本申請(qǐng)要求于2014年2月20日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/942,386號(hào)的優(yōu)先權(quán)，將其公開內(nèi)容整體并入本文。

發(fā)明背景

疫苗是預(yù)防和/或治療大量疾病和病癥(例如，病毒感染、細(xì)菌感染、以及癌癥)的重要手段。通常，使用注射進(jìn)行連續(xù)接種，由于不方便去接種疫苗的地點(diǎn)以及對(duì)注射的反感，降低了參與率。而且，疫苗的注射需要使用無菌藥劑盒，如注射器和針，并且需要熟練的專業(yè)人員施用。

對(duì)于流感疫苗，每年進(jìn)行大規(guī)模的活動(dòng)以收集足夠的受精卵，從而收獲并加工足夠的病毒以滿足市場(chǎng)需求。細(xì)胞培養(yǎng)物或植物來源的血凝素(HA)可以降低卵獲取并加工的負(fù)擔(dān)，但是這些方法仍需要昂貴的無菌填裝和處理以產(chǎn)生單獨(dú)的注射器針頭，所述注射器針頭需要作為生物危害物處理。在流行性疾病期間，學(xué)?？赡軙?huì)被關(guān)閉并強(qiáng)制社交距離，而大規(guī)模的流感免疫通常需要對(duì)象在健康門診部排隊(duì)注射。對(duì)于流感或其它病原體而言，口服疫苗可以通過郵遞送出，從而避免大多數(shù)人與人的接觸。而且，壓片是快速衛(wèi)生的過程，其不需要注射疫苗要求的昂貴的無菌填裝和處理過程。

可以以非腸胃外方式例如口服或粘膜遞送的疫苗描述于美國專利第8,222,224號(hào)。

發(fā)明概述

本文提供了對(duì)象(人或非人)更有效地接種疫苗的方法和組合物，其涉及將免疫原性生物物質(zhì)特異性地遞送至對(duì)象的回腸。因此，本公開提供了更高效且有效的疫苗，并且證明其在人體中的效力。

本文提供了用于在對(duì)象中引起免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，其包含免疫原性生物物質(zhì)，所述免疫原性生物物質(zhì)被將免疫原性生物物質(zhì)引導(dǎo)遞送至對(duì)象回腸的物質(zhì)(agent)包圍。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象是非人的動(dòng)物，例如，靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、兔、馬、狗、貓或家禽。在一些實(shí)施方案中，免疫原性生物物質(zhì)選自免疫原性多肽(例如病毒樣顆粒、糖蛋白、磷蛋白)、碳水化合物和脂類。

在一些實(shí)施方案中，免疫原性生物物質(zhì)是編碼免疫原性多肽的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體是病毒載體(例如腺病毒、AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒)。在一些實(shí)施方案中，病毒載體是減毒的或不能復(fù)制的。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含與編碼免疫原性多肽的序列可操作地連接的啟動(dòng)子(例如CMV、SV40早期或晚期、β-肌動(dòng)蛋白等)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體還編碼雙鏈(dsRNA)。在一些實(shí)施方案中，dsRNA編碼序列與啟動(dòng)子可操作地連接，例如與可操作地連接免疫原性多肽編碼序列的啟動(dòng)子相同的啟動(dòng)子(利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES))或不同的啟動(dòng)子。

在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物還包含至少一種佐劑，例如，TLR3激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR3激動(dòng)劑是dsRNA或dsRNA模擬物。

在一些實(shí)施方案中，將免疫原性生物物質(zhì)的至少50％在回腸中遞送(釋放)，例如，施用組合物中存在的免疫原性生物物質(zhì)的至少60％、70％、75％、80％、90％、95％或更多。在一些實(shí)施方案中，在免疫原性組合物到達(dá)回腸之前，引導(dǎo)遞送的物質(zhì)(例如，腸溶包衣或基質(zhì))開始溶解，但保留免疫原性生物物質(zhì)的至少50％，直到免疫原性組合物到達(dá)回腸。在一些實(shí)施方案中，引導(dǎo)遞送的物質(zhì)維持免疫原性生物物質(zhì)通過胃、十二指腸以及空腸，但在回腸中釋放免疫原性生物物質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，引導(dǎo)遞送的物質(zhì)是腸溶包衣。即，免疫原性生物物質(zhì)被腸溶包衣覆蓋。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣在pH≥5，例如，5.2、5.5、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、7.0、5.5-6.8、5.8-6.8等時(shí)崩解。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣選自甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(例如，1:1)，A型；甲基丙烯酸共聚物，C型；甲基丙烯酸共聚物A型和C型的混合物；以及Time在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣不包括鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣具有導(dǎo)致免疫原性生物物質(zhì)在回腸中釋放的厚度。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣是甲基丙烯酸共聚物基的，具有每平方厘米5.5-10毫克的覆蓋率。在一些實(shí)施方案中，引導(dǎo)遞送的物質(zhì)是無線電控制的膠囊。

在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100、檸檬酸三乙酯和滑石，例如，1份、2份、3份、4份或1-4份L-100，1-2份檸檬酸三乙酯以及1-2份滑石。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1和聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1的混合物。在一些實(shí)施方案中，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1與聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1的比值是1:4至4:1，例如，1:3、1:2、1:1、2:1、3:1。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100和L 100-55的混合物。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100和L100-55、檸檬酸三乙酯以及滑石，例如，1-4份L-100和L100-55、1-2份檸檬酸三乙酯以及1-2份滑石。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1和聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:2。在一些實(shí)施方案中，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1與聚(甲基丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物)1:2的比值是1:2至2:1。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100和S100的混合物。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100和S100、檸檬酸三乙酯以及滑石，例如，1-4份L-100和S100、1-2份檸檬酸三乙酯以及1-2份滑石。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:2和聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1的混合物。在一些實(shí)施方案中，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:2和聚(甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物)1:1的比值是1:4至4:1，例如，1:3、1:2、1:1、2:1或3:1。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100-55和S100的混合物。在一些實(shí)施方案中，腸溶包衣包含L-100-55和S100、檸檬酸三乙酯以及滑石，例如，1-4份L-100-55和S100、1-2份檸檬酸三乙酯以及1-2份滑石。

在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是片劑或膠囊的形式，例如，被腸溶包衣覆蓋的壓縮片劑的形式。在一些實(shí)施方案中，將免疫原性組合物封裝在包含明膠、羥丙基甲基纖維素、淀粉或支鏈淀粉的聚合膠囊中。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是直徑小于2mm的微粒形式，例如，各微粒被本文所描述的腸溶包衣覆蓋。

還提供了將免疫原性組合物遞送至對(duì)象回腸的方法，其包括將如上所述的免疫原性組合物(即，免疫原性生物物質(zhì)，其被將免疫原性生物物質(zhì)引導(dǎo)遞送至回腸的物質(zhì)包圍，任選地包含佐劑)口服施用至對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象是非人的動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致對(duì)象中的免疫應(yīng)答比接受未被引導(dǎo)至回腸的相同免疫原性組合物的對(duì)象(不同時(shí)間的同一對(duì)象，或者不同的對(duì)象)中的免疫應(yīng)答高至少10％，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、100％或更多。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象中的免疫應(yīng)答比接受未被引導(dǎo)至回腸的相同免疫原性組合物的對(duì)象(不同時(shí)間的同一對(duì)象，或者不同的對(duì)象)中的免疫應(yīng)答高至少1.5倍(例如，2倍、2.5倍、5倍或更高)。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是對(duì)免疫原性生物物質(zhì)具有特異性的抗體的增加。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是細(xì)胞的免疫應(yīng)答，例如，細(xì)胞因子如IFN-γ的增加。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是免疫(例如，對(duì)象對(duì)得到免疫原性生物物質(zhì)的病毒、細(xì)菌等的感染有抗性)。

還提供了在對(duì)象中引起增加的免疫應(yīng)答的方法，其包括將如上所述的免疫原性組合物(即，免疫原性生物物質(zhì)，其被將免疫原性生物物質(zhì)引導(dǎo)遞送至回腸的物質(zhì)包圍，任選地包含佐劑)口服施用至對(duì)象，例如，人類對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，相比于接受未被引導(dǎo)至回腸的相同免疫原性組合物的對(duì)象(不同時(shí)間的同一對(duì)象，或者不同的對(duì)象)中的免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答增加至少10％，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、100％或更多。在一些實(shí)施方案中，相比于接受未被引導(dǎo)至回腸的相同免疫原性組合物的對(duì)象(不同時(shí)間的同一對(duì)象，或者不同的對(duì)象)中的免疫應(yīng)答，對(duì)象中的免疫應(yīng)答增加至少1.5倍(例如，2倍、2.5倍、5倍或更多)。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是對(duì)免疫原性生物物質(zhì)具有特異性的抗體的增加。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是細(xì)胞的免疫應(yīng)答，例如，細(xì)胞因子如IFN-γ的增加。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是免疫(例如，對(duì)象對(duì)得到免疫原性生物物質(zhì)的病毒、細(xì)菌等的感染有抗性)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.在給予對(duì)象含有rAd-HA-dsRNA的無線電控制膠囊之后7天，在外周血中測(cè)量對(duì)HA具有特異性的抗體分泌細(xì)胞(ASC)。對(duì)象被隨機(jī)分配以在回腸或空腸中釋放疫苗(每組N＝12)。結(jié)果顯示，疫苗遞送至回腸的12名對(duì)象全部能夠產(chǎn)生識(shí)別HA的抗體分泌B細(xì)胞，而給予至空腸的疫苗的12名對(duì)象中只有9名能夠產(chǎn)生抗原特異性B細(xì)胞。，回腸的IgA和IgG ASC的平均數(shù)量顯著高于空腸。

圖2.在施用后7天，通過檢測(cè)IFN-γ的水平測(cè)定對(duì)rAd-HA-dsRNA的T細(xì)胞應(yīng)答。相比于75％的空腸遞送組，回腸遞送組中的所有個(gè)體顯示較高的IFN-γ水平。在回腸遞送組，平均IFN-γ水平也顯著較高。

圖3.在免疫后第0天和第28天測(cè)量對(duì)流感A/CA/07/2009的微中和抗體(MN)應(yīng)答。將MN滴度的倍數(shù)增加相對(duì)于最初MN滴度小于或等于40的個(gè)體對(duì)象作圖。結(jié)果顯示，相比于空腸遞送(10分之6)，回腸遞送導(dǎo)致免疫后高比例的MN滴度增加的對(duì)象(10分之9)。

圖4.使用微晶纖維素和淀粉制備片劑，具有10％硫酸鋇作為不透射線材料。這些片劑被包被上Eudragit腸溶包衣，并且通過經(jīng)口胃管給予雌性食蟹猴(cynomolgus macaque)。在施用之后隨時(shí)間進(jìn)行X-射線照射。A.胃中的片劑，用箭頭指向片劑。B.一小時(shí)之后，片劑在腸中可見，脊柱左邊的白點(diǎn)，用箭頭指向它。在后面的兩小時(shí)內(nèi)，其在腸中溶解，并且無法被看見。

圖5.在各自免疫之后7天，在第7天和第35天記錄ASC的數(shù)量。在第0天和第28天，背景ASC極小，并且未繪制。用水平線顯示各治療組7天的平均應(yīng)答。

圖6.個(gè)體對(duì)象的MN滴度的倍數(shù)增加。黑色陰影柱表示在28天至56天滴度上升的地方，而淺色陰影柱表示最初免疫之后的應(yīng)答。在MN的兩倍增加處畫線以指示哪些對(duì)象具有可檢測(cè)的中和抗體應(yīng)答。安慰劑組中無對(duì)象應(yīng)答，而在低劑量組中3名對(duì)象以及在高劑量組中7名對(duì)象在免疫之后對(duì)流感具有2倍或更大的中和抗體應(yīng)答。安慰劑N＝10，低劑量和高劑量N＝l1。

圖7.單次口服免疫之后的抗體應(yīng)答。A.顯示個(gè)體對(duì)象免疫前后(分別在第0天和第28天)的HAI抗體滴度。B.HAI幾何平均滴度(GMT)相對(duì)于時(shí)間。在免疫后0個(gè)月、1個(gè)月和6個(gè)月測(cè)量HAI滴度以評(píng)價(jià)抗體應(yīng)答的持久性。C.顯示個(gè)體對(duì)象免疫前后的MN滴度。D.免疫后的ASC應(yīng)答。免疫之后7天記錄IgG和IgA ASC的數(shù)量(每10⁶個(gè)PMBC)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將免疫原性生物物質(zhì)遞送至小腸的特定部分(即，回腸)導(dǎo)致比所述物質(zhì)未被靶向或被靶向至不同位置時(shí)大得多的治療應(yīng)答。這允許設(shè)計(jì)更有效的疫苗，降低材料的成本，并降低對(duì)接受者的副作用。

I.定義

術(shù)語“免疫原性”指物質(zhì)在宿主中引起免疫應(yīng)答(體液或細(xì)胞介導(dǎo)的)的能力。免疫原性物質(zhì)對(duì)宿主而言通常是“外來的”，例如，來自不同的物種，或者來自細(xì)菌、病毒或真菌。非外來的物質(zhì)例如在自身免疫應(yīng)答的情況下可以是免疫原性的。某些癌細(xì)胞的特異性物質(zhì)可被開發(fā)為免疫原性物質(zhì)，其允許宿主的免疫系統(tǒng)攻擊癌癥。

術(shù)語“生物物質(zhì)”指核酸、多肽、糖蛋白、碳水化合物、脂類或其修飾形式(例如甲基化的、糖基化的、可檢測(cè)標(biāo)記的)。生物物質(zhì)與小分子藥物的區(qū)別在于它們可通過生物方法(包括重組技術(shù))而不是化學(xué)合成產(chǎn)生。然而，生物物質(zhì)可以被化學(xué)修飾，或者包含非天然的核苷酸或氨基酸。生物物質(zhì)還可以是非天然的，例如，重組或嵌合的實(shí)體。

本文使用的“免疫原性生物物質(zhì)”指直接作為抗原的物質(zhì)(例如，被T細(xì)胞受體或抗體識(shí)別)，或者一旦在細(xì)胞中表達(dá)作為抗原的物質(zhì)。例如，免疫原性生物物質(zhì)可以包括編碼免疫原性多肽的表達(dá)載體。

術(shù)語“抗原”指多肽、糖蛋白、脂蛋白、脂類、碳水化合物或被T細(xì)胞受體和/或抗體結(jié)合的其它物質(zhì)(例如，被識(shí)別為“外來的”)?？乖ǔＴ醋约?xì)菌、病毒或真菌來源。術(shù)語“源自”表示，抗原本質(zhì)上以其在其天然抗原環(huán)境中存在的形式存在，或者已將其修飾以在某些條件下表達(dá)、以只包括大部分免疫原性部分或者以移除其它可能有害的相關(guān)組分等。

本文所描述的組合物的“免疫原性有效劑量或量”是引起或調(diào)節(jié)對(duì)選擇用于接種疫苗的抗原具有特異性的免疫應(yīng)答的量。免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。可以治療性或預(yù)防性地使用免疫原性組合物以治療或預(yù)防任何階段的疾病。

“體液免疫應(yīng)答”由血液的無細(xì)胞組分例如血漿或血清介導(dǎo)；血清或血漿從一個(gè)個(gè)體向另一個(gè)體的轉(zhuǎn)移傳遞了體液免疫力。體液免疫應(yīng)答通常是B細(xì)胞介導(dǎo)的，例如，抗體的產(chǎn)生。

“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”由抗原特異性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)；抗原特異性淋巴細(xì)胞從一個(gè)個(gè)體向另一個(gè)體的轉(zhuǎn)移傳遞了免疫力。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答至少部分由T細(xì)胞介導(dǎo)，并且例如可以通過檢測(cè)T細(xì)胞特異的細(xì)胞因子或T細(xì)胞生長(zhǎng)的增加被檢測(cè)到。

“回腸”是與十二指腸和空腸一起形成小腸的三段中最長(zhǎng)的。其組成空腸和盲腸之間的末端部分。

腸溶包衣是應(yīng)用于口服藥物的屏障，其阻止內(nèi)部的治療劑在胃和十二指腸的低pH環(huán)境(～pH 3)中被消化。

諸如腸溶包衣、基質(zhì)或膠囊的物質(zhì)據(jù)說能保留封裝或包埋的治療劑，這時(shí)治療劑的最初施用量的至少60％，例如，至少約70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％保持封裝或包埋在所述物質(zhì)內(nèi)。諸如腸溶包衣或基質(zhì)的物質(zhì)通常被設(shè)計(jì)為在某些條件下崩解并釋放治療劑。例如，在厚的或化學(xué)上更復(fù)雜的包衣的情況下，崩解可以是逐步的。一旦腸溶包衣的厚度相比于最初的施用厚度減少至少10％，例如，至少25％、50％或75％，包衣被稱為“崩解”。崩解不是絕對(duì)的術(shù)語，因?yàn)楦鶕?jù)條件，其可在不同的時(shí)間進(jìn)程內(nèi)發(fā)生。例如，設(shè)計(jì)于pH 6.5下5分鐘內(nèi)崩解的包衣可以于pH 6下崩解，盡管緩慢(例如，1小時(shí)內(nèi))。崩解不一定表示封裝或包埋的治療劑被釋放。然而，在腸溶包衣或基質(zhì)完全崩解之前治療劑可以開始釋放。

本文使用的關(guān)于例如核酸、蛋白或載體的術(shù)語“嵌合”或“重組”表示，核酸、蛋白或載體已通過引入異源核酸或蛋白或者改變天然核酸或蛋白被修飾。因此，例如，嵌合和重組的載體包括在載體的天然(非嵌合或非重組)形式內(nèi)不存在的核酸序列。嵌合的病毒表達(dá)載體指包含編碼異源(例如，免疫原性)多肽的核酸序列的病毒表達(dá)載體。

“表達(dá)載體”指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，具有一系列指定的允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的待轉(zhuǎn)錄的核酸。病毒表達(dá)載體通常是不復(fù)制的或減毒的。病毒來源的載體可以包括表達(dá)期望序列所需的表達(dá)載體的組分，但省略參與例如復(fù)制或其它致病作用的組分。

本文使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”和“表達(dá)控制序列”是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。啟動(dòng)子序列通常靠近轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，如在聚合酶II型啟動(dòng)子情況下的TATA元件。啟動(dòng)子還可包括遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子或阻遏元件，其可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)數(shù)千個(gè)堿基對(duì)處。啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。“組成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語“可操作地連接”指核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的排列)和第二核酸序列之間的功能連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。

術(shù)語“異源的”，當(dāng)提及核酸的部分使用時(shí)，表示核酸包含兩個(gè)或更多個(gè)在自然界彼此相同的關(guān)聯(lián)中不存在的子序列。例如，核酸通常以重組方式產(chǎn)生，其具有兩個(gè)或更多個(gè)來自不相關(guān)基因的序列，所述序列被排列以組成新功能核酸，例如，來自一種來源的啟動(dòng)子和來自另一來源的編碼區(qū)。類似地，蛋白的異源部分指示蛋白包含兩個(gè)或更多個(gè)在自然界彼此相同的關(guān)聯(lián)中不存在的子序列(例如，融合蛋白)。異源的核酸或蛋白是在具體的自然環(huán)境中不存在的核酸或蛋白，例如，在人體細(xì)胞中的異源小鼠蛋白。

在本文可互換使用的術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。所述術(shù)語涵蓋了基因、cDNA、RNA和寡核苷酸(短的多核苷酸)。所述術(shù)語涵蓋了含有已知的核苷酸類似物或者修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，其與參照核酸具有類似的結(jié)合特性，并且其以與參照核苷酸類似的方式進(jìn)行新陳代謝。此類類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性-磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。術(shù)語“核苷酸”通常指核酸單體。

除非另有指示，特定的核酸序列還涵蓋了其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體地，簡(jiǎn)并密碼子置換可通過產(chǎn)生這樣的序列來實(shí)現(xiàn)：在所述序列中，一個(gè)或多個(gè)選擇(或所有)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置換(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

本文所描述的組合物的“治療劑量”或“治療有效量”或“有效量”是預(yù)防、減輕、減緩或降低疾病和病癥的癥狀的嚴(yán)重性的量，所述疾病和病癥與選擇用于接種疫苗的抗原來源(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲或癌癥)相關(guān)。

術(shù)語“抗體”指特異性地結(jié)合并識(shí)別抗原的由免疫球蛋白基因編碼的多肽或其片段。免疫球蛋白序列包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)序列，以及極大數(shù)量的免疫球蛋白可變區(qū)序列。輕鏈被歸類為κ或λ。重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，其依次分別限定了免疫球蛋白類型，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

T細(xì)胞指特定的淋巴細(xì)胞類型，其表達(dá)由基因家族編碼的特異性受體(T細(xì)胞受體)。公認(rèn)的T細(xì)胞受體基因包括α、β、δ和γ基因座，并且T細(xì)胞受體通常(但不普遍)識(shí)別MHC加短肽的組合。T細(xì)胞通常被廣泛地歸類為輔助性T細(xì)胞(CD4+)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)?？贵w由B細(xì)胞例如抗體分泌細(xì)胞(ASC)天然產(chǎn)生。成熟的B細(xì)胞可以是初始的、漿B細(xì)胞(活化的和抗體生成的)、記憶的、B-l、邊緣區(qū)B細(xì)胞、濾泡B細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。

適應(yīng)性免疫應(yīng)答指T細(xì)胞和/或B細(xì)胞和/或抗體識(shí)別抗原。

抗原遞呈細(xì)胞(APC)是能夠?qū)⒚庖咴噪幕蚱淦芜f呈至T細(xì)胞以激活或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的細(xì)胞。APC包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞以及可被工程化為有效APC的其它細(xì)胞。可以但不必須對(duì)此類細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以增加遞呈抗原的能力、改善T細(xì)胞應(yīng)答的激活和/或維持、自身具有抗腫瘤作用和/或與接受者免疫兼容(即，匹配的HLA單體型)。APC可以分離自包括以下的多種生物流體和器官中的任一種：骨髓、外周血、腫瘤和癌周的組織，并且可以是自體的、同種異體的，同基因的或異基因的細(xì)胞。APC通常利用來自主要組織相容性(MHC)基因座的受體將短的多肽遞呈至T細(xì)胞。

佐劑是非特異性的免疫應(yīng)答增強(qiáng)子。合適的佐劑包括，例如，霍亂毒素、單磷酰脂A(MPL)、弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑、Quil A和Al(OH)。佐劑也可以是引起APC活化并通過像Toll樣受體的第二信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子增強(qiáng)T細(xì)胞遞呈的那些物質(zhì)，例如，雙鏈RNA(dsRNA)、dsRNA模擬物、細(xì)菌鞭毛、LPS、CpG DNA以及細(xì)菌脂肽(最近評(píng)述于[Abreu et al.,J Immunol,174(8),4453-4460(2005)])。

在本文可互換使用的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸的聚合物。所述術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及后來修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨基酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基和R基結(jié)合的碳)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、甲基甲硫氨酸锍。此類類似物具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指這樣的化學(xué)化合物：其具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用。

氨基酸在本文可以通過其公知的三字母符號(hào)或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)來表示。同樣地，核苷酸可以通過其通常接受的單字母代碼來表示。

“保守修飾的變體”適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定的核酸序列而言，保守修飾的變體指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果所述核酸不編碼氨基酸序列，則保守修飾的變體指基本上相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能上相同的核酸編碼任何指定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每一位置，將密碼子改變?yōu)槿魏嗡枋龅膶?duì)應(yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，其為保守修飾變異的一種。本文的編碼多肽的每一核酸序列還描述了核酸的每一可能的沉默變異。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以修飾核酸中的各密碼子(除了AUG和TGG，所述AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，所述TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變異隱含于各描述的序列中。

關(guān)于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)改變、添加或缺失編碼序列中單一氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的個(gè)別置換、缺失或添加，如果改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)類似的氨基酸置換，則是“保守修飾的變體”。提供功能上類似氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域公知的。此類保守修飾的變體另外不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因。

以下八組各自含有能彼此保守置換的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸I、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見，例如，Creighton,Proteins(1984))。

短語“選擇性(或特異性)雜交”指復(fù)雜混合物(例如，總細(xì)胞DNA或RNA或者文庫DNA或RNA)中的互補(bǔ)(或大部分互補(bǔ))核苷酸的結(jié)合、成雙螺旋或雜交。

多核苷酸可以包含天然的序列(即，編碼個(gè)別多肽或dsRNA或其部分的內(nèi)源序列)或者可以包含這樣的序列的變體。多核苷酸變體可以含有一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失和/或插入，使編碼多肽的至少一種生物活性(例如，免疫原性)相對(duì)于包含天然抗原的多肽沒有減弱。多核苷酸變體可以含有一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失和/或插入，使編碼dsRNA的佐劑活性相對(duì)于不含有置換、添加、缺失和/或插入的dsRNA沒有減弱。變體與編碼天然多肽或其部分或者dsRNA的多核苷酸序列優(yōu)選地呈現(xiàn)至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽序列的背景下，術(shù)語“相同的”或百分比“同一性”指當(dāng)利用下述序列比較算法之一或通過手動(dòng)比對(duì)和視覺檢查在比較窗或測(cè)量的指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行最大一致性比較和比對(duì)時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，指定區(qū)內(nèi)50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。則將此類序列稱為“基本相同的”。該定義還指測(cè)試多核苷酸序列的互補(bǔ)性。任選地，同一性在長(zhǎng)度至少約10至約100、約20至約75、約30至約50個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)存在。

“對(duì)照”樣本或值指作為參照(通常是已知的參照)的樣本，用于與測(cè)試樣本比較。例如，測(cè)試樣本可以取自例如測(cè)試化合物或處理存在的測(cè)試狀態(tài)，并且與來自例如測(cè)試化合物不存在(陰性對(duì)照)或已知化合物存在(陽性對(duì)照)的已知狀態(tài)的樣本比較。在本公開的背景下，陰性對(duì)照的實(shí)例是來自已知的健康(未感染)個(gè)體的生物樣本，而陽性對(duì)照的實(shí)例是來自已知的感染患者的生物樣本。對(duì)照還可以代表從大量測(cè)試或結(jié)果獲得的平均值或范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)照可被設(shè)計(jì)用于評(píng)估任意數(shù)目的參數(shù)。例如，對(duì)照可被設(shè)計(jì)來比較基于藥理學(xué)數(shù)據(jù)(例如，半衰期)或治療度量的治療益處(例如，益處和/或副作用的比較)。對(duì)照可被設(shè)計(jì)用于在體外應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，哪一些對(duì)照在指定情況下有價(jià)值，并且能夠分析基于與對(duì)照值比較的數(shù)據(jù)。對(duì)于確定數(shù)據(jù)的顯著性，對(duì)照也是有價(jià)值的。例如，如果指定參數(shù)的值在對(duì)照中廣泛地不同，則測(cè)試樣本中的變化將不被認(rèn)為是顯著的。

術(shù)語“診斷”指對(duì)象患有諸如感染或癌癥的病癥的相對(duì)可能性。類似地，術(shù)語“預(yù)后”指某種未來后果可能在對(duì)象中發(fā)生的相對(duì)可能性。如醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的，所述術(shù)語并非意指是絕對(duì)的。

術(shù)語“療法”、“治療”和“緩解”指癥狀嚴(yán)重性的任何減輕。在感染的背景下，治療可以指?jìng)魅疚镔|(zhì)的減少、減輕的癥狀等。在治療癌癥的情況中，治療可以指，例如，減小腫瘤大小、減少癌癥細(xì)胞的降低數(shù)目、生長(zhǎng)速率、轉(zhuǎn)移活性，減少非癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡等。術(shù)語“治療”和“預(yù)防”并非意指絕對(duì)的術(shù)語。治療和預(yù)防可以指?jìng)魅疚镔|(zhì)的任何相對(duì)的減少或明顯不存在、發(fā)作的延遲、癥狀的緩解、患者存活的改善、存活時(shí)間或存活率的增加等。治療和預(yù)防可以是完全的(傳染物質(zhì)或瘤細(xì)胞的水平不可檢測(cè))或部分的，使患者中存在的傳染物質(zhì)或瘤細(xì)胞比在無當(dāng)前所描述的免疫原性生物物質(zhì)的情況下出現(xiàn)的傳染物質(zhì)或瘤細(xì)胞少?？梢詫⒅委煹男Чc未接受治療的個(gè)體或個(gè)體集合比較，或者與治療之前或治療期間不同時(shí)間的同一患者比較。在一些方面，例如與施用之前的個(gè)體或與未經(jīng)歷治療的對(duì)照個(gè)體相比，感染或疾病的嚴(yán)重性降低至少10％。在一些方面，感染或疾病的嚴(yán)重性降低至少25％、50％、75％、80％或90％或者在一些情況下，使用標(biāo)準(zhǔn)的診斷技術(shù)不再能檢測(cè)到。

“對(duì)象”、“患者”、“個(gè)體”以及相似的術(shù)語可被互換地使用并且指哺乳動(dòng)物，如人和非人的靈長(zhǎng)類、以及兔、大鼠、小鼠、山羊、豬和其它哺乳類物種，除非另有指明。所述術(shù)語不一定表示對(duì)象已被診斷具有特定的疾病，但是通常指在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下的個(gè)體?；颊呖梢允菍で笾委?、監(jiān)測(cè)、調(diào)整或改變既有治療方案等的個(gè)體。

II.免疫原性生物物質(zhì)

免疫原性生物物質(zhì)是在宿主(例如人宿主)中引起免疫應(yīng)答的任何生物物質(zhì)。因此免疫原性生物物質(zhì)可以是多肽(例如糖蛋白、磷蛋白或其它修飾形式)、碳水化合物、脂類、多核苷酸(例如染色質(zhì)、甲基化多核苷酸或其它修飾形式)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性生物物質(zhì)直接地引起免疫應(yīng)答，例如，自身是靶免疫原(抗原)。在一些實(shí)施方案中，免疫原性生物物質(zhì)是編碼靶免疫原的多核苷酸。例如，當(dāng)編碼靶抗原的多核苷酸在抗原遞呈細(xì)胞(APC)中表達(dá)時(shí)，針對(duì)表達(dá)的抗原發(fā)起免疫應(yīng)答。免疫原性生物物質(zhì)可以單獨(dú)地，與第二、第三和/或第四免疫原性生物物質(zhì)組合(例如，在多靶標(biāo)預(yù)防疫苗的情況下)，和/或與佐劑組合施用以增加免疫應(yīng)答。

A.表達(dá)載體

用于本文所描述的用途的表達(dá)載體可以包括病毒來源的載體，例如，重組的腺相關(guān)病毒(AAV)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、修飾的牛痘安卡拉(MVA)載體以及慢病毒(例如，HSV-1來源的)載體(參見，例如，Brouard et al.(2009)British J.Pharm.157:153)。治療用途的病毒來源載體通常是不復(fù)制的或減毒的。例如，在腺病毒載體的情況中，可以修飾腺病毒基因組以移除El和E3基因。對(duì)于產(chǎn)生，可以將復(fù)制缺陷載體施用至表達(dá)El基因的細(xì)胞，使重組腺病毒(rAd)由細(xì)胞產(chǎn)生。可以將該rAd收集并用于單輪的感染以將轉(zhuǎn)基因組合物遞送至哺乳動(dòng)物內(nèi)另外的細(xì)胞，以便引起對(duì)編碼多肽抗原的免疫應(yīng)答。

合適的病毒載體的實(shí)例包括腺病毒5，所述腺病毒5包括，例如，E1/E3區(qū)缺失的Ad5和E4區(qū)缺失的Ad5。其它合適的腺病毒載體包括毒株2、口服測(cè)試的毒株4和7、腸腺病毒40和41、以及足以遞送抗原并引起對(duì)轉(zhuǎn)基因抗原適應(yīng)性免疫應(yīng)答的其它毒株(例如Ad34、Ad26或Ad35)[Lubeck et al.,Proc Natl Acad Sci USA,86(17),6763-6767(1989)；Shen et al.,J Virol,75(9),4297-4307(2001)；Bailey et al.,Virology,202(2),695-706(1994)]。病毒載體不需要分離自人，但可以來自非人類，如黑猩猩腺病毒3(ChAd3)(參見，例如，Colloca et al.(2012)Sci.Transl.Med.4:115；Stanley et al.(2014)Nat.Med.doi:10.1038/nm.3702)。在一些實(shí)施方案中，腺病毒載體是活的不復(fù)制腺病毒載體(如El和E3缺失的rAd5)、減毒活腺病毒載體(如E1B55K缺失病毒)或具有野生型復(fù)制的活腺病毒載體。

如本文所描述的待使用的表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可以由病毒源提供。例如，常用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子源自例如β肌動(dòng)蛋白、腺病毒、猴病毒(SV40)以及人巨細(xì)胞病毒(CMV)。例如，允許在CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺瘤病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)導(dǎo)物啟動(dòng)子或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯示表達(dá)有效的其它啟動(dòng)子的指導(dǎo)下表達(dá)蛋白的載體是適合的?？梢允褂昧硗獾牟《竞头遣《締?dòng)子、控制序列和/或信號(hào)序列，條件是此類控制序列與待轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞兼容。

B.免疫原

用于本文所述用途的免疫原可以源自抗原，如，例如，病毒抗原、細(xì)菌抗原、癌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原(對(duì)于本文所描述的可以使用的抗原列表參見，例如，美國專利第8,222,224號(hào))。

如本文所述可以使用的具體抗原的實(shí)例是源自以下的抗原：流感病毒(例如HA、NA、M1、NP)，人類免疫缺陷病毒(HIV，例如，gag、pol、env等)、人類乳頭瘤病毒(HPV，例如，衣殼蛋白如LI)，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)病毒，EB病毒(Epstein Barr virus)，單純皰疹病毒(HSV)，人皰疹病毒，鼻病毒，柯薩奇病毒，腸道病毒，A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎和G型肝炎(HAV、HBV、HCV、HEV、HGV，例如，表面抗原)，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒，麻疹病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，天花病毒，狂犬病毒和水痘-帶狀病毒。

合適的病毒抗原還包括病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，例如，由不編碼結(jié)構(gòu)多肽的病毒核酸所編碼的蛋白，不同于組成衣殼的蛋白或圍繞病毒的蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白包括促進(jìn)病毒核酸復(fù)制、病毒基因表達(dá)或翻譯后加工的那些蛋白，如，例如，來自委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEE)病毒、東方型馬腦脊髓炎(EEE)病毒或塞姆利基森林病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1、2、3和4(分別是NS1、NS2、NS3和NS4)。

細(xì)菌抗原可以源自，例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、單核細(xì)胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheria)、博氏疏螺桿菌(Borrelia burgdorferi)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、霍亂弧菌(Vibrio chloerae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、鼠疫耶爾森氏桿菌(Yersinia pestis)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、蒼白螺旋體(Treponema pallidum)、支原體(Mycoplasm sp.)、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌(Legionella pneumophila)、斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsia typhi)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)和痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)(例如，霍亂毒素B亞基、霍亂毒素共調(diào)節(jié)菌毛(TCP))；幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylorii)(例如，VacA、CagA、NAP、Hsp、過氧化氫酶、脲酶)；大腸桿菌(例如，熱不穩(wěn)定腸毒素、菌毛抗原)。

寄生蟲抗原可以源自，例如，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)、利什曼原蟲(Leishmania sp.)，錐體蟲(Trypanosoma sp.)，毛滴蟲(Trichomonas sp.)，瘧原蟲(Plasmodium sp.)(例如，惡性瘧原蟲表面蛋白抗原，如pfs25、pfs28、pfs45、pfs84、pfs 48/45、pfs 230、Pvs25和Pvs28)；血吸蟲(Schistosoma sp.)；結(jié)核分枝桿菌(例如，Ag85、MPT64、ESAT-6、CFPIO、R8307、MTB-32MTB-39、CSP、LSA-1、LSA-3、EXP1、SSP-2、SALSA、STARP、GLURP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、MSP-8、MSP-9、AMA-1、1型整合膜蛋白、RESA、EBA-175和DBA)。

真菌抗原可以源自，例如，足癬(Tinea pedis)、體癬(Tinea corporus)、股蘚(Tinea cruris)、甲癬(Tinea unguium)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、假絲酵母(Candida sp.)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)和卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)。

癌抗原包括例如在結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌(例如，黑素瘤)、白血病或淋巴瘤中表達(dá)或過表達(dá)的抗原。示例性的癌抗原包括，例如，HPV LI、HPV L2、HPV El、HPV E2、胎盤堿性磷酸酶、AFP、BRCA1、Her2/neu、CA 15-3、CA 19-9、CA-125、CEA、Hcg、尿激酶型纖溶酶原激活劑(Upa)、纖溶酶原激活劑抑制劑、CD53、CD30、CD25、C5、CD1la、CD33、CD20、ErbB2、CTLA-4。對(duì)于另外的癌靶標(biāo)，參見Sliwkowski&Mellman(2013)Science 341:6151。

C.佐劑

在一些實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種佐劑。合適的佐劑包括，例如，脂類和非脂類化合物、霍亂毒素(CT)、CT B亞基、CT衍生的CTK63、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、LT衍生的LTK63、Al(OH)₃、以及例如在WO2004/020592,Anderson and Crowle,Infect.Immun.31(1):413-418(1981),Roterman et al.,J.Physiol.Pharmacol.,44(3):213-32(1993),Arora and Crowle,J.Reticuloendothel.24(3):271-86(1978)和Crowle and May,Infect.Immun.38(3):932-7(1982))中所描述的多離子有機(jī)酸。合適的多離子有機(jī)酸包括例如，6,6'-[3,3'-二甲基[1,1'-聯(lián)苯]-4,4'-二基]雙(偶氮)雙[4-氨基-5-羥基-l,3-萘-二磺酸](伊文斯蘭)和3,3'-[1,1'聯(lián)苯]-4,4'-二基雙(偶氮)雙[4-氨基-l-萘磺酸](剛果紅)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，多離子有機(jī)酸可以用于與任何施用類型聯(lián)合的任何基于核酸的接種疫苗方法。

還可以使用TLR-3激動(dòng)劑(例如，dsRNA及其模擬物，如polyI:C、polyA:U和polyI:polyC)。TLR-3激動(dòng)劑包括例如短發(fā)夾RNA、病毒來源的RNA、可形成雙鏈或短發(fā)夾RNA的短片段RNA、以及短干擾RNA(siRNA)。在一些實(shí)施方案中，TLR-3激動(dòng)劑是病毒來源的dsRNA，例如，源自辛德比斯病毒的dsRNA或dsRNA病毒中間體(Alexopoulou et al.(2001)Nature 413:732)。在一些實(shí)施方案中，TLR-3激動(dòng)劑是短發(fā)夾RNA。短發(fā)夾RNA序列通常包含通過接頭序列連接的兩條互補(bǔ)序列。具體的接頭序列不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面?？梢允褂萌魏魏线m的接頭序列，只要其不干擾兩條互補(bǔ)序列結(jié)合形成dsRNA。當(dāng)TLR-3激動(dòng)劑在體外或體內(nèi)與應(yīng)答細(xì)胞(例如，樹突狀細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)接觸時(shí)，其可以導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放(例如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、IFN-β)。

其它合適的佐劑包括局部的免疫調(diào)節(jié)劑，如咪唑喹啉家族的成員，如，例如，咪喹莫特和瑞喹莫德(參見，例如，Hengge et al.,Lancet Infect.Dis.1(3):189-98(2001))。

另外合適的佐劑可商購獲得，例如，另外的基于鋁的佐劑(例如，Alhydrogel、Rehydragel、磷酸鋁、Algammulin)；基于油的佐劑(弗式不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Seppic MONTANIDE ISA 720)；基于非離子嵌段共聚物的佐劑、細(xì)胞因子(例如，GM-CSF或Flat3配體)；Merck佐劑65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；酰化酪氨酸的不溶懸浮液；酰化的糖；陽離子或陰離子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解的微球體；單磷酰脂A和Quil A。細(xì)胞因子，如GM-CSF或白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素7或白細(xì)胞介素12也是合適的佐劑。血藍(lán)蛋白(例如，鑰孔血藍(lán)蛋白)和血赤蘚素也可被用作佐劑。多糖佐劑如，例如，幾丁質(zhì)、殼聚糖和脫乙?；鶐锥≠|(zhì)作為佐劑也是合適的。其它合適的佐劑包括胞壁酰二肽(MDP、N乙酰基胞壁酰L丙氨酰D異谷氨酰胺)細(xì)菌肽聚糖及其衍生物(例如，蘇氨酰-MDP和MTPPE)。BCG和BCG細(xì)胞壁骨架(CWS)可用作佐劑，含或不含海藻糖二霉菌酸酯。可以使用海藻糖二霉菌酸酯本身(參見，例如，美國專利第4,579,945號(hào))。脫毒內(nèi)毒素也可以單獨(dú)或與其它佐劑聯(lián)合作為佐劑(參見，例如，美國專利第4,866,034號(hào)；第4,435,386號(hào)；第4,505,899號(hào)；第4,436,727號(hào)；第4,436,728號(hào)；第4,505,900號(hào)和第4,520,019號(hào))。皂角苷QS21、QS17、QS7也可用作佐劑(參見，例如，美國專利第5,057,540號(hào)；EP 0362 279；WO 96/33739和WO96/11711)。其它合適的佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,Calif.,United States)、ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(例如，SBAS-2、SBAS-4或SBAS-6或其變體，可獲自SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium)、Detox(Corixa,Hamilton,Mont.)以及RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)。

也考慮了將超抗原在本發(fā)明中作為佐劑使用。超抗原包括葡萄球菌外蛋白，如來自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的α、β、γ和δ腸毒素，以及α、β、γ和δ大腸桿菌外毒素。常見的葡萄球菌腸毒素被稱作葡萄球菌腸毒素A(SEA)和葡萄球菌腸毒素B(SEB)，腸毒素通過E(SEE)來描述(Rott et al，1992)。還可以使用釀膿鏈球菌B(SEB)、產(chǎn)氣梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)腸毒素(Bowness et al.,1992)、來自釀膿鏈球菌的細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白(CAP)(Sato et al,1994)以及來自金黃色葡萄球菌的中毒性休克綜合征毒素1(TSST1)(Schwab et al,1993)。

對(duì)于本文提供的藥物組合物，佐劑可被設(shè)計(jì)來誘導(dǎo)例如主要是Thl型或Th2型的免疫應(yīng)答。高水平的Thl型細(xì)胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)傾向于促成對(duì)施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。相比之下，高水平的Th2型細(xì)胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于促成體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)?？诜f送本文提供的包含免疫原性多肽的組合物之后，通常引起包括Thl型和Th2型應(yīng)答的免疫應(yīng)答。

III.靶向遞送系統(tǒng)

目前所描述用于回腸遞送的的組合物和方法可依賴于合適的包衣、基質(zhì)和裝置，如下文所描述的那些。

A.腸溶包衣、基質(zhì)和裝置

腸溶包衣用于屏蔽來自胃的低pH環(huán)境的物質(zhì)并且延遲封閉物質(zhì)的釋放直到其到達(dá)消化道后段的期望靶標(biāo)。腸溶包衣是已知的，并且可商購獲得。實(shí)例包括pH敏感聚合物、生物可降解聚合物、水凝膠、緩釋系統(tǒng)以及滲透遞送系統(tǒng)(參見，例如，Chourasia&Jain(2003)J.Pharm.Pharmaceutical Sci.6:33)。

胃腸道(GIT)的pH從胃中的非常酸(pH～2)進(jìn)展至回腸中的更接近中性(pH～5.8-7.0)?？梢允褂迷诨啬c中或就在回腸之前溶解的pH敏感性包衣。實(shí)例包括L和S聚合物(5.5-7.0的閾值pH范圍)；聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(pH 5.0)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯50和55(分別是pH 5.2和5.4)和鄰苯二甲酸乙酸纖維素(pH 5.0)。Thakral et al.(2013)Expert Opin.Drug Deliv.10:131評(píng)述了用于回腸遞送的制劑，特別是確保于pH≤7.0遞送的L和S的組合。Crotts et al.(2001)Eur.J Pharm.Biol.51:71描述了具有合適崩解特性的制劑。Vijay et al.(2010)J.Mater.Sci.Mater.Med.21:2583評(píng)述了用于在pH 6.8下回腸遞送的基于丙烯酸(AA)-甲基丙烯酸甲酯(MMA)的共聚物。

對(duì)于回腸遞送，聚合物包衣通常于約pH 6.8溶解并且允許在約40分鐘內(nèi)完全釋放(參見，例如，Huyghebaert et al.(2005)Int.J.Pharm.298:26)。為了實(shí)現(xiàn)該目的，可以使治療物質(zhì)由不同的包衣層覆蓋，例如，以便最外層保護(hù)所述物質(zhì)通過低pH條件，并且當(dāng)片劑離開胃時(shí)溶解，以及當(dāng)所述片劑進(jìn)入增加的pH時(shí)至少一個(gè)內(nèi)層溶解。用于遞送至末端回腸的分層包衣的實(shí)例描述于例如WO2013148258。

生物可降解的聚合物(例如，果膠、偶氮聚合物)通常依賴于在GIT中生活的微生物群落的酶活。相比于較前的區(qū)段，回腸棲息了大量的細(xì)菌，包括乳酸菌和腸道菌。

滲透控釋的口服遞送系統(tǒng)(Alza)是在水性條件下在一定時(shí)間內(nèi)降解的滲透系統(tǒng)的實(shí)例。可以處理此類材料以具有其它包衣或不同的厚度，從而特異性地遞送至回腸(參見，例如，Conley et al.(2006)Curr.Med.Res.Opin.22:1879)。

在WO2000062820中報(bào)導(dǎo)了遞送至回腸的組合聚合物。實(shí)例包括具有檸檬酸三乙酯(2.4mg/膠囊)的L100-55(25mg/膠囊)、以及Povidone K-25(20mg/片劑)，隨后是FS30D(30mg/片劑)。可以施加pH敏感聚合物以實(shí)現(xiàn)向回腸的遞送，如上文所描述的，例如甲基丙烯酸共聚物(例如聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1)、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、乙酸纖維素偏苯三酸酯、羧甲基乙基纖維素、蟲膠或其它合適的聚合物。包衣層還可以由對(duì)其它的腔組件(如細(xì)菌的降解)而不是pH敏感的成膜聚合物組成，或者由當(dāng)與另一成膜聚合物混合時(shí)具有這樣敏感性的組分組成。提供延時(shí)釋放至回腸的此類組分的實(shí)例是包含偶氮鍵的聚合物，諸如果膠的多糖及其鹽，半乳甘露聚糖、直鏈淀粉和軟骨素，二硫化物聚合物以及糖苷。

可以將具有不同pH、水和酶促敏感性的組分組合使用以將治療組合物靶向至回腸。包衣厚度還可以用來控制釋放。組分還可以用來形成基質(zhì)，在基質(zhì)中包埋治療組合物。通常參見，Frontiers in Drug Design&Discovery(Bentham Science Pub.2009)vol.4。

B.頻率或無線電控制的膠囊

作為溶解包衣和基質(zhì)的替代，位點(diǎn)特異性遞送可以經(jīng)由取決于外部產(chǎn)生的信號(hào)而釋放的膠囊。早期的模型由高頻(HF)信號(hào)引起釋放，如Digenis et al.(1998)Pharm.Sci.Tech.Today 1:160中所公開的。最初的HF膠囊概念后來已被更新，并且結(jié)果被市售為更新膠囊是射頻激活的非崩解遞送系統(tǒng)。膠囊的放射性標(biāo)記允許經(jīng)由γ閃爍掃描術(shù)確定膠囊在GI道的特定區(qū)域內(nèi)的位置。當(dāng)膠囊到達(dá)GI道中的期望位置時(shí)，外部激活打開膠囊藥物庫的一系列窗口。

在一些實(shí)施方案中，可以將免疫原性生物物質(zhì)封閉在無線電控制的膠囊中，以便一旦膠囊到達(dá)回腸，其被追蹤并發(fā)出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)或不檢測(cè)的情況下，膠囊在施用后指定的時(shí)間發(fā)出信號(hào)，所述指定的時(shí)間對(duì)應(yīng)于膠囊預(yù)期到達(dá)回腸的時(shí)間。

C.制劑

藥物組合物可被用于本文所描述的預(yù)防和治療目的。如上所解釋的，藥物組合物可被制備來保護(hù)免受胃的降解，使施用的免疫原性生物物質(zhì)到達(dá)期望的位置。用于口服遞送的DNA和藥物的微囊化方法描述于例如US2004043952。

免疫原性藥物組合物可以含有免疫原性生物物質(zhì)(例如，免疫原性多肽、或編碼免疫原性多肽的多核苷酸)的藥學(xué)可接受的鹽。此類鹽可由藥學(xué)可接受的無毒堿制備，包括有機(jī)堿(例如，伯胺、仲胺、叔胺的鹽以及堿性氨基酸)和無機(jī)堿(例如，鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽和鎂鹽)。鹽的一些具體實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水和生理鹽水(例如，用于攝取、鼻內(nèi)遞送或注射)。

對(duì)于藥物釋放的技術(shù)原因或計(jì)時(shí)控制，制劑的延時(shí)釋放包衣或另外的包衣可以含有對(duì)腔的條件不敏感的其它成膜聚合物。被用于此目的的材料包括但不限于：?jiǎn)为?dú)或在混合物中使用的糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。

可以將諸如分散劑、著色劑、顏料、另外的聚合物(例如，聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯))、抗粘著劑和消泡劑的添加物包含在包衣層。可以添加其它的化合物以增加膜的厚度并減少酸性胃液擴(kuò)散進(jìn)核心材料。包衣層還可以含有藥學(xué)可接受的增塑劑以獲得期望的機(jī)械性能。此類增塑劑例如但不限于三乙酰甘油酯、檸檬酸酯、苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、十六醇、聚乙二醇、甘油單酯、聚山梨醇酯或其它增塑劑以及其混合物。對(duì)于各配方，并且涉及選擇的聚合物、選擇的增塑劑和所述聚合物的施加量，可以優(yōu)化增塑劑的量。

可以將本領(lǐng)域已知的其它合適的藥物成分用于本發(fā)明的藥物組合物。合適的載體包括例如，水，生理鹽水，醇，脂肪，蠟，緩沖液，諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂的固體載體，或生物可降解的微球體(例如，聚乳酸、聚甘醇酸酯)。合適的生物可降解的微球體公開于例如美國專利第4,897,268號(hào)；第5,075,109號(hào)；第5,928,647號(hào)；第5,811,128號(hào)；第5,820,883號(hào)?？梢詫⒚庖咴远嚯暮?或載體表達(dá)載體封裝在生物可降解的微球體內(nèi)或者與微球體的表面結(jié)合。

此類組合物還可以包含非免疫原性緩沖液(例如中性的緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑(如EDTA或谷胱甘肽)、佐劑(例如氫氧化鋁)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑?？蛇x地，可以將本發(fā)明的組合物配制為凍干物。使用公知的技術(shù)，還可以將化合物封裝在脂質(zhì)體內(nèi)。

IV.免疫應(yīng)答和疫苗

本文所描述的用于回腸遞送的藥物組合物被設(shè)計(jì)來從個(gè)體引起對(duì)藥物組合物中包含的免疫原性生物物質(zhì)具有特異性的免疫應(yīng)答。藥物組合物可以作為疫苗預(yù)防性或治療性地使用以避免或減少病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲感染、真菌感染或癌癥。藥物組合物可被用來在任何階段，例如，癌前階段、癌癥階段或轉(zhuǎn)移性階段進(jìn)行治療，或者被用來預(yù)防疾病或感染。

例如，本文所描述的組合物可被用來預(yù)防或治療感染，如流感、肝炎或HIV，或者用于癌癥的預(yù)防或治療。在此類方法中，通常將藥物組合物施用至可能患有疾病、病癥或感染的個(gè)體或者可能未患有疾病、病癥或感染的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，在施用之前，例如，使用本領(lǐng)域通常接受的標(biāo)準(zhǔn)來診斷疾病、病癥或感染。例如，通過測(cè)量來自患者的樣本中的病毒滴度可以診斷病毒感染，通過檢測(cè)來自患者的樣本中的細(xì)菌可以診斷細(xì)菌感染，以及通過檢測(cè)惡性腫瘤的存在可以診斷癌癥?？梢栽谑中g(shù)移除原發(fā)腫瘤之前或之后和/或治療(如施用放射療法或常規(guī)化療藥物)之前或之后施用藥物組合物。

免疫療法是典型的主動(dòng)免疫療法，其中，治療依賴于，伴隨免疫應(yīng)答修飾劑(例如，免疫原性生物物質(zhì))的施用，體內(nèi)刺激內(nèi)源宿主免疫系統(tǒng)以針對(duì)例如腫瘤或者細(xì)菌或病毒感染的細(xì)胞起反應(yīng)。

本文所描述的預(yù)防或治療組合物的施用頻率以及劑量將因個(gè)體不同而不同，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)可以很容易確定。通常，在52周時(shí)段內(nèi)可以施用1至52次劑量。在一些實(shí)施方案中，1個(gè)月的間隔施用3次劑量，或者每2-3個(gè)月施用2-3次劑量。在一些實(shí)施方案中，可以同時(shí)或依次地施用多于一種抗原的組合，例如，含有針對(duì)流感的各亞型或亞型內(nèi)多個(gè)分枝的個(gè)別組分的每年一次的流感疫苗。在一些實(shí)施方案中，間隔更長(zhǎng)，如一年一次，例如，基于特定的流行毒株的每年一次的流感疫苗。其后，可以定期地給予加強(qiáng)接種。替代方案可適合于個(gè)體患者以及特定的疾病和病癥。

合適的劑量是當(dāng)如上所述施用時(shí)能夠促進(jìn)例如抗腫瘤、抗病毒或抗菌免疫應(yīng)答的免疫原性生物物質(zhì)的量，并且其是在本底(未治療的)水平之上至少15-50％，或者在非回腸靶向治療的水平之上至少5-50％(例如，5％、10％、20％、30％、50％、1.5倍、2倍或更高)。通過測(cè)量患者中的抗腫瘤抗體或細(xì)胞溶解型T細(xì)胞的疫苗依賴性產(chǎn)生可以監(jiān)測(cè)此類應(yīng)答，所述細(xì)胞溶解型T細(xì)胞能夠在體外殺死例如患者的腫瘤細(xì)胞、患者的病毒感染細(xì)胞或患者的細(xì)菌感染細(xì)胞。與未接種疫苗的患者或接受非回腸靶向治療的患者相比，在接種疫苗的患者中，此類疫苗還可以產(chǎn)生導(dǎo)致改善的臨床結(jié)果(例如，完全或部分或更長(zhǎng)的無病存活、降低的病毒滴度)的免疫應(yīng)答。

大體上，合適的劑量和治療方案提供了足以提供治療和/或預(yù)防益處的量的活性化合物?？梢酝ㄟ^與用非回腸靶向治療進(jìn)行治療的患者或未治療患者相比，在治療患者中確立改善的臨床結(jié)果(例如，減少的或陰性的病毒滴度、更頻繁的緩解、完全或部分或更長(zhǎng)的無病存活)來監(jiān)測(cè)這樣的應(yīng)答。通常，使用上文所描述的標(biāo)準(zhǔn)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子分析可以評(píng)價(jià)此類免疫應(yīng)答，其可以使用獲自治療前后患者的樣本來進(jìn)行。

例如，免疫原性多肽和體液中對(duì)免疫原性多肽具有特異性的抗體之間形成的免疫復(fù)合物的檢測(cè)可被用來監(jiān)測(cè)療法例如對(duì)免疫原性多肽相關(guān)的疾病或病癥的效力。對(duì)于免疫復(fù)合物，使用已知的方法，可以分析取自起始療法(例如，回腸靶向療法)之前以及之后個(gè)體的體液樣本。簡(jiǎn)言之，比較兩個(gè)樣本中檢測(cè)的免疫復(fù)合物的數(shù)目。第二樣本(靶向療法后)中的免疫復(fù)合物的數(shù)量相對(duì)于第一樣本(靶向療法前)的顯著變化反映了成功的療法。

實(shí)施例

將小分子遞送至腸的藥物方法是已知的，但是對(duì)將大的生物物質(zhì)遞送至腸用于適當(dāng)免疫識(shí)別的能力知之甚少。小鼠沒有能力吞咽藥丸，所以在動(dòng)物模型中用片劑進(jìn)行研究是困難的。而且，遞送疫苗載體以引起對(duì)轉(zhuǎn)基因抗原應(yīng)答的最佳位置的定位在人體中還沒有被表征。在綿羊中，空腸被證明是引起對(duì)腺病毒編碼轉(zhuǎn)基因抗原的免疫應(yīng)答的最有效靶標(biāo)(Mutwari et al.(1999)Immunology 97:455)。這里，我們顯示了使用改善的用于遞送生物物質(zhì)的人口服劑型進(jìn)行若干人或非人靈長(zhǎng)類研究的結(jié)果。

實(shí)施例1

為了確定小腸的哪一區(qū)域誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答最有效，在人體中進(jìn)行了測(cè)試。將無線電控制的膠囊給予健康的正常志愿者，其中疫苗在小腸的前段(空腸)或小腸的后段(回腸)釋放。使用無線電控制的膠囊遞送小分子藥物已有描述，但是沒有描述疫苗的遞送(Digenis et al.(1991)Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.7:309)。

疫苗由表達(dá)來自A/CA/04/2009的流感抗原HA的重組腺病毒(rAd-HA-dsRNA)組成(參見，例如，US2012/0244185)。在第0天，向各對(duì)象給予總計(jì)10¹¹個(gè)感染單位(IU)。在疫苗施用之后的第0天和第7天，通過抗體分泌細(xì)胞(ASC)分析來測(cè)量外周血中的循環(huán)前漿B細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果僅測(cè)量了識(shí)別抗原HA的ASC的數(shù)量。

結(jié)果顯示，在各治療組中，在免疫之后7天可以測(cè)量到ASC(圖1)。平均應(yīng)答在回腸給藥組中比空腸給藥組中高。第0天的背景ASC可忽略。對(duì)于回腸，在第7天觀察到340+/-111(標(biāo)準(zhǔn)誤差)IgG和74+/-18IgA ASC的平均值。對(duì)于空腸，平均且標(biāo)準(zhǔn)誤差應(yīng)答是118+/-30IgG和28+/-8IgA ASC。回腸組顯著不同于安慰劑(對(duì)于IgA ASC，在第7天P＝0.03，對(duì)于IgG ASC，趨于更高，p＝0.07)。與綿羊中的結(jié)果相反，在人體中的結(jié)果表明，在引起IgG或IgA抗體應(yīng)答方面，回腸遞送比空腸遞送更有效。

還通過使用分析檢測(cè)干擾素-γ的釋放(IFN-γ)來測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答。圖2顯示，施用后7天，相比于空腸給藥組中的8/12，回腸給藥組中12/12具有增加的IFN-γ水平。此外，相比于空腸給藥組，IFN-γ水平在回腸給藥組中顯著較高。

測(cè)量對(duì)流感A/CA/07/2009的微中和(MN)抗體滴度。增加的MN抗體水平指示中和抗體應(yīng)答。在排除最初中和抗體應(yīng)答大于40的對(duì)象之后(Faix et al.(2012)PloS One 7:e34581)，將MN滴度的倍數(shù)增加相對(duì)于個(gè)體對(duì)象作圖。對(duì)于回腸遞送疫苗，具有正增加的對(duì)象數(shù)量是10分之9，而對(duì)于空腸遞送疫苗是10分之6(圖3)。幾何平均滴度(GMT)在兩組之間相似，回腸GMT從22上升至92，而空腸GMT從18上升至90。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)對(duì)流感的中和抗體應(yīng)答方面，回腸釋放更可靠，其可能導(dǎo)致保護(hù)免受流感的百分比對(duì)象更大。

實(shí)施例2

使用微晶纖維素(PH-101，F(xiàn)MC)和淀粉(Starch 1500，Colorcon)手工制造片劑，其摻入10％硫酸鋇作為不透射線材料，含有煅制氧化硅作為助流劑以及硬脂酸鎂作為片劑潤(rùn)滑劑。使用10％包衣固體重量增加作為是否添加腸溶包衣的指導(dǎo)，在盤狀包衣機(jī)中，將直徑7.14mm和重量150mg的片劑包被上L-100；包衣固體含有4份聚合物與1份檸檬酸三乙酯和1份滑石。作為腸溶包衣性能的最初測(cè)試，使用經(jīng)口的胃管給予四只食蟹猴片劑。經(jīng)口的胃管是實(shí)心剛性的，但是沿中部是空心的用于徐徐滴入液體。其在剛性管的引導(dǎo)端具有可彎曲的硅膠管，所述硅膠管在適當(dāng)?shù)奈恢每梢匀菁{小片劑。管和藥丸裝置往下穿過受控制猴的食道，直到引導(dǎo)端穿過賁門括約肌并進(jìn)入胃。用橙汁沖洗將藥丸沖入胃。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行X-射線照射，并檢查片劑的位置和溶解情況。表1總結(jié)了結(jié)果。

圖4顯示，片劑在胃的低pH環(huán)境中完全是完整的；不存在片劑過早溶解的跡象。雖然對(duì)于猴來說很大，但是片劑能夠穿過胃完整進(jìn)入腸。在腸中，它們以合理的速率溶解并且在4只猴子的3只中完全溶解。在第4只猴子中，藥丸在3小時(shí)之后的某一時(shí)刻離開胃，并且在最后的x-射線照射時(shí)還沒有溶解。總之，選擇以可接受的方式起作用的片劑以及L-100包衣，用于未來的人類研究。

實(shí)施例3

完成第1期，連續(xù)的入選臨床研究，其中用隨機(jī)的和安慰劑對(duì)照的組群評(píng)價(jià)基于重組Ad血清型5(rAd5)的針對(duì)H1季節(jié)流感的口服疫苗的安全性和免疫原性。實(shí)施例1中描述了rAd5載體(具有來自A/C A/04/2009的HA的rAd-HA-dsRNA)。研究具有大約3個(gè)月的有效期，并且根據(jù)可適用的良好臨床實(shí)踐指南、美國聯(lián)邦法規(guī)和國際協(xié)調(diào)會(huì)議規(guī)范進(jìn)行。在討論風(fēng)險(xiǎn)之后，從所有對(duì)象獲得知情同意書。在給予對(duì)象藥物之前，得到IRB的批準(zhǔn)。

在Lonza Biologicals(Houston，TX)的袋(GE Healthcare，Waukesha，WI)中產(chǎn)生良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)級(jí)rAd-HA-dsRNA。通過離子交換層析，隨后通過緩沖液更換進(jìn)行純化。將純化載體與賦形劑混合，凍干，然后使用微晶纖維素和淀粉作為壓片物在Lonza壓片。使用VectorLDCS-5包衣機(jī)(Vector Freund,Cedar Rapids,IA)，用L 100(Evonik Industries,Darmstadt,Germany)將片劑包被上腸溶包衣。將終產(chǎn)物釋放在一起，并且通過標(biāo)準(zhǔn)IU分析進(jìn)行滴定。將安慰劑制備為類似大小和形狀的片劑，其含有150mg微晶纖維素，無腸溶包衣。針對(duì)引起對(duì)轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答的能力，研究比較了10⁹個(gè)IU治療對(duì)象、10¹⁰個(gè)IU治療對(duì)象和安慰劑治療對(duì)象。在第0天和第28天，給予對(duì)象片劑。

在最初劑量之后第0天和第7天，以及在第二次劑量之后第28天和第35天(在第28天遞送第二次劑量)，通過ASC分析測(cè)量外周血中的循環(huán)前漿B細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，在治療組中，各次免疫之后7天，可以測(cè)量到ASC計(jì)數(shù)，但是安慰劑組中不可以(圖5)。平均應(yīng)答在第7天較高，并且在高劑量組中比低劑量組中高。第0天和第28天的背景ASC可忽略，以及對(duì)于安慰劑組，在所有的時(shí)間點(diǎn)均可忽略。對(duì)于高劑量組，在第7天和第35天分別測(cè)量到105+/-33和27+/-12ASC的平均值。對(duì)于低劑量組，在第7天和第35天，平均ASC分別是41+/-32和14+/-8。在第7天和第35天，安慰劑組分別具有0.3+/-0.3和0的平均值。高劑量組顯著高于安慰劑(第7天和第35天，分別是P＝0.01和P＝0.05)。

通過MN分析測(cè)量對(duì)流感的中和抗體應(yīng)答。在相對(duì)于安慰劑對(duì)照的治療組中，結(jié)果顯示MN滴度的劑量依賴性增加(圖6)。高劑量組中具有至少2倍增加的MN應(yīng)答者的頻率顯著不同于安慰劑組(通過費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)得到P＝0.003)，而低劑量趨于更高，但是未顯著高于安慰劑(P＝0.2)。在排除MN滴度大于40的對(duì)象之后，在剩余對(duì)象中計(jì)算幾何平均滴度(GMT)(表2)。還計(jì)算了第56天的幾何倍數(shù)滴度應(yīng)答(GMFR)(表2)。這些結(jié)果表明，通過口服免疫產(chǎn)生對(duì)流感的中和抗體滴度，其中在高劑量組中，在免疫之后GMT具有大于3倍的增加。這些結(jié)果表明，L 100包被片劑可被用于向腸遞送疫苗。

實(shí)施例4

我們體外測(cè)試了腸溶包衣的參數(shù)以確定不同pH和包衣百分比情況下的溶解時(shí)間。在到達(dá)回腸之前，在低pH的胃部暴露(如同在胃中)，以及隨后經(jīng)過增加的pH梯度(如同存在于十二指腸和空腸中)之后，數(shù)據(jù)為回腸遞送提供了指導(dǎo)。

用如上所述制備的150mg片劑測(cè)試片劑崩解，所述片劑利用作為有機(jī)溶劑懸液施加的L100、L100-55或者L100和L100-55聚合物的1:1(w/w)混合物，用8％、10％或12％的總固體重量增加進(jìn)行包被。一式兩份，于37℃，將用各包衣聚合物制備的且具有各水平的包衣施加的片劑在VanKel Bio-Dis III往復(fù)圓筒溶解試驗(yàn)裝置中以每分鐘下降10次(DPM)的往復(fù)速率預(yù)暴露于USP模擬胃液(SGF，pH 1.6，無胃蛋白酶)120分鐘。然后將片劑轉(zhuǎn)移至USP模擬腸液(SIF，pH 6.8，無胰酶)。觀察片劑的崩解，并且兩次片劑完全崩解的時(shí)間被記錄到最接近的5分鐘。數(shù)據(jù)表明，崩解時(shí)間受聚合物組成和厚度二者的影響，并且提供關(guān)于適當(dāng)選擇包衣組合物以影響片劑離開胃之后包衣的行為的指導(dǎo)。

用150mg片劑測(cè)試pH對(duì)崩解時(shí)間的影響，所述片劑用LI 00或LI 00-55包被至10％總固體重量增加。通過將USP SIF(無胰酶)的pH調(diào)節(jié)至涵蓋USP說明書6.8的值來制備一系列的緩沖液。將片劑于37℃、10DPM下預(yù)暴露于USP SGF(無胃蛋白酶)120分鐘，然后轉(zhuǎn)移至pH更改的USP SIF溶液。觀察片劑的崩解，并且完全崩解的時(shí)間被記錄到最接近的5分鐘。數(shù)據(jù)表明，崩解速率受環(huán)境pH的影響，并且兩種聚合物之間有差異。再者，結(jié)果可用于適當(dāng)?shù)倪x擇包衣組合物以實(shí)現(xiàn)將藥物保留通過胃和小腸上部。

實(shí)施例5

我們進(jìn)行了第1期，連續(xù)的入選研究，其中用隨機(jī)的和安慰劑對(duì)照的組群評(píng)價(jià)基于重組Ad血清型5(rAd5)的針對(duì)H1季節(jié)流感的口服疫苗的安全性和免疫原性。如本文所述，將含有疫苗的片劑進(jìn)行包被以在回腸中溶解。數(shù)據(jù)顯示，在引起對(duì)流感的中和抗體應(yīng)答方面，口服片劑疫苗將與既有的疫苗有競(jìng)爭(zhēng)性。

在第0天和第28天測(cè)量血凝抑制(HAI)應(yīng)答(圖7A)。安慰劑治療的對(duì)象沒有血清轉(zhuǎn)化，但是一名安慰劑對(duì)象漏篩了并在第0天具有較高的值。疫苗對(duì)象中沒有一個(gè)具有>20的起始HAI滴度。在免疫之后，疫苗組中的9名對(duì)象達(dá)到了血清保護(hù)水平(HAI>40)(圖7A)。所述組的幾何平均滴度(GMT)是61.1(95％CI:30-124)，相對(duì)于7.9的最初GMT(95％CI:6-11)有7.7倍幾何平均倍數(shù)上升(GMFR)。在11名4倍上升者中(92％)，9名血清轉(zhuǎn)化(SC)，其他2名對(duì)象顯示HAI滴度從5至20的4倍增加。在4倍應(yīng)答者的數(shù)量方面，相對(duì)于安慰劑，疫苗組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(11相對(duì)于0，通過費(fèi)舍曼精確檢驗(yàn)，P<0.0000)。相對(duì)于第0天的11.0的GMT(95％CI:5-23)，安慰劑對(duì)象在第28天具有11.9的GMT(95％CI:6-25)。

通過檢測(cè)免疫之后180天的HAI應(yīng)答來測(cè)量抗體應(yīng)答的持久性。在疫苗免疫組中，75％(12名中有9名)的對(duì)象在第28天被血清保護(hù)，以及75％(12名中有9名)的對(duì)象在第180天仍被血清保護(hù)。繪制HAI GMT(圖7B)，并且在免疫后28天至180天，發(fā)現(xiàn)GMT降低28％。

通過MN分析測(cè)量對(duì)流感的中和抗體應(yīng)答。觀察到治療組中MN滴度相對(duì)于安慰劑對(duì)照的顯著增加(圖7C)。疫苗治療組中的4倍MN應(yīng)答者的頻率顯著不同于安慰劑組，其中相對(duì)于安慰劑組中的0名，在疫苗治療組中有11名對(duì)象應(yīng)答(通過費(fèi)舍曼精確檢驗(yàn)得到P<0.0000)。

在排除本底MN滴度(和HAI滴度)大于40的對(duì)象之后，如下述表中所示，在第0天和第28天，在剩余對(duì)象中計(jì)算幾何平均滴度(GMT)。在第28天，疫苗組的GMT上升至247(95CI:89-685)，而在安慰劑中GMT 9.6無上升(95CI:5-18)。這些計(jì)算對(duì)疫苗組沒有影響，因?yàn)閷?duì)象中沒有一個(gè)具有較高的最初MN或HAI滴度。這些結(jié)果表明，通過口服免疫產(chǎn)生對(duì)流感的中和抗體滴度，在疫苗治療組中，免疫之后的GMT具有大于20倍的增加。

為了測(cè)量對(duì)HA的總的抗體應(yīng)答，在免疫后的第0天和第7天，通過ASC分析測(cè)量外周血中的循環(huán)前漿B細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果顯示，在疫苗治療組中，在第7天可靠地測(cè)量到ASC(圖7D)。在第0天，背景ASC通?？珊雎?。對(duì)于疫苗治療組，在第7天，發(fā)現(xiàn)每1x 10⁶個(gè)PBMC存在992(+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差209，95％CI:532-1452)IgG ASC和337IgA ASC(+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差104，95％CI:117-580)的平均值，其中12名對(duì)象中只有1名對(duì)象具有不可檢測(cè)的ASC應(yīng)答。在第7天，安慰劑組不具有IgA斑點(diǎn)，但是一名對(duì)象具有較高的背景彌散以及比正常觀察的斑點(diǎn)小的可測(cè)量IgG ASC應(yīng)答。在第7天，在引起IgG或IgA ASC應(yīng)答的能力方面，治療組顯著不同于安慰劑(通過T檢驗(yàn)，分別得到Ρ＝0.0007和P＝0.008)。

回顧性地測(cè)量免疫前后對(duì)象的抗載體滴度。口服免疫之后，很少的疫苗治療對(duì)象具有對(duì)Ad5的中和抗體應(yīng)答的增加，其導(dǎo)致相比于安慰劑治療對(duì)象中1.0倍GM倍數(shù)上升，GM中和抗體滴度2.6倍的增加。在疫苗組中，HAI和MN應(yīng)答對(duì)于個(gè)體對(duì)象趨于類似。8名對(duì)象在免疫之前是Ad5陰性的，4名對(duì)象在免疫之前是Ad5陽性的。Ad5陽性的一名對(duì)象沒有HAI血清轉(zhuǎn)化，然而，Ad5陽性的一名對(duì)象在研究的任何對(duì)象中具有最高HAI滴度增加(64倍)。該同一對(duì)象具有362倍的MN滴度增加，而在免疫前后均沒有Ad5中和抗體滴度的任何增加。對(duì)于用片劑疫苗免疫的對(duì)象，在起始Ad5滴度相對(duì)于倍數(shù)MN應(yīng)答(或HAI應(yīng)答)之間沒有觀察到相關(guān)性。

而且，本公開的片劑疫苗在室溫穩(wěn)定大于270天，并且可耐受短期的較高溫度偏離，其使得該方法技術(shù)上可行。

實(shí)施例5討論

US軍隊(duì)進(jìn)行了獨(dú)立的研究以在軍隊(duì)全體人員中測(cè)量季節(jié)性疫苗活動(dòng)對(duì)中和抗體應(yīng)答的影響，并且在解釋了啟動(dòng)MN滴度在40以上的對(duì)象之后，報(bào)道了三價(jià)滅活疫苗(TIV)注射之后5.6的MN滴度GMFR以及在減毒活流感疫苗(LAIV)鼻內(nèi)施用之后2.2的GMFR(Faix et al.(2012)PloS one 7:e34581)。在另一研究中，對(duì)于一次注射45μg HA蛋白(無佐劑)，發(fā)現(xiàn)針對(duì)H1N1的SC率是45％(Gordon et al.(2012)Vaccine 30:5407)，而在又一研究中，在1次劑量的裂解疫苗之后，H1N1疫苗是高度免疫原性的，觀察到78％的SC率(Greenberg et al.(2009)361:2405)。

與用注射疫苗觀察到的可變結(jié)果相反，在本研究中，在第29天，針對(duì)12名疫苗治療對(duì)象，計(jì)算MN GMFR，其中92％的對(duì)象顯示MN滴度大于4倍的上升。在本發(fā)明的片劑研究中，疫苗治療對(duì)象之間的HAI SC率是75％，其中超過92％的對(duì)象具有HAI滴度的4倍上升(圖7A)。MN滴度比HAI滴度高。可能的是，MN分析更靈敏，或者在頭部之外，口服的基于rAd的疫苗引起的中和應(yīng)答比蛋白注射疫苗強(qiáng)。

用注射的商業(yè)疫苗引起HAI應(yīng)答，但是已知HAI滴度衰退。例如，非HIV感染志愿者在免疫后1至6個(gè)月具有67％的GMT HAI滴度下降(Crum-Cianflone et al.(2011)Vaccine 29:3183)。類似地，對(duì)于入選的具有血清陰性HAI滴度(<1:10)的HIV陰性對(duì)象，血清保護(hù)對(duì)象的百分比從75％下降至56％。流行性流感疫苗的研究也顯示了持久性的下降。在AS03禽流感疫苗研究中，在2次疫苗劑量之后，GMT達(dá)到563，但是在免疫后6個(gè)月，GMT下降至18，減少96％(Leroux-Roels et al.(2010)Vaccine 28:849)。在本發(fā)明的片劑疫苗研究中，血清保護(hù)對(duì)象的百分比在免疫后1個(gè)月和6個(gè)月時(shí)維持恒定的75％，以及HAI GMT的滴度下降不太顯著，僅顯示28％的減少(圖7B)。一種可能性是，對(duì)于基于載體的疫苗，由于增加的T細(xì)胞應(yīng)答，持久性更好。

實(shí)施例5材料和方法

臨床方案和入選.在45天的入選期內(nèi)，針對(duì)血凝抑制(HAI)滴度，對(duì)對(duì)象進(jìn)行預(yù)篩。為了符合研究條件，參與對(duì)象必須具有≤1:20的最初HAI滴度，年齡在18-49歲之間，并且健康狀態(tài)良好。試驗(yàn)的有效期貫穿28天，監(jiān)測(cè)安全性的隨訪期持續(xù)1年。

24名對(duì)象入選。入選的所有對(duì)象在有效期以及監(jiān)測(cè)期的180天完成安全性和免疫原性評(píng)估。

隨機(jī)化和掩碼(Masking).研究被設(shè)計(jì)以在給予單劑量的1x 10¹¹個(gè)感染單位(IU)的12名對(duì)象與給予安慰劑對(duì)照的12名對(duì)象中評(píng)價(jià)疫苗(VXA-A1·1)。有3名連續(xù)入選的前哨(sentinel)疫苗治療對(duì)象，其中各對(duì)象不再頻繁地每24小時(shí)給予一次。在監(jiān)測(cè)疫苗相關(guān)的毒性一周之后，將治療組群中的剩余對(duì)象(9)與12名安慰劑對(duì)照一起隨機(jī)分配。通過電腦產(chǎn)生的分配進(jìn)行隨機(jī)分配，以及由非盲的藥劑師將隱藏信息的研究藥物分配至盲的工作人員。所有研究點(diǎn)的工作人員以及直接涉及免疫學(xué)分析或臨床安全性評(píng)估的人員對(duì)治療分配仍然是盲的。所有對(duì)象在研究中是盲的。

疫苗.rAd載體(非復(fù)制Ad5)攜帶編碼HA(A/CA/04/2009)轉(zhuǎn)基因的DNA，所述DNA的表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，以及分子dsRNA發(fā)夾由單獨(dú)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。GMP藥物物質(zhì)在Lonza Biologicals(Houston，TX)的Wave袋(GE Healthcare,Waukesha,WI)中產(chǎn)生。通過離子交換層析，隨后通過緩沖液更換進(jìn)行純化。將純化的載體與賦形劑混合，凍干，然后使用微晶纖維素和淀粉作為壓片物在Lonza壓片。使用Vector Hi-Coater系統(tǒng)(Vector Freund,Cedar Rapids,IA)，用Eudragit(Evonik Industries,Darmstadt,Germany)將片劑包被上腸溶包被。將終產(chǎn)物釋放在一起，以及通過Lonza的標(biāo)準(zhǔn)IU分析進(jìn)行滴定。安慰劑被制備為類似大小和形狀的片劑，其含有150mg微晶纖維素，無腸溶包衣。

端點(diǎn).該研究的主要端點(diǎn)是安全性，以及次要端點(diǎn)是整個(gè)有效期的免疫原性，主要是HAI滴度和HAI血清轉(zhuǎn)化。另外的免疫學(xué)端點(diǎn)包括MN滴度和ASC。在安慰劑組中存在5例不良事件，在疫苗組中有4例，在嚴(yán)重性方面其全部是1級(jí)。在本研究中，沒有報(bào)道嚴(yán)重的不良事件。

PBMC的分離和低溫保藏.將血液收集在K₃EDTA管(BD,Franklin Lakes,NJ)，并且同一天使用Lymphoprep^TM管(Axis-Shield,Norway)分離PBMC。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Cellular Technology Ltd[CTL],Shaker Heights,OH)，使用無血清試劑將PBMC凍融。

抗體分泌細(xì)胞(ASC).根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Mabtech,Mariemont,OH)，針對(duì)IgG和IgA分泌B細(xì)胞操作酶聯(lián)免疫吸附(ELISpot)試劑盒。在含CTL測(cè)試培養(yǎng)基的三個(gè)重復(fù)孔中培養(yǎng)細(xì)胞(每孔1.5X 10⁴至5X10⁵個(gè)細(xì)胞)以優(yōu)化斑點(diǎn)。使用生物素化試劑盒(Pierce,Rockford,IL)，對(duì)HA蛋白(Protein Sciences Corp,Meriden,CT)進(jìn)行生物素化并定量。

抗體分析.得到HAI和微中和(MN)滴度并分別針對(duì)MDCK來源的A/CA/07/2009和卵來源的A/CA/07/2009進(jìn)行測(cè)量。如調(diào)控建議所提出的，HAI和MN滴度小于10被標(biāo)示為5。

統(tǒng)計(jì)分析.進(jìn)行非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)來檢驗(yàn)組間的顯著性差異。如文中所述，雙尾費(fèi)舍曼精確檢驗(yàn)用來確定觀察到的頻率對(duì)于一些分析來說是否不同。對(duì)于兩種檢驗(yàn)，p值≤0.05被認(rèn)為是顯著的。對(duì)于測(cè)量的值，提供95％的置信區(qū)間(95CI)。

應(yīng)理解，本文所描述的實(shí)例和實(shí)施方案僅出于示例的目的，以及鑒于此將會(huì)暗示本領(lǐng)域技術(shù)人員作出多種修飾或改變，并且所述多種修飾或改變被包括在本申請(qǐng)的精神和權(quán)限以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。為了所有目的，將本文所引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)、網(wǎng)址以及數(shù)據(jù)庫登錄入口通過引用整體在此并入。