)增殖，甚至在極低濃度的抗體時(shí)。用IgG1-huCD3抗體的非-激活的LFLEDA變體孵育不誘導(dǎo)人T細(xì)胞(圖4A和9A)或食蟹猴T細(xì)胞(圖4B和9B)的增殖。因此，盡管IgG1-huCD3抗體的非-激活的變體誘導(dǎo)在人T細(xì)胞中低水平的CD69表達(dá)(如實(shí)施例3所示)，通過這些非-激活的IgG1-huCD3變體不誘導(dǎo)人T細(xì)胞的增殖。圖9C和9D顯示非-激活的雙特異性抗體變體bsIgG1-huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA不誘導(dǎo)自人(圖9C)或食蟹猴(圖9D)分離的T細(xì)胞的增殖。實(shí)施例5–通過人源化CD3抗體變體誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性腫瘤特異性T細(xì)胞細(xì)胞毒性可通過一個(gè)臂與CD3結(jié)合和另一個(gè)臂與腫瘤特異性靶標(biāo)例如HER2結(jié)合的雙特異性抗體介導(dǎo)。雙特異性抗體同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩者將導(dǎo)致T細(xì)胞活化和腫瘤細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性。在本實(shí)施例中，針對HER2-陽性腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性使用針對CD3(人源化變體)和HER2的雙特異性抗體進(jìn)行評價(jià)。因此，AU565(人乳腺癌)細(xì)胞在補(bǔ)充10%(vol/vol)熱滅活的CCS、1.5g/L碳酸氫鈉(Lonza)、1mM丙酮酸鈉、4.5g/L葡萄糖(Sigma)、50IU/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素的RPMI1640中培養(yǎng)。將細(xì)胞系保持在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中。AU565細(xì)胞培養(yǎng)至接近匯合，之后細(xì)胞經(jīng)受胰蛋白酶處理，再懸浮于培養(yǎng)基中和通過細(xì)胞過濾器獲得單細(xì)胞懸液。將5x104細(xì)胞接種至96-孔培養(yǎng)板的各孔，和細(xì)胞在37℃,5%CO2孵育至少3小時(shí)，以允許附著至板上。人或食蟹猴PBMC自全血或血沉棕黃層分離。分離的PBMC用PBS洗滌，再懸浮于培養(yǎng)基中和按1:1比率添加至在96-孔板中的AU565腫瘤細(xì)胞。PBMC中存在的T細(xì)胞的百分比使用小鼠抗-人CD3-PerCP(BD,#345766)抗體(用于染色T細(xì)胞)通過FACS-分析測量，該抗體與食蟹猴CD3交叉反應(yīng)。使用的PBMC群中的T細(xì)胞含量通常為50-60%。稀釋系列(終濃度范圍0.001直至10,000ng/mL)的雙特異性抗體變體bsIgG1CD3xHER2-LFLEDA、bsIgG1CD3xb12-LFLEDA、bsIgG1huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA在培養(yǎng)基中制備和加入板中。包括IgG1-HER2-LFLEDA和IgG1-b12作為對照。除了非-激活的突變之外，LFLEDA抗體變體包含F(xiàn)405L或K409R突變，用于以雙特異性形式制備(見實(shí)施例1)。將板在37℃,5%CO2孵育3天。細(xì)胞用1μM星孢素(#S6942-200,Sigma)孵育，作為100%腫瘤細(xì)胞殺死的參考使用。板用PBS洗滌兩次，和包含10%Alamarblue的150μL培養(yǎng)基加入各孔。將板在37℃,5%CO2孵育4小時(shí)。測量590nm的吸光度(Envision,PerkinElmer,Waltham,MA)。雙特異性CD3xHER2-LFLEDA抗體變體(bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA和bsIgG1-CD3xHER2-LFLEDA)在低濃度時(shí)使用人效應(yīng)細(xì)胞(圖5A)或食蟹猴效應(yīng)細(xì)胞(圖5B)誘導(dǎo)殺死AU565細(xì)胞。CD3雙特異性對照抗體huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA，其顯示與食蟹猴CD3無交叉反應(yīng)，僅當(dāng)使用人PBMC時(shí)誘導(dǎo)殺死AU565細(xì)胞(圖5A)。因此，當(dāng)食蟹猴效應(yīng)細(xì)胞用于該測定法時(shí)未觀察到殺死靶細(xì)胞(圖5B)。用單特異性IGG1-b12或IgG1-HER2-LFLEDA或bsIgG1-CD3xb12-LFLEDA抗體孵育不誘導(dǎo)靶細(xì)胞的非特異性殺死。雙特異性抗體變體bsIgG1huCD3-H3L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H3L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L3xHER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H4L1xHER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H4L3xHER2-LFLEDA在低濃度時(shí)使用人效應(yīng)細(xì)胞(圖10A)或食蟹猴效應(yīng)細(xì)胞(圖10B)誘導(dǎo)殺死AU565細(xì)胞。用單特異性IgG1-b12或IgG1-HER2-LFLEDA抗體孵育不誘導(dǎo)非特異性靶細(xì)胞殺死(圖10A和B)。因此，包含非-激活的Fc區(qū)的人源化CD3變體不誘導(dǎo)非特異性靶細(xì)胞殺死，這表明包含非-激活的Fc區(qū)的變體可用于確保靶向的T細(xì)胞活化和因此避免非-靶向的T細(xì)胞活化。實(shí)施例6–通過人源化CD3抗體變體的恒河猴T細(xì)胞活化在用具有野生型IgG1Fc區(qū)的人源化CD3(huCD3)抗體變體孵育后，評價(jià)在恒河猴T細(xì)胞上的CD69表達(dá)以確定T細(xì)胞的早期活化。通過流式細(xì)胞術(shù)分離恒河猴PBMC和評價(jià)CD69表達(dá)按實(shí)施例3所述進(jìn)行。圖11顯示人源化CD3抗體變體IgG1-huCD3-H1L1、IgG1-huCD3-H1L2、IgG1-huCD3-H1L3、IgG1-huCD3-H3L3和IgG1-huCD3-H4L1誘導(dǎo)在恒河猴來源的T細(xì)胞上的CD69表達(dá)至類似于IgG1-CD3(如實(shí)施例1所述)的水平。陰性對照抗體IgG1-b12不誘導(dǎo)在恒河猴T細(xì)胞中CD69的表達(dá)。因此，本發(fā)明的huCD3變體可用于涉及恒河猴CD3的實(shí)驗(yàn)。huCD3變體與恒河猴CD3交叉反應(yīng)。實(shí)施例7-通過huCLB-T3/4的非-激活的變體的T細(xì)胞活化在用具有Fc區(qū)突變的IgG1-huCLB-T3/4變體(見實(shí)施例1)孵育后，T細(xì)胞上的CD69表達(dá)通過FACS分析進(jìn)行評價(jià)以確定T細(xì)胞的早期活化。通過密度梯度分離使用Leucosep管(#227290；GreinerBio-one,Alphena/dRijn,TheNetherlands)自全血或血沉棕黃層分離PBMC，用PBS洗滌和重懸浮于培養(yǎng)基中。劑量反應(yīng)系列的IgG1-huCLB-T3/4變體、陰性對照(IgG1-huCLB-T3/4-Fab)和陽性對照(IgE-huCLB-T3/4)在培養(yǎng)基中制備(范圍1-1000ng/mL，以3倍稀釋)，和加入到包含PBMC的96-孔圓底板的各孔。在16-24小時(shí)孵育后，通過離心將細(xì)胞沉淀，和收集上清液(包含細(xì)胞因子)和在-20℃貯存。然后細(xì)胞用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌，和在4℃用小鼠-抗-人CD28-PE(854.222.010；Sanquin,Amsterdam,TheNetherlands；T細(xì)胞標(biāo)志物)和小鼠-抗-人CD69-APC抗體(340560；BDBiosciences,FranklinLakes,NJ)染色30分鐘。未結(jié)合的抗體通過用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次除去。將細(xì)胞重懸浮于150μL/孔和在FACSCantoII(BDBiosciences)上測量CD28陽性細(xì)胞上的CD69-表達(dá)。圖12A顯示在用IgE-huCLB-T3/4、IgG1-huCLB-T3/4、IgG1-huCLB-T3/4-DA和IgG1-huCLB-T3/4-DAPS孵育的細(xì)胞上CD69表達(dá)高。與野生型IgG1-huCLB-T3/4相比，用IgG1-huCLB-T3/4-N297Q孵育誘導(dǎo)略微較低的CD69表達(dá)水平，和用IgG1-huCLB-T3/4-LFLE和IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS孵育誘導(dǎo)CD69至更低程度。PBMC用IgG1-CD3Fab、IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA、IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ、IgG1-huCLB-T3/4-DANQ和IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS抗體孵育不誘導(dǎo)T細(xì)胞上的CD69的任何表達(dá)。圖12B顯示在用IgE-huCLB-T3/4和IgG1-huCLB-T3/4孵育的細(xì)胞上CD69表達(dá)高。與野生型IgG1-huCLB-T3/4相比，用IgG1-huCLB-T3/4-LALA孵育誘導(dǎo)略微較低的CD69表達(dá)水平，和用IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA和IgG1-b12(陰性對照)孵育不誘導(dǎo)T細(xì)胞上的CD69的任何表達(dá)。實(shí)施例8–通過huCLB-T3/4的非-激活的變體的T-細(xì)胞增殖huCLB-T3/4變體(描述于實(shí)施例1)對T細(xì)胞增殖的作用通過來自RocheAppliedScience的細(xì)胞增殖ELISA試劑盒(細(xì)胞增殖ELISA,BrdU試劑盒,#11647229001；RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)進(jìn)行評價(jià)，其按照制造商的說明書進(jìn)行。自全血或血沉棕黃層分離的PBMC在96-孔培養(yǎng)板中用稀釋系列(范圍0.1-1000ng/mL)的IgG1-CD3變體孵育。包括IgE-CD3和IgG1-CD3作為陽性對照和IgG1-b12(具有K409R突變用于產(chǎn)生雙特異性抗體)作為陰性對照。用抗體孵育3天后，將BrdU(RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)加入培養(yǎng)基，和將板孵育5小時(shí)。然后通過離心將細(xì)胞沉淀，和收集上清液和在-20℃貯存。將板干燥和在4℃貯存直至進(jìn)行ELISA。DNA中的BrdU摻入通過ELISA根據(jù)制造商的說明書測定(細(xì)胞增殖ELISA,BrdU試劑盒,#11647229001；RocheAppliedScience)。將細(xì)胞固定至板上，之后在室溫(RT)用與過氧化物酶綴合的抗-BrdU抗體將板孵育90分鐘。板用PBST洗滌，和使用ABTS緩沖液(代替試劑盒提供的TMB溶液)測定結(jié)合。在30min后通過加入2%草酸至各孔終止顯色。然后在EL808ELISA-閱讀器上測量OD405nm。圖13A顯示PBMC用IgG1-huCLB-T3/4、IgG1-huCLB-T3/4-DA和IgG1-huCLB-T3/4-DAPS孵育誘導(dǎo)T細(xì)胞的強(qiáng)增殖，甚至在極低濃度的抗體時(shí)。用IgG1-huCLB-T3/4-N297Q孵育誘導(dǎo)劑量依賴性增殖，這與IgE-huCLB-T3/4陽性對照相當(dāng)。PBMC用IgG1-huCLB-T3/4-Fab、IgG1-b12-N297Q、IgG1-huCLB-T3/4-LFLE、IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA、IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ、IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS、IgG1-huCLB-T3/4-DANQ和IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS抗體孵育不誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖。圖13B顯示PBMC用IgG1-huCLB-T3/4孵育誘導(dǎo)T細(xì)胞的強(qiáng)增殖，甚至在極低濃度的抗體時(shí)。用IgE-huCLB-T3/4(陽性對照)和IgG1-huCLB-T3/4-LALA孵育誘導(dǎo)劑量依賴性增殖。PBMC用IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA孵育不誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖。根據(jù)實(shí)施例7和8的結(jié)果，被視為最少激活的一個(gè)突變體亞組進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)施例9–通過非-激活的抗體變體huCLB-T3/4誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性AU565(人乳腺癌)細(xì)胞在補(bǔ)充10%(vol/vol)熱滅活的CCS、1.5g/L碳酸氫鈉(Lonza)、1mM丙酮酸鈉、4.5g/L葡萄糖(Sigma)、50IU/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素的RPMI1640中孵育。將細(xì)胞系保持在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中。AU565細(xì)胞培養(yǎng)至接近匯合。細(xì)胞經(jīng)受胰蛋白酶處理，再懸浮于培養(yǎng)基和通過細(xì)胞過濾器獲得單細(xì)胞懸液。將5x104細(xì)胞接種至96-孔培養(yǎng)板的各孔，和將細(xì)胞在37oC,5%CO2孵育至少3小時(shí)，以允許附著至板上。使用Leucosep30mL管根據(jù)制造商的方案(GreinerBio-one)，外周血單核細(xì)胞(PBMC)自健康志愿者的血液分離。分離的PBMC用PBS洗滌，重懸浮于培養(yǎng)基和按1:1比率加入96-孔板中的AU565腫瘤細(xì)胞。PBMC中存在的T細(xì)胞的百分比通過FACS-分析使用小鼠抗-人CD3-PerCP(BD,#345766)抗體(用于染色T細(xì)胞)測量。使用的PBMC群中的T細(xì)胞含量通常為50-60%。稀釋系列(終濃度范圍0.004-1000ng/mL)的IgG1-b12、IgG1-huCLB-T3/4、IgG1-HER2和雙特異性huCLB-T3/4xb12和huCLB-T3/4xHER2抗體，表示為不同的Fc-變體、野生型、N297Q、LFLE、LALA、LFLENQ、LFLEDA、DANQ和LFLEDENQPS，在培養(yǎng)基中制備，和加入至板中。將板在37oC,5%CO2孵育3天。細(xì)胞用1μM星孢素(#S6942-200,Sigma)孵育，用作100%腫瘤細(xì)胞殺死的參考。孵育后，除去上清液，和在-20℃貯存。將板用PBS洗滌兩次，和包含10%Alamarblue的150μL培養(yǎng)基加入各孔。將板在37oC,5%CO2孵育4小時(shí)。測量590nm的吸光度(Envision,PerkinElmer,Waltham,MA)。使用來自不同供體的PBMC進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測試Fc-變體N297Q、LFLE、LFLENQ、LFLEDA、DANQ和LFLEDANQPS(圖14A-G)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測試Fc-變體LFLEDA和LALA(圖15A-C)。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中包括具有野生型Fc-結(jié)構(gòu)域的抗體作為參考。用野生型單特異性IgG1-huCLB-T3/4或雙特異性huCLB-T3/4xb12抗體孵育誘導(dǎo)靶細(xì)胞的非特異性殺死(圖14A-G和15A-C)。單特異性IgG1-huCLB-T3/4和bsIgG1-huCLB-T3/4xb12變體N297Q(圖14A-G)和LALA(圖15A-C)仍誘導(dǎo)一些非特異性靶細(xì)胞殺死，雖然比在同一實(shí)驗(yàn)中測試的野生型抗體的程度低。非特異性靶細(xì)胞殺死不被任何其它測試的具有非-激活的突變的IgG1-huCLB-T3/4或bsIgG1-huCLB-T3/4xb12抗體誘導(dǎo)(圖14A-G和15A-C)。所有雙特異性huCLB-T3/4xHER2抗體誘導(dǎo)AU565細(xì)胞的劑量依賴性殺死，與沒有非-激活的突變的野生型雙特異性huCLB-T3/4xHER2抗體相比具有至少相當(dāng)?shù)墓π?圖14A-G和15A-C)。在極低濃度時(shí)發(fā)生最大殺死。通過單特異性b12或HER2抗體的野生型或非-激活的變體不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(圖14A-G和15A-C)，這如所期望的。實(shí)施例10–C1q與huCLB-T3/4的非-激活的抗體變體的結(jié)合的評價(jià)C1q與結(jié)合至靶細(xì)胞的抗體的相互作用是補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑的第一步。因?yàn)橐吧虸gG1包含C1q的相互作用位點(diǎn)，因此C1q與這些非-激活的IgG1變體的相互作用通過ELISA進(jìn)行評價(jià)。在4℃將稀釋系列(范圍7-30,000ng/mL，以4倍稀釋)的IgG1-huCLB-T3/4、bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2和IgG1-CD20(陽性對照)和如上文實(shí)施例1所述的其非-激活的抗體變體包被在96-孔MicrolonELISA板(Greiner,Germany)上過夜。將板洗滌，和用補(bǔ)充0.025%Tween20和0.1%明膠的PBS封閉。將板序貫用3%混合人血清(Sanquin,product#M0008)在37?C孵育1h，用100μL/孔兔抗-人C1q(DAKO,product#A0136,1/4,000)在室溫孵育1h，和用100μL/孔豬抗-兔IgG-HRP(DAKO,P0399,1:10,000)作為檢測抗體在室溫孵育1h，在孵育之間進(jìn)行洗滌。通過加入1mg/mL2,2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche,Mannheim,Germany)約30min進(jìn)行檢測。通過加入100μL2%草酸終止反應(yīng)。在微板閱讀器中(Biotek,Winooski,VT)測量405nm的吸光度。Log變換數(shù)據(jù)通過使用GraphPadPrism軟件擬合具有可變斜率的S形劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行分析。圖16A顯示具有野生型IgG1Fc區(qū)的抗體IgG1-CD20和IgG1-huCLB-T3/4顯示C1q結(jié)合。在所有評價(jià)的具有非-激活的突變的抗體變體(N297Q,LFLE,LFLENQ,LFLEDA,DA,DAPS,DANQ,LFLEPS,LFLEDANQPS,LALA)中未檢出C1q的結(jié)合。圖16B顯示具有野生型IgG1Fc區(qū)的抗體bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2顯示C1q結(jié)合。在所有評價(jià)的具有非-激活的突變的抗體變體(N297Q,LFLE,LFLENQ,LFLEDA,DA,DAPS,DANQ,LFLEPS,LFLEDANQPS,LALA)中未檢出C1q的結(jié)合。圖16C和圖16D顯示具有野生型IgG1Fc區(qū)的抗體IgG1-CD20、IgG1-huCLB-T3/4和bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2顯示C1q結(jié)合。在具有非-激活的突變的抗體變體(LFLEDA和LALA)中未檢出C1q的結(jié)合。實(shí)施例11–非-激活的抗體變體的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分析將該研究中的小鼠飼養(yǎng)在CentralLaboratoryAnimalFacility(Utrecht,TheNetherlands)的隔離單元中，和保持在頂部凈化籠中，無限制提供水和食物。所有實(shí)驗(yàn)獲得UtrechtUniversity動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。7-10周齡C.B-17SCID小鼠(C.B-17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl,Charles-River)靜脈內(nèi)注射100μg野生型抗體(IgG1-huCLB-T3/4,IgG1-HER2,或bsIgG-huCLB-T3/4xHER2)或其非-激活的變體(LALA,LFLEDA,LFLENQ,DANQ或LFLEDANQPS)，使用3只小鼠/組。在抗體給予后10分鐘、4小時(shí)、1天、2天、7天、14天和21天，自隱靜脈收集50μL血液樣品。收集血液至含肝素的小瓶，和以10,000xg離心5分鐘。血漿貯存在–20℃直到測定抗體濃度。人IgG濃度使用總hIgG夾心ELISA測定。對于該測定，小鼠mAb抗-人IgG-kappa克隆MH16(#M1268,CLBSanquin,TheNetherlands)，以濃度2μg/mL包被在96-孔MicrolonELISA板(Greiner,Germany)上，用作捕獲抗體。用補(bǔ)充0.2%牛血清白蛋白的PBS封閉板后，加入用ELISA緩沖液(補(bǔ)充0.05%Tween20和0.2%牛血清白蛋白的PBS)連續(xù)稀釋的樣品，和在板振蕩器上在室溫(RT)孵育1h。隨后用山羊抗-人IgG免疫球蛋白(#109-035-098,Jackson,WestGrace,PA)孵育板，和用2,2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche,Mannheim,Germany)顯色。30min后通過加入2%草酸至各孔終止反應(yīng)。在微板閱讀器中(Biotek,Winooski,VT)測量405nm的吸光度。血漿清除率(mL/天/kg)基于曲線下面積(AUC)，根據(jù)以下方程式來計(jì)算：數(shù)據(jù)分析使用Graphpadprism軟件進(jìn)行。圖17A顯示當(dāng)與野生型抗體相比時(shí)，對于抗體變體N297Q、DANQ、LFLENQ和LFLEDANQPS，血漿人IgG濃度更低，表明更快速的清除率。對于抗體變體LFLEDA和LALA，血漿中人IgG濃度類似于野生型抗體。圖17B表明抗體變體N297Q、DANQ和LFLENQ的血漿清除率是野生型抗體的2-3倍?？贵w變體LFLEDANQPS的清除率是野生型抗體的3-5倍?？贵w變體LFLEDA和LALA的血漿清除率類似于野生型抗體。實(shí)施例12–IgG1-LFLEDA骨架的體外免疫原性評價(jià)為了確定IgG1-LFLEDA-K409R骨架的臨床免疫原性的可能性，將Antitope的EpiScreen?平臺(tái)應(yīng)用于IgG1-HER2-LFLEDA。簡言之，自代表歐洲和北美洲人群的一組50個(gè)HLA-型健康供體分離PBMC。在CD8+T細(xì)胞耗盡后，將PBMC群單獨(dú)冷凍和貯存。隨后培養(yǎng)解凍的PBMC，和用IgG1-HER2-LFLEDA-K409R或?qū)φ諛悠分?IgG1-HER2或IgG1-HER2-LFLE-K409R)孵育5-8天。樣品誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的能力通過測量細(xì)胞增殖([3H]-胸苷摻入)和IL-2產(chǎn)生(ELISpot測定)來評價(jià)。在兩種測定中顯示刺激指數(shù)(SI；信號(hào)/基線信號(hào))≥1.9的反應(yīng)的供體被視為陽性。EpiScreen?分析表明，對于IgG1-HER2-LFLEDA，4名供體(8%)顯示陽性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，這與對于IgG1-HER2和IgG1-HER2-LFLE分別為4(8%)和3(6%)個(gè)陽性反應(yīng)相當(dāng)(圖18)。因此，IgG1-HER2-LFLEDA-K409R(以及IgG1-HER2和IgG1-HER2-LFLE-K409R)顯示低的免疫原性可能性，反應(yīng)頻率低于10%。陽性對照人源化A33(例如[84])用作臨床基準(zhǔn)對照抗體，其在臨床上顯示高水平的免疫原性和通常在EpiScreen測定中誘導(dǎo)20-30%T細(xì)胞反應(yīng)。實(shí)施例13–產(chǎn)生突變體以優(yōu)化人源化CD3抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生huCD3-L1突變體質(zhì)粒產(chǎn)生數(shù)個(gè)IgG1-huCD3-L1LC突變體以改進(jìn)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定中IgG1-huCD3-H1L1的表達(dá)水平，參見表2。殘基的選擇基于：與種系序列的比較或huCD3-L1中稀有殘基的存在情況的篩選，以及來自同源抗體的晶體結(jié)構(gòu)。選擇的序列在GeneArt(LifeTechnologies,Germany)合成。p33L編碼SEQIDNO:31的人IgLC2/IgLC3λ輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。p33G1f編碼SEQIDNO:15的IgG1m(f)重鏈恒定區(qū)。表2在Expi293F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)對于單一抗體，使用ExpiFectamine293(Lifetechnologies)將編碼重鏈(HC)和輕鏈(LC)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至FreestyleExpi293F細(xì)胞(Lifetechnologies,USA)。將總共1.5μgHC編碼質(zhì)粒和1.5μgLC編碼質(zhì)粒(表2)稀釋于150μLOpti-MEM(Gibco,USA)。為了制備轉(zhuǎn)染混合物，將8μLExpiFectamine293稀釋于150μLOpti-MEM和在室溫下孵育5分鐘。接著，DNA/Opti-MEM和ExpiFectamine293/Opti-MEM溶液混合，在室溫下孵育20分鐘和加入至2.55mL包含7.5x106Expi293F細(xì)胞和50U/mLPen-Strep的Expi293表達(dá)培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37℃,8%CO2孵育和以200rpm搖振。為提高表達(dá)，轉(zhuǎn)染后21小時(shí)，加入15μL強(qiáng)化混合物1和150μL強(qiáng)化混合物2。細(xì)胞孵育4天，接著收獲上清液。將上清液以3,000xg離心和經(jīng)0.2μm過濾器過濾除菌。在OctetRED(ForteBio,US)上使用抗-人IgG傳感器(ForteBio,USA)測量IgG表達(dá)水平。IgG濃度分析對于所列的所有突變體，單獨(dú)或組合測量IgG表達(dá)水平。圖20顯示對于表2所列的表達(dá)的抗體組，上清液中測量的IgG表達(dá)水平。IgG1-huCD3-H1L1抗體表達(dá)至72μg/mL。對于IgG1-huCD3-H1L1-LT41K突變體，觀察到IgG表達(dá)4-倍增加(295μg/mL)。對于尤其包括T41K突變的IgG1-huCD3-H1L1-LLKNH突變體，觀察到類似的表達(dá)水平(311μg/mL)。與IgG1-huCD3-H1L1相比，當(dāng)單獨(dú)測試時(shí)，這些構(gòu)建體中的其它突變未顯示表達(dá)提高(IgG1-huCD3-H1L1-LF10L、IgG1-huCD3-H1L1-LK55N、IgG1-huCD3-H1L1-LL97H)。對于R23A和A35P的組合，觀察到第二組提高表達(dá)的突變。盡管缺少R23A和A35P的IgG1-huCD3-H1L1-LLTGPEAEY形式未顯示提高的表達(dá)(83μg/mL)，但包含另外的R23A和A35P突變的IgG1-huCD3-H1L1-LLAPTGPEAEY的確顯示3倍表達(dá)增加(237μg/mL)。單獨(dú)地，R23A或A35P未顯示提高的表達(dá)水平(分別為56和81μg/mL)。實(shí)施例14-huCD3-H1L1-LFLEDA變體與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合測試了huCD3-H1L1-LFLEDA變體與Jurkat細(xì)胞的表觀結(jié)合親和力。公開于US2012038219的IgG1-CD3-hmAb286用作參考抗體。將Jurkat細(xì)胞(DSMZ,Brunswick,Germany)在37℃解凍，和用30mLPBS洗滌一次和以300xg在4℃離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸于25mLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物，終濃度為0.8x106細(xì)胞/mL。將100μL的該細(xì)胞懸液(0.8x105細(xì)胞/孔)轉(zhuǎn)移至聚苯乙烯96-孔圓底板(GreinerBio-one,Alphena/dRijn,TheNetherlands)，和用在PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中連續(xù)稀釋的上清液制備物(范圍3-10,000ng/mL，以3倍稀釋)在4℃孵育30分鐘。用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌三次后，Jurkat細(xì)胞以50μL用第二抗體在4℃孵育30min。作為第二抗體，在PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中按1/200稀釋的R-藻紅蛋白(PE)-綴合的山羊-抗-人IgGF(ab’)2(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA)用于所有實(shí)驗(yàn)。接著，Jurkat細(xì)胞用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次，重懸于150μLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物和在FACSCantoll(BDBiosciences)上進(jìn)行分析。使用非線性回歸(S形劑量反應(yīng)，具有可變斜率)使用GraphPadPrismV5.04軟件(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)，分析結(jié)合曲線。圖21顯示結(jié)合曲線，和表3顯示IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA突變體的EC50值。T41K突變對結(jié)合親和力沒有影響，而K55N和LKNH突變體顯示表觀親和力是野生型IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA的1/5。參考抗體IgG1-CD3-hmAb286-LFLEDA的親和力低于IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA，和類似于包含K55N突變的IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA變體。表3抗體EC50(μg/mL)IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA0.096IgG1-huCD3-H1-LFLEDA-LF10L0.169IgG1-huCD3-H1-LFLEDA-LT41K0.096IgG1-huCD3-H1-LFLEDA-LK55N0.531IgG1-huCD3-H1-LFLEDA-LL97H0.095IgG1-huCD3-H1-LFLEDA-LLKNH0.438IgG1-CD3-hmAb286-LFLEDA0.397實(shí)施例15–雙特異性huCD3xHER2親和變體對T細(xì)胞的結(jié)合在Fc區(qū)具有或沒有LFLEDA突變的雙特異性(bs)IgG1-huCD3xHER2分子的純化的親和變體與自血沉棕黃層(供體號(hào)：N001814268806,購自Sanquin,Amsterdam,TheNetherlands)分離的人T細(xì)胞的結(jié)合通過FACS分析進(jìn)行分析。按照制造商的說明書，將T細(xì)胞通過StemSepTM人T細(xì)胞富集試劑盒分離(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada)。Herceptin-LbH1-突變從來自Bostrom等(85,86)的公開數(shù)據(jù)庫鑒定，和與Herceptin(曲妥單抗)相比，對HER2具有較低的親和力。為評價(jià)結(jié)合，將分離的T細(xì)胞(1x105細(xì)胞/孔)在聚苯乙烯96-孔圓底板(Greinerbio-one650101)中用在100μLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中連續(xù)稀釋的抗體制備物(范圍6.4-10,000ng/mL，按5倍稀釋)在4℃孵育30分鐘。用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次后，將T細(xì)胞以50μL用第二抗體在4℃孵育30分鐘。作為第二抗體，按1/200在PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中稀釋的R-藻紅蛋白(PE)-綴合的山羊-抗-人IgGF(ab’)2(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA)用于所有實(shí)驗(yàn)。接著，T細(xì)胞用PBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物洗滌兩次，重懸于100μLPBS/0.1%BSA/0.02%疊氮化物中和在FACSCantoll(BDBiosciences)上分析。使用非線性回歸(S形劑量反應(yīng)，具有可變斜率)使用GraphPadPrismV5.04軟件(GraphPadSoftware,SanDiego,CA,USA)分析結(jié)合曲線。結(jié)合曲線結(jié)果顯示于圖22，和EC50值顯示于表4。如所見到的，CD3變體的EC50值之間的最大差異是2倍。表4抗體EC50(μg/mL)bsIgG1-huCD3-H1L1/Herceptin-LFLEDA~0.40bsIgG1-huCD3-H1L1/Herceptin-LbH1-LFLEDA~0.28bsIgG1-huCD3-H1L1/HER2-LFLEDA0.26bsIgG1-huCD3-H1L1-LK55N/Herceptin-LFLEDA~0.44bsIgG1-huCD3-H1L1-LK55N/Herceptin-LbH1-LFLEDA0.40bsIgG1-huCD3-H1L1-LK55N/HER2-LFLEDA0.61bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LFLEDA0.53bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LbH1-LFLEDA0.68bsIgG1-huCD3-hmAb286/HER2-LFLEDA0.46實(shí)施例16-通過huCD3抗體親和變體誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性在本實(shí)施例中，針對HER2-陽性腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性使用針對huCD3和HER2具有不同親和力的雙特異性抗體評價(jià)。雙特異性抗體按上文所述制備，和在CD3臂中包含F(xiàn)405L突變，和在HER2臂中包含K409R突變。具有不同的HER2表達(dá)水平的A431和AU565(人乳腺癌)細(xì)胞用于本測定法。HER2拷貝數(shù)對于A431細(xì)胞為~20,000和對于AU565細(xì)胞為~1,000,000。AU565細(xì)胞在補(bǔ)充10%(vol/vol)含鐵牛血清(LifeTechnologies,Germany)、1.5g/L碳酸氫鈉(Lonza,Germany)、1mM丙酮酸鈉(Lonza,Germany)、4.5g/L葡萄糖(Sigma)、50IU/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素(Lonza,Basel,Switzerland)并具有HEPES和L-谷氨酰胺的RPMI1640(Lonza,BaselSwitzerland)中培養(yǎng)。A431(ATCC,表皮樣癌)細(xì)胞在補(bǔ)充10%(vol/vol)含鐵牛血清(LifeTechnologies,Germany)、50IU/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素(Lonza,Basel,Switzerland)并具有HEPES和L-谷氨酰胺的RPMI1640(Lonza,Basel,Switzerland)中培養(yǎng)。將細(xì)胞系維持在37℃在5%(vol/vol)CO2潮濕孵育器中。AU565和A431細(xì)胞培養(yǎng)至接近匯合，之后細(xì)胞經(jīng)受胰蛋白酶處理，重懸于培養(yǎng)基和通過細(xì)胞過濾器以獲得單細(xì)胞懸液。將AU565和A431細(xì)胞分別以3x104和1.6x104細(xì)胞/孔接種至96-孔培養(yǎng)板，和在37℃,5%CO2孵育至少3小時(shí)以允許附著至板上。人T細(xì)胞自血沉棕黃層分離，如實(shí)施例15中所述。分離的T細(xì)胞用PBS洗滌，重懸于培養(yǎng)基(RPMI1640,10%血清)和在96-孔板中按1:3比率加入至AU565或按1:10比例加入至A431細(xì)胞。稀釋系列(終濃度范圍0.1直至10,000ng/mL)的雙特異性抗體變體bsIgG1-huCD3/Herceptin-LFLEDA、bsIgG1-huCD3/Herceptin-LbH1—LFLEDA、bsIgG1-huCD3-H1L1/HER2-LFLEDA、bisIgG1-huCD3-LK55N/Herceptin-LbH1—LFLEDA、bsIgG1-huCD3-LK55N/HER2-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LFLEDA、bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LbH1—LFLEDA、bsIgG1-CD3-hmAb286/HER2-LFLEDA和bsIgG1-huCD3-H1L1/b12-LFLEDA在培養(yǎng)基中制備，和加入板中。將板在37℃,5%CO2孵育3天。細(xì)胞用1μM星孢素(Sigma)孵育，用作100%腫瘤細(xì)胞殺死的參考。將板用PBS洗滌兩次，和將包含10%Alamarblue(LifeTechnologies,Germany)的150μL培養(yǎng)基加入至各孔。將板在37℃,5%CO2孵育4小時(shí)。測量590nm的吸光度(Envision,PerkinElmer,Waltham,MA)。圖23顯示用CD3和HER2親和變體處理的A431細(xì)胞(圖23A)和AU565細(xì)胞(圖23B)的成活力。較低的HER2親和力組合高和低的CD3親和力在兩個(gè)細(xì)胞系中導(dǎo)致較低的功效(在兩個(gè)圖中作為開符號(hào)顯示)。對HER2具有類似的高親和力的雙特異性抗體(Herceptin和HER2)組合野生型huCD3-H1L1、huCD3-LK55N或CD3-hmAb286CD3臂顯示對A431細(xì)胞的類似功效。CD3臂的親和力變化對A431細(xì)胞的功效沒有影響。對HER2具有類似的高親和力的雙特異性抗體(Herceptin和HER2)組合CD3-hmAb286CD3臂、huCD3-LK55N臂和野生型huCD3-H1L1臂，顯示對AU565細(xì)胞的類似功效，對于CD3hmAb286CD3臂，顯示相對更高的功效。對CD3臂而言，較低的結(jié)合親和力在與A431細(xì)胞相比具有較高的HER2表達(dá)的AU565細(xì)胞中更加有利。實(shí)施例17–在NOD-SCID小鼠中huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA和huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA的體內(nèi)腫瘤殺死作用雙特異性CD3xHER2抗體bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA的體內(nèi)抗-腫瘤功效在皮下NCI-N87異種移植物模型中評價(jià)。在該模型中，人未受激的PBMC作為人T細(xì)胞的來源，與腫瘤細(xì)胞共接種，類似于Brischwein等(Mol.Immunol.43(2006),1129–1143)描述的模型。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用6-11周齡雌性NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠。來自健康供體的人PBMC自血沉棕黃層分離，如實(shí)施例15所述。在第0天，包含5x106細(xì)胞的PBMC和NCI-N87細(xì)胞兩者的混合物以200μL皮下接種至各小鼠的右脅。在注射的1小時(shí)內(nèi)，將小鼠隨機(jī)指定為7個(gè)不同的治療組(n=4/供體)。各組靜脈內(nèi)注射(i.v.)單劑量的(雙特異性)抗體。治療組顯示在表5中。使用測徑器(PLEXX)每周評價(jià)腫瘤生長兩次，直至終點(diǎn)腫瘤體積為1500mm3，直到腫瘤顯示潰瘍或直到研究結(jié)束。結(jié)果顯示在圖24中。如從圖24A中可見的，huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA在所有三個(gè)測試濃度下有效地減少腫瘤大小。圖24B顯示腫瘤接種后29天的腫瘤大小。與PBS對照組相比，在用劑量0.05mg/kg、0.5mg/kg和5mg/kg的bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA治療的小鼠中腫瘤形成受到顯著抑制(p<0.0001,Tukeys多重比較檢驗(yàn))，而用0.005mg/kg治療不影響腫瘤形成。用5mg/kg的對照抗體bsIgG1-huCD3-H1L1xb12-LFLEDA治療不抑制腫瘤形成，而用bsIgG1-b12xHER2-LFLEDA治療與PBS對照相比似乎誘導(dǎo)一定的腫瘤生長抑制，但根據(jù)單向Anova,Tukey’s多重比較檢驗(yàn)，這不具有顯著性。表5組抗體劑量1PBS2bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA0.1μg(=0.005mg/kg)3bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA1μg(=0.05mg/kg)4bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA10μg(=0.5mg/kg)5bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA100μg(=5mg/kg)6bsIgG1-huCD3-H1L1xb12-LFLEDA100μg(=5mg/kg)7bsIgG1-b12xHER2-LFLEDA100μg(=5mg/kg)雙特異性CD20xCD3抗體huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA的體內(nèi)抗-腫瘤功效在皮下Raji異種移植物模型中評價(jià)。在該模型中，人未受激的PBMC作為人T細(xì)胞的來源，與腫瘤細(xì)胞共接種，類似于Brischwein等(Mol.Immunol.43(2006),1129–1143)描述的模型。使用6-11周齡的雌性NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠。來自健康供體的人PBMC自血沉棕黃層分離，洗滌和重懸于PBS-0.1%BSA。在第0天，包含5x106細(xì)胞的PBMC和Raji細(xì)胞兩者的混合物以200μL皮下接種至各小鼠的右脅。在注射的1小時(shí)內(nèi)，將小鼠分選至7個(gè)組(n=4/供體)和各組靜脈內(nèi)注射(i.v.)單劑量的(雙特異性)抗體。治療組顯示在表6中。使用測徑器(PLEXX)每周評價(jià)腫瘤生長兩次，直到終點(diǎn)腫瘤體積1500mm3，直到腫瘤顯示潰瘍或直到研究結(jié)束。結(jié)果顯示在圖25中。如從圖25A中可見的，在huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA的兩個(gè)較高的測試劑量下(0.5mg/kg和0.05mg/kg)，huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA有效地減少腫瘤大小。在圖25B中，在各組是完整的最后一天(第21天)指示個(gè)體小鼠的腫瘤大小。與PBS對照組相比，在用劑量0.05mg/kg和0.5mg/kg的huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA治療的小鼠中，腫瘤形成受到顯著抑制(p-值分別是p<0.05和p<0.01，用單向Anova,Tukey’s多重比較檢驗(yàn)評價(jià))。用0.005mg/kg治療不影響腫瘤形成。與PBS對照相比，用0.5mg/kg和0.05的對照抗體b12xCD20(bsIgG1-b12xCD20-LFLEDA)治療不顯著抑制腫瘤形成(單向Anova,Tukey’s多重比較檢驗(yàn))。表6組抗體劑量1PBS2bsIgG1-huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA0.1μg(=0.005mg/kg)3bsIgG1-huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA1μg(=0.05mg/kg)4bsIgG1-huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA10μg(=0.5mg/kg)5bsIgG1-b12xCD20-LFLEDA1μg(=0.05mg/kg)6bsIgG1-b12xCD20-LFLEDA10μg(=0.5mg/kg)參考文獻(xiàn)列表[1]Xu等,2000,CellImmunol.200(1):16-26[2]Herold等,2005,Diabetes,54(6):1763-9[3]Staerz等,1985,Nature314:628-631[4]Muller和Kontermann,2010,BioDrugs24:89-98[5]Lum和Thakur,2011,BioDrugs25:365-379[6]Linke等,2010,MAbs2:129-136[7]Ruf等,2010,BrJClinPharmacol69:617-625[8]Bokemeyer等,2009,JClinOncol(MeetingAbstracts),3036[9]Heiss等,2010,IntJCancer127:2209-2221[10]Jones等,2009,LancetOncol10:1179-1187[11]Kiewe等,2006,ClinCancerRes12:3085-3091[12]WO2012/162067[13]WO2008/119567[14]FundamentalImmunologyCh.7,Paul,W編輯,第二版.RavenPress,N.Y.(1989)[15]LefrancMP,等,200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