本發(fā)明涉及已知的重金屬螯合化合物的新用途。背景和現(xiàn)有技術慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一種阻塞性肺病，其表征為慢性氣流不暢(poorairflow)、呼吸短促、咳嗽和產痰。據信在世界范圍內COPD影響接近600,000,000名個體。絕大多數患有COPD的患者是吸煙者或曾經的吸煙者。已知COPD有許多可能的病因，吸煙是最常見的。其他病因包括空氣污染，特別是燃料燃燒(例如木頭煙)所致的空氣污染。據信該病癥也有遺傳成分。被理解的是，COPD由長期暴露于這些刺激物從而在肺部產生炎癥反應所致。這導致支氣管收縮和肺組織損壞(肺氣腫)。雖然COPD被認為是一種在很大程度上可以被預防的疾病(例如通過減少對導致其的病原體的暴露)，但其仍是世界上第三位的常見的死亡原因。對患者的治療提出很大的挑戰(zhàn)。目前的第一線治療包括吸入式支氣管擴張藥和皮質類固醇。然而，COPD患者中的氣流減弱通常不隨目前采用的藥物的施用而顯著改善，這意味著通常采用更劇烈的措施，包括氧療和甚至肺移植。癥狀惡化通常需要住院治療。由于缺少有效的治療，COPD的經濟負擔巨大，2010年估計為$2.1萬億。COPD的社會-經濟成本可能隨發(fā)達國家和發(fā)展中國家中的壽命增加而增加。在歐盟，治療2百萬受影響最大的患者的直接成本為約每年€30Bn(€15.000/患者/年)。治療另外2千萬受影響者的直接成本為約€10Bn(€500/患者/年)。因此，總成本為約€40Bn，這不包括由于喪失生產力所致的額外的間接成本。并發(fā)癥在COPD中非常常見，這進一步增加了治療成本。因此，對于COPD的新的和/或更好的治療存在很大的臨床上未滿足的需要。對于能夠靶向關鍵病理過程從而可能改變疾病的進展、減少進展到更嚴重的疾病階段的患者數目的改進療法也有明顯的需要。N,N-二-2-巰基乙基異鄰苯二甲酰胺(NBMI)首先被公開在美國專利號US6,586,600B2中。其作為飲食補充物以及在減輕氧化應激中的用途被公開在美國專利申請2010/0227812中。已知NBMI是強效的重金屬(包括汞、鎘和鉛)螯合劑。還參見Patel等,ToxicologyMechanismsandMethods,22,383(2012)。NBMI的類似物已被特別地公開在US8,426,368B2和國際專利申請WO2011/038385和WO2012/121798中。然而，上述文獻都沒有公開NBMI或相關化合物在COPD的潛在治療中的潛在用途。通常已知的是，在COPD患者中，在肺內以及在全身發(fā)生增加的氧化應激，兩者都是由于香煙的煙本身以及因此的自炎性細胞釋放的反應性氧種類(ROS)的增加所致的氧化負擔。細胞內真核細胞具有由其氧化產物脫氫抗壞血酸鹽(DHA)再生抗壞血酸鹽的酶系統(tǒng)，從而防止其不可逆地氧化成缺少抗氧化功能的下游產物(參見例如Corti等,Arch.Biochem.Biophys.,500,107(2010))。因此，該機制對于維持細胞抗壞血酸鹽濃度是必要的并且可以通過脫氫抗壞血酸鹽還原酶如谷氧還蛋白(參見Saaranen等,Antioxid.RedoxSignal.,12,15(2010))和蛋白質二硫鍵異構酶(Nardai等,J.Biol.Chem.,276,8825(2001))的作用而在使用酶的情況下發(fā)生，并且可以通過用GSH將其還原(Winkler等,FreeRadic.Biol.Med.,17,333(1994))而在不使用酶的情況下發(fā)生。最近的研究表明，抗壞血酸鹽注入增加患有COPD的患者中的骨骼肌疲勞耐受(參見例如Rossman等,Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.,305,(2013))。我們發(fā)現(xiàn)，不僅NBMI能夠抑制已知在COPD患者中表達的關鍵抗炎標記物如白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放(參見，例如，Rubini等,Inflamm.AllergyDrugTargets,12,315(2013),Thorleifsson等,Respir.Med.,103,1548(2009)和Tang,J.InterferonCytokineRes.,34,162(2014)以及Dadvand等,Eur.Respir.J.,(2014),Feb20)，而且，非常出人意料地，NBMI能夠在氣道襯液(liningfluid)內再生抗壞血酸鹽。此外，已經發(fā)現(xiàn)，NBMI可以通過充當抗壞血酸鹽循環(huán)的電子供體來發(fā)揮該作用。我們還驚人地發(fā)現(xiàn)NBMI可以被施用于患者以通過改善癥狀和改變/阻止疾病的進展來治療性治療COPD，而不產生顯著的不良副作用。技術實現(xiàn)要素：根據本發(fā)明的第一方面，提供NBMI或其藥用鹽或其衍生物，其用于治療COPD的方法。此種方法包括向需要此種治療的患者施用藥物有效量的NBMI。要理解術語“COPD”包括在文獻中被不同地稱為“慢性阻塞性肺病(chronicobstructivelungdisease，COLD)或“慢性阻塞性氣道病(chronicobstructiveairwaydisease，COAD)”的那些病癥，所述病癥表征為例如慢性氣流不暢、呼吸短促、咳嗽和產痰。為了避免疑義，在本發(fā)明的語境中，術語“治療”、“療法”和“治療方法”包括治療性或或緩解性治療有需要的COPD或本文提及的其他相關病癥的患者?！盎颊摺卑ㄈ嘶颊摺？梢蕴峒暗腘BMI的藥用鹽包括堿土金屬鹽，并且更特別是堿金屬鹽，如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、銣鹽、銫鹽和鈁鹽。此種鹽可以通過常規(guī)方式形成，例如通過使NBMI與一當量以上的合適的堿任選地在溶劑中或在鹽不溶的介質中反應，之后使用標準技術除去所述溶劑或所述介質(例如在真空中，通過凍干或通過過濾)。鹽也可以通過以下方式制備：例如使用合適的離子交換樹脂，將鹽形式的活性成分的抗衡離子與另一種抗衡離子交換。NBMI的藥用衍生物包括谷胱甘肽、半胱氨酸、α二氫硫辛酸、胱胺、硫醇磷酸鹽、5′-硫醇腺苷、L-高半胱氨酸、輔酶A、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、碘代乙酸鹽、溴代乙酸鹽、氟代乙酸鹽或氯代乙酸鹽衍生物。此種衍生物可以如例如美國專利申請2011/0237776中所述制備。NBMI、其藥用鹽及其藥用衍生物在下文中一起被簡單地統(tǒng)稱為“NBMI”。根據本發(fā)明的另一方面，提供治療患者中的COPD的方法，所述方法是通過在所述患者中以能夠再生抗壞血酸鹽(例如全身性地)的足夠的、藥物有效劑量施用NBMI來進行。技術人員充分了解，在文獻中“抗壞血酸鹽”也可以被不同地稱為抗壞血酸(ascorbicacid)、L-抗壞血酸和/或維生素C。已知COPD與呼吸系統(tǒng)發(fā)病和死亡相關，根據本發(fā)明，利用NBMI可以降低其風險。根據本發(fā)明的另一方面，提供降低患者中呼吸系統(tǒng)發(fā)病和死亡的風險(即預防)的方法，所述方法包括向顯示COPD癥狀的此種患者施用NBMI。技術人員將理解，術語“發(fā)病”通常包括任何至少部分地使人虛弱的疾病狀態(tài)、殘疾或疾病和/或不良的健康狀態(tài)?！昂粑到y(tǒng)”發(fā)病因此包括這樣的作為例如COPD的結果顯示的狀態(tài)。已經發(fā)現(xiàn)NBMI用于減輕COPD的癥狀，包括疲勞(例如骨骼肌疲勞)、呼吸短促、咳嗽和產痰。根據本發(fā)明的另一方面，提供減輕患有COPD的患者中COPD的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括向所述患者施用NBMI。雖然不限于此，可以提及的根據本發(fā)明的治療用途和方法包括其中患者是吸煙者或曾經的吸煙者的那些。在本文所述的用途和方法中，NBMI優(yōu)選以包含藥用劑量形式的化合物的藥物制劑的形式局部施用或全身施用，例如口服施用、靜脈內施用或動脈內施用(公開通過血管內或其他血管周圍的設備/劑型(例如支架))、肌肉內施用、經皮施用、皮下施用、透黏膜施用(例如舌下施用或經頰施用)、經直腸施用、透皮施用、經鼻施用、經肺施用(例如通過吸入、經氣管施用或經支氣管施用)、局部施用或通過任何其他腸胃外途徑。優(yōu)選的遞送方式包括經口遞送(特別地)、靜脈內遞送、經皮遞送或皮下遞送、經鼻遞送、肌肉內遞送或腹膜內遞送。NBMI通常以與藥用佐劑、稀釋劑或載體混合的一種或多種藥物制劑的形式施用，所述藥用佐劑、稀釋劑或載體可以根據計劃的給藥途徑和標準制藥學實踐來選擇。所述藥用載體可以在化學上對活性化合物是惰性的并且可以在使用條件下不具有有害的副作用或毒性。所述藥用載體也可以提供立即的或改變的NBMI釋放。合適的藥物制劑可以是市售的或是文獻中描述的，所述文獻例如，RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,MackPrintingCompany,Easton,Pennsylvania(1995)和Martindale–TheCompleteDrugReference(第35版)以及其中引用的文獻，所有所述文獻中的相關公開內容都通過引用結合于此。另外，合適制劑的制備可以由技術人員使用常規(guī)技術非創(chuàng)造性地實現(xiàn)。適用于NBMI的藥物制劑也被描述在美國專利申請2010/0227812中。制劑中NBMI的量將取決于病癥的嚴重性和受治的患者以及采用的化合物，但是可以由技術人員非創(chuàng)造性地確定。取決于受治的患者以及給藥途徑，可以將NBMI以不同的治療有效劑量施用給需要其的患者。然而，在本發(fā)明的語境中，施用于人的劑量應當足以在合理的時間范圍內(如前文所述的)實現(xiàn)治療反應。本領域技術人員將認可，準確的劑量和組成以及最合適的遞送方案的選擇還將特別受制劑的藥學性質、治療的病癥的性質和嚴重性和接受者的身體狀況和精神敏度以及受治患者的年齡、狀態(tài)、體重、性別和反應和疾病的階段/嚴重性以及患者間的遺傳差異影響。NBMI的施用可以是連續(xù)的或間歇的(例如通過推注)。所述劑量也可以通過施用的時間安排和頻率來確定。因此，NBMI的合適劑量為每天每公斤患者總體重約0.5至約100.0mg，包括約1至約60mg，例如約1.5至約40mg的化合物。在任何情況下，醫(yī)療從業(yè)者或其他技術人員都將能夠常規(guī)地確定最適合于個體患者的實際劑量。上述劑量是平均情況的示例；當然可能存在這樣的個體情況，其中更高或更低的劑量范圍是有益的，并且這也在本發(fā)明的范圍內。在本文所述的用途和方法中，NBMI也可以與可能用于或已被指定用于治療COPD的一種或多種活性成分組合。因此，所述患者也可以(和/或已經)接受基于施用一種或多種所述活性成分的治療，這是指在用NBMI治療前、用NBMI額外治療和/或在用NBMI治療后接受指定劑量的一種或多種本文提及的那些活性成分。此種活性成分包括短效支氣管擴張藥(如沙丁胺醇(salbutamol/albuterol)、左旋沙丁胺醇(levosalbutamol/levalbuterol)、吡布特羅(pirbuterol)、腎上腺素(epinephrine)、麻黃堿(ephedrine)和特布他林(terbutaline))、長效支氣管擴張藥(如沙美特羅(salmeterol)、克倫特羅(clenbuterol)、福莫特羅(formoterol)、班布特羅(bambuterol)和茚達特羅(indacaterol))、抗膽堿藥(如噻托溴銨(tiotropium)和異丙托溴銨(ipratropiumbromide))、皮質類固醇(如氟尼縮松(flunisolide)、丙酸氟地松(fluticasonepropionate)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、丙酸倍美松(beclomethasonedipropionate)和布地縮松(budesonide))和其他用于治療COPD的藥物，包括長期抗生素(例如大環(huán)內酯類(macrolides)如紅霉素(erythromycin))、溶粘蛋白藥(mucolytics)和氧。NMBI也可以與抗氧化劑或螯合劑，包括維生素-E、維生素-D、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、硫辛酸谷胱甘肽(GSH)、二氫硫辛酸(DLPA)、硫辛酸(LPA)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二巰基丙磺酸酯(DMPS)、二巰基琥珀酸(DMSA)、乙二胺四乙酸(EDTA)及其混合物一起施用?？梢蕴峒暗目捎糜谥委烠OPD的其他活性成分的藥用鹽包括酸加成鹽和堿加成鹽。此種鹽可以通過常規(guī)方式形成。可用于治療COPD的其他活性成分的合適劑量是本領域技術人員已知的并且包括在醫(yī)學文獻中針對目的藥物列出的那些，所述文獻如Martindale–CompleteDrugReference(第35版)及其中引用的文獻，所有所述文獻中的相關公開內容通過引用結合于此。當在本文中使用詞語“約”時，例如在量(例如活性成分的劑量)的語境中，要理解的是，此種變量是大致的并且因此可以與本文中指定的數目有±10％，例如±5％，并且優(yōu)選±2％(例如±1％)的變化。與現(xiàn)有技術中已知的用于此種治療的類似方法(治療)相比，本文所述的用途/方法可以具有這樣的優(yōu)點，即在COPD的治療中，其對醫(yī)生和/或患者可以是更方便的，可以是更有效的，可以是毒性更低的，可以具有更寬的活性范圍，可以是更強效的，可以產生更少的副作用，或其可以具有其他有用的藥理學性質。通過以下實施例來說明而絕非限制本發(fā)明，其中：圖1顯示，在抗壞血酸鹽氧化模型中，抗壞血酸鹽通過9,10-菲醌(9,10-PQ)氧化成DHA，之后DHA通過NMBI和二硫蘇糖醇(DTT)再循環(huán)。圖2顯示，在抗壞血酸鹽氧化模型中，抗壞血酸鹽通過CuSO4氧化成DHA，之后在10、20和30分鐘添加的NBMI和DTT使DHA再循環(huán)，其中抗壞血酸鹽氧化和再循環(huán)動力學顯示在左圖中，而在添加NBMI和DTT后抗壞血酸鹽濃度的相應躍升和持續(xù)增加顯示在右圖中。實施例1使用NBMI抑制IL-6和IL-8使用以下方法在A549和BEAS-2B細胞中測量響應于顆粒暴露的促炎性細胞因子白介素(IL)-6、IL-8(以及GM-CSF和MCP-1)向細胞培養(yǎng)基中的分泌。以5x104將肺上皮細胞接種到24孔板中。在與NBMI、用作陽性對照的抗氧化劑化合物N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或載體預孵育3小時后，除去培養(yǎng)基。含有不同濃度的各種顆粒(如下)的新鮮培養(yǎng)基的總體積為0.5ml，持續(xù)24小時。然后通過離心將上清液與細胞分離。使用DuoSetELISADevelopment試劑盒(R&DSystems，Abingdon，UK)，根據制造商的方案，在無細胞的液體中測量IL-8、IL-6、GM-CSF和MCP-1。僅暴露于培養(yǎng)基充當陰性對照。每個實驗以4個重復進行兩次。通常，P25型二氧化鈦和城市灰塵(參考SRM1649b)兩者在肺上皮細胞系A549和BEAS-2B中引起促炎性細胞因子的產生。以各種濃度的相關顆粒測試利用50μMNBMI的預孵育對顆粒引發(fā)的細胞因子形成的作用。研究證明，在兩種細胞系中，NBMI都能夠減少顆粒引發(fā)的促炎性細胞因子的分泌，雖然僅在一些例子中降低至背景水平。在暴露于75μg/cm2的TiO2P25的A549細胞的上清中獲得最高濃度的IL-8和IL-6。在該劑量，50μMNBMI使IL-8分泌減少29％并且使IL-6分泌減少38％。在A549細胞中，在100μg/cm2城市灰塵的情況下，與50μMNBMI預孵育使IL-8分泌減少30％，并且使IL-6分泌減少38％。在BEAS-2B細胞中，在100μg/cm2TiO2P25的情況下，與50μMNBMI預孵育使IL-8分泌減少49％，并且使IL-6分泌減少37％。在BEAS-2B細胞中，在100μg/cm2城市灰塵的情況下，與50μMNBMI預孵育使IL-6分泌減少47％。與5mMNAC預孵育在減少炎性細胞因子分泌方面也是有效的。實施例2使用NBMI再生抗壞血酸鹽檢測NBMI以觀察其是否能夠充當抗壞血酸鹽再循環(huán)的電子供體。使用抗壞血酸鹽損耗測定(Kelly等,Res.Rep.HealthEff.Inst.,163,3(2011)檢查1μM9,10-PQ和2μM硫酸銅(CuSO4)發(fā)起的抗壞血酸鹽氧化的動力學。采用9,10-PQ以致NBMI的作用可以在其螯合性質的分離中檢查。所有實驗一式三份地在UV96孔平底板(Greinerbio-one)中以200μL的終體積進行。通過以下方式開始暴露：向含有160μLChelex-100樹脂處理的水(含10％DMSO)的各孔中添加20μL抗壞血酸鹽濃縮儲液(2mM)，加上10μL水、4mM的CuSO4儲液或2mM的9,10-PQ儲液以及10μLNMBI(4mM和200μL)。所有溶液都在Chelex-100樹脂處理的水(含10％DMSO)中制備。這在所述孔中產生200μL抗壞血酸鹽、2μMCuSO4或1μM9,10-PQ和10至200μMNBMI的終濃度。在向各測定孔添加抗壞血酸鹽前，將平板在37℃在讀板儀(SpectraMax190)中預孵育10分鐘。在暴露期間，將平板保持在該溫度。在添加抗壞血酸鹽后，通過測量265nm的吸光度來監(jiān)測各孔中剩余的濃度，每2分鐘一次，達兩小時。關于標準曲線確定抗壞血酸鹽濃度，通過使用MicrocalSoftwareLimited’sOriginLab(版本5.0)經由濃度對時間圖的起始部分進行線性回歸來確定抗壞血酸鹽氧化速率。這對三份中的每一份進行并且抗壞血酸鹽損耗速率最終表示為平均mols1x10-9抗壞血酸鹽損耗±標準差。對于其中測量向抗壞血酸鹽添加NBMI的影響的實驗，隨后檢查隨時間的CuSO4和9,10-PQ損耗測定。僅前55-60分鐘平板在有190μL的情況下進行測定，其后將其從讀板儀中取出并且向各孔中加入10μL的NMBI或已知的還原劑、DTT儲液或水。然后將平板放回讀板儀并且監(jiān)測265nm的吸光度達另外60分鐘。確定測量的抗壞血酸鹽濃度的立即增加并且其被稱為‘躍升(jump)’，并作為立即再循環(huán)能力的量度。也確定剩余的60分鐘孵育內的持續(xù)‘增加’。兩者之間的差異反映添加的化合物隨后抑制CuSO4或9,10-PQ發(fā)起的抗壞血酸鹽氧化的速率的能力。圖1顯示實驗的前60分鐘通過與9,10-PQ孵育發(fā)起的抗壞血酸鹽氧化的動力學。在該時間，添加NMBI(200μM)并且其被證明導致42.8μM的抗壞血酸鹽的立即的回彈增加。其后，抗壞血酸鹽氧化速率相對于前60分鐘下降?？箟难猁}的此種回彈增加(其表示DHA再循環(huán)回抗壞血酸鹽)是驚人的，并且當與使用(DTT，200μM)所實現(xiàn)的相比時明顯更大，使用(DTT，200μM)實現(xiàn)較低的抗壞血酸鹽的立即恢復(5.1μM)，其也不是持續(xù)的。圖2顯示在CuSO4抗壞血酸鹽模型中，利用10、20和30分鐘的孵育，NMBI使DHA再循環(huán)的能力。聚焦于這些較早的時間點，NMBI添加后抗壞血酸鹽的回彈增加在較高的兩個測試濃度最明顯，隨后的氧化速率猝滅，這可能是由于化合物的螯合性質所致。在60分鐘添加NMBI和DTT(都為200μM)的情況下重復這些實驗。這顯示在使用DTT的情況下的7.93±6.58μM的抗壞血酸鹽濃度的立即‘躍升’，與之相比的是在使用NBMI的情況下的24.98±5.54μM增加。在剩余的60分鐘孵育里，對于DTT和NBMI，抗壞血酸鹽的持續(xù)‘增加’分別為10.79±2.45μM相比于25.45±2.45μM。這些結果指示NBMI的迄今未知的和驚人的性質，提示其可以使DHA再循環(huán)回抗壞血酸鹽。實施例3治療患有COPD的患者居住在美國的退休女性，若干年前在醫(yī)學上被診斷為患有COPD，規(guī)律性地在任意24小時時期內經歷咳嗽發(fā)作二至四次，在白天或夜晚的任意時間開始并且持續(xù)約40至75分鐘。由于這些咳嗽發(fā)作，患者的呼吸淺，其喉嚨受刺激，其聲音沙啞，其能量水平非常低并且其生活質量非常差。每天用在膠囊中的100mgNBMI劑量治療三次(在吃飯時)達八天時間，導致癥狀的明顯改善。到治療的第八天，患者沒有經歷咳嗽發(fā)作并且呼吸明顯改善。實施例4體內“吸煙小鼠”研究I研究顯示，當暴露于每周5天每天5-6只香煙時，香煙煙霧可以在C57B1/6和Balb/c小鼠二者中引起炎性肺反應(參見例如D′hulst等,Eur.Respir.J.,26,204(2005)和Jung等,BMCComplement.Altern..Med.,13,219(2013))。開發(fā)香煙煙霧(CS)引起的氣道疾病的小鼠模型，其中使用吸煙機將四組BALB/c小鼠暴露于CS(僅鼻子)，持續(xù)2周，每周7天，所述吸煙機由過濾的研究香煙產生側流煙和主流煙的組合。作為14天的劑量發(fā)現(xiàn)研究的部分，在每次暴露于CS前給三組小鼠皮下施用NMBI(5、30或150mg/kg)。進行支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的炎性細胞計數、BAL中的流式細胞術(FACS)分析和細胞因子分析。材料和方法將雌性BALB/c小鼠(Harlem實驗室，Netherlands)用于該研究。使其居于具有吸收性墊料的塑料籠中并且保持12小時日光周期。隨意提供食物和水。其看護和實驗方案由的動物實驗地區(qū)倫理委員會(RegionalEthicsCommitteeonAnimalExperiments)批準。當開始香煙暴露方案時，小鼠為12周齡。CS暴露方案使動物遭受吸入的CS(側流煙和主流煙皆有)。在由研究香煙(1R5F，UniversityofKentucky，Lexington，KY，USA)產生煙霧的微處理器控制的吸煙機(TE-10，TeagueEnterprises，CA，USA)中進行CS暴露。香煙被自動加載到輪子中，點燃，吸進并噴出。每只香煙被吸10分鐘并且通過機器的氣流被設定為12L/min。將香煙存儲在-20℃直至需要。使小鼠每10分鐘經受4只香煙x3(即30分鐘12只香煙)，每天一次，每周7天，持續(xù)兩周。煙霧被轉移到煙塔(EMMS，UK)中，從而提供均等的和同時的對CS的暴露。將小鼠置于塑料小室中并“僅通過鼻子”吸入而經受CS。對照小鼠每天處理并且呼吸室內空氣，但不被從其籠中取出。因此，5個處理組如下：1.每天暴露于干凈空氣(安慰劑組)2.每天暴露于CS(CS暴露的安慰劑組)3.每天暴露于CS；用5mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI5mg/kg組)4.每天暴露于CS；用30mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI30mg/kg組)5.每天暴露于CS；用150mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI150mg/kg組)在第15天，給小鼠放血并進行支氣管肺泡灌洗(BAL)。經由氣管導管用總體積1mL+3x1mL無Ca2±/Mg2+Hanks平衡鹽溶液(HBSS，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)將肺灌洗四次。然后立即將BAL液離心(10分鐘，4℃，1750rpm)。在除去上清后直至進一步分析，將細胞沉淀重懸然后用0.5mLPBS稀釋。在血球計中手動對白細胞計數以致可以加載20,000個細胞并使用離心機(cytospin3細胞離心機，細胞制備系統(tǒng))離心。將經細胞離心的制劑用May-Grünwald-Giemsa試劑染色并且使用標準形態(tài)學標準進行肺炎性細胞(巨噬細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和嗜曙紅細胞)的差異細胞計數并且每個細胞涂片(cytospin)制備物計數300個細胞。對于白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL17、嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、G-CSF、INFγ、GM-CSF、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-lβ、RANTES和TNFα的存在，分析BAL和血清中的炎性介質。所有細胞因子分析利用多路(multiplex)試劑盒(BioPlexTMProMouseCytokine23-plexpanel)根據生產商的使用說明(Bio-Rad)同時進行并且在Bio-PlexTm系統(tǒng)(LuminexBio-PlexTm200System，Bio-Rad，Hercules，CA)上進行分析。來自BAL的白細胞利用流式細胞術使用BDFACSortTM(BectonDickinson，SanJose，CA)來分析。將來自BAL的細胞重懸在PBS中，如上所述?？贵w染色在96孔板中以2.0x105個細胞/樣品進行。將細胞與FcR封閉抗體(抗-CD16/CD32；克隆2.4G2)預孵育以減少非特異性結合。用于鑒別T細胞亞型的mAb為：CD3-FITC(克隆17A2)、CD4-PE(克隆H129.19)和CD8a-PE-Cy5(克隆53-6.7)。同種型匹配抗體用作陰性對照。使用BDFACSortTM(BectonDickinson，SanJose，CA)根據標準程序進行流式細胞術并且利用BDFACSDiva軟件進行分析。所有抗體都來源于BDSciencesPharmingen(SanDiego，CA)。T細胞限定為CD3+。結果以平均值±平均值的標準差(S.E.M)顯示。通過參數方法使用雙因素方差分析(ANOVA)評估統(tǒng)計學顯著性以確定組間差異，之后是Bonferroni事后(posthoc)檢驗。適當時，使用單因素ANOVA或Student非配對t檢驗。p<0.05的統(tǒng)計結果被認為是顯著的。進行統(tǒng)計分析并且利用GraphPadPrism(版本6.0GraphPad軟件Inc.，SanDiego，CA，USA)制圖。結果從第1天開始每天給所有動物稱重，直到第15天，在最后一次煙霧暴露后24小時。在第1天，小鼠沒有任何明顯的體重差異。在第15天，NBMI5mg/kg組中的動物比暴露于CS(20.3±0.3g，p<0.05)的小鼠具有更低的終體重(19.5±0.3g)。不管NBMI的劑量如何，所有暴露于CS的小鼠從第1天到第15天都有明顯體重損失。CS暴露的動物中的總BAL細胞計數(第15天)并不明顯高于對照組(有CS的情況下為296,700±43,650個細胞/mL，沒有CS的情況下為284,670±63,200個細胞/mL，p>0.05)。CS暴露引起B(yǎng)AL液中嗜中性粒細胞的顯著增加(有CS的情況下為940±250個細胞/mL，沒有CS的情況下為260±160個細胞/mL，p<0.05)。在第15天，NBMI150mg/kg組和NBMI30mg/kg組中的動物比僅暴露于CS的小鼠的嗜中性粒細胞數目明顯低。兩周的CS暴露沒有明顯增加BAL中炎性介質的水平，除了G-CSF以外。與CS暴露的安慰劑組相比，NBMI5mg/kg組具有降低的MIP-1α水平(p<0.05)。分析的炎性介質之間沒有其他顯著差異。兩周的CS暴露沒有明顯增加血清中炎性介質的水平。與CS暴露的安慰劑組相比，NBMI150mg/kg組具有明顯降低水平的IL-1β、IL-3、IL-6、嗜酸性粒細胞趨化因子、MIP-1α和RANTES。NMBI30mg/kg組的血清中的IL-10水平增加。分析的炎性介質之間沒有其他顯著差異。兩周的CS暴露沒有明顯增加BAL液中CD4細胞或CD8細胞的水平。任何組間沒有顯著差異。NBMI150mg/kg組中的小鼠在頸部出現(xiàn)傷口。另兩個NBMI組沒有顯示潰瘍的征候，并且安慰劑組也沒有。實施例5體內“吸煙小鼠”研究II從以上實施例4中描述的研究的結果得出的結論是，兩周的吸煙在時間上可能不足以引起炎癥反應。因此，在所述14天劑量發(fā)現(xiàn)研究后，使用與以上實施例4中所述的基本相同的設備和方案進行90天研究。在此情況下，5個處理組如下：1.每天暴露于干凈空氣(安慰劑組；第1組)2.每天暴露于CS(CS暴露的安慰劑組；第2組)3.每天暴露于CS；用30mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI30mg/kg組；第3組)4.每天暴露于CS；用60mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI60mg/kg組；第4組)5.每天暴露于CS；用150mg/kg劑量的NBMI處理(NBMI150mg/kg組；第5組)在第91天，給動物稱重并且用戊巴比妥鈉麻醉(90mg/kg體重，腹膜內注射)。用18-規(guī)格的套管給小鼠進行氣管切開術并且以類似正弦的方式利用小動物呼吸器(flexiVentTM，)以3Hz的頻率和12mL/kg體重的潮氣量(VT)進行機械呼吸。施用3cmH2O的呼氣末正壓。在整個呼吸機制評估期間，監(jiān)測動物的心臟輸出。用泮庫溴銨(pancuronium)(0.1mg/kg體重，腹膜內注射(局部補充器))將小鼠麻痹，之后在試驗開始時以3xVT進行4次嘆氣操作(sighmanoeuvre)以建立穩(wěn)定的基線呼吸機制并且保證在實驗前的相似的體積史。通過施加正弦標準化呼吸測量動態(tài)肺機制并且使用單室模型和多重線性回歸進行分析，給出呼吸阻抗(RRS)、倒電容(ERS)和順應性(compliance)(CRS)。RRS的測量值反映導電的氣道的窄化和肺的改變。CRS和ERS的測量值僅反映肺外圍事件，特別是導致肺單位減振(de-recruitment)的氣道關閉。形成對比的是，CRS的選擇性改變指示更遠的動作位點。根據Jonasson等,Respir.Res.,9,23(2008)和Respir.Physiol.Neurobiol.,165,229(2009)使用強迫振蕩技術(FOT)對肺機制進行更徹底的評估。該研究中獲自FOT測量的參數為：牛頓阻抗(RN)、組織減幅(G)(其與組織阻抗密切相關并且反映肺組織中的能量消耗)；和組織倒電容(H)(其表征組織硬度并且反映組織中的能量存儲)。通過給肺充氣至30cmH2O的最大壓力確定動態(tài)壓力體積(PV)曲線，允許使用計算機控制的Flexivent呼吸器的被動呼氣來測量體積和壓力。匯編來自各動物的個體結果。所有PV測量一式三份地進行。準靜態(tài)PV回路(PVloop)通過對肺進行緩慢的逐步充氣和放氣獲得。進行PV回路用于PEEP水平，3cmH2O。PV回路的遞減分支的形狀因子(k)通過將數據擬合到Salazar-Knowles等式的數據來計算。據信，參數k的值隨纖維化和肺氣腫特征性改變。還獲得足以達到20cm水的準靜態(tài)順應性(Cst)和倒電容(Est)和吸入的空氣體積?；旧先缫陨蠈嵤├?中所述的那樣進行支氣管肺泡灌洗(BAL)，來自BAL的細胞的流式細胞術分析和BAL和血清中的炎性介質分析也是如此。在4℃使用混合磨機(Retchmm400)將冷凍的肺組織與1mLPBS一起在2mL管中勻漿化2分鐘。勻漿化后立即將管離心15分鐘(1500rpm，4℃)。將上清取出并保存以用于使用NanoDrop分光光度計(ProteinsA280)的蛋白質濃度測定。在分析蛋白質含量后，保留等量的來自各樣品的蛋白質用于轉化生長因子β(TGFβ)1-3分析。使用多路試劑盒(Bio-PlexProTGF-β3-PlexImmunoassay)根據生產商的使用說明(Bio-Rad)同時分析肺組織勻漿中的TGFβ1-3并且在Bio-PlexTM系統(tǒng)(LuminexBio-PlexTM200System，Bio-Rad，Hercules，CA)上進行分析。進行組織學分析的動物不進行呼吸功能測試以保護組織完整性。將右肺葉取出并且在4％多聚甲醛中固定直至石蠟包埋。在包埋在石蠟中后，將組織切成3μm厚的切片并且安裝在帶正電荷的載玻片上。為了評估炎性細胞滲透，將所述切片脫石蠟，脫水，并且用蘇木精和曙紅染色。對染色的切片的組織病理學評估由在Uppsala，Sweden的NationalVeterinaryInstitute(SVA)的專門研究小動物的專業(yè)病理學家進行?；旧先缫陨蠈嵤├?中所述的那樣進行統(tǒng)計分析。結果在以下表1中，列出用于不同分析的小鼠數目。血液取樣自所有小鼠。表1氣道生理學，BAL和血清組織學和血清第1組93第2組73第3組93第4組83第5組73在90天暴露期間，5只小鼠死亡。在大多數情況下，其由于惡化的健康狀況(如體重大幅下降和嗜睡)而被實施安樂死，參見表5。在分析期間，6只小鼠是明顯的異常值并因此被從數據組中排除(表2)。表2所有CS暴露的小鼠都明顯受暴露影響。它們遭受皮毛起皺和肌肉力量喪失。接受NBMI(第3組和第4組)的動物在一定程度上表現(xiàn)為比接受安慰劑的其他組更健康(動物技術員的觀察)。改變皮下施用NBMI的注射位點以避免結疤和潰瘍。雖然進行了這種努力，但第5組中的小鼠還是在頸部出現(xiàn)了傷口和囊炎(bunion)。另兩個NBMI組沒有顯示潰瘍的征候，安慰劑組也沒有。對照動物接受與第5組中的NBMI相同濃度的DMSO。在第90天，CS暴露的動物顯示明顯的與對照動物的體重差異。對照小鼠體重增加15％(2.8±0.2g)，而暴露于CS的小鼠體重沒有顯著成都的增加(-0.1±0.3g)。接受NBMI的動物與起始重量相比都增加了重量(第3組:1.0±0.4g，第4組:0.7±0.2g和第5組:0.6±0.2g)。在第90天，CS暴露的動物中的總BAL細胞計數明顯高于對照組(在CS的情況下為246,700±21,980個細胞/mL而在無CS的情況下為152,000±20,540個細胞/mL，p<0.01)。CS暴露引起B(yǎng)AL液中巨噬細胞的明顯增加(在CS的情況下為229,300±21,400個細胞/mL，而在無CS的情況下為134,200±18,600個細胞/mL，p<0.01)。與對照組(第1組)相比，CS暴露沒有增加BAL液中滲透的嗜中性粒細胞和淋巴細胞的數目。接受NBMI(30、60和150mg/kg)的動物的BAL液中的巨噬細胞數目并不明顯更低。然而，第4組和第5組中有較低數目嗜中性粒細胞的趨勢并且在用NMBI處理的組中有較低數目淋巴細胞的趨勢。如FACS分析顯示的，九十天的CS暴露沒有顯著增加BAL液中T輔助(CD4+/CD3+)或T細胞毒性(CD8+/CD3+)淋巴細胞的水平。在NBMI處理后，這兩種淋巴細胞的百分比都沒有明顯改變。然而，因為在NBMI處理后淋巴細胞減少，所以與第2組相比，NBMI處理的動物中的BAL液中的T細胞毒性(CD8+/CD3+)淋巴細胞顯著減少。九十天的CS暴露與對照動物相比(第2組相比第1組)引起肺的結構變化，如由較大和較小的氣道中的CS引起的改變(增加的ERS和H以及減小的CRS)所顯示的。CS減小的滯后性(hysteresivity)系數η反映肺中異質性的減小。較高劑量的NBMI(第4組和第5組)顯著增加較小和較大氣道阻抗(RRS和G)。在暴露于CS的小鼠(第2組)中測量PV曲線并將其與暴露于室內空氣的小鼠(第1組)相比。CS暴露使得肺明顯更硬并且需要更大的壓力來給肺充氣。接受NBMI(30、60和150mg/kg)的動物與安慰劑組(第2組)相比沒有顯示明顯改變的呼吸系統(tǒng)功能。Cst、Est和k未受煙霧暴露影響。九十天的CS暴露沒有顯著增加BAL和血清中的炎性介質水平。當與CS暴露的安慰劑組(第2組)相比時，在NBMI150mg/kg組(第5組)中，血清中的MIP-1β(p<0.05)和GM-CSF(p<0.01)水平較低。分析的炎性介質之間沒有其他顯著差異。與對照組(第1組)相比，CS暴露的動物(第2組)沒有顯示肺勻漿中增加的TGFβ水平。與接受CS的安慰劑組(第2組)相比，接受NBMI的動物的TGFβ1-3的量沒有顯著變化。所有肺中的支氣管腔和肺泡都顯示少許巨噬細胞。在處理組中，巨噬細胞稍多并且顯示胞質黃色色素或黑色色素顆粒。黑色色素可能是來源于香煙暴露的煙灰而黃色色素可能是脂褐質。在CS暴露的動物中，偶爾在肺泡隔并且同樣在胸膜下在肺周圍區(qū)域中觀察到低數目的白細胞(嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、單核細胞、巨噬細胞)。香煙暴露組中巨噬細胞數目的輕微升高不十分明顯并且肺很好地保持在炎癥閾值以下。觀察到的變化不足夠強以引起臨床征候。該研究中的對照動物與CS暴露的小鼠相比顯示明顯更好的氣道功能和更大的體重增加，但是BAL液中的細胞的細胞的增加與第2組沒有明顯不同。除了暴露于CS煙霧以外，對照小鼠接受的處理與第2組相同。然而，所有動物在實驗室中共享相同的空間。結論CS暴露的小鼠顯示重量損傷(或缺少增加的重量)，巨噬細胞增加，和更硬的肺以及呼吸順應性下降。用NBMI處理(第3組和第4組)改善每日暴露于CS達90天的小鼠的健康狀況。積極治療效果得到以下各項支持：與CS暴露的安慰劑組(第2組)相比，增加的重量以及BAL液中淋巴細胞數目減少的趨勢和CD8+細胞的減少。當前第1頁1 2 3